KR100959557B1

KR100959557B1 - 육두구 가종피 추출 화합물을 유효성분으로 포함하는당뇨병 또는 피피에이알-감마 매개 질환 예방 및 치료용약학적 조성물

Info

Publication number: KR100959557B1
Application number: KR1020080019147A
Authority: KR
Inventors: 황재관; 이재영; 김정환; 심재석; 이해지
Original assignee: (주)바이오케어; (주)뉴트리
Priority date: 2007-06-20
Filing date: 2008-02-29
Publication date: 2010-05-27
Anticipated expiration: 2028-02-29
Also published as: KR20080112090A

Abstract

본 발명은 육두구 가종피 추출 화합물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 육두구의 가종피에서 추출한 화합물인 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 또는 리카린 E를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 및 리카린 E는 육두구 가종피(aril of nutmeg)의 추출물에서 분리된 화합물이고, 상기 화합물과 육두구 가종피 추출물은 PPARγ의 리간드로 작용하여 PPARγ을 활성화하므로 PPARγ에 의해 매개되는 당뇨병 및 당뇨합병증과 같은 질환을 예방 및 치료하는 목적으로 사용할 수 있다. 또한 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7, 리카린 E와 육두구 가종피(aril of nutmeg) 추출물도 혈당을 감소시켜 당뇨병 예방제 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7, 리카린 E, 육두구 가종피, 당뇨병

Description

육두구 가종피 추출 화합물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 피피에이알-감마 매개 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing and treating diabetes or PPARγ-mediated disease comprising compounds extracted from aril of nutmeg as an active ingredient}

본 발명은 육두구 가종피 추출 화합물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 육두구의 가종피에서 추출한 화합물인 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판(2-(4-allyl-2,6-dimethoxyphenoxy)-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-propane), 아우스트로바이리그난 7(austrobailignan 7) 또는 리카린 E(licarin E)를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

PPAR(peroxisome proliferator activated receptor)은 퍼옥시좀(peroxisome)의 수를 증가시킬 수 있는 화합물인 퍼옥시좀 증식제(peroxisome proliferator)를 리간드로 하는 핵내 수용체를 말하며, PPARα, PPARδ, PPARγ의 동형체(isoform)가 알려져 있다(J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 51, 157, 1994; Gene Expression, 4, 281, 1995; Biochem . Biophys . Res . Commun ., 224, 431, 1996).

PPAR은 주로 지방대사에 관여하는 유전자 또는 지방세포(adipocyte)의 분화에 관여하는 유전자의 발현을 조절하며(J. Invest . Dermatol . 111, 1116-1121, 1998; J. Med . Chem ., 43, 527-550, 2000), PPAR의 동형체 중 PPARα는 간, 망막(retina) 및 지방조직(adipose tissue)에서 주로 발현되며 지방산의 산화나 독성물질의 중화에 관여하며 염증반응에 관여한다. PPARγ은 지방세포, 면역세포, 부신(adrenal gland), 비장(spleen), 및 소장에서 주로 발현되며, 지방세포의 분화에 중심 조절자로 알려져 있다. PPARδ는 조직특이적으로 발현하지 않고, 광범위하게 발현되며 그 기능은 확실치 않다(Endocrinology., 137, 354, 1996).

PPAR이 지방대사에 중요한 역할을 하기 때문에, PPAR을 대상으로 하는 대사 질환의 치료제를 개발하기 위한 많은 연구가 진행되고 있다. PPARγ이 활성화되면, 지방세포의 당 수용능력이 극대화 되며 지방세포 분화가 촉진되고 인슐린 저항성이 감소된다(Tren . Pharmacol . Sci ., 25: 331-336, 2004). 따라서 PPARγ의 리간드는 인슐린 저항성으로 인한 당뇨병 치료제로서 역할을 할 수 있으며, 현재 피오글리타존(pioglitazone) 및 로지글리타존(rosiglitazone)과 같은 TZD 약제가 대표적인 PPARγ의 리간드로써 당뇨병 치료제로 사용되고 있다.

당뇨병은 크게 제 1 형과 제 2 형 당뇨병으로 나눌 수 있는데 제 1 형 당뇨 병은 유전적 감수성 및 바이러스 감염으로 인해 췌장에 면역학적 반응이 유발되고, β-세포가 선택적으로 파괴되어 발생하는 자가면역질환이다. 제 2 형 당뇨병은 인슐린 저항성이 선행하는 형으로 주요 병인으로는 비만, 인슐린 수용체의 감소, tyrosine kinase 활성도 감소, 근육조직과 지방조직의 muscle/adipose tissue type transportor의 감소, insulin receptor substrate-1(IRS-1)의 세포 내 결핍 등 복잡한 원인에 의해 발병하는 것으로 보고되고 있다. 제 2 형 당뇨병은 주로 성인에서 발병하는데 전체 당뇨병 중 90%를 차지하고 있다(Drugs, 65: 433-445, 2005).

한편, 육두구(nutmeg)는 열대지방에서 재배되는 다년생 식물인 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)의 열매로서 오래전부터 향신료로 이용되어 왔다. 아울러, 육두구 가종피는 상기 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)의 열매의 껍질 부분을 나타내는 것으로 헬리코박터 파일로리 균의 성장 억제 활성(In Vivo., 17;541-4, 2003), 간의 해독 작용 기작의 활성화(Food Chem . Toxicol., 31;517-21, 1993), 피부 사마귀의 화학적 예방작용(Cancer Lett., 56;59-63, 1991), 항염활성(Jpn . J. Pharmacol., 49;155-63, 1999) 등이 보고되었다. 그러나 아직까지 육두구 가종피의 PPAR과의 관계 및 항당뇨 용도에 대해서는 연구 보고된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 여러 종류의 천연물을 대상으로 하여 인슐린 저항성 당뇨병을 치료 또는 예방할 수 있는 활성 물질을 찾고자 탐색한 결과, 육두구 가종피로부터 분리된 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7, 리카린 E가 당뇨병 또는 PPARγ 매개 질환의 치료 및 예방에 효과를 가짐을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 육두구 가종피 추출물로부터 분리된 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 및 리카린 E의 당뇨병 또는 PPARγ 매개 질환의 예방 및 치료제로서의 신규 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 육두구 가종피 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7, 리카린 E 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7, 리카린 E 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 PPARγ에 의해 매개되는 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 육두구 가종피 추출물의 신규한 용도, 더 나아가서는 육두구 가종피 추출물로부터 분리된 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 및 리카린 E의 신규한 용도를 제공하는 데 그 특징이 있다.

본 발명의 항당뇨 활성을 갖는 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 및 리카린 E는 각각 하기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3의 구조를 가지는 화합물로서 종래의 물질을 추출하고 분리하는 방법을 이용하여 육두구(nutmeg)의 가종피(aril)로부터 분리정제될 수 있다.

<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>

바람직하게는 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 및 리카린 E는 통상의 추출 및 분리방법에 의하여 수득할 수 있는데, 예를 들어, 건조시킨 육두구 가종피를 4배 내지 10배의 추출 용매와 함께 추출장치에 넣고 이틀 동안 방치하여 추출하고 이를 농축기로 농축 및 건조하여 추출물을 얻는다. 본 발명에 있어 분리를 위한 추출 용매로는 물 또는 C1-C6의 유기용매를 사용할 수 있으며 바람직하게는 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 상기와 같이 얻어진 추출물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피법을 이용하여 극성에 따른 분획물을 얻고 분리된 특정 분획물을 다시 역상 컬럼 크로마토그래피법 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)법을 통하여 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 또는 리카린 E를 분리할 수 있다. 그러나 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 육두구 가종피(aril of nutmeg)는 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)의 열매의 껍질 부분을 나타내는 것으로 상기 육두구 가종피 추출물에서 분리한 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 및 리카린 E는 PPARγ에 대한 리간드로 작용하여 PPARγ을 활성화시켜며, 이러한 점은 본 발명자들에 의해 처음으로 밝혀졌다.

본 발명의 일실시예에서는 PPARγ에 결합하여 PPARγ 반응서열(PPRE, PPAR response element)을 가지는 유전자를 활성화시키는 리간드를 찾는 공지의 방법을 이용하여 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 및 리카린 E가 PPAR, 특히 PPARγ와 결합하여 이를 활성화시킨다는 것을 확인하였다(도 12 및 도 20 참조).

PPARγ가 활성화되면, PPRE(PPAR 반응 원소; PPAR response element)라는 DNA 서열에 결합함으로써 목적 유전자의 발현을 조절하며, 주로 지방대사에 관여하는 PPARγ의 목적 유전자(target gene)들의 발현이 증가한다. 따라서, 본 발명의 다른 실시예에서는 PPAR의 목적 유전자로 알려진 aP2, LPL, PEPCK 및 GLUT4의 발현이 증가하는지 알아보았다. 그 결과, 상기 PPARγ의 목적 유전자의 발현이 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 및 리카린 E 처리 시 유의적으로 증가하는 것을 알 수 있었다(도 13 및 도 21 참조).

한편, PPARγ가 활성화 될수록 지방세포의 당 수용능력이 극대화 되며 지방세포 분화가 촉진됨이 알려져 있다(Trends in Pharmacological Sciences, 25: 331-336, 2004). 따라서 본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7이 PPARγ을 활성화 시켜 지방세포분화를 촉진하는지 알아보았다. 그 결과, 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7이 전지방세포인 3T3-L1의 지방세포분화를 촉진하는 것을 확인하였다(도 14 참조).

한편, 비만/당뇨 마우스(ob/ob mouse)는 렙틴(leptin) 유전자의 결핍으로 식욕이 조절되지 않아 지속적으로 음식을 과도하게 섭취하게 된다. 그 결과, 지방이 체내에 과도하게 축적되며 출생 후 약 3개월 정도가 되면 일반적인 마우스 체중의 2배에 달하는 50g 내외를 유지하게 된다. 또한 일반 마우스에 비하여 높은 혈당을 가지는 전형적인 제 2 형 당뇨병의 모델이 된다(Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 109: 307-319, 2001). 이러한 비만/당뇨 마우스는 항비만 및 항당뇨 예방 및 치료제를 탐색 하거나 항비만 및 항당뇨 효능을 평가하는데 쓰이는 대표적인 실험 동물모델이다. 따라서, 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 및 리카린 E가 비만/당뇨 마우스 모델에서의 작용을 확인하였다. 그 결과 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 및 리카린 E는 비만/당뇨 마우스 모델에서 유의 있게 혈당을 감소시킴으로서 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병 억제 효과가 있음을 시사하였다.

따라서, 이와 같이 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 및 리카린 E가 PPAR의 리간드, 특히 인슐린 민감도를 증가시키는 PPARγ의 리간드이며, 비만/당뇨 마우스 모델에서 유의 있게 체중과 혈중 중성지방을 감소시킴으로서 비만과 대사성 질환인 고지혈증 및 심장 혈관 질환에 대한 억제 효과가 있고, 혈당을 감소시킴으로서 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병 억제 효과가 있음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명은 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7, 리카린 E 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7, 리카린 E 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 PPARγ에 의해 매개되는 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기에서 본 발명의 “PPARγ에 의해 매개되는 질환”이란 PPARγ의 활성화로 인해 증상이 예방, 치료, 경감 또는 완화되는 질환을 의미한다. 바람직하게 상기 PPARγ에 의해 매개되는 질병은 이에 한정되지는 않으나, 제2형 당뇨병(NIDDM; non-insulin-dependent diabetes mellitus), 고인슐린증(hyperinsulinemia), 비만(obesity), 고혈당증(hyperglycemia), 고지질증(hyperlipidemia), X 증후군(syndrome X), 고콜레스테롤증(hypercholesterolemia), 고지질단백질증(hyperlipoproteinemia), 동맥경화증(atherosclerosis), 고혈압(hypertension), 인슐린 저항성(insulin resistance), 대사이상증후군(dysmetabolic syndrome), 당뇨합병증(diabetic complications), 당 항상성 손상(impaired glucose homeostasis), 내당능 손상(impaired glucose tolerance), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 골다공증(osteoporosis; J. Biol . Chem. 275: 14388- 14393, 2000), 사구체신염(glomerulonephritis; Kidney Int., 60: 14-30, 2001) 또는 당뇨병으로 인한 신장병(Kidney Int., 60: 14-30, 2001)이다.

본 발명에 따른 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 및 리카린 E는 그 자체 또는 염, 바람직하게는 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기에서 ‘약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 상기 염으로는 약제학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에서의 당뇨병은 이에 한정되지는 않으나, 제2형 당뇨병을 말하며, 당뇨병 치료의 목적으로 임상적으로 투여되는 경우에 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여에 적합한 단위투여형의 약제학적 제형으로 제제화시켜 사용할 수 있다. 일반적인 의약품의 형태로 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 또는 리카린 E에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 연고제, 크림제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 또는 리카린 E를 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다. 투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법 및 배설 그리고 약제 혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화시킬 수 있다.

이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 또는 리카린 E를 래트(rat)에 경구 투여시의 독성 실험을 수행한 결과, 경구 독성시험에 의한 50 % 치사량 (LD₅₀)은 2,000 mg/kg 이상인 것으로 나타났다.

따라서, 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 및 리카린 E는 육두구 가종피(aril of nutmeg)의 추출물에서 분리된 화합물이고, 상기 화합물과 육두구 가종피 추출물은 PPARγ의 리간드로 작용하여 PPARγ을 활성화하므로 PPARγ에 의해 매개되는 당뇨병 및 당뇨합병증과 같은 질환을 예방 및 치료하는 목적으로 사용할 수 있다. 또한 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7, 리카린 E와 육두구 가종피(aril of nutmeg) 추출물도 혈당을 감소시켜 당뇨병 예방제 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또한 모든 활성 분석은 모두 3회 이상 반복 수행하였으며 그 결과는 평균 ± 표준편차로 표시하였다.

< 실시예 1>

육두구 가종피로부터 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판(2-(4-allyl-2,6-dimethoxyphenoxy)-1-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl)-propane) 및 아우스트로바이리그난 7(austrobailignan 7)의 분리 · 정제 및 구조결정

<1-1> 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7의 분리 및 정제

건조 분쇄한 육두구 가종피(aril of nutmeg) 100 g에 75% 메탄올 400 ㎖을 가하여 상온에서 이틀 동안 방치하였다. 추출된 용액을 여과하고 진공 농축하여 육두구 가종피 메탄올 추출물(13.26g)을 제조하였으며, 상기 추출물을 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 분획하였다. 에틸아세테이트 분획물(10.29 g)을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 클로로포름과 에틸아세테이트를 9:1(v/v)의 비율로 혼합한 용매로 용출시켜 분획물 Ⅴ(0.52)과 분획물 Ⅵ(0.19 g)를 얻었다. 분획물 Ⅴ를 클로로포름과 에틸아세테이트와 아세톤 24:0.3:1(v/v/v)의 비율로 혼합한 용매로 컬럼 크로마토그래피하여 분획물 Ⅴ-C(0.05 g)을 얻었다. 이후, 분획물 Ⅴ-C를 리싸이클링 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 100% 메탄올로 용출시켜 단일물질 분획 Ⅴ-C-2(0.03 g, 하기 <실시예 1-2>에서 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판으로 확인)를 얻었다. 또한 분획물 Ⅵ를 클로로포름과 에틸아세테이트와 아세톤 30:1:2(v/v/v)의 비율로 혼합한 용매로 컬럼 크로마토그래피하여 분획물 Ⅵ-B(0.52 g)을 얻었다. 이후, 분획물 Ⅵ-B를 리싸이클링 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 100% 메탄올로 용출시켜 단일물질 분획 Ⅵ-B-5(0.011 g, 하기 <실시예 1-3>에서 아우스트로바이리그난 7로 확인)를 얻었다. 이와 같은 분리 공정도를 도 1에 나타내었다.

<1-2> 단일물질 Ⅴ-C-2의 구조분석

상기 분리된 단일물질 Ⅴ-C-2의 구조를 결정하기 위하여 ¹H-NMR 스펙트럼과 ¹³C-NMR 스펙트럼을 각각 600MHz 와 150MHz(용매: CDCl₃)에서 측정하였다. 그 결과를 도 2와 도 3에 각각 나타내었다. ¹H-NMR과 ¹³C-NMR의 결과를 종합적으로 분석하여 표 1에 나타내었다.

Position	¹³C-NMR	¹H-NMR
1	134.5
2	112.4	6.77 (1H, d)
3	146.3	3.82 (3H, s, 3-OMe)
4	144.0	5.48 (1H, s, -OH)
5	114.1	6.82 (1H, d)
6	122.3	6.70 (1H, dd)
α	43.0	2.72 (1H, dd) 3.12 (1H, dd)
β	79.8	4.33 (1H, dd)
γ	19.6	1.20 (3H, d)
1'	135.6
2'	153.8	3.80 (6H, s)
3'	105.7	6.40 (2H, d',5'-H)
4'	131.2
5'	105.7	6.40 (2H, 3',5'-H)
6'	153.8	3.80 (6H, s, 2'-OMe, 6'-OMe)
α	40.5	3.34 (2H, d)
β	137.4	5.92-6.02 (1H, m)
γ	115.8	5.07-5.15 (2H, m)
-OMe	56.0 56.2

¹³C-NMR 스펙트럼과 ¹H-NMR 스펙트럼의 결과를 토대로 ¹H-¹H의 상관관계와 ¹H-¹³C의 상관관계를 측정하기 위하여 ¹H-¹H COSY 스펙트럼과 ¹H-¹³C HMBC 스펙트럼을 측정하였다. 그 결과를 도 4와 도 5에 각각 나타내었다. 상기 분리된 단일물질의 질량 분석을 위해 측정한 FAB/MS의 결과를 도 6에 나타내었다. 본 화합물은 FAB/MS에서 [M]⁺가 m/z 358에서 관측되어 분자량이 358로 판명되었고, 분자식은 C₂₁H₂₆O₅이었다.

이상의 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, ¹H-¹H COSY, ¹H-¹³C HMBC 및 FAB/MS에 대한 결과와 기존에 기재된 참고문헌(Chem . Pharm . Bull ., 35: 668, 1987)을 통해, 분리된 단일 물질은 하기 화학식 1로 표시되는 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판인 것으로 확인되었다.

<화학식 1>

<1-3> 단일물질 Ⅵ-B-5의 구조분석

상기 분리된 단일물질 Ⅵ-B-5의 구조를 결정하기 위하여 ¹H-NMR 스펙트럼과 ¹³C-NMR 스펙트럼을 각각 600MHz 와 150MHz(용매: CDCl₃)에서 측정하였다. 그 결과를 도 7와 도 8에 각각 나타내었다. ¹H-NMR과 ¹³C-NMR의 결과를 종합적으로 분석하여 표 2에 나타내었다.

Position	¹³C-NMR	¹H-NMR
1	137.4
2	108.9	6.92 (1H,d)
3	148.1
4	147.1
5	106.7	6.78 (1H, d)
6	119.8	6.82 (1H, dd)
α	85.9	4.61 (1H, d)
β	43.7	2.39-2.43 (2H, m)
γ	12.0	1.00 (3H, d)
1'	132.7
2'	119.0	6.91 (1H, d)
3'	114.2
4'	144.5	5.54 (1H, s, -OH)
5'	146.5	6.88 (1H, d)
6'	108.2	6.77 (1H, dd)
α'	85.0	5.42 (1H, d)
β'	47.9	2.39-2.43 (2H, m)
γ'	9.6	0.61 (3H, d)
-OMe	56.2	3.89 (3H, s)
-OCH₂O-	101.1	5.94 (1H, d) 5.95 (1H, d)

¹³C-NMR 스펙트럼과 ¹H-NMR 스펙트럼의 결과를 토대로 ¹H-¹H의 상관관계와 ¹H-¹³C의 상관관계를 측정하기 위하여 ¹H-¹H COSY 스펙트럼과 ¹H-¹³C HMBC 스펙트럼을 측정하였다. 그 결과를 도 9와 도 10에 각각 나타내었다. 상기 분리된 단일물질의 질량 분석을 위해 측정한 FAB/MS의 결과를 도 11에 나타내었다. 본 화합물은 FAB/MS에서 [M]⁺가 m/z 342에서 관측되어 분자량이 342로 판명되었고, 분자식은 C₂₀H₂₂O₅이었다.

이상의 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, ¹H-¹H COSY, ¹H-¹³C HMBC 및 FAB/MS에 대한 결과와 기존에 기재된 참고문헌(Aust. J. Chem., 28: 81, 1975)을 통해, 분리된 단일 물질은 하기 화학식 2로 표시되는 아우스트로바이리그난 7인 것으로 확인되었다.

<화학식 2>

<1-4> 리카린 E( licarin E)의 분리 및 정제

건조 분쇄한 육두구 가종피 100 g에 100% 에탄올 400 ㎖을 가하여 상온에서 5일 동안 방치하였다. 추출된 용액을 여과하고 진공 농축하여 육두구 가종피 에탄올 추출물(26.61 g)을 제조하였으며, 상기 추출물을 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 분획하였다. 에틸아세테이트 분획물(18.44 g)을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 클로로포름과 에틸아세테이트를 9:1(v/v)의 비율로 혼합한 용매로 용출시켜 분획물 II(3.04 g)을 얻었다. 분획물 II를 클로로포름과 핵산과 에틸아세테이트와 아세톤 15:10:0.1:0.1 (v/v/v/v)의 비율로 혼합한 용매로 컬럼 크로마토그래피하여 분획물 II-B(0.4 g)을 얻었다. 이후, 분획물 II-B를 리싸이클링 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 100% 메탄올로 용출시켜 단일물질 분획인 II-B-2(0.016 g, 하기 <실시예 1-5>에서 리카린 E로 확인)를 얻었다. 이와 같은 분리 공정도를 도 15에 나타내었다.

<1-5> 단일물질 II -B-2의 구조분석

상기 분리된 단일물질 II-B-2의 구조를 결정하기 위하여 ¹H-NMR 스펙트럼과 ¹³C-NMR 스펙트럼을 600MHz(용매: CDCl₃)에서 측정하였다. 그 결과를 도 17와 도 18에 각각 나타내었다. ¹H-NMR과 ¹³C-NMR의 결과를 종합적으로 분석하여 표 3에 나타내었다.

Carbon No.`	δ_C	δ_Η
1
2	93.0
3	45.5	1.35 (3H, d, 7-OMe)
3a	132.7	5.48 (1H, s, -OH)
4	113.0	6.82 (1H, d)
5	131.8	6.70 (1H, dd)
6	109.2	5.15 (d, 9)
7	143.7	3.2-3.7 (m)
7a	146.2	1.35 ( 3H, d, 7)
3-Me	17.6	5.92
OMe	55.7
1'	134.0
2'	106.3	3.80 (6H, s)
3'	147.5	3.88 (s)
4'	147.2
5'	107.7	6.40 (2H, 3', 5'-H)
6'	119.7	3.80 (6H, s, 2'-OMe, 6'-OMe)
α	130.6	3.34 (2H, d)
β	122.9	5.92-6.02 (1H, m)
γ	18.1	1.84 (3H, d, 5)

¹³C-NMR 스펙트럼과 ¹H-NMR 스펙트럼의 결과를 토대로 ¹³C-DEPT 스펙트럼을 측정하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다. 상기 분리된 단일물질의 질량 분석을 위해 측정한 FAB/MS의 결과를 도 16에 나타내었다. 본 화합물은 FAB/MS에서 [M]⁺가 m/z 324에서 관측되어 분자량이 324로 판명되었고, 분자식은 C₂₀H₂₀O₄이었다.

이상의 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, ¹³C-DEPT 및 FAB/MS에 대한 결과와 기존에 기재된 참고문헌(J. Chromatogr. 110, 91-102)을 통해, 분리된 단일 물질은 하기 화학식 3으로 표시되는 리카린 E(licarin E)인 것으로 확인되었다.

<화학식 3>

< 실시예 2>

2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7에 의한 PPARγ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor γ)의 활성화

2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7이 PPARγ의 리간드로 작용하는 지 알아보기 위하여, PPARγ를 발현하는 플라스미드와 PPRE(peroxisome proliferator responsive element) 통제하에 있는 루시퍼라제(luciferase) 유전자를 갖는 벡터를 사용한 공지의 방법(Cell, 68: 879-887, 1992; J. Biol. Chem., 272: 25252-25259, 1997)에 따라 수행하였다.

루시퍼라제 발현의 활성화는 COS-7 원숭이 신장세포(ATCC CRL-1651)를 PPARγ 플라스미드와 pFR-루시퍼라제 벡터(Stratagene, USA)로 형질감염 시킨 후 상기 실시예 1에서 분리한 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7을 24시간 처리하여 측정하였다. 상기 PPARγ 플라스미드는 사람의 PPARγ(Genbank Acession No. NM_138712)의 전체 아미노산 서열 중 PPARγ 리간드 결합 도메인인 아미노산 서열 176번부터 477번까지의 아미노산을 암호화하는 염기서열을 서열번호 1(TCGGTTTAAGATTCATCTTTATT) 및 서열번호 2(GTCTCCGGTACCTTGATCACCTGC)의 프라이머를 이용한 RT-PCR을 수행하여 수득한 후 pFA벡터(Stratagene, USA)의 XbaI와 KpnI의 제한효소부위에 클로닝하여 제조하였다. RT-PCR은 역전사효소를 이용하여 42℃에서 60분간 cDNA를 합성한 다음, Taq 중합효소를 이용하여 95℃에서 1분, 54℃ 30초, 72℃에서 2분을 30번 반복하여 수행하였다. 이 때 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7을 농도별(3, 5 및 10 μM)로 함께 처리한 실험군과 DMSO(Dimethyl Sulfoxide) 0.01% 처리한 대조군 및 PPARγ 리간드로서 공지된 화합물인 트로글리타존(Sigma, USA)을 5 μM로 함께 처리한 것을 비교하였다.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7은 PPARγ 활성을 농도 의존적으로 증가 시켰고, 처리한 모든 농도에서 대조군과 비교 했을 때 유의적인 차이(**, p < 0.01)를 보였다. 예를 들어, 5 μM을 각각 처리하였을 때, 비교화합물인 트로글리타존의 활성은 대조군에 비해 약 10 배 높았고, 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7에 의해 유도된 루시퍼라제 활성은 각각 대조군보다 약 6.6 배, 약 3.1 배 높았다. 이는 본 발명의 천연물질인 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7이 PPARγ의 리간드로써 PPARγ를 활성화 시켰을 뿐 아니라 공지된 PPARγ의 리간드인 합성물질 트로글리타존와 비슷한 활성을 나타내어 효율적으로 PPARγ를 활성화시킴을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7의 PPARγ 활성화에 따른 목표유전자의 발현 확인

10% FBS(Fetal bovine serum)가 포함된 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 배지에서 배양된 3T3-L1 마우스 전지방세포(ATCC CL-173)를 1× 10⁶개씩 분주하여 5시간동안 추가로 배양하였다. 배양된 세포의 배지에 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7을 5 및 10 μM로 첨가하여 24시간 방치하였다. 배양한 세포는 MDI (0.5 mM 3-isobutyl-1-metylxanthine, 0.5 uM dexamethasone, 10 ug/ml insulin) 배지로 배지를 갈아주어 지방세포 분화를 유도시켰다(Am. J. Physiol. Cell Physiol., 280: C807-C813, 2001). MDI 배지를 넣어준 시점부터 2일 후 세포를 수득하고, 트리졸(TRIZOL; Invitrogen, USA)을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 총 RNA는 정량한 후 각 시료별 동일량의 RNA를 역전사효소를 이용하여 42℃에서 20분간 cDNA를 합성하였다. 이를 각각 aP2 증폭용 프라이머(서열번호 3(ACAGCTCCTCCTCGAAGG) 및 서열번호 4(GCGTAAATGGGGATTTGGTCA)), LPL 증폭용 프라이머(서열번호 5(TATCCGCGTGATTGCAGAGA) 및 서열번호 6(AGAGAGTCGATGAAGAGATGAATGG)), PEPCK 증폭용 프라이머(서열번호 7(CAGGCGGCTGAAGAAGTATGA) 및 서열번호 8(AACCGTCTTGCTTTCGATCCT)) 및 GLUT4증폭용 프라이머(서열번호 9(ATCCATGGATGGACGGTAACG) 및 서열번호 10(CTGGATCCCAATACTTCGACCA))와 Taq Polymerase를 이용하여 95℃에서 1분, 56℃ 30초, 72℃에서 2분을 30번 반복하여 RT-PCR을 실시하였다.

그 결과, 도 13에서 보는 바와 같이, PPARγ에 의해 발현이 증가되는 목표유전자인 aP2, LPL, PEPCK 및 GLUT4의 mRNA 발현이 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7의 처리농도에 비례하여 모든 실험군에서 대조군에 비해 유의적으로(**, p < 0.01; *, p < 0.05) 증가함을 확인하였다. 이는 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7이 PPARγ을 활성화시켜 PPARγ의 목표 유전자들의 발현을 조절할 수 있음을 의미한다.

< 실시예 4>

2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7의 PPARγ활성화에 따른 지방세포분화 촉진 확인

10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양된 3T3-L1 마우스 전지방세포를 1× 10⁶개씩 5시간동안 배양하였다. 배양된 세포 중에 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7 10 μM을 첨가하여 24시간 방치하였다. 배양한 세포는 MDI (0.5 mM 3-isobutyl-1-metylxanthine, 0.5 uM dexamethasone, 10 ug/ml insulin) 배지로 배지를 갈아주어 지방세포 분화를 유도시켰다(Am. J Physiol. Cell Physiol., 280: C807-C813, 2001). MDI 배지를 넣어준 시점부터 2일 후 세포의 형태를 광학현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 14에서 보는 바와 같이, 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7을 처리한 군(10μM)은 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7 대신 0.01% DMSO를 처리한 대조군과 트로글리타존 10μM를 처리한 군에 비해 지방세포의 분화가 촉진되었음 알 수 있었다. 이는 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7이 PPARγ를 활성화 시켜 지방세포의 당 흡수를 극대화하여 지방세포분화를 촉진시켰음을 의미한다.

< 실시예 5>

비만/당뇨 마우스 모델에서 2-(4-알릴-2,6- 디메톡시페녹시 )-1-(4-히드록시-3- 메톡시페닐 )-프로판의 항당뇨효과 검정

당뇨 모델동물로서 이용된 비만/당뇨 마우스(ob/ob mouse)는 렙틴(leptin) 유전자의 결핍으로 식욕이 조절되지 않아 지속적으로 음식을 과도하게 섭취하게 된다. 그 결과, 지방이 체내에 과도하게 축적되며 일반 마우스에 비하여 높은 혈당을 가지는 전형적인 제2형 당뇨병의 모델이 된다. 따라서, 당뇨예방 및 치료효과를 알아보기 위하여 성숙한 10 주령의 비만/당뇨 마우스를 실험군 마다 각각 4마리씩 사용하였고, 실험군으로는 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판을 옥수수 기름에 희석하여 20 mg/kg의 투여농도로 1일 1회씩 10일 동안 일정한 시간에 투여하고, 대조군의 경우는 동일량의 옥수수 기름만을 투여하였다. 투여시작 후 10일째에 실험군과 대조군의 혈당을 측정하여 분석하였다.

경구 투여시작 10 일후에 실험군과 대조군의 혈당을 측정한 결과, 대조군의 경우 혈당이 456.23 ± 15.27 mg/dl로 정상 마우스의 혈당 226.68 ± 13.26 mg/dl에 비해 고혈당으로 유지되는 것과 비교하여, 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판을 처리한 군은 316.95 ± 22.76 mg/dl로 유의하게(*, p < 0.01) 혈당이 30.53% 감소하는 현상을 보여 당뇨의 예방 및 치료효과를 관찰할 수 있었다.

< 실시예 6>

비만/당뇨 마우스 모델에서 아우스트로바이리그난 7의 항당뇨효과 검정

당뇨예방 및 치료효과를 알아보기 위하여 성숙한 10 주령의 비만/당뇨 마우스를 실험군 마다 각각 4마리씩 사용하였고, 실험군으로는 아우스트로바이리그난 7을 옥수수 기름에 희석하여 20 mg/kg의 투여농도로 1일 1회씩 10일 동안 일정한 시간에 투여하고, 대조군의 경우는 동일량의 옥수수 기름 만을 투여하였다. 투여시작 후 10일째에 실험군과 대조군의 혈당을 측정하여 분석하였다.

경구 투여시작 10 일후에 실험군과 대조군의 혈당을 측정한 결과, 대조군의 경우 혈당이 456.23 ± 15.27 mg/dl로 정상 마우스의 혈당 226.68 ± 13.26 mg/dl에 비해 고혈당으로 유지되는 것과 비교하여, 아우스트로바이리그난 7을 처리한 군은 352.95 ± 19.54mg/dl로 유의하게(*, p < 0.01) 혈당이 22.64% 감소하는 현상을 보여 당뇨의 예방 및 치료효과를 관찰할 수 있었다.

< 실시예 7>

리카린 E에 의한 PPAR γ의 활성화

리카린 E(licarin E)가 PPARγ의 리간드로 작용하는 지 알아보기 위하여, PPARγ를 발현하는 플라스미드와 PPRE 통제하에 있는 루시퍼라제(luciferase) 유전자를 갖는 벡터를 사용한 공지의 방법(Cell , 68: 879-887, 1992; J. Biol . Chem ., 272: 25252-25259, 1997) 및 실시예 2에 기재된 방법에 따라 수행하였다.

루시퍼라제 발현의 활성화는 COS-7 원숭이 신장세포(ATCC CRL-1651)를 PPARγ플라스미드와 pFR-luciferase 벡터(Stratagene, USA)로 형질감염 시킨 후 상기 실시예 1에서 분리한 리카린 E를 24시간 처리하여 측정하였다. RT-PCR은 역전사효소를 이용하여 42℃에서 60분간 cDNA를 합성한 다음, Taq 중합효소를 이용하여 95℃에서 1분, 54℃ 30초, 72℃에서 2분을 30번 반복하여 수행하였다. 이 때 본 발명의 리카린 E(licarin E)를 농도별(5, 10 및 25 μM)로 함께 처리한 실험군과 DMSO 0.01% 처리한 대조군 및 PPARγ 리간드로서 공지된 화합물인 트로글리타존(Sigma, USA)을 10 μM로 함께 처리한 것을 비교하였다.

그 결과, 도 20에 나타난 바와 같이 리카린 E는 PPARγ 활성을 농도 의존적으로 증가시켰고, 처리한 모든 농도에서 대조군과 비교 했을 때 유의적인 차이(**, p < 0.05)를 보였다. 예를 들어, 5 μM을 각각 처리하였을 때, 비교화합물인 트로글리타존의 활성은 대조군에 비해 약 10 배 높았고, 본 발명의 리카린 E(licarin E)에 의해 유도된 루시퍼라제 활성은 각각 대조군보다 약 5 배, 약 8 배 높았다. 이는 본 발명의 천연물질인 리카린 E(licarin E)가 PPARγ의 리간드로써 PPARγ를 활성화 시켰을 뿐 아니라 공지된 PPARγ의 리간드인 합성물질 트로글리타존와 비슷한 활성을 나타내어 효율적으로 PPARγ를 활성화시킴을 알 수 있었다.

< 실시예 8>

리카린 E( licarin E)의 PPAR γ 활성화에 따른 목표유전자의 발현 확인

10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양된 3T3-L1 마우스 전지방세포(ATCC CL-173)를 1× 10⁶개씩 분주하여 5시간동안 추가로 배양하였다. 배양된 세포의 배지에 리카린 E를 10 μM로 첨가하여 24시간 방치하였다. 배양한 세포는 MDI (0.5 mM 3-isobutyl-1-metylxanthine, 0.5 uM dexamethasone, 10 ug/ml insulin) 배지로 배지를 갈아주어 지방세포 분화를 유도시켰다(Am . J. Physiol. Cell Physiol ., 280: C807-C813, 2001). MDI 배지를 넣어준 시점부터 2일 후 세포를 수득하고, 트리졸(TRIZOL; Invitrogen, USA)을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 총 RNA는 정량한 후 각 시료별 동일량의 RNA를 역전사효소를 이용하여 42℃에서 20분간 cDNA를 합성하였다. 이를 각각 서열번호 3 및 서열번호 4의 aP2 중폭용 프라이머 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 LPL 증폭용 프라이머와 Taq Polymerase를 이용하여 95℃에서 1분, 56℃ 30초, 72℃에서 2분을 30번 반복하여 RT-PCR을 실시하였다.

그 결과, 도 21에서 보는 바와 같이, PPARγ에 의해 발현이 증가되는 목표유전자인 aP2, LPL의 mRNA 발현이 II-B-2의 처리농도에 비례하여 모든 실험군에서 대조군에 비해 유의적으로(**, p < 0.01) 증가함을 확인하였다. 이는 본 발명의 리카린 E가 PPARγ을 활성화시켜 PPARγ의 목표 유전자들의 발현을 조절할 수 있음을 의미한다.

< 실시예 9>

비만/당뇨 마우스 모델에서 리카린 E의 항당뇨효과 검정

당뇨예방 및 치료효과를 알아보기 위하여 성숙한 10 주령의 비만/당뇨 마우스를 실험군 마다 각각 4마리씩 사용하였고, 실험군으로는 리카린 E를 옥수수 기름에 희석하여 20 mg/kg의 투여농도로 1일 1회씩 10일 동안 일정한 시간에 투여하고, 대조군의 경우는 동일량의 옥수수 기름 만을 투여하였다. 투여시작 후 10일째에 실험군과 대조군의 혈당을 측정하여 분석하였다.

경구 투여시작 10 일후에 실험군과 대조군의 혈당을 측정한 결과, 대조군의 경우 혈당이 456.23 ± 15.27 mg/dl로 정상 마우스의 혈당 226.68 ± 13.26 mg/dl에 비해 고혈당으로 유지되는 것과 비교하여, 리카린 E를 처리한 군은 316.95 ± 22.76 mg/dl로 유의하게(*, p < 0.01) 혈당이 30.53% 감소하는 현상을 보여 당뇨의 예방 및 치료효과를 관찰할 수 있었다.

< 실시예 10>

비만/당뇨 마우스 모델에서 육두구 가종피의 에탄올 추출물의 항당뇨효과 검정

건조 분쇄한 육두구 가종피(aril of nutmeg) 100 g에 에탄올 400 ㎖을 가하여 상온에서 이틀 동안 방치하였다. 추출된 용액을 여과하고 진공 농축하여 육두구 에탄올 추출물(14.29 g)을 제조하였다.

상기 제조된 에탄올 추출물에 대하여 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 비만/당뇨 마우스 모델에서 항당뇨효과를 검정한 결과, 대조구에 비하여 혈당이 37.6% 감소하였다.

< 실시예 11>

비만/당뇨 마우스 모델에서 육두구 가종피의 헥산 추출물의 항당뇨효과 검정

건조 분쇄한 육두구 가종피(aril of nutmeg) 100 g에 헥산(hexane) 400 ㎖을 가하여 상온에서 이틀 동안 방치하였다. 추출된 용액을 여과하고 진공 농축하여 육두구 헥산 추출물(16.78 g)을 제조하였다.

상기 제조된 헥산 추출물에 대하여 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 비만/당뇨 마우스 모델에서 항당뇨효과를 검정한 결과, 대조구에 비하여 혈당이 32.9% 감소하였다.

< 제조예 1>

본 발명에 따른 당뇨병 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 함유하는 약제의 제조

<1-1> 정제의 제조

본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7, 리카린 E 또는 육두구 가종피 추출물 25㎎을 부형제 직타용 락토오스 26㎎과 아비셀(미결정 셀룰로오스) 3.5㎎, 붕해 보조제인 나트륨 전분 글리코네이트 1.5㎎, 그리고 결합제인 직타용 L-HPC(low-hydrosyprophylcellulose) 8㎎과 함께 U형 혼합기에 넣고 20분간 혼합하였다. 혼합이 완료된 후 활탁제로서 마그네슘 스테아레이트 1㎎을 추가로 첨가하고 3분간 혼합하였다. 정량 시험과 항습도 시험을 거쳐 타정하고 필름 코팅하여 정제를 제조하였다.

<1-2> 시럽제의 제조

본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7, 리카린 E 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분 2%(W/V)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7의 산부가염 2g, 사카린 0.8g 및 당 25.4g을 온수 80g에 용해시켰다. 상기 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린 8.0g, 향미료 0.04g, 에탄올 4.0g, 소르브산 0.4g 및 적량의 증류수를 혼합하였다. 상기 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되도록 하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7, 리카린 E 또는 육두구 가종피 추출물 50㎎, 유당 50㎎, 전분 46.5㎎, 탈크 1㎎ 및 적량의 스테아린산 마그네슘을 혼합하고 이를 경질 젤라틴 캡슐에 충진함으로써 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 주사액제의 제조

유효성분 10㎎을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 또는 리카린 E의 염산염 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 제조하였다. 상기 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7 및 리카린 E는 육두구 가종피(aril of nutmeg)의 추출물에서 분리된 화합물이고, 상기 화합물과 육두구 가종피 추출물은 PPARγ의 리간드로 작용하여 PPARγ을 활성화하므로 PPARγ에 의해 매개되는 당뇨병 및 당뇨합병증과 같은 질환을 예방 및 치료하는 목적으로 사용할 수 있다. 또한 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판, 아우스트로바이리그난 7, 리카린 E와 육두구 가종피(aril of nutmeg) 추출물도 혈당을 감소시켜 당뇨병 예방제 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 육두구 가종피(aril of nutmeg)로부터 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7을 분리하는 공정도이다.

도 2는 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.

도 3은 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.

도 4는 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼이다.

도 5는 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판의 ¹H-¹³C HMBC 스펙트럼이다.

도 6은 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판의 FAB/Mass 스펙트럼이다.

도 7은 본 발명의 아우스트로바이리그난 7의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.

도 8는 본 발명의 아우스트로바이리그난 7의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.

도 9는 본 발명의 아우스트로바이리그난 7의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼이다.

도 10은 본 발명의 아우스트로바이리그난 7의 ¹H-¹³C HMBC 스펙트럼이다.

도 11은 본 발명의 아우스트로바이리그난 7의 FAB/Mass 스펙트럼이다.

도 12는 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7이 농도별로 PPARγ을 활성화 시키는 효과를 측정한 그래프이다.

도 13은 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7이 PPARγ의 목표 유전자의 발현을 증가시키는 효과를 측정한 결과이다.

A : aP2

B : LPL

C : PEPCK

D : GLUT4

도 14는 본 발명의 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 및 아우스트로바이리그난 7이 3T3-L1 쥐 섬유아세포의 지방세포 분화를 촉진시킨 결과이다.

도 15는 육두구 가종피(aril of nutmeg)로부터 리카린 E를 분리하는 공정도이다.

도 16은 본 발명의 리카린 E의 FAB/Mass 스펙트럼이다.

도 17은 본 발명의 리카린 E의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.

도 18은 본 발명의 리카린 E의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.

도 19는 본 발명의 리카린 E의 ¹³C-DEPT 스펙트럼이다.

도 20은 본 발명의 리카린 E가 농도별로 PPARγ을 활성화 시키는 효과를 측정한 그래프이다.

도 21은 본 발명의 리카린 E가 PPARγ의 목표 유전자의 발현을 증가시키는 효과를 측정한 결과이다.

A : LPL

B : aP2

<110> HWANG, Jae-kwan <120> Pharmaceutical composition for preventing and treating diabetes or PPAR-gamma-mediated disease comprising compounds extracted from aril of nutmeg as an active ingredient <130> NP08-0022 <150> KR 10-2007-0060176 <151> 2007-06-20 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 1 tcggtttaag attcatcttt att 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 2 gtctccggta ccttgatcac ctgc 24 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aP2 primer 1 <400> 3 acagctcctc ctcgaagg 18 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aP2 primer 2 <400> 4 gcgtaaatgg ggatttggtc a 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPL primer 1 <400> 5 tatccgcgtg attgcagaga 20 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPL primer 2 <400> 6 agagagtcga tgaagagatg aatgg 25 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPCK primer 1 <400> 7 caggcggctg aagaagtatg a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPCK primer 2 <400> 8 aaccgtcttg ctttcgatcc t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLUT4 primer 1 <400> 9 atccatggat ggacggtaac g 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLUT4 primer 2 <400> 10 ctggatccca atacttcgac ca 22

Claims

육두구 가종피(aril of nutmeg)의 탄소수 1 내지 6을 가지는 유기용매 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 탄소수 1 내지 6을 가지는 유기용매는 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane)으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판(2-(4-allyl-2,6-dimethoxyphenoxy)-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-propane) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.

<화학식 1>
하기 화학식 2로 표시되는 아우스트로바이리그난 7(austrobailignan 7) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.

<화학식 2>
하기 화학식 3로 표시되는 리카린 E(licarin E) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.

<화학식 3>
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 2-(4-알릴-2,6-디메톡시페녹시)-1-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-프로판 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 제2형 당뇨병(NIDDM; non-insulin-dependent diabetes mellitus), 고인슐린증(hyperinsulinemia), 비만(obesity), 고혈당증(hyperglycemia), 고지질증(hyperlipidemia), 고콜레스테롤증(hypercholesterolemia), 고지질단백질증(hyperlipoproteinemia), 동맥경화증(atherosclerosis), 고혈압(hypertension), 인슐린 저항성(insulin resistance), 당 항상성 손상(impaired glucose homeostasis), 내당능 손상(impaired glucose tolerance), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 골다공증(osteoporosis), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 당뇨신장병으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor γ)에 의해 매개되는 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.

<화학식 1>
하기 화학식 2로 표시되는 아우스트로바이리그난 7 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 제2형 당뇨병(NIDDM; non-insulin-dependent diabetes mellitus), 고인슐린증(hyperinsulinemia), 비만(obesity), 고혈당증(hyperglycemia), 고지질증(hyperlipidemia), 고콜레스테롤증(hypercholesterolemia), 고지질단백질증(hyperlipoproteinemia), 동맥경화증(atherosclerosis), 고혈압(hypertension), 인슐린 저항성(insulin resistance), 당 항상성 손상(impaired glucose homeostasis), 내당능 손상(impaired glucose tolerance), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 골다공증(osteoporosis), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 당뇨신장병으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 PPARγ에 의해 매개되는 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.

<화학식 2>
하기 화학식 3으로 표시되는 리카린 E 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 제2형 당뇨병(NIDDM; non-insulin-dependent diabetes mellitus), 고인슐린증(hyperinsulinemia), 비만(obesity), 고혈당증(hyperglycemia), 고지질증(hyperlipidemia), 고콜레스테롤증(hypercholesterolemia), 고지질단백질증(hyperlipoproteinemia), 동맥경화증(atherosclerosis), 고혈압(hypertension), 인슐린 저항성(insulin resistance), 당 항상성 손상(impaired glucose homeostasis), 내당능 손상(impaired glucose tolerance), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 골다공증(osteoporosis), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 당뇨신장병으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 PPARγ에 의해 매개되는 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.

<화학식 3>
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