KR100936283B1 - 인산화 반응 측정용 바이오칩 및 이를 이용한 인산화 반응측정 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인산화 반응 측정용 바이오칩 및 이를 이용한 인산화 반응 측정 방법에 대한 것으로, 구체적으로 키나아제(kinase) 기질이 집적된 바이오칩과 방사성 동위원소로 표지 된 보조 인자로 구성된 인산화 반응 측정용 바이오칩 및 이를 이용한 인산화 반응 측정 방법에 관한 것이다. 본 발명의 인산화 반응 측정용 바이오칩은 방사성 동위원소를 사용함으로써 기존의 항체를 이용한 방법에 비해 최소량의 시료를 가지고 간단한 과정을 통하여 인산화 반응을 측정할 수 있으며, 빠른 시간 내에 많은 시료를 분석할 수 있으므로 키나아제 활성 분석에 유용하게 이용될 수 있다.

바이오칩, 방사성 동위원소, 키나아제, 인산화 반응

Description

인산화 반응 측정용 바이오칩 및 이를 이용한 인산화 반응 측정 방법{The biochip for the detection of phosphorylation and the detection method using the same}

본 발명은 인산화 반응 측정용 바이오칩 및 이를 이용한 인산화 반응 측정 방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 키나아제(kinase) 기질이 집적된 바이오칩과 방사성 동위원소로 표지 된 보조 인자로 구성된 인산화 반응 측정용 바이오칩 및 이를 이용한 인산화 반응 측정 방법에 관한 것이다.

최근의 생명공학산업은 소형화 기술이 부각되면서 기존 생물학 연구에 전자, 전산, 기계 등의 주변기술이 급격히 융합되고 있다. 생물학 연구도 이제는 단위 생물 개체를 총체적으로 접근할 수 있는 시스템화 된 연구를 필요로 하고 있으며, 연구방법 또한 극미량의 실험재료로 다량의 실험을 동시에 수행할 수 있는 새로운 접근 방법을 필요로 하고 있다. 이에 따라 유전자, 단백질, 세포 등을 이용한 생물 정보 분석 및 이용기술에 있어서 바이오칩은 핵심적인 역할을 수행할 것으로 예 견되고 있다.

인간 유전체 프로젝트의 완성과 더불어, 생물 산업계 전반에서 유전자 분석이나 단백질 분석을 위한 DNA 칩 또는 단백질 칩(protein chip) 등의 초소형 분석 시스템에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔으며, 이러한 바이오칩은 향후 막대한 시장을 형성할 것으로 예측되고 있으며, 우리나라에서도 바이오 산업의 대표적 제품으로 육성 개발할 필요가 강력히 대두되고 있다.

단백질 칩(Protein chip) 혹은 펩타이드 칩(peptide chip)은 작은 기판 위에 수십 개에서 수천 개, 또는 수만 개의 단백질 혹은 펩타이드를 고정시킨 후, 그 단백질들의 결합을 동시에 분석하는 자동화 분석 장치로서 DNA 칩과는 분석원리와 응용범위가 다른 미래형 바이오센서(Biosensor)로 알려져 있다. 단백질 칩은 특정 단백질에 특이적으로 상호 작용하는 생체분자의 기능을 밝히고, 단백질 기능분석 및 네트워크 분석을 통하여 얻어진 자료를 바탕으로 고전적인 방법으로는 불가능했던 질병에 대한 치료 및 예방법을 개발하는 연구 분야에서 핵심이 되는 기술이다.

단백질 칩 기술은 칩의 제조와 관련된 단백질 마이크로어레이(protein microarray) 기술과, 어레이 상태로 고정화된 단백질을 관찰하고자 하는 단백질 간의 상호반응 정도를 정량적으로 측정하고 비교하는 분석기술 및 단백질 칩의 응용기술 등 크게 3가지 핵심기술로 구분할 수 있다. 단백질 칩의 제작은 단백질 칩을 분석하는 기술에 따라 여러 가지 방법을 이용하는데, SPR(Surface Plasmon Resonance)을 이용하는 경우에는 금과 같은 금속 박막 위에 단백질을 고정해야 하 기 때문에 금 박막 제작기술과 단백질 고정화 기술을 동시에 개발해야할 필요가 있다. 형광 물질을 이용하는 경우에는 단백질을 슬라이드 글라스 위에 직접 고정하여 분석하기 때문에 단백질을 형광물질로 표지할 수 있어야 한다.

두 번째 핵심기술인 단백질 칩을 분석하는 기술은 현재 알려진 SPR, 질량분석방법, 형광분석방법, 전기화학적 분석방법 이외에도 타원편광분석법(Ellipsometry)과 같은 나노이미지화(Nano-Imaging) 기술을 이용한 방법이 연구 개발되고 있는데, 이는 현재 가장 경쟁적으로 개발되고 있는 분야이다. 지금까지 DNA 칩의 분석기술에 기초를 둔 형광분석방법이 가장 많이 이용되어 왔으나 각각의 방법마다 장단점이 지적되고 있어 아직까지 질병의 진단에 적절한 단백질 칩 분석방법은 미지수인 실정이다.

마지막 핵심기술인 단백질 칩 응용기술은 가장 광범위한 연구개발 가능성을 가지고 있으며 거의 미개척 분야라고 할 수 있을 정도로 아직까지 활발한 연구개발이 진행되지 못하고 있는 분야이다.

지금까지 진행되어온 단백질 칩에 관한 최신기술은 다음과 같이 크게 네 가지로 분류할 수 있다.

(1) DNA 마이크로어레이 기술을 이용하여 DNA와 단백질과의 상호작용을 칩 상에서 분석하는 기술이다. 칩 상에서 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드로 전환시킨 후, 다시 특정 DNA 서열에 특이적인 제한효소를 반응시켜 절단 유무를 통해 DNA-단백질 상호작용을 검사함으로써, 새로운 DNA 결합 단백질을 발굴하고 그 특성을 밝혀내는 데 유용하다 (Bulyk, M.L. et al ., Nature. Biotechnol ., 17:573-577, 1999).

(2) 제한효소, 페록시다아제(peroxidase), 포스파타제(phosphatase), 단백질 키나아제(protein kinase) 등의 여러 종류의 효소 및 항원-항체반응을 칩 상에서 분석하는 기술이다(미국공개특허 2002/0055186A1; 국제공개특허 01/83827A1; Braunwalder A. et al., Anal . Biochem ., 234:23-26, 1996; Houseman B. et al ., Nature Biotechnol ., 20:270-274, 2002; Ruud M. et al ., Nature Biotechnol ., 18:989-994, 2000). 특히, 본 기술은 단백질-단백질 상호작용, 키나아제-펩타이드 기질반응, 단백질-리간드 결합반응을 통해 대량측정, 생화학적 분석, 신약 후보물질 분석, 질병 진단 등에 응용할 수 있다. 그러나 키나아제 특이적인 기질인 펩타이드 또는 분자량이 작은 단백질을 고정할 경우, 비특이적인 고정을 막기 위해 사용되는 봉쇄물질인 소혈청알부민(BSA)으로 인하여 고정되는 물질이 묻혀버리는 제한점이 있다. 또한, 칩 상에 서로 다른 종류의 항체를 고정하고, 형광체가 표지된 항원 혼합물과 반응시켰을 때, 항체의 60%만이 정량적인 결과를 나타냈으며, 단지 23%만이 정성적인 결과를 나타냈다고 보고되어 있다(MacBeath G. et al ., Science, 289:1760-1763, 2000; Haab B. et al ., Genome Biol. 2:research 0004, 2001).

(3) cDNA 라이브러리로부터 대량의 단백질을 칩 상에서 발현하여 분석하는 기술이다(국제공개특허 01/83827, 국제공개특허 02/50260). 본 기술은 단백질의 생화학적 활성에 대한 대량측정에 유용하다(Heng Zhu, et al ., Nature genetics, 26:283-289, 2000).

(4) 친화성 태그를 이용하여 생체분자의 배향성(orientation)을 분자수준에 서 조절하면서, 균일하고 안정된 생체분자의 단일 층을 칩 표면에 형성시키는 기술을 이용하여 시료를 분석하는 기술이다(미국공개특허 2002/0055125A1; 미국등록특허 제 6,406,921호; Paul J. et al ., JACS, 122:7849-7850, 2000; RaVi A. et al ., Anal. Chem ., 73:471-480, 2001; Benjamin T. et al ., Tibtech ., 20:279-281, 2002). 예를 들어, 단백질을 His-태그(tag) 융합 형태로 발현시킨 다음, Ni-NTA 기능기가 고정된 칩에 반응시켜 고정시킴으로써, 생체분자의 활성을 유지시키거나 또는 인테인(intein)이 융합된 형태로 발현시켜 정제를 용이하게 할 뿐만 아니라, 특정 부위를 바이오틴화시켜 아비딘 처리된 칩 상에서 일정방향으로 고정하여 보다 안정적이고 활성적인 상태를 유지시킬 수 있다(Zhu et al., Science, 293:2101-2105, 2001; Marie-Laure L. et al ., JACS 124:8768-8769, 2002). 또한, 지지체에 특이적으로 결합하는 단백질(칼모듈린 등) 및 태그(폴리 시스테인, 라이신, 히스티딘 등)를 사용하여 융합된 형태로 발현시킨 다음 고정시켜, 단백질 간 상호작용을 이용하여 단백질 정제, SPR (surface plasmon resonace) 및 FACS (fluorescence activated cell sorter)에 활용하였다(Hentz et al., Anal . Chem ., 68:3939-3944, 1996; Hodneland et al., PNAS, 99:5048-5052, 2002; Kukar et al ., Anal . Biochem., 306:50-54, 2002; 미국특허 6,117,976).

한편, 키나아제(kinase)는 생체 신호 전달(signal transduction)에 관여하여 생체(세포) 내에서 일련의 단계적인 반응을 일으킴으로써 약물의 표적이 될 수 있는 단백질이다. 키나아제는 세포 내에서 표적 단백질의 특정 서열 내에 있는 세린(serine), 트레오닌(threonine), 타이로신(tyrosine) 잔기에 공급된 ATP로부터 γ-인산화기를 붙여줌으로서 진핵 세포 내에서 신호 전달경로를 포함하여 많은 질병, 특히 암에 관련되어 있다(Hunter, T., Cell 100:113-127, 2000; Zhang, Z.Y., Curr. Opin . Chem . Biol. 5:416-423, 2001). 기존 키나아제 활성 연구 방법으로 세포막(cell membrane)에 방사성 동위원소를 이용하여 반응시키는 검사법이 있으나 속도가 느리고 많은 작업량이 요구된다. 또한, 기존의 키나아제 및 수용체에 대한 대량 측정을 위한 방법으로 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 방법, 항체를 이용하는 방법을 사용하였으나, ELISA 방법은 상대적으로 정확하지만 많은 시간을 소요하며 많은 시료량을 소모한다. 또한, 항체를 이용한 방법은 대량 측정이 가능하나 비용이 많이 들며, 실험 방법이 복잡하다.

프로메가 사(Promega, Co., USA)에서는 방사성 동위원소로 표지된 ATP와 바이오틴(biotin)화된 키나아제 기질과 흡착력이 높은 막(membrane)을 이용한 인산화 반응 어세이 키트를 제공하고 있으나, 대량 측정하는데 한계가 있다. 또한 상기 회사에서는 방사성 동위원소를 사용하지 않으면서, 키나아제의 인산화 반응 후 기질의 알짜전하(net charge) 차이로 인한 전기영동 상의 이동차를 이용하여 분석하는 방법을 제공하나 이 역시 대량 측정시 고비용이 드는 단점이 있다. 이와 같이 상기 4가지 단백질 칩 기술 분야 이외에 단백질 칩 또는 펩타이드 칩을 이용하여 단백질 인산화효소의 활성을 대량으로 탐색할 수 있는 방법은 아직 개발된바 없다. 따라서 저가이면서 정확하고 신속한 측정을 위한 시스템 개발이 절실히 요구된다.

이에, 본 발명자들은 방사성 동위원소를 사용한 바이오칩 상에서 키나아제와 기질간의 신속하고 정확한 최적 반응 조건을 확립하고, 키나아제에 의한 인산화 반응의 측정을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 소량의 시료 량을 이용하여 신속하게 인산화 반응을 측정할 수 있는 인산화 반응 측정용 바이오칩을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 활성기가 코팅된 기관 표면에 기질이 집적된 바이오칩을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바이오칩과 [γ-³²P]ATP를 포함하는 인산화 반응 측정용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 인산화 반응 측정용 키트를 이용하는 인산화 반응 측정 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 활성기가 코팅된 바이오칩과 [γ-³²P]ATP와 혼합된 인산화효소(kinase)를 이용한 상기 인산화효소에 특이적인 기질의 검출 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 활성기가 코팅된 기판 표면에 기질이 집적된 바이오칩 및 상기 바이오칩과 [γ-³²P]ATP를 포함하는 인산화 반응 측정용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 로보틱 마이크로어레이어(robotic microarrayer)(Affymetrix 417 Arrayer (Takara Shuzo, Japan))를 이용한 스팟팅 방법(spotting method)(Jong-Gu Park, J. Biomed . Lab . Sci. 10:75-84, 2004)으로 제작된 바이오칩 상에서 키나아제와 기질 간의 반응을 확인하였다. 문헌 조사(Frederic D. Sigoillot, David R. Evans, and Hedeel I. J. Biol . Chem. 277(18):15745-15751, 2002)에 의해 켐타이드(Kemptide), 단백질 포스파아제 저해자-2(protein phosphatase inhibitor 2), Elk1(p62 ternary complex factor)과 같은 여러 가지 기질 중 기질 및 키나아제 군을 선택하여 바이오칩을 제작하였다. 본 발명의 실시예에서는 cAMP-의존 단백질 키나아제(cAMP-depedent protein kinase)를 선택하였고, 상기 키나아제 기질로는 켐타이드를 선택하였다. 도 2와 같이 7개의 아미노산 서열을 특징적으로 가지는 켐타이드에 cAMP-의존 단백질 키나아제가 특이적으로 반응하여 세린기(serine)에 ATP의 인산기(phosphate group)를 전달해 주는데, 이는 동물 세포에서 빈번하고 일반적으로 일어나는 반응이다(도 1 참조).

선택한 기질을 자체 제작한 마이크로어레이어를 이용하여 단백질만이 고정화될 수 있는 기능기 즉 알데하이드기로 처리된 슬라이드 글라스 표면에 스팟딩 방법을 이용하여 고정화시켰다. 이때, 스팟 간의 직경과 간격은 각각 1 mm 이하, 바람직하게는 50 ㎛와 300 ㎛ 정도로 하였으며, 스팟을 1 cm × 1 cm 범위 내에 각각의 기질 단백질을 1 ㎕ 이하로 분주하였다. 기존의 연구에서는 키나아제 활성도 어세이 수행시 보통 10-20 ㎕ 정도의 기질 단백질이 필요하나, 본 발명의 바이오칩의 경우 한 스팟 당 1 ㎕ 이하 정도의 부피만을 이용하였다. 본 발명의 바이오칩은 기존 어세이보다 매우 적은 양의 기질을 사용하였으며, 제작한 하나의 슬라이드글라스 바이오칩에 5,000여 개 정도의 기질을 집적할 수 있으며, 5,000 여개 정도의 서로 다른 키나아제-기질 어세이를 동일한 조건에서 분석할 수 있다.

상기에서 제작된 바이오칩에 cAMP-의존 단백질 키나아제를 처리하였다. 혼성화 반응에는 키나아제 완충용액, 키나아제 및 [γ-³²P]ATP를 첨가하여 키나아제-기질과의 특이적 반응을 유도하였다. 이 후 X-선 필름(X-ray film) 또는 방사형광분석기용 스크린에 감광하여 키나아제에 의한 인산화 반응을 측정하였다. 그 결과, 소량의 기질 및 키나아제를 사용하여 인산화 반응이 신속하게 측정됨을 확인하였다. 일반적인 바이오칩의 경우, 기질의 크기가 작은 경우, 항체가 반응을 할 수 없어 다른 단백질과 융합된 형태로만의 분석이 가능하다는 단점이 있었다(Lee, SJ and Lee, SY., Anal . Biochem. 330:311-316, 2004).

본 발명의 인산화 반응 측정용 키트의 바이오칩의 기판은 유리(glass), 플라스틱, 금속 및 실리콘으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것이 바람직하며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 유리를 이용하였으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 바이오칩의 기판에 코팅된 활성기는 펩티드를 고정하는 역할을 하며, 아민기(amine group), 알데하이드기(aldehyde group), 카르복실기(carboxyl group) 및 티올기(thiol group)로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것이 바람직하며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 알데하이드기를 사용하였으나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 단백질 분자를 기판에 고정할 수 있는 활성기로 알려진 모든 활성기가 사용 가능하다.

상기 바이오칩의 기질은 켐타이드, 말릭효소-캠타이드(malic enzyme-kemptide), 단백질 포스파아제 저해자-2, Elk1으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 켐타이드 및 말릭효소-캠타이를 사용하였으나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자가 표적으로 하는 피검시료, 즉 세포 배양액, 세포 분쇄액, 세포 또는 조직의 조추출물, 소변, 땀, 타액, 눈물 등 각종 분비액, 또는 혈액, 혈장, 림프액, 혈청 등 각종 체액으로 이루어진 군으로부터 유래한 키나아제의 기질인 단백질은 모두 본 발명의 바이오칩의 기질로서 사용될 수 있다.

특히 본 발명에서는 저분자량의 폴리펩티드 기질을 기판에 고정시킬때 융합단백질 파트너로서 통상적으로 사용하는 말릭효소와 같은 고분자 단백질을 사용하지 않더라도 효율적으로 기판에 상기 폴리펩타이드 기질을 고정할 수 있었다. 따라서 본 발명에서 사용하는 폴리펩티드 기질은 융합 단백질일 수도 있으나 폴리펩티드 기질 자체가 직접 기판에 고정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 인산화 반응 측정용 키트는 암세포 증식(tumor cell proliferation)과 암혈관 신생(tumor angiogenesis)에 관여하는 것으로 알려진 RAF, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR-β, KIT, FLT-3, RET 등과 많은 종류의 암(고형암)에서 발생하는 단백질인 오로라 카이네이즈(Aurora kinases)로 불리는 BTAK나 STK15, 세포 만성 림프모구 백혈병(B cell chronic lymphocytic leukemia ; B-CLL)을 야기하는 효소인 Lyn이라는 티로신 키나아제(tyrosine kinase), PTK (protein tyrocine kinase), MAPK (MAP kinase), MAPKK (MAP kinase kinase), PKA (protein kinase A), PKC (protein kinase C), ERK (extracellular signal-regulated kinase), CAM KⅡ(calcium/Calnodulin-dependent protein kinase), MEKK (MAP/ERK kinase kinase), JNK (c-Jun N-terminal kinase), SAPK (stress-activated protein kinase), p38K (p38 kinase), phosphatase 2B, cPKC (conventional protein kinase), Serine Kinase IKKβ, Ab1K (Ab1 kinase), BTK (Bruton tyrosine kinase), CDK (cyclin-dependent kinase), VEGF-RTK (Vascular endothelial growth factor-receptor tyrosine kinase), AKT1 kinase, AKT2 kinase, AKT3 kinase, PK (Pyruvate kinase), Tumor M2-pyruvate kinase로 이루어진 군으로부터 선택되는 키나아제의 인산화 반응을 측정할 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 모든 키나아제의 인산화 반응을 측정하는데 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 인산화 반응 측정용 키트는 대조군으로 단백질 키나아제를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 인산화 반응 측정용 키트를 이용하는 인산화 반응 측정 방법을 제공한다.

본 발명은 하기의 단계를 포함하는 인산화 반응 측정 방법을 제공한다:

1) 피검 시료를 [γ-³²P]ATP와 혼합하는 단계;

2) 단계 1)의 혼합한 피검 시료를 상기 바이오칩에 처리하여 인산화 반응을 유도하는 단계;

3) 단계 2)의 바이오칩을 세척하는 단계; 및

4) 단계 3)의 바이오칩을 감광하여 인산화 정도를 측정하는 단계.

상기 측정 방법에 있어서, 단계 1)의 피검 시료는 세포 및 조직의 추출물, 분획 또는 세포 배양액, 세포 분쇄액, 세포 또는 조직의 조추출물, 소변, 땀, 자액, 눈물 등 각종 분비액, 또는 혈액, 혈장, 림프액, 혈청 등 각종 체액 등 당업자에게 알려진 모든 생물학적 시료가 사용될 수 있다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 바이오칩은 차단 용액으로 차단 처리할 수도 있으나 차단 처리를 하지 않더라도 노이즈 없는 신호를 수득할 수 있으므로, 차단 용액을 처리하지 않는 것이 바람직하다. 본 발명자들은 대장균 말릭효소-캠타이드 융합 단백질 및 캠타이드를 알데히드 처리된 슬라이드 글라스 위에 집적한 후, 인산화반응을 하기 전에 시행하는 차단 단계에서 여러 가지 용액을 이용하여 차단 효과를 알아보았다. 그 결과, 보편적으로 사용하는 1% BSA 뿐만 아니라 1% 글라이신, 10% 글리세롤을 처리한 곳 및 차단 용액을 처리하지 않은 곳에서도 깨끗한 스팟을 확인하였으므로 본 발명의 방법에서는 차단 용액을 처리하지 않아도 무방함을 확인하였다(도 7 참조).

현재까지의 기술적인 취약점은 키나아제 특이적인 기질인 펩타이드 또는 분자량이 작은 단백질을 고정할 경우, 비특이적인 고정을 막기 위해 사용되는 봉쇄물질인 소혈청알부민으로 인하여 고정되는 물질이 묻혀버리는 제한점이 있었다. 하지만, 상기와 같은 결과에 따라 차단 단계를 거치지 않아도 되는 시간적 경제적 효 과를 얻을 수 있다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 피검 화합물과 바이오칩을 반응시키는 조건은 30℃ 또는 37℃의 습윤 챔버에 30분 내지 1 시간 반응시키는 것이 바람직하며, 1 시간 반응시키는 것이 가장 바람직하나, 피검 시료의 키나아제와 기질 간의 특이성을 고려하여 반응 시간은 유동적일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 단계 4)의 바이오칩을 감광시키는 방법은 X-레이 필름 또는 방사형광분석기에 감광시키는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 감광 시간은 12 시간 내지 24 시간이 바람직하며 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 감광 시간은 키나아제와 기질 간의 특이성을 고려하여 유동적일 수 있다.

기존 형광 ELISA 방식의 경우, 실험시작 단계에서 검출까지의 총 7단계 이상의 복잡한 단계를 거쳐야했다. 그러나, 본 발명의 인산화 반응 측정 방법은 기질고정화시 칩 표면처리 공정이 단순하고, 또한 기질에 인산화반응시 원-포트(one-pot)로 표지되는 방사성동위원소를 그대로 검출할 수 있어 매우 간단하고 빠르게 공정을 단순화할 수 있다.

아울러, 기존 형광검출 방식의 경우, 기질의 특정 아미노산을 인산화시킨 후, 인산화 된 아미노산 부위에 형광물질이 결합되어 있는 2차 항체를 반응시켜야하는 간접 검출법으로 정확한 정량분석을 하기에는 부족한 면이 있다. 그러나, 본 발명의 인산화 반응 측정 방법은 기질에 직접적으로 방사성동위원소가 표지되는 인산화반응이므로 반응 후 정확하게 검출결과를 정량화할 수 있을 뿐만 아니라, 극미량의 농도도 검출이 가능하여 고감도의 검출효과까지 얻을 수 있다.

아울러, 본 발명은 활성기가 코팅된 바이오칩과 [γ-³²P]ATP와 혼합된 인산화효소(kinase)를 이용한 인산화효소에 특이적인 기질의 검출 방법을 제공한다. 구체적으로,

1) 피검 시료를 활성기가 코팅된 기판 표면에 집적하여 기질 분석용 바이오칩을 제조하는 단계;

2) 인산화효소(kinase)와 [γ-³²P]ATP를 단계 1)의 바이오칩에 처리하여 인산화 반응을 유도하는 단계;

3) 단계 2)의 바이오칩을 세척하는 단계; 및

4) 단계 3)의 바이오칩을 감광하여 인산화 정도를 측정하는 단계를 포함하는 피검 시료 내에 상기 인산화효소에 특이적인 기질의 검출 방법을 제공한다.

상기 방법은 정해진 농도의 기질이 집적된 바이오칩을 이용하여 시료 내의 상기 기질을 정량하는 단계를 추가적으로 포함한다.

상기 단계 1)에서 피검 시료의 예로는 세포 배양액, 세포 분쇄액, 세포 또는 조직의 조 추출액, 소변, 땀, 타액, 눈물 등 각종 분비액, 또는 혈액, 혈장, 림프액, 혈청 등 각종 체액 등이 있으며, 피검 시료는 기판에 직접 고정되는 것이 바람직하다. 또한, 피검 시료의 스팟 직경은 40-60 ㎛, 간격은 300-500 ㎛, 양은 스팟 당 1 nℓ 이내인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 1)의 기판은 유리, 플라스틱, 금속 또는 실리콘 등을 이용할 수 있으나 이에 제한은 없다.

또한, 상기 단계 1)의 활성기는 아민기(amine group), 알데하이드기(aldehyde group), 카르복실기(carboxyl group) 및 티올기(thiol group)로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

단계 2)에서 바이오칩은 차단 용액으로 차단 처리할 수도 있으나 차단 처리를 하지 않더라도 노이즈 없는 신호를 수득할 수 있으므로, 차단 용액을 처리하지 않는 것이 바람직하다.

단계 2)의 인산화효소와 바이오칩을 반응시키는 조건은 30℃ 또는 37℃의 습윤 챔버에 30분 내지 1 시간 반응시키는 것이 바람직하며, 1 시간 반응시키는 것이 가장 바람직하나, 인산화효소와 피검 시료 간의 특이성을 고려하여 반응 시간은 유동적일 수 있다.

단계 4)에서 바이오칩을 감광시키는 방법은 X-레이 필름 또는 방사형광분석기에 감광시키는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 감광 시간은 12 시간 내지 24 시간이 바람직하며 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 감광 시간은 키나아제와 피검 시료간의 특이성을 고려하여 유동적일 수 있다.

현재까지는 기질을 검출하기 위하여 웨스턴 블랏팅 분석을 주로 이용하여 왔으나, 상기와 같은 방법으로 방사성 동위원소 [γ-³²P]ATP와 인산화효소를 이용하면 피검 시료 내의 기질을 고감도, 단순화된 공정으로 검출 및 정량할 수 있다.

본 발명의 인산화 반응 측정용 바이오칩과 키트 및 이를 이용한 인산화 반응 측정 방법은 방사성 동위원소를 사용하여 감도를 높임으로써 항체를 이용하는 기존의 방법보다 적은 양의 시료만으로 간단하고 신속하게 인산화 반응을 측정할 수 있으며, 본 발명의 바이오칩은 차단 단계를 거치지 않아도 매우 깨끗한 결과를 얻을 수 있어 시간적, 경제적인 장점이 있다. 또한, 최소량의 시료만을 사용하므로 스팟 크기가 현저히 작아 기존의 칩에 비해 일정 면적 내에 집적할 수 있는 스팟의 수가 많으므로 빠른 시간 내에 많은 시료를 분석할 수 있으므로 키나아제 활성 분석에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 비교예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 비교예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 비교예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 말릭효소 - 캠타이드 ( malic enzyme - kemptide ) 융합 단백질의 제조

<1-1> E. coli 말릭효소 - 캠타이드 융합 단백질의 클로닝

우선 E. coli 말릭효소-캠타이드 융합 재조합 단백질을 위하여, 우선 새로운 균주를 제조하였다. E. coli의 sfcA 유전자(말릭효소)를 증폭하기 위하여 센스프라이머(5'-CATGCCATGGGCATCACCATCATCACCATGATATTCAAAAAAGAGTG; 서열번호 1)와 안티센 스프라이머(5'-GCTCTAGATTAGCCCAGGCTCGCACGACGCAGGATGGAGGCGGTA; 서열번호 2)를 이용하여 E. coli W3110의 염색체 DNA를 주형으로하여 PCR하였다. PCR 반응은 2.0 unit Taq DNA 폴리머라제(50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 1.5 mM MgCl₂, 0.01% gelatin, 0.1% Triton X-100), 0.4 mM dNTP, 상기 프라이머쌍의 반응액에서 Palm-cycler(Corbett Life Science, USA)를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분 동안 전변성화(pre-denaturation)시킨 후, 94℃에서 1분; 55℃에서 1분; 및 72℃에서 1분으로 한 사이클을 30회 반복한 다음, 72℃에서 5분간 최종 확장(extension)시켜 반응을 종결시켰다. PCR산물은 1% 아가로스겔을 이용하여 전기영동 한 후, ETBR(ethidium bromide)로 염색 확인 후, 증폭된 원하는 사이즈의 DNA(1.8 kb)를 EasyTrap ver.2(Takara Bio Inc. Japan)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물에 캠타이드를 융합시킨 후, 제한효소 NcoI과 XbaI으로 제한하였다. 같은 제한효소로 잘라낸 플라스미드 pTrc99A (Pharmacia, Sweden)에 상기 제한된 캠타이드가 융합된 PCR 산물을 라이게이션(ligation)하였고, E. coli BL21(DE3)로 형질전환하여 E. coli 말릭효소-캠타이드 융합 재조합 단백질을 위한 새로운 균주를 제조하였다.

<1-2> E. coli 말릭효소 - 캠타이드 융합 단백질의 생산 및 정제

상기 실시예 <1-1>에서 제조된 균주를 200 ㎖ LB배지(tryptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, NaCl 5 g/L)를 500 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고 37 ℃, 200 rpm 조건에서 배양하였다. 이때 항생제 암피실린의 최종농도는 50 ㎍/㎖이 되게 주입하였다. 세포를 약 O.D.(흡광도) 660=0.6 정도까지 배양하고, 최종농도 1 mM이 되도록 IPTG를 첨가하였고, 다시 37 ℃, 200 rpm의 조건에서 3 시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포를 집균(8,000 rpm, 10분, 4 ℃)하여 정제하는데 사용하였다. 집균된 세포를 PBS 용액(200 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM KH2PO4, 1 mM Na₂HPO₄, pH 7.5)에 현탁한 후, 초음파파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 다음으로 원심분리를 하여, 세포 찌꺼기를 제거하였다. E. coli 말릭효소-캠타이드 융합 단백질의 정제는 6-히스티딘 태그(histidine tag)에 대한 Ni-킬레이팅 수지(GE Healthcare, Sweden)를 이용하여 정제하였다. 정제된 단백질은 BSA (bovine serum albumin)를 표준으로 하여 브래드포드(Bradford) 방법에 의해 정량하였다.

< 실시예 2> 바이오칩( bipchip )의 제조

먼저, 슬라이드 글라스 상에서 기질의 고정을 위해 기질인 켐타이드(Promega, Madison, WI) 또는 말릭효소-캠타이드(malic enzyme-kemptide) 융합 단백질을 고정하였다. 구체적으로 켐타이드 용액(10% 글리세롤(glycerol), 60% PBS, pH 7.5)에 0.1 mg/㎖의 농도로 용해시키고, 상기 기질 용액을 마이크로어레이 기기[Affymetrix 417 Arrayer (Takara Shuzo, Japan)]를 이용하여 알데하이드 처리된 슬라이드 글라스 위에 스팟 간 간격이 300 ㎛가 되도록 집적하였다(2500 개/1 cm²). 또한, 상기 실시예 1에서 제조된 말릭효소-캠타이드(malic enzyme-kemptide) 도 상기 슬라이드 글라스 위에 스팟 간 간격이 300 ㎛가 되도록 집적하였다(2500 개/1 cm²). 이때, 각 스팟의 크기는 50 ㎛가 되도록 하였다.

상기와 같이 집적한 바이오칩을 30℃의 습윤 챔버(humid chamber) 안에서 1 시간 반응시켜 고정시켰다.

< 실시예 3> 키나아제 -기질 반응 조건 확인

실시예 2에서 제작한 바이오칩은 세척 완충용액(washing buffer: 2 mM KH2PO4, 1 mM Na₂HPO₄, 200 mM NaCl, 3 mM KCl, pH 7.5)을 이용하여 3 회 세척한 후, 칩 상의 기질과 키나아제를 반응시켰다. 구체적으로 키나아제 완충용액(kinase buffer: 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, pH 7.5)으로 1회 세척하였고, 100 μM ATP가 첨가된 키나아제 완충용액으로 전-반응(pre-incubation) 시켰다. 이 후 키나아제 용액(2 ㎕[γ-³²P]ATP(20 uCi)과 10 unit cAMP-의존 단백질 키나아제를 포함하는 키나아제 완충용액) 200 ㎕를 상기 바이오칩 표면에 분주하고 커버 웰(cover well)로 덮어 1 시간 동안 반응시켰다.

1 시간 후에 세척 완충용액으로 3 회 세척 후 증류수로 세척하였고, 200 xg, 1 분 조건으로 원심분리하여 여분의 수분을 완전히 제거하였다. 상기 반응시킨 바이오칩을 X-선 필름에 12-24시간 감광하여 키나아제에 의한 인산화 반응을 측정하였다.

그 결과, 예상되는 바와 같이 음성 대조군(negative control)으로 선정된 1번 BSA의 스팟에는 아무런 시그널이 나오지 않았다. 반면에 말릭효소-캠타이드(malic enzyme-kemptide) 융합 단백질 또는 캠타이드의 스팟에서는 확연히 스팟 시그널을 확인할 수 있어 일차적으로 인산화반응에 방사성 동위원소 [γ-³²P]ATP의 적용 유효성을 검증할 수 있었다(도 5).

이어, 본 발명자들은 본 발명의 바이오칩이 상기 X-선 필름은 물론 방사형광분석기의 검출 방법으로 검출되는지 확인하기 위하여 상기 실시예 2의 바이오칩 제조 과정에서 켐타이드를 "RFT"(Road to Fine Tomorrow)로 집적한 후 상기와 같은 조건으로 인산화반응을 실시하였다. 그 후 필름에서 감광하여 현상한 것과 이미지 플레이트(IP)에서 감광하여 방사형광분석기 장치(bioimage analyzer BAS1500)에서 스켄한 것을 비교하였다. 그 결과, 감광시간이 달라 정확한 감도를 확인하는 것은 어려우나, 이론상으로는 필름에 비해 IP는 필름에 비해 약 100배의 검출능력을 갖고 있었다(도 6). 따라서, 감광시간이 약 43%밖에 안되는 IP에서도 뚜렷히 시그널을 확인할 수 있었고, 또한 더욱 고감도의 검출이 가능한 IP를 이용하였을 때 조기진단을 위한 고감도 효과를 갖을 수 있을 것이다. 더욱이 -80 ℃에서 감광해야 시그널이 더 강해지는 필름에 비해, 실온에서 IP를 감광하였으므로 활용도면에서 IP가 유용하다고 볼 수 있다.

< 비교예 1> 기질고정 후 칩표면처리에 대한 여러가지 차단 용액의 효과

0.1 ㎎/㎖ 대장균 말릭효소-캠타이드 융합 단백질 및 1.25 μg/㎖ 캠타이드를 알데히드 처리된 슬라이드 글라스 위에 집적한 후, 10 unit/㎖ PKA와 0.1 μCi/㎕[γ-³²P]ATP의 농도로 하여 바이오칩에 방사성 동위원소 [γ-³²P]ATP의 적용 유효성을 확인해 보았다. 음성 대조군(negative control)으로는 소혈청알부민(BSA, Bovine Serum Albumin)로 하였다. 그리고 각각 대장균 말릭효소-캠타이드 융합 단백질 및 캠타이드를 알데히드 처리된 슬라이드 글라스 위에 집적한 후, 인산화반응(10 unit/㎖ PKA, 0.4 μCi/㎕ [γ-³²P]ATP)을 하기 전에 시행하는 차단 단계에서 여러 가지 용액을 이용하여 차단 효과를 알아보았다. 일반적으로 사용하는 1% BSA 뿐만 아니라 1% 글라이신, 10% 글리세롤, 무처리조건으로 각각 37 ℃, 1 시간 동안 차단한 후, 인산화반응을 시행하였다.

그 결과, 보편적으로 사용하는 1% BSA 뿐만 아니라 1% 글라이신, 10% 글리세롤을 처리한 곳에서도 깨끗한 스팟을 확인하였다. 더욱이 아무것도 처리하지 않는 곳에서도 스팟 이외의 백그라운드 부분이 매우 깨끗하였다(도 7).

<실시예 4> 방사성 동위원소를 이용한 IkB에 특이적인 기질의 검출

IkB를 검출하기 위하여 알데히드기가 코팅된 유리기판에 용해된 세포의 총단백질을 고정화하여 기질 분석용 바이오칩을 제조하였다. 바이오칩 제조 과정은 기판에 고정된 기질을 제외하고는 실시예 2와 동일하였다. 이어, 상기 바이오칩을 세척하고 키나아제(IkB kinase; IKK)와 [γ-³²P]ATP를 처리하여 반응시킨 후, X-선 필름에서 인산화반응을 측정하였다.

그 결과, 예상되는 바와 같이 음성 대조군(negative control)으로 선정된 1번 BSA의 스팟에서는 아무런 시그널이 나오지 않았다. 반면, 용해된 세포의 총단백질의 스팟에서는 확연히 스팟 시그널을 확인할 수 있었다(도 8).

도 1은 키나아제 어세이(kinase assay)의 기작을 도식화한 도면이다:

K: 키나아제(kinase); 및

S: 기질.

도 2는 켐타이드(kemtide)와 cAMP-의존 단백질 키나아제(cAMP-dependent protein kinase) 간의 반응 원리를 도식화한 도면이다.

도 3은 방사성 동위원소를 사용한 바이오칩 상의 반응을 도식화한 도면이다.

도 4는 바이오칩의 모식도이다.

도 5는 방사성 동위원소를 이용한 바이오칩 적용 유효성을 나타낸 사진이다:

1: 음성 대조군(소혈청알부민, BSA);

2: 대장균 말릭효소-캠타이드 융합 단백질; 및

3: 캠타이드.

도 6은 인산화반응 후 검출 기술에 대한 비교를 나타낸 사진이다.

도 7은 [γ-³²P]ATP를 이용한 인산화반응에서 여러가지 차단 용액의 효과를 나타낸 사진이다:

a: 차단 용액 무처리;

b: 1% 소혈청알부민;

c: 1% 글라이신;

d: 10% 글리세롤;

1: 소혈청알부민;

2: 대장균 말릭효소-캠타이드 융합 단백질; 및

3: 캠타이드.

도 8은 방사성 동위원소를 이용한 바이오칩 적용 유효성을 나타낸 사진이다:

1: 음성 대조군(소혈청알부민, BSA); 및

2: 용해된 세포의 총단백질.

<110> Korea Atomic Energy Research Institute <120> The biochip for the detection of phosphorylation and the detection method using the same <130> 7p-06-11 <150> KR2006-65146 <151> 2006-07-12 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 1 catgccatgg gcatcaccat catcaccatg atattcaaaa aagagtg 47 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 2 gctctagatt agcccaggct cgcacgacgc aggatggagg cggta 45

Claims (28)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 1) 인산화 효소에 특이적인 기질 펩타이드를 활성기가 코팅된 기판 표면에 직접 집적하고, 차단 용액으로 차단 처리하지 않은 인산화 반응 측정용 바이오칩을 제조하는 단계;

    2) 피검 시료를 [γ-³²P]ATP와 혼합하는 단계;

    3) 단계 2)의 혼합한 피검 시료를 단계 1)의 바이오칩에 처리하여 인산화 반응을 유도하는 단계;

    4) 단계 3)의 바이오칩을 세척하는 단계; 및

    5) 단계 4)의 바이오칩을 감광하여 인산화 정도를 측정하는 단계를 포함하는 인산화 반응 측정 방법.
12. 제 11항에 있어서, 단계 2)의 피검 시료는 세포 배양액, 세포 분쇄액, 세포 또는 조직의 조 추출액, 소변, 땀, 타액, 눈물 등 각종 분비액, 또는 혈액, 혈장, 림프액, 혈청 등 각종 체액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인산화 반응 측정 방법.
13. 삭제
14. 제 11항에 있어서, 단계 3)의 반응 시간은 30℃ 또는 37℃에서 30-60분인 것을 특징으로 하는 인산화 반응 측정 방법.
15. 제 11항에 있어서, 단계 5)의 감광 방법은 X-선 필름(X-ray film) 또는 방사형광분석기에 감광시키는 것을 특징으로 하는 인산화 반응 측정 방법.
16. 1) 세포 배양액, 세포 분쇄액, 세포 또는 조직의 조 추출액, 소변, 땀, 타액, 눈물 등 각종 분비액, 또는 혈액, 혈장, 림프액, 혈청 등 각종 체액으로 이루어진 군에서 선택된 피검 시료를 활성기가 코팅된 기판 표면에 직접 집적하고 차단용액으로 차단 처리하지 않은 기질 분석용 바이오칩을 제조하는 단계;

    2) 인산화효소(kinase)와 [γ-³²P]ATP를 단계 1)의 바이오칩에 처리하여 인산화 반응을 유도하는 단계;

    3) 단계 2)의 바이오칩을 세척하는 단계; 및

    4) 단계 3)의 바이오칩을 감광하여 인산화 정도를 측정하는 단계를 포함하는 피검 시료 내에 상기 인산화효소에 특이적인 기질의 검출 방법.
17. 제 16항에 있어서, 인산화 효소는 IkB인 것을 특징으로 하는 기질의 검출 방법.
18. 제 16항에 있어서, 정해진 농도의 기질이 집적된 바이오칩을 이용하여 시료 내의 상기 기질을 정량하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 기질의 검출 방법.
19. 삭제
20. 삭제
21. 제 16항에 있어서, 단계 1)의 피검 시료의 스팟 직경은 40-60 ㎛이며, 간격은 300-500 ㎛인 것을 특징으로 하는 기질의 검출 방법.
22. 제 16항에 있어서, 단계 1)의 피검 시료의 양은 스팟 당 1 nℓ 이내인 것을 특징으로 하는 기질의 검출 방법.
23. 제 16항에 있어서, 단계 1)의 기판은 유리, 플라스틱, 금속 및 실리콘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 기질의 검출 방법.
24. 제 16항에 있어서, 단계 1)의 활성기는 아민기(amine group), 알데하이드기(aldehyde group), 카르복실기(carboxyl group) 및 티올기(thiol group)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 기질의 검출 방법.
25. 제 16항에 있어서, 단계 2)의 인산화효소(kinase)는 오로라 카이네이즈(Aurora kinases; BTAK, STK15), 티로신 키나아제(tyrosine kinase; Lyn), PTK (protein tyrocine kinase), MAPK (MAP kinase), MAPKK (MAP kinase kinase), PKA (protein kinase A), PKC (protein kinase C), ERK (extracellular signal-regulated kinase), CAM KⅡ(calcium/Calnodulin-dependent protein kinase), MEKK (MAP/ERK kinase kinase), JNK (c-Jun N-terminal kinase), SAPK (stress-activated protein kinase), p38K (p38 kinase), phosphatase 2B, cPKC (conventional protein kinase), Serine Kinase IKKβ, Ab1K (Ab1 kinase), BTK (Bruton tyrosine kinase), CDK (cyclin-dependent kinase), VEGF-RTK (Vascular endothelial growth factor-receptor tyrosine kinase), AKT1 kinase, AKT2 kinase, AKT3-kinase, PK (Pyruvate kinase), Tumor M2-pyruvate kinase로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 기질의 검출 방법.
26. 삭제
27. 제 16항에 있어서, 단계 2)의 반응 시간은 30℃ 또는 37℃에서 30-60분인 것을 특징으로 하는 기질의 검출 방법.
28. 제 16항에 있어서, 단계 4)의 감광 방법은 X-선 필름(X-ray film) 또는 방사형광분석기에 감광시키는 것을 특징으로 하는 기질의 검출 방법.

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