KR100935826B1 - 부유밀도구배 원심분리를 이용하여 말초혈액단핵구로부터 단세포를 분리하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 목적은 종래 방법에 비하여 용이하고 경제적이며 고순도 및 고수율로 단세포를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은,
히스토페이크(Histopaque) 또는 피콜(ficoll) 용액을 이용하여 말초혈액단핵구(PBMC)를 부유밀도 구배 원심분리함으로써, 말초혈액단핵구로부터 단세포를 분리하는 것을 특징으로 한다.
이때, 히스토페이크(Histopaque) 또는 피콜(ficoll) 용액의 밀도와 삼투압 농도는 각각 1.071~1.073 g/ml 및 330~340 Osm/L H2O, 더 바람직하게는 1.072 g/ml 및 335 Osm/L H2O인 것을 특징으로 한다.
부유밀도구배 원심분리, 말초혈액단핵구, 단세포
Description
본 발명은 부유밀도구배 원심분리를 이용하여 말초혈액단핵구(PBMC, peripheral blood mononuclear cell)로부터 단세포(monocyte)를 분리하는 방법 및 그렇게 하여 얻어진 단세포를 이용하여 수지상세포를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 종래 방법에 비하여 용이하고 경제적이며 고순도 및 고수율로 단세포를 분리하는 방법 및 그를 이용한 수지상세포의 제조방법에 관한 것이다.
수지상세포 (DCs)는 종양 특이적 T-세포 반응 유도에 중요한 역할을 한다. 이 점을 착안하여 암환자에게 종양을 치료하거나 예방하기 위한 목적으로 수지상세포의 연구가 10년 진행되고 있다. 수지상세포(DCs)를 얻기 위한 가장 일반적인 방 법은 CD14+ 단세포로부터 수지상세포(DCs)를 체외에서 배양하는 것이다. 따라서 임상에 적용하기 위한 충분한 수지상 세포를 얻기 위해서는 많은 양의 단세포를 고수율과 고순도로 분리해야 한다.
현재까지 사용되고 있는 단세포를 분리하는 방법으로서 플라스틱 부착(plastic-adherent) 단세포 분리 방법은 여전히 가장 많이 사용되는 수단 중 하나이긴 하지만, 단세포를 분리하기 위해 플라스크에서 1-2시간 동안 PBMC를 배양한 다음 부착하지 않은 세포를 직접 제거해야 하는 노동 집약적이고 시간 소모적인 방법이며 얻고자 하는 단세포의 수율이 낮고 (회수율 약 10% 이하) 활성화되는 경향이 있다. 또한, CD14+ 마그네틱 비드(magnetic bead; positive selection) 사용, B와 T 세포의 고갈(negative selection) 또는 일루트리에이션(elutriation) 등, 단세포를 분리하는 여러 개의 다른 방법이 있는데, 이들 기법은 값비싼 장비와 기술적 스킬이 필요하다.
1960년 후반부터 1980년대까지, 밀도구배 원심분리 방법에 기반하여 단세포 분리를 위한 많은 프로토콜이 고안되었고 현재까지 이 밀도구배 원심분리 방법은 여전히 매력적이고 경제적인 방법으로 이용되고 있다. 최근에는 림프구와 단세포의 겹치는 밀도로 인해 밀도 차이를 기반으로 효과적인 분리는 어려운 것으로 입증되었지만 삼투압 및 밀도 구배 용액을 사용하여 개선할 수 있었다. 원리는 삼투압이 증가함에 따라 세포는 내부의 물을 방출하여 밀도를 높여 그렇지 않으면 통과하지 못했을 밀도 장벽을 통과할 수 있게 된다는 것이다. 림프구는 단세포보다 삼투압의 증가에 민감하다. 결과적으로 림프구는 단세포보다 더 작고 더 밀도가 높은 경향이 있기 때문에 림프구와 단세포는 분리할 수 있는 것이다. 하지만, 이를 이용한 여러 연구에서 삼투압 농도가 높을수록 단세포의 순도가 증가하였고 생존율의 변화는 없었지만 단세포의 수율이 떨어지는 단점이 발견되었다. 이점을 해결하기 위해 본 발명에서는 밀도 및 삼투압을 적절히 조절하여 단세포의 수율 및 순도를 높이고자 한다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 종래 방법에 비하여 용이하고 경제적이며 고순도 및 고수율로 단세포를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
이에 본 발명의 발명자는, PBS(Phosphate Buffered Saline, 인산염완충액) 및 NaCl을 이용하여 밀도와 삼투압 농도를 각각 1.072 g/ml과 335 Osm/L H2O로 조정한 히스토페이크(Histopaque) 또는 피콜(ficoll) 용액을 사용하여 부유밀도구배 원심분리를 함으로써 PBMC에서 단세포를 고순도 및 고수율로 분리하는, 쉽고 간단한 방법을 개발하게 되었다. [‘히스토페이크’나 ‘피콜’이라는 이름은 실험실에서 널리 사용되는 이름으로서, 그 물건을 용이하게 입수할 수 있고 그로써 물건 자체가 명확히 특정되기도 한다는 점을 밝히고자 한다.]
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은,
히스토페이크(Histopaque) 또는 피콜(ficoll) 용액을 이용하여 말초혈액단핵구(PBMC)를 부유밀도 구배 원심분리함으로써, 말초혈액단핵구로부터 단세포를 분리하는 것을 특징으로 한다.
이때, 히스토페이크(Histopaque) 또는 피콜(ficoll) 용액의 밀도와 삼투압 농도는 각각 1.071~1.073 g/ml 및 330~340 Osm/L H2O, 더 바람직하게는 1.072 g/ml 및 335 Osm/L H2O인 것을 특징으로 한다.
또한 이때, 히스토페이크(Histopaque) 또는 피콜(ficoll) 용액의 밀도와 삼투압 농도를 각각 위와 같은 수치로 하기 위한 수단으로서 히스토페이크(Histopaque) 또는 피콜(ficoll) 용액에 PBS와 NaCl 용액을 혼합하는 것을 특징으로 한다.
또한 위와 같은 방법으로 분리한 단세포를 배양함으로써 수지상세포를 얻는 것을 특징으로 한다.
위와 같이 조절된 히스토페이크(Histopaque) 또는 피콜(ficoll) 용액을 사용하여 부유밀도구배 원심분리를 시행한 결과, 후술하는 바와 같이 회수된 단세포의 순도는 71.44%~82.38%의 범위를 나타내었고 평균 74.75 ± 3.84%이었다. 또한, 수율은 21.02 ~ 53.63%의 범위를 나타내어 평균 32.62 ± 11.16%이었다. 또한 이렇게 부유밀도구배 원심분리에 의해 분리된 단세포를 수지상세포로 분화 유도시켜 그 형태, 표현형, 기능적인 면을 분석해 보았을 때 전형적인 수지상세포로 분화됨을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명에 따른 방법은 앞서 간단히 살핀 종래의 방법보다 용이하고 경제적이다. 이러한 장점을 바탕으로 임상단계에서 수지상세포를 안전하고 효율적으로 배양할 수 있는 클로즈 시스템(closed system)에도 적용이 가능할 것으로 기대된다.
이하, 본 발명을 실시예와 함께 상세히 설명한다.
Ⅰ. 재료 및 방법
1. 채혈
건강한 지원자에게 해당 사실을 알리고 동의를 받은 후 말초혈액을 채취했다. 각 기부자에 대해 CPDA-1이 포함된 트리플백으로 최소 350ml의 혈액이 채혈하였다.
2.
buffy
coat
분리
트리플백으로 채혈한 혈액을, 실온에서 550 × g로 20분 동안 swinging bucket rotor가 장착된 원심분리기에서 원심분리하였다(Hanil Science, Korea).
분리된 buffy coat 30-40ml를 50ml 코니컬(conical) 튜브에 넣고 일부를 취하여 CBC와 WBC 분석을 시행하였다.
3.
PBMC
분리
분리된 buffy coat는 같은 양의 PBS에 희석시켰다. 15ml의 Histopaque-1077 용액을 50ml 코니컬 튜브에 넣고 희석된 buffy coat를 조심스럽게 Histopaque-1077 용액 위층에 올린다. Buffy coat-Hisopaque는 실온에서 30분 동안 400 × g로 원심분리 하였다.
원심분리 후 다음과 같이 층이 분리되었다. :
- 첫 번째 층 : 혈장성분
- 두 번째 층 : 말단혈액단핵구(PBMC) 성분
- 세 번째 층: Histopaque 용액
- 네 번째 층: RBC를 포함한 세포층
두 번째 층을 채집하고 PBS 5 ~ 40ml로 3번 세척하였다.
4. 단핵구 분리
밀도와 삼투압 농도가 각각 1.072g/ml 및 335 Osm/L H2O로 조절된, 발명자가 안출한 최적의 밀도구배 용액을 만들기 위해 9.35ml Histopaque-1077 또는 피콜(ficoll) 용액을 0.65ml PBS와 50ul 5M NaCl 용액으로 혼합하였다.
채집된 세포는 조절된 Histopaque 또는 피콜(ficoll) 용액 5ml으로 완전히 부유시키고 15ml의 코니컬 튜브로 옮긴 다음 실온에서 20분 동안 600 × g로 원심분리하였다.
상단 밴드, 상부 중간 부분, 하부 중간 부분과 하단 부분을 포함한 네 부분을 따로 채집하였다. 채집된 각 부분은 PBS 10ml로 세번 세척하였다(Fig 1, 2)
Fig 1. 부유밀도구배 원심분리 후 각 부분의 개요도
(위에서부터 순서대로, 상단 밴드, 상부 중간 밴드, 하부 중간 밴드, 하단 밴드)
Fig 2. 부유밀도구배 원심분리 후에 찍은 사진
(위에서부터 순서대로, 상단 밴드, 상부 중간 밴드, 하부 중간 밴드, 하단 밴드)
5. 단핵구 분리를 위해 걸리는 시간
아래와 같이 필요한 전반적 시간은 약 2.5시간이었다.
(1) Histopaque-1077 원심밀도구배에서 buffy coat로부터 말초혈액 단핵구(PBMC) 분리: 60분.
(2) 세포 카운팅: 10분
(3) 원하는 세포 농도로 세포 현탁액 준비: 10분
(4) 1.072 g/ml 및 335 Osm/L H2O로 조절된 Histopaque 또는 피콜(ficoll) 용액 준비: 15분
(5) 조절된 Histopaque 또는 피콜(ficoll) 용액에서 말초혈액단해구(PBMC)로부터 단세포 분리: 20분
(6) 4개 부분으로부터 세포를 분리하고 세포를 세척: 20분
(7) 각 부분의 세포 카운팅 : 15분
아래 Fig 3은 부유밀도구배 원심분리를 이용한 단세포 분리 절차의 흐름도이다.
Fig 3. 부유밀도구배 원심분리를 이용한 단세포 분리 절차의 도식 흐름도
6.
수지상세포
배양
수지상세포는 상단 밴드에서 농축된 단세포로부터 효과적으로 분화 유도 되었다. 농축된 단세포는 GM-CSF (1000 U/mL, LG Life Sciences, Seoul, Korea) 및 IL-4 (1000 U/mL, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)이 포함된 무동물혈청배지에서 1×106 cells/mL의 농도로 배양되었다.
배양은 5% CO2 및 37℃ 인큐베이터에서 수행되었고, 사이토킨이 보충된 신선 한 배지는 2~3일 간격으로 추가하였다. 배양 6일째, 표면항원과 미성숙수지상세포의 포식자용을 분석하기 세포를 수거하였다. 또한, 미성숙수지상 세포는 TNF-a (10 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, Minn.), IL-1b (10 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, Minn.), IL-6 (1000 U/ml; R&D Systems, Minneapolis, Minn.) 및 PGE2 (1 ug/ml; Sigma) 첨가하여 12 ~ 24시간 동안 성숙시켜 7일째 수거하였다. 세포분화 과정은 광학 현미경으로 모니터하였다.
7.
유세포
분석을 위한 세포 준비
각 부분의 단핵세포 개체수의 백분율과 표현형을 측정하기 위해 유세포 분석을 수행하였다.
(1) 각 부분의 세포는 다음의 FITC(fluorescein isothiocyanate)-, phycoerythrin (PE)- 또는PE/cyanin (PC5)-결합 단클론 항체 (mAbs): CD3, CD4, CD8, CD14, CD19 (Beckman Coulter)로 각 부분의 세포의 표현형을 분석하였다.
(2) FITC- 또는 PE- 결합 단클론 항체 : HLA-ABC, HLA-DR, CD11c, CD14, CD54, CD80, CD83, CD86 (Beckman Coulter)를 사용하여 각 성숙화 단계에서 수지상세포의 표면 항원을 분석하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위해 PI(Propidium iodide)로 염색하여 분석하였다.
각 단클론항체와 세포는 결합을 위해 4℃에서 20분 동안 반응시켰다. EPICS XL Flow Cytometer Coulter를 사용하여 분석이 수행되었다.
8.
FITC
-
Dextran
을 이용한 포식작용 측정(
Endocytosis
Assay
)
미성숙 수지상세포는 성숙한 수지상세포에 비하여 항원을 인식하여 포식하는 능력이 우수하다고 알려져 있다. 따라서 본 발명의 방법에 따라 분화된 미성숙수지상세포의 Dextran-FITC 업테이크(uptake) 정도를 유세포 분석기로 측정하여 포식능을 확인하였다. 미성숙수지상세포 (1× 106/㎖)에 Dextran-FITC를 1㎎/㎖의 농도로 처리하고 37℃에서 1시간 배양하였다. 수지상세포를 4℃에서 1시간 동안 배양시킨 것을 음성 대조군으로 사용하였으며, 배양 후에는 PBS로 2회 세척하여 유세포 분석기로 분석하였다.
Ⅱ. 결과
1.
부유밀도구배
원심분리 후 단세포 순도와 수율 평가
밀도와 삼투압이 조절된 Histopaque (1072-335) 용액을 이용하여 부유밀도구배 원심분리하면 상단 밴드 (TOP), 상부 중간(UM)과 하부 중간(LM) 부분 및 하단 펠렛(BOT)를 포함한 4개의 부분으로 나누어진다. 각 층의 세포를 수거하여 CD3와 CD14에 대한 단클론 항체를 이용하여 단핵구의 수율, 회수율과 순도를 측정하였다(표 1). 대표적으로 donor #2의 유세포 분석(flow cytometric analysis) 자료는 Fig 4에 나와 있다. 초기 PBMC에서 단세포 (CD3- 및 CD14+)의 평균 비율(mean percentage)은 14.28 ± 3.79%(mean ± SD)였다. 단세포는 상단 밴드에서 가장 많이 얻을 수 있었다. 단세포의 평균 순도는 74.75 ± 3.84%였고 개별 순도는 71.44%~82.38%이었다. 또한, 단세포의 평균 수율은 32.62 ± 11.16%이었고, 개별 수율 범위는 21.02 ~ 53.63%였다. 수율과 순도는 위에서 아래로 가면서 점차적으로 줄어들어 표 1에 예시된 것처럼 하단 부분에서 최저의 수율과 순도를 보였다.
표 1. 단세포 분리 후 각 부분의 단세포 순도, 수율과 회수율 결과.
[이 데이타는 7명의 기부자에게서 측정한 자료이다. 각 부분의 평균 단세포비율은 단세포 수율, 순도와 회수율로 제시되었다. 각 부분의 세포 부유액은 전방 스캐터(FSC) VS 측면 스캐터(SSC) 도트 플롯(단세포 게이트)을 사용하여 유세포 분석기 로 분석되었다. a 부유 밀도구배 원심분리 후 상단 밴드(단세포 농축 부분), b 부유 밀도구배 원심분리 후 상부 중간 부분, c 부유 밀도구배 원심분리 후 하부 중간 부분, d 부유 밀도구배 원심분리 후 펠렛]
Fig 4. 유세포 분석기를 이용하여 부유밀도구배 원심분리 후 각 부분의 단세포 순도분석. [대표적으로 기부자 #2의 CD3 과 CD14 단클론항체를 이용한 유세포 분석 자료이다. histopaque-1077 단계 후 PBMC (A) 상단 밴드 (B), 상부 중간 부분 (C), 하부 중간 부분 (D), 하단 부분 (E)]
2.
부유밀도구배
원심분리로 분리된 단세포에서 유도된
수지상세포의
포식 작용 및 표현형
수지상세포를 부유밀도구배 원심분리 후 상단 부분에 농축된 단세포에서 수지상세포로 효율적으로 분화유도가 되는지 확인하였고, 그 결과 단세포는 수지상 세포로 성공적으로 분화되었다(Fig 5). 배양된 세포는 단세포와 비교하여 전형적인 미성숙수지상세포 형태를 나타내었고 HLA-ABC, HLA-DR, CD11c, CD54, CD80, CD86 및 CD83 표면항원을 측정하여 수지상세포임을 확인하였다(Fig 6). 분화 후, CD14 단세포 표현형은 거의 나타나지 않았고 상단 부분의 단세포로부터 유도된 미성숙수지상세포는 포식능이 매우 높게 나타났다(Fig 7).
그리고 co-stimulating molecule로 알려진 CD80과 CD86의 발현 정도가 성숙 수지상세포에서 증가했으며, 특히 성숙수지상세포에서 발현된다고 알려져 있는 CD83의 발현이 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한, adhesion molecule로 알려진 CD54의 발현 정도도 성숙수지상세포에서 증가함을 알 수 있었다.
결과적으로 부유밀도구배 원심분리를 이용한 단세포 분리 방법은 수지상세포의 포식작용과 분화능에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.
Fig 5. 상단 밴드에서 농축된 단세포로부터 분화 유도된 수지상세포
(A) 부유밀도구배 원심분리 후 상단 밴드에서 농축된 단세포.
(B) 상단 밴드에서 농축된 단세포로부터 유도한 수지상세포.
[상단 밴드에 분리된 단세포는 IL-4 (1000 U/ml) 및 GM-CSF (1000 U/ml)가 첨가된 무동물혈청배지에서 6일 동안 배양되었다.]
Fig 6. 부유밀도구배 원심분리 후 상단 밴드에서 농축된 단세포로부터 분화 유도된 수지상세포의 표면항원
[IL-4 (1000 U/ml) 및 GM-CSF (1000 U/ml)가 첨가된 무동물혈청배지에서 단세포를 7일 동안 배양했다. TNF- (10 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, Minn.), IL-1 (10 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, Minn.), IL-6 (1000 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, Minn.) 및 PGE2 (1 g/ml Sigma)는 6일째 수지상 세포의 성숙화를 유도하기 위해 첨가되었다. 미성숙 수지상세포 표면항원 (A), 성숙 수지상세포 표면항원 (B)]
Fig 7. 미성숙 수지상세포에 의한 포식작용
[미성숙 수지상세포(1× 106/㎖)에 Dextran-FITC를 1㎎/㎖의 농도로 처리하고 37℃에서 1시간 배양하였다. 수지상세포를 4℃에서 1시간 동안 배양시킨 것을 음성 대조군으로 사용하였으며, 배양 후에는 PBS로 2회 세척하여 유세포 분석기로 분석하였다.]
Ⅲ. 정리
수지상세포 임상연구에서 충분한 단세포 유래 수지 세포를 얻기 위해서는 많은 양의 단세포를 고수율과 고순도로 분리해야 하는바, 본 발명에서는 밀도와 삼투압을 PBS 및 NaCl 용액으로 1.072g/ml 및 335 Osm/L H2O로 조절된 Histopaque 또는 피콜(ficoll)용액을 사용하여 말초혈액 단핵구로부터 고순도와 고수율 단세포를 분리하도록 하였다. 밀도 및 삼투압이 조절된 Histopaque 또는 피콜(ficoll) 용액에서 부유밀도구배 원심분리 후 단세포는 상단 밴드에서 농축되었고 혈소판(platelet) 오염은 거의 없었다(데이터에 표시되지 않음). 상단 밴드에서 단세포의 평균 순도와 수율은 각각 74.75%와 32.62%였다.
플라스틱 부착 단세포 분리 방법은 개별 기술적 스킬의 다양성으로 인해 일관적으로 높은 순도와 수율을 가진 단세포를 얻기는 어렵다. 그러므로, 부유밀도구배 원심분리 방법은 플라스틱 부착 방법보다 경제적이며 간단하고 빠른 방법이다. 이전에 다른 연구에서는 자신들의 고유한 밀도구배 원심분리 기법을 사용했다. OptiPrep 밀도구배 용액을 사용한 단세포 분리 방법에서 평균 순도의 범위는 87.9 ~ 96.4%였고 평균 수율은 26.1%였다. 하지만 이 방법은 3층으로 나누어지기 때문에 각층이 섞이는 것을 방지하여야 하였다. 최근에는 단세포를 buffy coat로부터 분리하기 위해 간단하고 경제적인 Percoll 밀도 구배가 개발되었다. 단세포 순도와 회수율은 각각 약 75%와 13.5%였다(이상에 대해서는 아래 표 2에도 나타냄). 이 방법은 3가지 단계로 구성되었다: (1) Ficoll 밀도구배에서 MNC의 분리 (2) 고밀도 과도 삼투압(hyper-osmotic) Percoll 밀도구배의 림프구로부터 단세포의 분리 및 (3) 저밀도 등삼투압(iso-osmotic) Percoll 밀도구배의 혈소판(platelets)과 죽은 세포로부터 단세포 분리.
기본적으로 부유밀도구배 원심분리 방법은 Histopaque 또는 피콜(ficoll) 밀도구배에서 PBMC 분리와 PBS 및 NaCl 용액으로 1.072g/ml 및 335 Osm/L H2O로 조절된 Histopaque 또는 피콜(ficoll) 용액을 이용하여 림프구로부터 단세포를 분리하는 과정으로 구성된다. 이 방법은 이전의 다른 밀도 구배 방법과 비교 우위를 가지는 순도 및 수율을 보여준다.
CD14+ 마그네틱 비드(magnetic bead)를 이용한 분리 방법 및 elutriation 방법을 포함한 다른 방법의 경우 단세포는 일반적으로 매우 높은 순도(80% 이상) 및 회수율(60% 이상)을 가지게 되며 이를 이용하여 수지상세포의 임상적용을 위한 closed system에 적용되고 있지만 경제적인 부담이 크다.
부유밀도구배 원심분리에 의해 분리되는 단세포는 그 형태, 표현형 및 기능적인 측면을 볼 때 체외(In vitro)에서 성숙 수지상세포로 성공적으로 배양할 수 있다. 이렇게 분리된 단세포는 백(bag)에서 쉽게 옮겨 배양할 수 있어 quasi-closed system으로 이용할 수 있다.
결론적으로, 말초혈액단핵구로부터 단세포를 분리하기 위해 본 연구에서 사용된 부유밀도구배 원심분리 방법은 플라스틱 부착법(plastic adherence), elutriation 및 immunomagnetic selection보다 용이하고 경제적인 방법이다. 나아가 이러한 장점을 바탕으로 임상단계에서 수지상세포를 안전하고, 효율적으로 배양할 수 있는 closed system에도 적용이 가능할 것으로 기대된다.
<표 2. 기존 방법과의 비교자료>
| 분리방법 | 플라스크 부착법 | OptiPrep 이용 방법 | Percoll 이용 방법 | 부유밀도구배법 (1.072 g/ml-335 Osm/L H2O) |
| 순 도 | - | 87.9 ~ 96.4% | 75% | 75% |
| 회수율(수율) | - | 26.1% | 13.5% | 33% |
| 장·단점 | 고전적인 방법으로 시간 및 노동 집약적이며,연구자의 숙련도에 따라 편차가 심함. | OptiPrep 용액을 이용하여 비중 및 삼투압을 조절하기위한 시약조제 과정이 복잡함.(5단계) | hyper- 및 iso-osmotic Percoll 용액 조제 과정이 필요하며 2번의 밀도구배 원심분리가 요구됨. | 비중 및 삼투압 조절을 위한 시약 조제가 간단하며 1번의 밀도구배 원심분리로 단세포를 분리할 수 있다. |
Claims (6)
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- 히스토페이크(Histopaque) 또는 피콜(ficoll) 용액을 이용하여 말초혈액단핵구(PBMC)를 부유밀도 구배 원심분리함으로써 단세포를 분리하는 방법에 있어서,히스토페이크(Histopaque)-1077 또는 피콜(ficoll) 용액으로서 밀도와 삼투압 농도가 각각 1.072g/ml 및 335 Osm/L H2O인 것을 사용하는 것을 특징으로 하는,부유밀도구배 원심분리를 이용하여 말초혈액단핵구로부터 단세포를 분리하는 방법.
- 제3항에 있어서,히스토페이크(Histopaque)-1077 또는 피콜(ficoll) 용액의 밀도와 삼투압 농도를 그 정해진 수치로 하기 위한 수단으로서 히스토페이크(Histopaque)-1077 또는 피콜(ficoll) 용액에 인산염완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)과 NaCl 용액을 혼합하는 것을 특징으로 하는,부유밀도구배 원심분리를 이용하여 말초혈액단핵구로부터 단세포를 분리하는 방법.
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006127150A2 (en) | 2005-04-08 | 2006-11-30 | Argos Therapeutics, Inc. | Dendritic cell compositions and methods |
| US20070259330A1 (en) * | 2006-05-04 | 2007-11-08 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Separation of cells |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210107335A (ko) | 2020-02-24 | 2021-09-01 | 주식회사 싸이토딕스 | 분리 챔버, 이를 포함하는 ctc 분리 장치 및 ctc 분리 방법 |
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