KR100946562B1 - 원화 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는암 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 원화 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 원화 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 여러 종류의 사람 암세포에 대하여 세포 독성을 나타내며 특히 사람 폐암세포에 대하여 선택적인 성장 억제 활성을 지니며 정상세포의 성장에는 큰 영향을 미치지 않는 우수한 항암 활성을 가지고 있음을 확인함으로서, 암 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

원화, 암, 폐암, 약학조성물, 건강기능식품.

Description

원화 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 조성물 {Composition comprising the compound isolated from the flower extract of daphne genkwa for preventing and treating cancer disease}

본 발명은 원화 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] Folksman et al., Science, 235, pp. 442-447, 1987

[문헌 2] Cordell et al., Bioactive Natural Products, CRS Press, pp.195-220, 1993

[문헌 3] Blume-Jensen and Hunter, Nature, 411, pp. 355-365, 2001

[문헌 4] 정보섭 및 신민교, 항약대사전, 영림사, pp740-741, 1998

[문헌 5] Kai et al., Yakugaku Zasshi, 124, pp. 349-354, 2004

[문헌 6] Zhan et al., Bioorgan Med Chem 13, pp. 645-55, 2005

[문헌 7] Lee et al., Chemico-Biol Interact 115, pp. 215-228, 1998

암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이며, 우리나라의 경우, 질병 사망 원인 중 제 1위의 질병으로서 연간 약 10만 명 이상이 진단되고, 약 6 만 명 이상이 사망하고 있다. 이러한 암의 유발 인자인 발암물질로는 흡연, 자외선, 화학 물질, 음식물, 기타 환경인자들이 있으나, 그 유발 원인이 다양하여 치료제의 개발이 어려울 뿐만 아니라 발생하는 부위에 따라 치료제의 효과 또한 각기 다르다. 현재 치료제로 사용되는 물질들은 상당한 독성을 지니고 있으며, 암세포만을 선택적으로 제거하지 못하므로, 암의 발생 후 이의 치료 뿐 아니라, 암의 발생을 예방하기 위한 독성이 적고 효과적인 항암제의 개발이 절실히 필요하다.

암이란 “제어되지 않은 세포성장”으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양 (tumor)이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 한다. 학문적으로는 신생물 (neoplasia)이라고도 불린다. 암은 수술, 방사선 및 화학요법으로 치료를 하더라도 많은 경우에 근본적인 치유가 되지 못하고 환자에게 고통을 주며 궁극적으로는 죽음에 이르게 하는 난치성 만성질환이다. 암의 발생요인으로는 여러 가지가 있으나, 내적 요인과 외적 요인으로 구분하기도 한다. 정상세포가 어떠한 기전을 거처 암세포로 형질전환이 되는지에 대해서는 정확하게 규명되지 않았으나, 적어도 80 내지 90%가 환경요인 등 외적인자에 의해 영향을 받아 발생하는 것으로 알려져 있다. 내적 요인으로는 유전 인자, 면역학적 요인 등이 있으며, 외적 요인으로는 화학물질, 방사선, 바이러스 등이 있다. 암의 발생에 관련되는 유전자에는 종양형성유전자 (oncogenes)와 종양억제유전자 (tumor suppressor genes)가 있는데, 이들 사이의 균형이 위에서 설명한 내적 혹은 외적 용인들에 의해 무너질 때 암이 발생하게 된다.

암세포는 정상세포와 많은 면에서 그 성질이 유사하므로 정상세포에는 피해를 주지 않고 암세포만을 제거하는 것은 쉬운 일이 아니다. 그러나 암세포에는 몇 가지 일반 세포와 구분되는 특징이 있는데, 첫째는 암세포는 세포 증식이 조절되지 않는다는 것이고, 둘째는 분화의 특징이 비교적 결여되어 있다는 것이며, 셋째는 주위의 조직에 침투하여 전이를 한다는 것이다. 정상세포는 필요에 따라 성장인자에 의해 신호를 전달받아 증식을 하는 반면 암세포는 성장인자에 대한 의존도가 낮고 주변의 세포와 접촉에 의해 성장이 저해되는 접촉성 저해 (contact inhibition)가 없으며, 안지오제닉 인자 (angiogenic factor)를 분비하여 전이를 활발히 한다. 또한 암세포는 분화가 되지 않고, 세포사멸 (apoptosis or programmed cell death)이 일어나지 않으며, 유전적으로 불안정한 특징이 있다. 암세포의 유전적인 불안정은 암의 진행에 있어서 매우 중요하며 화학요법제에 대한 내성을 유도하기도 하는 것으로 알려져 있다 (Folksman et al., Science, 235, pp. 442-447, 1987).

암은 혈액암과 고형암으로 크게 분류되며, 폐암, 위암, 유방암, 구강암, 간암, 자궁암, 식도암, 피부암 등 신체의 거의 모든 부위에서 발생한다. 이들 악성종양을 치료하기 위해 사용하는 방법들 중 수술이나 방사선 요법을 제외한 화학요법 제를 총칭하여 항암제라고 하며, 주로 핵산의 합성을 저해하여 항암활성을 나타내는 물질이 대부분이다. 화학요법제는 크게 대사길항제 (antimetabolites), 알킬화제 (alkylating agent), 유사분열억제제 (antimitotic drugs), 호르몬제 (hormones) 등으로 분류되며, 암세포의 증식에 필요한 대사과정을 저해하는 대사길항제로는 엽산유도체 (methotrexate), 퓨린유도체 (6-mercaptopurine, 6-thioguanine), 피리미딘유도체 (5-fluorouracil, cytarabine) 등이 있으며, DNA의 구아닌 등에 알킬기를 도입하여 DNA의 구조를 변형시키고 사슬절단을 시켜 항암효과를 발휘하는 알킬화제로는 니트로겐 머스타드계 화합물 (chlorambucil, cyclophosphamide), 에틸렌이민계 화합물 (thiotepa), 알킬설포네이트계 화합물 (busulfan), 니트로소우레아계 화합물 (carmustine), 트리아젠계 화합물 (dacarbazine)이 있다. 분열시기 특이성 약물로서 유사분열을 차단하여 세포분열을 억제하는 유사분열억제제에는 악티노마이신 D (actinomycin D), 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신과 같은 항암성항암제, 빈크리스틴, 븐빌라스틴과 같은 식물알칼로이드, 탁산환을 포함하는 유사분열 저해제인 탁소이드 등이 포함된다. 이외에 부신피질호르몬이나 프로게스테론과 같은 호르몬제와 시스플라틴 같은 백금함유 화합물이 항암제로서 사용되고 있다.

화학요법제의 가장 큰 문제는 약제 내성으로써, 항암제에 의한 초기의 성공적인 반응에도 불고하고 결국에는 치료가 실패하게 되는 주요 요인이다. 이러한 부작용을 극복하는 문제와 관련지어 최근에는 민간에서 사용되어지는 천연물에서 그 활성 성분을 찾으려는 노력이 진행되고 있다.

천연물은 예로부터 질병의 치료 및 경감을 위한 의약품의 원료 및 선도물질의 제공원으로서 중요한 역할을 하고 있다. 과학기술이 발달함에 따라 천연물 자체를 이용하기 보다는 천연물 중에 함유되어 있는 유효성분을 분리하거나 그 유도체를 합성하여 약으로 이용하고자 하는 연구가 활발하게 이루어지고 있으며, 현재 이용되고 있는 의약품의 상당수가 천연물에서 유래한 물질자체 또는 그 유도체들로 알려져 있다. 현재 임상에 사용중인 항암성 화학요법제중에도 천연약용식물로부터 분리된 활성물질을 선도물질로 한 것들이 많은데, 대표적인 것으로는 북미 태평양 연안에 많이 서식하고 있는 약용식물인 주목나무(Taxus brevifolia)껍질로부터 얻어진 물질인 택솔(taxol: 일반명 paclitaxel)로서 이는 특히 여성암중 유방암, 난소암에 효과적인 것으로 알려져 있다. 또 다른 예로서 칸타란투스 로세우스 (Catharanthus roseus )에서 분리된 알칼로이드 (alkaloid)인 빈브라스틴 (vinblastine), 포도필룸 펠타툼 (Podophyllum peltatum )에서 분리된 리그난 (lignan)인 포도필로톡신 (podophyllotoxin)의 반합성 유도체인 에토포사이드 (etoposide)와 테니포사이드 (teniposide), 캄토테카 아쿠미나타 (Camptotheca accuminata )에서 분리된 캄토테신 (camptothecine), 세팔로택서스 하링토니아 바 드루파시아 (Cephalotaxus harringtonia var. drupacea )에서 분리된 호모하링토닌 (homoharringtonin), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani )에서 분리된 4-이포메아놀 (4-ipomeanole) 등이 있다 (Cordell et al., Bioactive Natural Products, CRS Press, pp.195-220, 1993). 천연물 유래 물질은 합성된 물질과는 달리 매우 복잡한 대사 및 합성 과정을 통하여 생성되므로 새로운 구조 및 작용기전을 지닐 수 있고 아직 그 성분이나 성분의 작용기전에 대해 충분히 연구되지 못한 실정이기 때문에, 천연물에서 활성 물질을 분리하여 그 작용기전을 연구하는 거은 매우 큰 가치를 지닌다고 할 수 있다.

또한, 최근의 항암성 화학요법제 개발 동향은 특정 암에 대한 선택성을 높임과 동시에 기존 항암제의 가장 큰 단점이라고 할 수 있는 정상세포에 대한 부작용을 경감시키기 위하여 암세포에만 특이적으로 발현되는 세포신호 전달 체계에 작용하는 물질을 개발하고자 하는 추세에 있다. 암세포에는 여러 티로신 키나아제 (tyrosine kinase)류, 성장 인자 수용체 (growth factor receptor), 래스 팔네실트란스퍼라아제 (Ras farnesyltransferase), 텔로머라아제 (telomerase), 사이클린 (cyclin) 류 등이 과발현되어 있는 것으로 알려져 있어, 이들을 저해하는 물질은 암세포에 선택적인 새로운 항암제로서 작용할 수 있을 것으로 여겨진다. 실제로 천연 약용식물인 흰자작나무에서 분리된 베툴리닉산(betulinic acid)의 경우 피부 흑색종암(melanoma)에 선택성이 높아 현재 임상 시험중에 있으며, 글리벡(Gleevec)의 경우 protein tyrosine kinase에 속하는 bcr-abl, c-abl, v-abl을 선택적으로 저해하여 만성 골수성 백혈암에 탁월한 효과를 나타내고 있고, 이레사(Iressa, ZD1839)는 EGF(epidermal grwoth factor) receptor를 저해하는 물질로서 현재 폐암에 대하여 임상 응용되고 있다 (Blume-Jensen and Hunter, Nature, 411, pp. 355-365, 2001).

원화 (Daphne genkwa SIEB. et ZUCC)는 팥꽃나무의 꽃봉오리이다. 잎이 피기전의 꽃봉오리를 따서 말린 것을 주로 약재로 사용한다. 주요성분으로는 젠콰다프 닌 (genkwadaphnin), 아피제닌 (apigenin), 시토스테로 (sitosterol), 벤조산 (benzoic acid) 및 자극성 유상 물질 등이 있다. (정보섭 및 신민교, 항약대사전, 영림사, pp740-741, 1998). 원화는 신경과민으로 마음이 안정되지 않고 가슴이 뛰고, 잘 놀라고, 건망증이 있는 증상에 효과를 나타내고 있다. 또한 천식, 해수, 피부가 붓고, 음식이 소화가 안되는 증상에도 효과가 있으며, 정신분열증, 조울증, 신경기능 문란증 등에 상당한 호전 반응을 보였다는 임상보고가 있다. 이뇨, 수종, 신장염에도 사용한다. (Kai et al., Yakugaku Zasshi, 124, pp. 349-354, 2004).

그러나, 상기 문헌 어디에도 원화로부터 사람 폐암 세포에 보다 특이적으로 성장 저해 효능을 나타내는 물질이 분리되었다는 내용이 교시되거나 개시된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 한방에서 많이 사용되는 생약제 기원의 항암제를 연구한 결과, 원화로부터 분리된 본 발명의 화합물들이 우수한 항암활성을 나타낼 뿐만 아니라 폐암에 특이적 선택성이 높고 정상세포에 비하여 암세포 성장을 억제하는 효과가 탁월함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 원화 추출물로부터 분리된 하기 일반식 (I)의 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:

(I)

상기 식에서,

R은 수소원자, C₂ 내지 C₁₀의 알킬기 및 C₂ 내지 C₁₀의 알콕시기로 구성되는 군으로부터 선택된 치환기이다.

상기 일반식 (I)의 바람직한 화합물로는 R은 수소원자, C₂ 내지 C₅의 저급 알킬기 또는 C₂ 내지 C₅의 저급 알콕시기이고, 보다 바람직한 화합물로는 R은 수소원자, 에틸기 또는 프로필기인 화합물군이다.

상기 일반식 (I)의 가장 바람직한 화합물로는 5베타-하이드록시레시니페고놀-6알파, 7알파-에폭시-12베타-프로파녹실-9,13,14-오르소-2E,4E-디카디에노에이트 또는 5베타-하이드록시레시니페고놀-6알파, 7알파-에폭시-12베타-부타녹실-9,13,14-오르소-2E,4E-디카디에노에이트이다.

상기 일반식 (I)으로 표기되는 본 발명의 신규 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수 있다.

염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올 (예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산 (maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산 (citric acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산 (glycollic acid), 글루콘산 (gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산 (glutaric acid), 글루쿠론산 (glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

상기의 일반식 (I) 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 일반식 (I) 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트 (메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트 (토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명은 원화 추출물로부터 분리된 상기 일반식 (I) 으로 표기되는 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 원화는 팥꽃나무의 꽃봉오리, 줄기, 잎 또는 뿌리, 바람직하게는 팥꽃나무의 꽃봉오리임을 특징으로 한다.

상기 암 질환은 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종 양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종, 바람직하게는 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 위암 또는 간암, 보다 바람직하게는 폐암을 포함한다.

이하, 본 발명의 화합물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 화합물은, 건조된 원화를 세절하여 건조 중량의 약 1 내지 50 배, 바람직하게는 8배의 클로로포름:아세톤:메탄올 (1:1:1)의 혼합용매로 상온에서 약 1일 내지 20일, 바람직하게는 약 7일 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 냉침 추출방법을 이용하고 감압 농축하여 조추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 조추출물을 초음파 세척기에서 메탄올 : 클로로포름 (2:8)의 혼합용매로 녹인 후, 상등액과 침전물을 여과하여, 그 중 상등액을 농축하여 분획하는 제 2단계; 제 2단계에서 수득한 메탄올 및 클로로포름 분획물을 메탄올 : 클로로포름 (1:1(v/v) 용출용매로 실리카 겔 컬럼크로마토그래피를 수행하여 3개의 분획으로 나누는 제 3단계; 상기 제 3단계의 분획 중 2번째 분획을 50 내지 100%의 메탄올의 용매로 역상 ODS 플래쉬 컬럼을 실시하여 5개의 분획으로 나누는 제 4단계; 상기 제 4단계의 분획 중 활성이 높은 분획을 아세톤 : 메틸렌클로라이드 (8~30%)를 용출용매로 실리카 오픈 컬럼을 수행하여 6개의 분획으로 나누고, 이 중 활성이 높은 분획으로부터 본 발명의 화합물들을 수득할 수 있다.

본 발명의 암 질환의 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제 제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 원화 추출물로부터 분리된 상기 일반식 (I)으로 표기되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 암 질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 화합물은 암 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 원화 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 여러 종류의 사람 암세포에 대하여 세포 독성을 나타내며 특히 사람 폐암세포에 대하여 선택적인 성장 억제 활성을 지니며 정상세포의 성장에는 큰 영향을 미치지 않는 우수한 항암 활성을 가지고 있음을 확인함으로서, 암 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 화합물의 분리

1-1. 원화 추출물의 제조

건조된 원화 (한약유통) 10 kg을 클로로포름 : 아세톤 : 메탄올 (1:1:1)로 초음파 추출기 장치를 이용, 수욕 상에서 3시간씩 3회 추출하였다. 추출물을 여과한 다음 감압 농축하여 386 g의 원화 추출물을 얻었다. 원화 추출물을 메탄올 : 클로로포름 (2:8)에 분산시키고, 여과한 다음 감압 농축하여 216 g의 원화의 메탄올 및 클로로포름 추출물 (이하, ‘WH'라 명명함)을 얻고 이를 하기 실시예 1-2에서 이용하였다.

1-2. 원화 추출물로부터 화합물의 분리

상기 실시예 1-1에서 수득한 WH에 대해 클로로포름, 메틸렌 클로라이드 (1:1(v/v)), 메탄올 : 클로로포름 (1:1(v/v)) 용매를 이용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 3개의 분획물을 얻었다. 이 중 사람 폐암세포(A549)에 대한 세포성장 억제 효과활성이 가장 높은 2번째 분획을 취하여 다시 50-100% 메탄올의 ODS 플래시 크로마토그래피를 이용하여 4개의 분획물을 얻었다. 이 중 가장 활성이 높은 3번째 분획을 취하여 아세톤 : 메틸렌클로라이드 용매 구배 (5:100→30:100(v:v))를 이용한 실리카 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 6개의 분획물을 얻었다. 이 중 3번째 분획물을 93% 메탄올로 고성능액체크로마토그래피 (ODS HPLC)를 이용하여 신규물질 (1)인 5베타-하이드록시레시니페고놀-6알파,7알파-에폭시-12 베타-부타녹실-9,13,14-오르소-2E,4E-디카디에노에이트 (40 mg)을 분리하였다 (이하, “유안후아린 (yuanhualine)” 또는 “YH1"이라 명명함). 그리고 5번째 분획물을 93% 메탄올로 고성능액체크로마토그래피 (ODS HPLC)를 이용하여 신규물질 (2)인 5베타-하이드록시레시니페고놀-6알파,7알파-에폭시-12베타-프로파녹실-9,13,14-오르소-2E,4E-디카디에노에이트 (40 mg)을 분리하였다 (이하 “유안후아힌 (yuanhuahine)” 또는 "YH2"라 명명함).

1-3. 화합물의 구조 결정

분석 HPLC (analytical HPLC)를 이용하여 상기 실시예 1-2에서 분리한 성분들의 순도를 평가하였다. 단일 성분임이 확인된 상태에서 각종 분광학적 실험 즉, H¹-NMR, C¹³-NMR, DEPT, H¹-H¹ COSY, H¹-C¹³ COSY, HMBC, HRESIMS를 실시하였고, 그 결과를 종합하여 그 구조를 결정하였다. 신규 화합물인 유안후아힌은 하얀색의 무정형 상태로 얻어졌으며, HRESIMS에서 m/z 601 [M+H]+, 623 [M+Na]+ 의 분자이온을 보여주어, 이 물질의 분자식을 C₃₃H₄₄O₁₀으로 예측할 수 있었다. 표 1에서 나타나는 바와 같이, 유안후아힌은 ¹H NMR 스펙트럼 분석결과 추가적인 한 개의 메틸렌을 제외하고 유안후아딘의 결과와 유사하였다. ¹H NMR 스펙트럼에서 다섯 개의 메틸기에 대한 시그널이 관찰되었으며 여섯 개의 apliphatic 메틸렌, 한 개의 exo-메틸렌, 7개의 aliphatic 메틴 및 5개의 olefinic 메틴이 관찰되었다. DEPT와 HMQC 스펙트 럼과 함께 ¹³C NMR 스펙트럼에 따르면 33개의 탄소원자는 5개의 메틸 탄소원자, 7개의 메틸렌 탄소원자, 12개의 메틴 탄소원자 및 9개의 4급 탄소원자로 이루어져있다. 신규 화합물인 유안후아린은 하얀색의 무정형 상태로 얻어졌으며, HRESIMS에서 m/z 615 [M+H]+, 637 [M+Na]+의 분자이온을 보여주어, 이 물질의 분자식을 C₃₄H₄₆O₁₀으로 동정하였다 (표 1 참조).

표 2에서 나타나는 바와 같이, 유안후아린은 ¹H NMR 스펙트럼 분석결과 추가적인 두 개의 메틸렌을 제외하고 유안후아딘의 결과와 유사하였다. 이는 유안후아딘보다 유안후아린의 분자량이 2x14 mmu 더 높은 것으로 확인될 수 있다 (표 2 참조). (Zhan et al., Bioorgan Med Chem 13, pp. 645-55, 2005).

유안후아힌의 NMR 데이터

Assignment	13C (ppm)	1H (ppm)
1	160.7	7.57 (1H, br s)
2	137.1
3	209.7
4	72.7
5	72.4	4.26 (1H, s)
6	60.7
7	64.3	3.56 (1H, s)
8	35.6	3.51 (1H, d, 2.7)
9	78.3
10	47.7	3.92 (H, br s)
11	44.3	2.36 (1H, g, 7.2)
12	78.3	4.99 (1H, s)
13	83.9
14	80.7	4.76 (1H, d, 2.7)
15	143.3
16	113.6	5.01 and 4.95 (2H, br s)
17	18.9	1.84 (3H, s)
18	18.5	1.31 (3H, d, 7.2)
19	10.1	1.80 (3H, dd, 2.7, 1.2)
20	65.2	3.94 and 3.81 (2H, d, 11.7)
1'	117.2
2'	122.5	5.65 (1H, d, 16.5)
3'	135.3	6.67 (1H, dd, 16.5, 10.5)
4'	128.8	6.05 (1H, 15.0, 10.5)
5'	139.6	5.87 (1H, m)
6'	32.9	2.10 (2H, q, 7.2)
7'	28.9	1.39 (2H, m)
8'	31.5	1.26 (2H, m)
9'	22.7	1.31 (2H, overlapped)
10'	14.2	0.89 (3H, t, 6.9)
1''	173.4
2''	28.0	2.25 (2H, q, 7.5)
3''	9.2	1.09 (3H, t, 7.5)

유안후아린의 NMR 데이터

Assignment	13C (ppm)	1H (ppm)
1	159.4	7.36 (1H, br s)
2	136.8
3	208.9
4	72.7
5	70.2	4.00 (1H, d, 2.1)
6	61.5
7	63.8	3.33 (1H, d, 6.6)
8	35.2	3.32 (1H, 3.9)
9	78.3
10	47.3	3.70 (1H, br s)
11	43.8	2.24 (1H, m)
12	78.1	4.08 (1H, s)
13	83.6
14	80.3	4.61 (1H, d, 2.7)
15	143.0
16	113.2	4.85 and 4.79 (2H, br s)
17	18.4	1.67 (3H, s)
18	18.0	1.12 (3H, d, 7.2)
19	9.6	1.61 (3H, br s)
20	64.7	3.56 and 3.76 (2H, br d, 12.3)
1'	116.9
2'	122.2	5.46 (1H, d, 15.3)
3'	135.0	6.49 (1H, dd, 15.3 10.5)
4'	128.4	5.88 (1H, m)
5'	139.3	5.70 (1H, m)
6'	32.5	1.94 (2H, q, 6.9)
7'	28.5	1.21 (2H, m)
8'	31.2	1.14 (2H, m)
9'	22.3	1.10 (2H, m)
10'	13.7	0.72 (3H, t, 6.6)
1''	172.9
2''	36.2	2.06 (2H, t, 7.5)
3''	18.0	1.42 (2H, m)
	13.3	0.75 (3H, t, 7.5)

실험예 1. 시험관 내에서 사람암세포 성장 억제 효능 측정

상기 실시예 1-2에서 수득한 화합물들의 세포 성장에 미치는 영향을 술포로다민 B (sulforhodamine B: SRB법)으로 측정하였다 (Lee et al., Chemico-Biol Interact 115, pp. 215-228, 1998).

사람암세포주 (한국세포주은행) (A549, 사람폐암세포; HCT116, 사람결장암세포; T47D, 사람유방암세포; PC-3, 사람전립선암세포; SNU-638, 사람위암세포; SK-HEP-1, 사람간암세포)를 10% FBS, 1% PSF 등을 함유한 RPMI/MEME/DMEM 배지에서 계대 배양하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 10% DMSO에 녹아있는 시료 10 ㎕와 상기 세포현탁액 190 ㎕ (5 x 10⁴ cells/ml) 넣고 3일간 배양하였다. 적어도 16 웰에 상기 세포현탁액 190 ㎕를 넣고 30분간 배양하여 실험 전의 음성대조 (zero-day control)로 사용하였다. 배양한 세포를 10% TCA (trichloroacetic acid)로 고정시킨 후 SRB 용액으로 염색하고, 10 mM 트리스 베이스 (Tris-base)로 염색액을 용해시킨 다음 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 10% DMSO에서 배양한 경우를 대조군으로 하여 각 시험 물질처리에 따른 세포 생존율을 하기 수학식 1을 이용하여 측정하였다.

시료를 처리하지 않은 대조군을 100%로 하였을 때 시료 처치군의 값을 대조군에 대한 백분율로 나타내었으며, 각 시험물질 처리는 이중 혹은 삼중 시험의 평균값 ± SEM으로 구하였다. IC₅₀ 값은 50% 생존율에 대한 시험 물질의 농도이다. 유안후아힌과 유안후아린이 사람암세포 및 사람 폐세포에 미치는 영향을 표 3 및 표 4 내지 도 1에 나타내었다 (도 1 참조).

실험 결과, 표 3에서 나타나는 바와 같이, 화합물들은 농도의존적으로 사람 폐암세포의 성장을 선택적으로 억제하는 효능을 나타내었다. 사람 폐암세포에 대한 IC₅₀는 0.7-53 nM이었고 다른 암세포종에 대하여는 IC₅₀가 10 μM 안팎으로 나타나 폐암세포에 대한 선택성이 10,000 배 이상 높은 것으로 확인되었다 (도 1 참조).

한편 화합물들은 표 4에서 나타나는 바와 같이, 사람 폐암세포에 비하여 사람 정상 폐세포에 대하여 낮은 세포성장 억제효능을 나타냄을 나타내어 상대적으로 독성이 낮음을 관찰할 수 있었다. (도 1 참조).

실험예 2. 시험관내에서 세포 형태 관찰

사람 폐암세포인 A549 세포를 10% FBS-MEME에 2 x 10⁵ cells/ml로 현탁하였다. 세포현탁액 10 ml를 10 cm 세포 배양 디쉬에 부착시켰다. 상기 실시예 1-2의 유안후아힌(5-100 nM 농도)을 첨가한 다음 37℃, 5% CO₂에서 일정시간 배양하였다. 먼저 세포의 형태 변화를 관찰하기 위하여 세포를 48시간 배양한 다음 배양 배지를 걷어내고 PBS (phosphate buffered saline)로 2회 세척하였다. 현미경 하에서 100 배의 배율로 세포의 형태를 관찰하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다 (도 2 참조).

실험결과, 도 2에서 나타나는 바와 같이, 유안후아힌을 처리한 세포는 대조군 세포에 비하여 세포의 수가 감소하였음을 확인할 수 있었다.

하기에 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

유안후아힌 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

유안후아린 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

유안후아힌 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

유안후아린 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_{4 ,}12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

유안후아힌 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

유안후아린 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

유안후아힌 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

도 1은 본 발명의 유안후아힌의 사람 폐암세포 및 정상 폐세포에 대한 성장 억제 효과를 나타낸 도이고,

도 2는 본 발명의 유안후아힌의 사람 폐암세포 성장억제 효과에 대한 현미경 사진을 나타낸 도이다.

Claims (9)

1. 원화 추출물로부터 분리된 5베타-하이드록시레시니페고놀-6알파,7알파-에폭시-12베타-프로파녹실-9,13,14-오르소-2E,4E-디카디에노에이트 또는 5베타-하이드록시레시니페고놀-6알파, 7알파-에폭시-12베타-부타녹실-9,13,14-오르소-2E,4E-디카디에노에이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
2. 삭제
3. 삭제
4. 원화 추출물로부터 분리된 제 1항의 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 위암, 대장암, 유방암, 전립선암, 간암 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 원화 추출물로부터 분리된 제 1항의 신규 화합물을 유효성분으로 함유하는 위암, 대장암, 유방암, 전립선암, 간암 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
9. 삭제

Images