KR100922675B1

KR100922675B1 - 면역아쥬반트

Info

Publication number: KR100922675B1
Application number: KR1020047016359A
Authority: KR
Inventors: 오노다다오; 우치무라에이지; 후앙란; 구앙밍
Original assignee: 리가가쿠 겐큐쇼; 셀 메디신 가부시키가이샤
Priority date: 2002-04-18
Filing date: 2003-04-15
Publication date: 2009-10-19
Anticipated expiration: 2023-04-15
Also published as: CN1305528C; ATE343397T1; US20060008478A1; EP1495767A1; AU2003235158A1; JP2003306444A; WO2003086455A1; EP1495767B1; KR20050026382A; CN1646159A; CA2482929C; AU2003235158A8; EP1495767A4; ES2277099T3; CA2482929A1; DE60309307T2; DE60309307D1; JP3492671B2

Abstract

생체에게 있어서는 바람직하지 않은 상태를 피하면서 강한 아쥬반트 활성을 효율적으로 발휘할 수 있는 면역아쥬반트로서, (a) 가용성 단백(단 투베르쿨린에 함유되는 가용성 단백을 제외한다); 및 (b) 뮤코다당의 코아세르베이션에 의한 침전을 포함하고, 추가로 상기 침전과 함께 공침전된 (c) 투베르쿨린에 함유되는 가용성 단백을 포함하는 면역아쥬반트.

생체, 면역아쥬반트, 가용성 단백, 투베르쿨린, 뮤코다당, 코아세르베이션, 침전

Description

면역아쥬반트{Immunoadjuvant}

본 발명은 면역아쥬반트에 관한 것이다.

투베르쿨린(tuberculin)은 옛날부터 결핵균 감염력 검출용 시험약으로서, 또는 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) BCG(이하, BCG) 투여 후의 양전(陽轉) 검출용 시험약으로서 사용되어 왔다. 투베르쿨린 중의 단백성분을 황산암모늄 침전법에 의해 정제한 정제 투베르쿨린에서는, 그 자체를 반복해서 인간에게 투여했다고 하더라도 소위 투베르쿨린 반응시험에 있어서 다소의 부스터(booster) 효과는 인정되고 있지만(Singh, D. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2001, Sep 15; 164(6): 962-4), 과잉된 피부 염증반응에는 이르지 않아 매우 안전한 것이다.

본 발명자 등은 고체화 또는 미립자화한 종양조직을 적어도 1종류의 사이토카인 또는 사이토카인 유도제와 함께 체내에 투여함으로써, 효율적으로 종양세포에 대한 항종양 면역반응을 유도할 수 있는 것을 발견하였다(PCT/JP00/00692). 이 때, 일반적인 면역아쥬반트로서 정제 투베르쿨린을 가용성의 상태인 채로 동시에 투여함으로써, 더욱 강력한 종양세포에 대한 항종양 면역반응을 유도할 수 있는 것도 발견하였다(PCT/JP00/0692). 이와 같이 투베르쿨린의 성분은 면역아쥬반트로서도 이용할 수 있지만, 투베르쿨린 성분이 가용성이기 때문에 확산에 의해 투여국소로 부터 빠르게 소실되어 버린다는 결점이 있었다.

한편, M. tuberculosis의 배양 여과액 중의 성분은 용해상태에서는 약한 아쥬반트 활성밖에 없지만, 폴리스티렌 미립자에 결합함으로써 T 세포반응을 촉진하는 것이 알려져 있다(Wilkinson, K. A., et al., J. Immunol. Methods, 235: 1-9, 2000). 즉, 용해상태의 아쥬반트를 불용성의 아쥬반트 캐리어 상에 고정하면 급속하게 확산 소실하지 않아 강한 아쥬반트 활성을 나타내게 된다. 단, 이 고정화물에 있어서의 폴리스티렌 미립자는 항원제시세포에 탐식되지만 세포 내에서 분해되지 않고 체내에 잔존하는 바람직하지 않은 플라스틱이 된다.

이 문제점을 해결하는 방법으로서, 이 문헌 중에는 생분해성 합성 고분자의 미립자에 세균의 배양 여과액 중의 성분을 결합시키는 방법도 인용되어 있다(Vordermeier, H.M., et al., Vaccine, 13, 1576-1582, 1995; Ertl, H.C., et al., Vaccine, 14, 879-885, 1996; Jones D.H., et al., J. Biotechnology, 44, 29-36, 1996; Venkataprasad, N., et al., Vaccine, 17, 1814-1819, 1999). 단, 기재된 합성 고분자 폴리(DL-락티드 co-글리콜라이드)(PLG)는 분해시에 유산(乳酸)을 발생하고, 분해 국소환경을 산성화하는 것이 알려져 있어 역시 생체에게 있어서는 바람직한 것이 아니다.

이상과 같이, 종양 면역학의 분야에서는 고체상 및 생분해성이고, 또 상술한 바와 같은 바람직하지 않은 작용이 없는 아쥬반트가 요망되고 있다. 또한, 종래의 기술에서는, 복잡다기(複雜多岐)에 이르는 종양항원을 포함하는 종양조직 또는 종양세포를 동계(同系) 동물개체의 체내에서 물리적으로 변성시킨 후에 해당 변성조 직 중에 면역아쥬반트를 투여한 경우, 살아있는 해당 종양세포에 대한 항종양 면역반응을 효율적으로 자극할 수 있는 면역아쥬반트는 없었다.

발명의 개시

상술한 바와 같이, 투베르쿨린은 용해상태에서는 약한 아쥬반트 활성밖에 없지만, 반복해서 인간에게 투여했다고 하더라도 매우 안전하다. 본 발명의 과제는, 투베르쿨린을 사용하여 생체에게 있어서는 바람직하지 않은 상태를 피하면서 강한 아쥬반트 활성을 효율적으로 발휘할 수 있는 면역아쥬반트를 제공하는 것에 있다.

본 발명자 등은 상술한 문제를 해결하기 위해 예의 연구를 행한 결과, 투베르쿨린을 서방성(徐放性) 제제로 함으로써 높은 아쥬반트 활성이 얻어지는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자 등은 투베르쿨린의 서방화에 있어, 알부민과 헤파린을 혼합하여 코아세르베이션(coacervation)에 의한 침전을 형성하면 투베르쿨린 단백이 이 침전 중에 말려들어 불용성 미립자가 형성되는 것, 및 이 불용성 미립자를 항원 및 가용성의 정제 투베르쿨린과 함께 체내에 투여하면 강력한 종양 방어효과를 나타내고, 열변성한 체내 종양조직에 투여하면 강력한 항종양 면역반응을 유도할 수 있는 것을 발견하였다. 본 발명은 이들 발견을 토대로 완성된 것이다.

즉, 본 발명에 의해, 면역아쥬반트로서,

(a) 가용성 단백(단 투베르쿨린에 함유되는 가용성 단백을 제외한다); 및

(b) 뮤코다당(mucopolysaccharide)

의 코아세르베이션에 의한 침전을 포함하고, 추가로 상기 침전과 함께 공(共)침전 된

(c) 투베르쿨린에 함유되는 가용성 단백

을 포함하는 면역아쥬반트가 제공된다.

이 발명의 바람직한 태양에 의하면, 성분 (a) 가용성 단백이 알부민이고, 성분 (b) 뮤코다당이 헤파린인 상기 면역아쥬반트; 침전물이 단백분자간 가교제에 의해 가교된 상기 면역아쥬반트; 및 상기 성분 (c)가 투베르쿨린에 함유되는 가용성 단백 및 항원성이 있는 가용성 단백의 조합인 상기 면역아쥬반트; 항원성이 있는 상기 가용성 단백이 종양조직, 종양세포, 종양세포 성분 및/또는 종양항원 펩티드인 상기 면역아쥬반트가 제공된다.

다른 관점에서는, 면역아쥬반트로서, (c) 투베르쿨린에 함유되는 가용성 단백과 (d) 불용성 단백분자를 포함하고, 상기 성분 (c) 및 (d)가 단백분자간 가교제에 의해 가교된 불용성 미립자의 형태인 면역아쥬반트가 본 발명에 의해 제공된다. 이 발명의 바람직한 태양에 의하면, 불용성 단백분자가 콜라겐인 상기 면역아쥬반트가 제공된다.

더욱이 다른 관점에서는, 항원과 혼합한 후 인간을 포함하는 포유류 동물의 체내에 투여해서 상기 항원에 대한 전신성 면역반응을 유도하기 위한 상기 면역아쥬반트; 상기 항원이 종양조직, 종양세포, 종양세포 성분 및/또는 종양항원 펩티드인 상기 면역아쥬반트가 제공된다.

더욱이, 상기 면역아쥬반트를 포함하는 종양백신이 본 발명에 의해 제공된다. 이 발명의 바람직한 태양에 의하면, 물리적 수단으로 변성시킨 종양조직 내에 투여함으로써 항종양 면역반응을 유도하기 위한 상기 종양백신; 물리적 수단이 마이크로파 조사(照射), 고주파(radio frequency) 응고법, 동결 응고법, 전기메스 가열, 열수(熱水) 주입, 알코올 주입, 색전법(塞栓法), 방사선 조사, 레이저광 조사 및 초음파 파괴로 이루어진 군으로부터 선택되는 수단인 상기 종양백신; 체외에서 면역담당세포와 혼합한 후에 투여함으로써 체내에 있어서의 면역반응을 자극하기 위한 상기 종양백신; 면역담당세포가 수지상세포, B 림프구, T 림프구 및 자연살세포(natural killer cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 종양백신; 및 체외에서 면역담당세포 및 항원과 혼합하여 투여하기 위한 상기 종양백신이 제공된다.

더욱이 다른 관점에서는, 전신성 면역반응의 유도방법으로서, 인간을 포함하는 포유류 동물에 상기 면역아쥬반트를 투여하는 공정을 포함하는 방법; 종양의 치료방법으로서, 물리적 수단으로 변성시킨 종양조직 내에 상기의 종양백신을 투여하는 공정을 포함하는 방법; 항종양 면역반응을 유도하는 방법으로서, 물리적 수단으로 변성시킨 종양조직 내에 상기 종양백신을 투여하는 공정을 포함하는 방법; 및 미리 상기 종양백신과 면역담당세포를 체외에서 혼합한 후에 인간을 포함하는 포유류 동물의 체내에 투여하여 체내에 있어서의 면역반응을 자극하는 방법이 제공된다.

도면의 간단한 설명

도 1은 본 발명의 종양백신에 의한 간암증식 억제효과를 나타낸 도면이다. 점선은 누적생존율(대조군), 실선은 누적생존율(미립자화 투베르쿨린 백신 투여군 ), 작은 점선은 양성 대조군을 나타낸다.

도 2는 마이크로파 응고 후의 종양조직 중에 투여한 본 발명의 종양백신에 의한 종양재발 방어효과를 나타낸 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 면역아쥬반트는,

(b) 뮤코다당(단 상기 (a) 가용성 단백과 코아세르베이션에 의해 침전을 생성하는 뮤코다당이다)

의 코아세르베이션에 의한 침전을 포함하고, 추가로 상기 침전과 함께 공침전된

(c) 투베르쿨린에 함유되는 가용성 단백

을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

상기의 (a) 가용성 단백 및 (b) 뮤코다당의 조합으로서는, 양자가 당업자에게 주지인 조건하에서 코아세르베이션에 의한 침전을 생성하는 것이라면 특별히 한정되지는 않는다. 코아세르베이션에 대해서는, 예를 들면 미국특허 제5,759,582 명세서에 상세하게 기술적 설명이 기재되어 있지만, 이 용어는 어떠한 의미에 있어서도 한정적으로 해석해서는 안되며 가장 넓은 의미로 해석해야만 한다. 예를 들면 (a) 가용성 단백으로서 알부민, 뮤코다당으로서 헤파린을 바람직하게 사용할 수 있지만, (a) 가용성 단백 및 (b) 뮤코다당의 조합은 상기의 조합으로 한정되지는 않는다. 투베르쿨린에 함유되는 가용성 단백으로서는, 예를 들면 정제 투베르쿨린의 모든 단백을 사용할 수 있는 것 외에, 당업자에게 주지인 방법으로 투베르쿨린으로부터 조제한 가용성 단백의 전부 또는 그 일부를 사용할 수 있다. 상기 세가지 성분을 교반함으로써 성분 (a)와 성분 (b)의 코아세르베이션에 의한 침전이 생성되지만, 그 때 성분 (c)가 상기 침전에 삽입되어 공침전되어 침전물을 부여한다.

(c) 투베르쿨린에 함유되는 가용성 단백과 (a) 가용성 단백의 비율은 특별히 한정되지 않아, (a) 가용성 단백 및 (b) 뮤코다당이 코아세르베이션을 일으키는 범위내라면 어떠한 비율이어도 된다. 일례를 들면, pH 2.5의 2.5% 인간 혈청 알부민용액을 가용성 단백으로서 사용하는 경우, 뮤코다당으로서 약 5 mg/ml의 시판 헤파린용액을 사용하여 600 ㎕의 뮤코다당에 대해서 투베르쿨린의 가용성 단백을 2.5 ㎍ 용해한 후, 이 혼합물을 교반하면서 상기 인간 혈청 알부민용액을 용량비 1/1.75, 1/1.5, 1/1.25, 1/1이 되도록 변화시키면서 적하하여 코아세르베이션에 의한 미립자를 형성한다. 이 현탁액을 원심하고, 그 상청의 단백질 함량을 정량하여 혼합한 단백질의 대부분이 미립자에 삽입되는 용량비를 선택하는 것이 바람직하다. 단, 성분 (a) 내지 (c)의 비율이나 코아세르베이션의 조건 등은 당업자가 적절히 선택할 수 있는 것은 말할 것도 없다. 얻어지는 침전에 포함되는 미립자의 입경은 통상 1 ㎛ 이하이지만, 특정 크기로 한정되는 것은 아니다.

얻어진 침전, 바람직하게는 미립자형상 침전은 그대로 면역아쥬반트로서 사용할 수 있지만, 필요에 따라서 침전을 증류수로 세정해도 된다. 또한, 침전을 안정화하기 위해서 단백분자간 가교제를 작용시킴으로써 가교를 형성하여 불용성 미립자를 형성해도 된다. 단백분자간 가교제의 종류는 특별히 한정되지 않아, 당업자 에게 주지인 것을 주지의 방법으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드를 20 mg/ml의 수용액으로 하고, 최종 농도가 0.8~1.5 mg/ml이 되도록 소용돌이 혼합기(vortex mixer)로 섞으면서 가한 후, 실온에서 15분간 정치(靜置)하면 침전 중의 단백분자간에 충분히 안정한 가교가 형성된다. 단, 가교형성은 상기 특정의 조건 또는 특정의 단백분자간 가교제에 한정되는 것은 아니다. 상기와 같이 하여 얻어지는 면역아쥬반트, 바람직하게는 가교처리된 면역아쥬반트는, 물로 세정해도 용해되지 않아 본 발명의 면역아쥬반트로서 적합하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 바람직한 태양에 의하면, 항원성이 있는 가용성 단백과 투베르쿨린에 함유되는 가용성 단백을 혼합해 두고, 상기 (c) 대신에 이 혼합물을 사용하고 상기와 동일하게 하여 침전물을 얻음으로써 항원성이 있는 가용성 단백과 아쥬반트 활성이 있는 투베르쿨린 가용성 단백을 포함하는 면역아쥬반트를 제조할 수 있다.

다른 관점에서는, 단백분자간 가교제에 의해 가교된 투베르쿨린에 함유되는 가용성 단백과 불용성 단백분자를 포함하는 불용성 미립자 형태의 면역아쥬반트가 본 발명에 의해 제공된다. 불용성 단백분자로서는 생분해성의 불용성 단백분자를 사용할 수 있다. 예를 들면, 콜라겐을 사용할 수 있지만 반드시 이것으로 한정되는 것이 아니어서, 생체 내에서 분해되는 불용성 단백분자라면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 단백분자간 가교제의 종류는 특별히 한정되지 않아 당업자에게 주지인 것을 주지의 방법으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카 르보디이미드 등을 사용할 수 있다. 미립자의 입경은 통상 1 ㎛ 이하가 바람직하지만, 특정 크기로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 면역아쥬반트는 일반적인 면역아쥬반트로서 사용할 수 있다. 단순히 항원과 혼합하여 인간 또는 동물의 체내에 투여함으로써 상기 항원에 대한 전신성 면역반응을 유도할 수 있다. 그 항원이 종양조직, 종양세포, 종양세포 성분 및/또는 종양항원 펩티드인 경우는 종양백신으로서 이용할 수 있다. 예를 들면, 환자로부터 분리하여 고정화한 암세포와 본 발명의 면역아쥬반트를 혼합하여 환자의 피내(皮內)에 주사하면, 환자의 체내에서 해당 암세포에 대한 항종양 면역반응을 유도할 수 있다. 단, 본 발명의 면역아쥬반트의 사용방법은 상기의 것으로 한정되지는 않아 면역아쥬반트를 사용하는 통상의 형태 어느 방법을 사용해도 된다.

더욱이, 환자의 체내에 있는 종양조직을 물리적 수단에 의해 변성시킨 후 그 조직 내에 본 발명의 면역아쥬반트를 투여함으로써, 환자의 체내에 살아남아 있는 종양세포에 대해서 항종양 면역반응을 유도할 수 있다. 종양조직의 물리적 변성수단은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 마이크로파 조사, 고주파 응고법, 동결 응고법, 전기메스 가열, 열수 주입, 알코올 주입, 색전법, 방사선 조사, 레이저광 조사, 초음파 파괴 등의 수단을 채용할 수 있다. 단, 이들로 한정되는 것은 아니어서 종양조직 내에 있는 종양세포의 세포사(細胞死)를 유도할 수 있는 수단이라면 어떠한 것을 사용해도 된다. 두가지 이상의 물리적 수단을 적절히 조합해도 된다.

예를 들면, 종양조직을 마이크로파 조사에 의해 가열 응고하여 그 응고조직 내에 본 발명의 면역아쥬반트를 투여하면, 해당 종양조직 내부나 그 주변에 살아남 아 있는 종양세포에 대해서 항종양 면역반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 면역아쥬반트를 투여할 때, 투베르쿨린 용액을 동시에 투여하는 것도 바람직하다. 단, 본 발명의 면역아쥬반트의 투여방법은 상기의 태양으로 한정되는 것은 아니어서, 해당 변성 종양조직에 모여드는 항원제시세포에 본 발명의 면역아쥬반트가 변성 종양조직에 포함되는 종양항원과 함께 삽입되거나, 또는 본 발명의 면역아쥬반트가 항원제시세포를 직접 자극할 수 있는 환경을 부여하는 것이라면 어떠한 방법을 채용해도 된다.

또한, 미리 본 발명의 면역아쥬반트와 면역담당세포를 체외에서 혼합한 후 환자의 체내에 투여하여 체내에서의 면역반응을 자극하는 것도 가능하다. 그 면역담당세포로서는, 수지상세포, B 림프구, T 림프구 및/또는 자연살세포 등을 바람직하게 사용할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

더욱이 다른 관점에서는, 상기의 면역아쥬반트를 유효성분으로서 포함하는 백신이 본 발명에 의해 제공된다. 이 백신을 투여할 때에는, 면역담당세포를 동시에 혼합해도 된다. 또한 항원으로서 종양조직 및/또는 종양세포를 혼합해서 사용하는 것도 가능하고, 이와 같이 하여 얻은 백신을 상기 종양이 유래된 환자에게 투여함으로써 종양을 치료할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 하기의 실시예로 한정되지는 않는다. 본 실시예에 있어서 조제되는 본 발명의 면역아쥬반트를 미립자화 투베르쿨린(또는 그 유사어)으로 부르는 경우가 있다.

예 1: 본 발명의 종양백신에 의한 간암증식 억제효과

A. 재료 및 방법

1. 면역아쥬반트의 제작

1) 25% 인간 혈청 알부민용액(HSA, Baxter Albumac, Baxter)을 멸균수로 2.5%가 되도록 희석하고, 4N HCl로 pH 2.5로 맞추었다.

2) 미리 이 2.5% 인간 혈청 알부민용액과 헤파린용액(노보·헤파린 주(注) 1000, 1000 단위/ml, 약 7.69 mg/ml 이하, Aventis Pharma Ltd.)을 여러 비율로 혼합하여 헤파린용액의 적정 혼합비를 결정하였다. 적정 혼합비는, 당초 적당한 혼합비로 마이크로 파티클(micro particle)을 작성하여 2,500 rpm(1300 g)으로 15분간 원심하고, 그 상청의 단백질 함량을 단백질 분석 키트 1(Nippon Bio-Rad Laboratories, 도쿄)로 정량하여 혼합한 단백질의 99.9% 이상이 마이크로 파티클에 삽입되는 조건으로 하였다.

3) 투베르쿨린(일본 BCG 제조 가부시키가이샤, 일반진단용 정제 투베르쿨린(PPD) 1인용, 표준품 0.25 ㎍ 상당량)을 주사용 헤파린용액에 현탁(懸濁)하여 소용돌이 혼합기로 섞으면서, 미리 결정해 둔 비율로 2.5% 인간 혈청 알부민용액을 적하하였다.

4) 4,300 rpm(1300 g)으로 15분간 원심하고, 멸균 증류수로 2회 씻어 멸균 증류수에 재현탁하였다.

5) 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 용액(EDC, SIGMA, 물에 용해하여 20 mg/ml로 한 것)을 최종 농도가 0.8~1.5 mg/ml이 되도록 소용돌이 혼합기로 섞으면서 가한 후 실온에서 15분간 정치하였다.

6) 4,300 rpm(1300 g)으로 15분간 원심하고, 멸균 증류수로 6회 씻어 필요한 농도가 되도록 멸균 생리식염수로 재현탁하였다. 이것을 미립자화 투베르쿨린 현탁액으로 하였다.

2. 종양백신에 의한 마우스 간암증식 억제효과 측정

1) 직경 10 cm의 플라스틱 배양 접시에 콘플루언트(confluent)가 될 때까지 배양한 간암세포 Hepa 1-6을, 3% 파라포름알데히드 용액에서 실온하에 2시간 고정하였다. 칼슘·마그네슘 함유 덜벳코 인산(Dulbecco's phosphate) 완충 생리식염수(PBS(+))로 충분히 세정하고, 70% 에탄올로 추가로 세정 멸균하여 다시 PBS(+)로 충분히 세정하였다.

2) 이것에 DMEM 배지를 접시당 10 ml 가하여 2일간 37℃에서 항온처리(incubation)하였다.

3) PBS(+)로 충분히 세정한 후, 폴리-L-리신용액(25 ㎍/ml)을 접시당 3 ml 가하여 2시간 항온처리하였다.

4) PBS(+)로 충분히 세정한 후, 스크레이퍼(scraper)로 고정세포 전부를 긁어 모아 PBS(+)에 현탁하였다.

5) 접시 4개 분량의 세포에 상당하는 200 ㎕를 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)에 넣고, 투베르쿨린 용액 100 ㎕(0.25 ㎍/100 ㎕ PBS(+))를 첨가하여 2시간 항온처리하였다.

6) 미립자화 투베르쿨린 현탁액 150 ㎕(투베르쿨린을 3 ㎍/ml의 농도로 포함한다) 를 가하고, 추가로 50 ㎕의 PBS(+)를 첨가하였다. 이것을 미립자화 투베르쿨린 백신으로 하였다. 이 때, 미립자화 투베르쿨린과 PBS(+) 대신에 5KE/ml의 OK432(중외제약(Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.), 피시바닐(PICIBANIL) 5KE)를 PBS(+)로 10배 희석한 것 200 ㎕를 가한 에펜도르프 튜브도 제작하였다. 이것은 양성 대조군용 백신으로 하였다.

7) 간암세포 Hepa 1-6과 동계 마우스(C57L/J 계통, 6-9주령(週齡), 수컷) 9마리에, 이 미립자화 투베르쿨린 백신을 1마리당 50 ㎕ 피내 주사하였다. 1주일 후에 이것을 반복하였다. 대조군의 마우스 9마리에는 칼슘·마그네슘 불함유 덜벳코 인산 완충 생리식염수(PBS(-))만 주사하였다. 또한, 양성 대조군에는 상기 6)에서 제작한 양성 대조군용 백신을 동일하게 주사하였다.

8) 추가로, 1주일 후 Hepa 1-6 세포(1×10⁷개/0.2 ml PBS(-))를 오른쪽 다리 피하에 주사하였다.

9) 이 챌린지(challenge) 후, 상기 6)의 단계까지 동일한 조작으로 제작한 미립자화 투베르쿨린 백신(단, 이 백신 제작시에 사용한 미립자화 투베르쿨린은 투베르쿨린을 2 ㎍/ml의 농도로 포함하는 것이었다)을 1마리당 50 ㎕ 피내 주사하였다. 대조군의 마우스 9마리에는 PBS(-)만 주사하였다. 또한, 양성 대조군에는 상기 6)에서 제작한 양성 대조군용 백신을 동일하게 주사하였다.

10) 이후, 피하 간암이 증대된 후의 마우스의 생존율을 측정하였다.

B. 결과

결과를 도 1에 나타낸다. 이것은 대조군, 미립자화 투베르쿨린 백신 투여군, 양성 대조군의 카플란-마이어(Kaplan-Meyer) 커브이다. 미립자화 투베르쿨린 백신 투여군은, 통계적 유의차(有意差)로써 대조군보다도 생존율이 좋았다(log-rank test, p<0.0001). 게다가, 양성 대조군보다도 우수한 항종양 효과를 나타냈다.

예 2: 마이크로파 응고 후의 종양조직 중에 투여한 미립자화 투베르쿨린의 종양재발 방어효과

A. 재료 및 방법

1. 미립자화 투베르쿨린의 제작은 예 1의 1.에 따랐다.

2. C57BL/6 마우스(암컷, 1군 6마리)의 오른쪽 다리 피하에 1×10⁶개의 동계 폐암세포(Lewis Lung Carcinoma 세포주)를 주사, 8일째에 피하 폐암조직이 거의 75 ㎣에 도달했을 때, 펜토바르비탈(pentobarbital) 나트륨으로 마취하고 폐암조직 옆의 피부에 상처를 내어 거기에서 암조직 내에 Microtaze endoscopy-use mono-ball type electrode(E-24N, 직경 2.4 mm)를 찔러 넣었다.

3. Microtaze(HSE-8M형, AZWELL Inc.제)에 이 electrode를 연결하여, 10 W로 3분간 마이크로파를 조사, 외관상은 완전히 암조직을 열응고시켰다.

4. 상처난 곳을 봉합하고, 10일째에 투베르쿨린 용액(정제 투베르쿨린 25 ng을 25 ㎕의 생리식염수 중에 용해)과, 현탁한 미립자화 투베르쿨린(정제 투베르쿨린으로서 50 ng을 함유, 5 ㎕의 생리식염수에 현탁)을 암조직 내에 주사하였다. 14일째에 한번 더 이 주사를 반복하였다(a군). 대조군(b군)의 마우스에는 마이크로파의 조사만 행하였다. 또한, 마이크로파를 조사하지 않은 대조군(c군)도 설치하고, 미립자화 투베르쿨린 대신에 OK-432(1 KE/25 ㎕)를 사용한 군(d군), 투베르쿨린 용액 대신에 OK-432(1 KE/25 ㎕)를 사용한 군(e군)도 설치하였다.

5. 이후, 재발하여 종창(腫脹)해 오는 암조직의 크기(㎣)를 시간경과에 따라 측정하였다.

B. 결과

결과를 도 2에 나타낸다. 각 점은 마우스 6마리의 폐암조직 크기의 평균값이다. 폐암세포 이식 후 33일째까지의 관찰에 있어서, b군, c군과 비교하여 a군에서는 명백하게 폐암조직의 재발이 억제되어 있었다. 특히, 미립자화 투베르쿨린과 투베르쿨린 용액을 포함하는 a군에서는 6마리 중 1마리도 재발이 없어 완전히 억제되어 있었던 것에 대해서, 미립자화 투베르쿨린을 포함하지 않는 d군 및 투베르쿨린 용액을 포함하지 않는 e군에서는 마이크로파 조사 후에 일단 축소된 후 다시 성장해 온 조직의 각각이 작은 암조직이고, b군, c군과 비교하여 암의 증식은 억제되고는 있지만 6마리 중 5마리에 재발이 보였다(표 1).

본 발명의 면역아쥬반트는 생체에게 있어서는 바람직하지 않은 상태를 피하면서 강한 아쥬반트 활성을 효율적으로 발휘할 수 있다.

Claims

물리적 수단으로 변성시킨 종양조직 내에 투여하기 위한 면역아쥬반트로서,

(a) 가용성 단백(단 투베르쿨린에 함유되는 가용성 단백을 제외한다); 및

(b) 뮤코다당

의 코아세르베이션에 의한 침전을 포함하고, 추가로 상기 침전과 함께 공침전된

(c) 투베르쿨린에 함유되는 가용성 단백

을 포함하는 면역아쥬반트.
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제1항에 있어서, 물리적 수단이 마이크로파 조사, 고주파 응고법, 동결 응고법, 전기메스 가열, 열수 주입, 알코올 주입, 색전법, 방사선 조사, 레이저광 조사 및 초음파 파괴로 이루어진 군으로부터 선택되는 수단인 면역아쥬반트.
제1항 또는 제16항의 면역아쥬반트를 포함하는 종양백신.