KR100926899B1 - 선천성 부신피질 과형성증 진단키트 - Google Patents
선천성 부신피질 과형성증 진단키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 대립유전자 특이 프라이머 연장(allele specific primer extension, ASPE)을 위한 프라이머, CYP21 유전자 1차 증폭용 프라이머, CYP21 유전자 2차 증폭용 프라이머, CYP21 유전자 결손 확인용 프라이머, 안티-태그 염기서열이 표지된 플렉스 맵 비드, 바이오틴이 표지된 dNTP 및 형광물질이 표지된 스트렙타비딘을 포함하는 선천성 부신피질 과형성증(CAH) 진단키트에 관한 것이다. 본 발명의 선천성 부신피질 과형성증(CAH) 진단키트를 사용하면, 지금까지 알려진 선천성 부신피질 과형성증을 나타낼 수 있는 모든 돌연변이 유전자를 간편하고 정확하게 검출할 수 있으므로, 보다 효과적인 선천성 부신피질 과형성증의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
선천성 부신피질 과형성증(CAH), 진단키트, 플렉스 맵 비드
Description
도 1은 본 발명의 CAH 진단키트로 환자의 시료에 존재하는 점 돌연변이를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 CAH 진단키트로 정상인과 CAH 환자의 CYP21 유전자에 존재하는 큰 결손의 존재여부를 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
본 발명은 선천성 부신피질 과형성증 진단키트에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 대립유전자 특이 프라이머 연장(allele specific primer extension, ASPE)을 위한 프라이머, CYP21 유전자 1차 증폭용 프라이머, CYP21 유전자 2차 증폭용 프라이머, CYP21 유전자 결손 확인용 프라이머, 안티-태그 염기서열이 표지된 플렉스 맵 비드, 바이오틴이 표지된 dNTP 및 형광물질이 표지된 스트렙타비딘을 포함하는 선천성 부신피질 과형성증(CAH) 진단키트에 관한 것이다.
선천성 부신피질 과형성증(congenital adrenal hyperplasia, CAH)은 코티솔(cortisol) 생합성의 이상으로 발생하는 유전병이다. 일반적으로, 코티솔 합성을 위해서는 5개의 효소(17-히드록실라제, 3b-HSD, 21-히드록실라제, 11b-히드록실라제, StAR 단백질)가 필요하고, 부신피질 과형성증 환자의 90% 이상은 21-히드록실라제가 결핍되거나 기능이 손상되어 있다.
이러한 CAH 발병원인으로 알려져 있는 21-히드록실라제를 암호화하는 유전자로는 6번 염색체 상에 존재하는 활성형인 참(true) 유전자(CYP21)와 비활성형인 유사유전자(CYP21P)가 알려져 있으며, 각 유전자의 사이에는 약 30kbp의 컴플리먼트 단백질 4B(compliment protein 4B, C4B)를 암호화하는 유전자가 존재한다고 알려져 있다. 특히, 21-히드록실라제의 결핍은 주로 CYP21 유전자의 점 돌연변이(point mutation), 8bp크기의 작은 유전자 결손 및 30kbp크기의 큰 유전자 결손이 주 원인으로 알려져 있다. 특히, 점 돌연변이는 액손 1의 30번 아미노산이 프롤린에서 류신으로 치환된 돌연변이(P30L), 액손 2의 2번 아미노산이 이소류신에서 글리신으로 치환된 돌연변이(I2G), 액손 4의 172번 아미노산이 이소류신에서 아스파라긴으로 치환된 돌연변이(I172N), 액손 6의 235번 아미노산이 이소류신에서 아스파라긴으로 치환된 돌연변이(I235N), 액손 6의 236번 아미노산이 발린에서 글루탐산으로 치환된 돌연변이(V236E), 액손 6의 238번 아미노산이 메티오닌에서 리신으로 치환된 돌연변이(M238K), 액손 7의 281번 아미노산이 발린에서 류신으로 치환된 돌연변이(V281L), 액손 7의 306번 아미노산이 페닐알라닌에서 트레오닌으로 치환된 돌연 변이(F306T), 액손 8의 318번 아미노산이 글루타민에서 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이(Q318X) 및 액손 8의 356번 아미노산이 아르기닌에서 글루타민으로 치환된 돌연변이(R356Q)가 알려져 있다.
상기 CAH는 효소의 활성 정도에 따라서, 고전적 CAH 와 비고전적 CAH의 두 가지 증상으로 구분되는데, 고전적 CAH의 증상은 염분배출(salt wasting) 및 여성의 남성화(virilising)를 나타내어 체내의 항상성이 붕괴되므로, 최종적으로는 환자가 사망하게 된다. 이에 반하여, 비 고전적 CAH의 증상은 21-히드록실라제의 활성도가 다소 감소되는 것 이외에는, 특이한 생리학적 변화는 없는 것으로 알려져 있다.
또한, 고전적 CAH는 신생아 약 12,500명중 한 명 꼴로 발생하지만, 상염색체(somatic chromosome) 열성유전 형태이므로 이 유전자의 돌연변이 보인자(carrier)는 50명중 한 명 꼴로 존재하며, 당대에서 발병하지 않더라도 자손에게서 발병할 수 있다. 이에, CAH를 진단하는 다양한 방법이 개발되었으며, 가장 일반적인 방법은 21-히드록실라제의 기질인 17-OH 프로게스테론의 혈중농도를 측정하는 방법이다. 그러나, 상기 방법은 정확도와 민감도가 현저하게 낮아서 신뢰성이 낮기 때문에, 현재에는 CYP21 유전자의 염기를 분석하는 방법과 병행하여 사용되고 있으나, 이 또한 많은 비용과 시간이 소요되어 새로운 진단방법의 개발이 요청되었다. 이에 따라, 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 방법을 응용한 CAH 진단키트를 개발하고자 하였으나, CYP21 유전자의 모든 돌연변이를 검출할 수 있는 키트는 아직까지 개발되지 않고 있는 실정이다.
따라서, CYP21 유전자의 모든 돌연변이를 검출하면서도 보다 정확하고 신속하게 CAH를 진단할 수 있는 키트를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자는 CYP21 유전자의 모든 돌연변이를 검출하면서도 보다 정확하고 신속하게 CAH를 진단할 수 있는 키트를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 대립유전자 특이 프라이머 연장법(allele specific primer extension, ASPE)을 응용하여 CYP21 유전자의 돌연변이를 검출함으로써 CAH를 진단할 수 있는 키트를 고안하였으며, 상기 키트를 사용할 경우, CYP21 유전자의 모든 돌연변이를 검출할 수 있으면서도 정확하고 신속하게 CAH를 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 CAH 진단키트를 제공하는 것이다.
본 발명자는 CYP21 유전자의 모든 돌연변이를 검출하면서도 보다 정확하고 신속하게 CAH를 진단할 수 있는 키트를 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 최근에 개발된 대립유전자 특이 프라이머 연장에 주목하게 되었다. 대립유전자 특이 프라이머 연장(ASPE)이란, 적외석 염료와 적색염료로 염색된 비드(FlexMAP Bead)를 이용하여 돌연변이를 검출하는 방법으로서(참조: 미국특허공개 제 2005-0191625호), 이에 사용되는 플렉스 맵 비드는 TM 바이오사이언스사(TM Bioscience Co., Ltd.)에서 상업적으로 입수할 수 있으며, 본 발명자들은 상기 ASPE를 응용하여, 선천성 부신피질 과형성증의 점 돌연변이를 진단할 수 있는 키트를 개발하였다.
즉, 본 발명의 선천성 부신피질 과형성증(CAH) 진단키트는 (i) 서열번호 1 내지 28의 염기서열을 갖는, 대립유전자 특이 프라이머 연장(allele specific primer extension, ASPE)을 위한 프라이머; (ii) 서열번호 41 및 42의 염기서열을 갖는, CYP21 유전자 1차 증폭용 프라이머; (iii) 서열번호 29 내지 36, 39 및 40의 염기서열을 갖는, CYP21 유전자 2차 증폭용 프라이머; (iv) 서열번호 42 내지 44의 염기서열을 갖는, CYP21 유전자의 결손 확인용 프라이머; (v) 서열번호 45 내지 72의 염기서열을 갖는 안티-태그 염기서열이 표지되고, 적외선 염료와 적색염료로 염색된 플렉스 맵 비드(FlexMap Bead); (vi) 바이오틴이 표지된 dNTP; 및, (vii) 바이오틴을 검출할 수 있는 형광물질이 표지된 스트렙타비딘을 포함한다.
상기 키트에 포함된 ASPE 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:
PL30L-C-ASPE(N): 5'-ctttatcaatacatactacaatcaggagcctccacctccc-3'(서열번호 1)
PL30L-T-ASPE(M): 5'-tcatttaccaatctttctttatacggagcctccacctcct-3'(서열번호 2)
I2G-A-ASPE(N): 5'-tacatacactaataacatactcataccctccagcccccaa-3'(서열번호 3)
I2G-C-ASPE(N): 5'-aaacaaacttcacatctcaataataccctccagcccccac-3'(서열번호 4)
I2G-G-ASPE(M): 5'-aatctacaaatccaataatctcataccctccagcccccag-3'(서열번호 5)
8bp del-G-ASPE(N): 5'-ctactatacatcttactatactttccggacctgtccttggg-3'(서열번호 6)
8bp del-T-ASPE(M): 5'-tcatcaatcaatctttttcactttccggacctgtccttggt-3'(서열번호 7)
8bp del-T1-ASPE(M): 5'-tcaattacttcactttaatcctttccggacctgtcgttggt-3'(서열번호 8)
I172N-T-ASPE(N): 5'-tatatacacttctcaataactaaccctcacctgcagcatcat-3'(서열번호 9)
I172N-A-ASPE(M): 5'-caattcaaatcacaataatcaatccctcacctgcagcatcaa-3'(서열번호 10)
I235N-T-ASPE(N): 5'-atactacatcataatcaaacatcatagagaagagggatcacat-3'(서열번호 11)
I235N-A-ASPE(M): 5'-ctacaaacaaacaaacattatcaatagagaagagggatcacaa-3'(서열번호 12)
V236E-T-ASPE(N): 5'-tcaaaatctcaaatactcaaatcagaagagggatcacatcgt-3'(서열번호 13)
V236E-A-ASPE(M): 5'-caattaactacatacaatacatacgaagagggatcacatcga-3'(서열번호 14)
M238K-T-ASPE(N): 5'-ttacctttatacctttctttttacggatcacatcgtggagat-3'(서열번호 15)
M238K-A-ASPE(M): 5'-ctaactaacaataatctaactaacggatcacatcgtggagaa-3'(서열번호 16)
V281N-G-ASPE(N): 5'-ctttaatctcaatcaatacaaatcgctcctggaagggcacg-3'(서열번호 17)
V281N-T-ASPE(M): 5'-atcatacatacatacaaatctacagctcctggaagggcact-3'(서열번호 18)
F306+T-G-ASPE(N): 5'-cttttcatcttttcatctttcaatctgggccgtggtttttttg-3'(서열번호 19)
F306+T-T-ASPE(M): 5'-tacactttctttctttctttctttctgggccgtggtttttttt-3'(서열번호 20)
Q318X-C-ASPE(N): 5'-ttactacacaatatactcatcaatagattcagcagcgactgc-3'(서열번호 21)
Q318X-T-ASPE(M): 5'-caatttcatcattcattcatttcaagattcagcagcgactgt-3'(서열번호 22)
R356Q-C-ASPE(N): 5'-ctatctttaaactacaaatctaacgaggtgctgcgcctgc-3'(서열번호 23)
R356Q-T-ASPE(M): 5'-cttttcatcaataatcttacctttgaggtgctgcgcctgt-3'(서열번호 24)
Control-1T-ASPE(N): 5'-tcataatctcaacaatctttctttcacttacctgtaagggct-3'(서열번호 25)
Control-2A-ASPE(N): 5'-aatccttttacattcattacttacgagccacctttggggca-3'(서열번호 26)
Control-3C-ASPE(N): 5'-ttcaatcattcaaatctcaactttctctgcaggagagcctc-3'(서열번호 27)
Control-4G-ASPE(N): 5'-aatcttactacaaatcctttctttctgaggtgcgtcctgg-3'(서열번호 28)
상기 키트에 포함된 1차 증폭용 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:
21BF1: 5'-cccaggtgggggcggacacta-3'(서열번호 41)
21BR1: 5'-aattaacggtcaatcctctgcagcg-3'(서열번호 42)
상기 키트에 포함된 2차 증폭용 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:
P30L-F: 5'-tggctggggctcttgagcta-3'(서열번호 29)
P30L-R: 5'-gcctgtagatgggcccgaat-3'(서열번호 30)
I2G-F: 5'-gccctcagctgccttcatca-3'(서열번호 31)
I2G-R: 5'-gcctcaggagcccagcctta-3'(서열번호 32)
I172N-F: 5'-ggtcagcctcgcctctcaca-3'(서열번호 33)
I172N-R: 5'-gaggggctgtgaggcacctt-3'(서열번호 34)
I235N-F: 5'-ccgcagttcttccccaatcc-3'(서열번호 35)
I235N-R: 5'-gctgaggccggtagcatcac-3'(서열번호 36)
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삭제
Q318X-F: 5'-caccggcactcaggctcact-3'(서열번호 39)
Q318X-R: 5'-gcaaggctaagggcacaacg-3'(서열번호 40)
상기 키트에 포함된 결손 확인용 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:
21BR1: 5'-aattaacggtcaatcctctgcagcg-3'(서열번호 42)
21AF1: 5'-cccaggtcggggcggacaccc-3'(서열번호 43)
21BF2: 5'-gtcaggccctcagctgccttca-3'(서열번호 44)
상기 키트에 포함된 플렉스 맵 비드에 표지된 안티-태그 염기서열은 다음과 같다:
p30L(N): 5'-tgattgtagtatgtattgataaag-3'(서열번호 45)
p30L(M): 5'-gtataaagaaagattggtaaatga-3'(서열번호 46)
I2G(N): 5'-atgagtatgttattagtgtatgta-3'(서열번호 47)
I2G(N): 5'-attattgagatgtgaagtttgttt-3'(서열번호 48)
I2G(M): 5'-atgagattattggatttgtagatt-3'(서열번호 49)
8bp del(N): 5'-aaagtatagtaagatgtatagtag-3'(서열번호 50)
8bp del(M): 5'-aaagtgaaaaagattgattgatga-3'(서열번호 51)
8bp del(M): 5'-aaaggattaaagtgaagtaattga-3'(서열번호 52)
I172N(N): 5'-gttagttattgagaagtgtatata-3'(서열번호 53)
I172N(M): 5'-gattgattattgtgatttgaattg-3'(서열번호 54)
I235N(N): 5'-tgatgtttgattatgatgtagtat-3'(서열번호 55)
I235N(M): 5'-ttgataatgtttgtttgtttgtag-3'(서열번호 56)
V236E(N): 5'-tgatttgagtatttgagattttga-3'(서열번호 57)
V236E(M): 5'-gtatgtattgtatgtagttaattg-3'(서열번호 58)
M238K(N): 5'-gtaaaaagaaaggtataaaggtaa-3'(서열번호 59)
M238K(M): 5'-gttagttagattattgttagttag-3'(서열번호 60)
V281L(N): 5'-gatttgtattgattgagattaaag-3'(서열번호 61)
V281L(M): 5'-tgaagatttgtatgtatgtatgat-3'(서열번호 62)
F306+T(N): 5'-attgaaagatgaaaagatgaaaag-3'(서열번호 63)
F306+T(M): 5'-aaagaaagaaagaaagaaagtgta-3'(서열번호 64)
Q318X(N): 5'-attgatgagtatattgtgtagtaa-3'(서열번호 65)
Q318X(M): 5'-tgaaatgaatgaatgatgaaattg-3'(서열번호 66)
R356Q(N): 5'-gttagatttgtagtttaaagatag-3'(서열번호 67)
R356Q(M): 5'-aaaggtaagattattgatgaaaag-3'(서열번호 68)
control(1T): 5'-aaagaaagattgttgagattatga-3'(서열번호 69)
control(2A): 5'-gtaagtaatgaatgtaaaaggatt-3'(서열번호 70)
control(3C): 5'-aagttgagatttgaatgattgaa-3'(서열번호 71)
control(4G): 5'-aaagaaaggatttgtagtaagatt-3'(서열번호 72)
또한, 스트렙타비딘에 표지된 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 플루오레신(fluorescein), 이소티오시아네이트(isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 피코에리트린(phycoerythrin), 피코시아닌(phycocyanin), 알로피코시아닌(allophycocyanin), o-프탈데히드(o-phthaldehyde) 및 플루오레스카민(fluorescamin) 등을 사용함이 바람직하고, 가장 바람직하게는 피코에리트린을 사용한다.
상기 CAH 진단키트를 이용할 경우, CAH를 발병시킬 수 있는 CYP21 유전자의 모든 돌연변이를 검출할 수 있는데, 구체적인 방법은 다음과 같다:
첫 째, 환자로부터 DNA를 수득한 다음, 이를 주형으로 하여, 상기 키트의 CYP21 유전자 1차 증폭용 프라이머를 이용한 1차 PCR을 수행함으로써, 환자의 CYP21 유전자를 수득한다.
둘 째, 수득한 CYP21 유전자를 주형으로 하여, 상기 키트의 CYP21 유전자 2 차 증폭용 프라이머를 이용한 2차 PCR을 수행함으로써, 돌연변이가 발생하는 부위를 포함하는 유전자 절편을 수득한다.
셋 째, 전기 수득한 유전자 절편을 주형으로 하여, 상기 키트의 태그를 포함하는 ASPE 프라이머 및 바이오틴이 표지된 dNTP를 이용한 3차 PCR을 수행함으로써, 태그가 포함되고 바이오틴이 표지된 증폭산물을 수득한다.
넷 째, 상기 태그가 포함되고 바이오틴이 표지된 증폭산물을 상기 키트의 플렉스 맵 비드와 혼성화반응을 수행한다. 상기 플렉스 맵 비드에는 상기 태그와 상보적으로 결합할 수 있는 안티-태그가 표지되어 있으므로, 태그가 포함된 증폭산물은 상기 비드와 혼성화반응에 의하여 결합될 수 있다.
다섯 째, 혼성화반응이 수행된 플렉스 맵 비드에 상기 키트의 형광표지된 스트렙타비딘을 처리한 다음, 플랙스 맵 비드로부터 형광을 검출하여, 점 돌연변이의 수 및 종류를 검출한다.
여섯 째, 환자에서 수득한 DNA를 주형으로 하여, 상기 키트의 CYP21 유전자의 결손 확인용 프라이머를 이용한 PCR을 수행한 다음, 이를 전기영동하여 CYP21 유전자에 큰 결손이 발생하였는지의 여부를 확인함으로써, 큰 결손이 발생된 CAH의 돌연변이를 검출할 수 있다.
구체적으로, CYP21 유전자에서 큰 결손이 발생할 경우에는, CYP21P 유전자의 중간 부위, CYP21P 유전자의 3’-말단부위 및 CYP21 유전자의 5’-말단부를 포함하는 영역이 결손되므로, CYP21P 유전자의 5’-말단을 인식하는 21AF1(서열번호 43), CYP21 유전자의 5’-말단을 인식하는 21BF2(서열번호 44) 및 CYP21 유전자의 3’- 말단을 인식하는 21BR1(서열번호 42)를 포함하는 상기 키트의 CYP21 유전자의 결손 확인용 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하면, 결손의 유무에 따라, 각각 다른 크기의 절편을 수득할 수 있다. 즉, 결손이 발생하지 않은 유전자인 경우에는, 21BF2(서열번호 44) 및 21BR1(서열번호 42)를 이용한 PCR이 수행되기 때문에 약 2.5kbp의 절편을 얻을 수 있고, 상보적인 염기서열에서 모두 결손이 발생한 유전자의 경우에는(homo type), 21AF1(서열번호 43) 및 21BR1(서열번호 42)를 이용한 PCR이 수행되기 때문에 약 3.5kbp의 절편을 얻을 수 있으며, 상보적인 염기서열에서 한쪽에 결손이 발생한 유전자의 경우에는(hetero type), 21BF2(서열번호 44) 및 21BR1(서열번호 42)를 이용한 PCR과 21AF1(서열번호 43) 및 21BR1(서열번호 42)를 이용한 PCR이 함께 수행되기 때문에, 각각 다른 크기를 갖는 약 2.5kbp의 절편과 3.5kbp의 절편을 모두 얻을 수 있다.
본 발명의 본 발명의 선천성 부신피질 과형성증(CAH) 진단키트를 사용하면, 지금까지 알려진 선천성 부신피질 과형성증을 나타낼 수 있는 모든 돌연변이 유전자를 간편하고 정확하게 검출할 수 있으므로, 보다 효과적인 선천성 부신피질 과형성증의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통 상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 선천성 부신피질 과형성증(CAH) 진단키트의 제조
본 발명의 선천성 부신피질 과형성증(CAH) 진단키트를 제조하기 위하여, 서열번호 1 내지 28의 염기서열을 갖는 ASPE 프라이머, 서열번호 29 내지 36, 39 및 40의 염기서열을 갖는 2차 증폭용 프라이머, 서열번호 41 및 42의 염기서열을 갖는 1차 증폭용 프라이머, 서열번호 42 내지 44의 염기서열을 갖는 결손 확인용 프라이머 및 서열번호 45 내지 72의 염기서열을 갖는 안티-태그 염기서열을 각각 화학적으로 합성하였다.
또한, 적외선 염료와 적색염료가 서로 다른 양으로 염색되어 있어 이후 레이져를 이용하여 염색 정도를 읽어내면, 이를 통해 각각의 비드를 구별할 수 있도록 제작된 플렉스 맵 비드(FlexMAP bead, TM Bioscience, USA)에 전기 합성된 안티-태그 염기서열을, 상기 플렉스 맵 비드의 사용자 매뉴얼에 따라 결합시켜, 안티-태그가 표지된 플렉스 맵 비드를 작제하였다.
끝으로, 바이오틴이 표지된 dNTP(Sigma Chem. Co., USA) 및 형광물질인 피코에리트린(phycoerytrin)이 결합된 스트렙타비딘(Streptavidin-phycoerytrin, Sigma Chem. Co., USA)을 구비하여, 선천성 부신피질 과형성증(CAH) 진단키트를 제조하였다.
실시예 2: 선천성 부신피질 과형성증(CAH) 진단키트를 이용한 CAH의 점 돌연변이의 분석
상기 실시예 1에서 제조한 CAH 진단키트를 이용하여, 환자로부터 CAH를 발생시킬 수 있는 유전자 변이가 발생하였는지의 여부를 확인하였다.
실시예 2-1: 환자로부터 CYP21 유전자의 수득
CAH 환자에서 채취한 혈액을 DNA 추출키트(DNA blood mini kit, Qiagen, USA)에 적용하여, DNA를 추출하였다. 추출된 DNA(20ng/ul) 4ul를 주형으로 하고, 21BF1(서열번호 41)과 21BR1(서열번호 42)의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여(94℃에서 5분 1사이클 이후, 94℃에서 15초, 66℃에서 40초, 72℃에서 3분 20초 조건으로 35사이클 수행 후, 72℃에서 7분의 조건), CYP21 유전자를 수득하였다.
실시예 2-2: 돌연변이가 발생하는 부위를 포함하는 유전자 절편의 수득
상기 실시예 2-1에서 수득한 CYP21 유전자에서 돌연변이가 발생하는 부위를 포함하는 유전자 절편을 수득하기 위하여, 상기 실시예 2-1에서 수득한 CYP21 유전자를 주형으로 하고, 서열번호 29 내지 36, 39 및 40의 염기서열을 갖는 2차 증폭용 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여(94℃에서 5분 1사이클 이후, 94℃에서 20초, 65℃에서 30초, 72℃에서 30초 조건으로 20사이클 수행 후, 72℃에서 7분의 조건), 증폭된 유전자 절편을 수득하였다.
실시예 2-3: 바이오틴이 표지된 증폭산물의 수득
상기 실시예 2-2에서 수득한 유전자 절편을 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 28의 염기서열을 갖는 ASPE 프라이머 및 바이오틴이 표지된 dNTP를 사용한 PCR을 수행하여(94℃에서 5분간 1사이클을 하고, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 35사이클을 수행 후, 72℃에서 7분의 조건), 바이오틴이 표지된 증폭산물을 수득하였다.
상기 사용된 각각의 ASPE 프라이머에는 플렉스 맵 비드에 표지된 안티-태그와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 갖는 태그가 5’-말단에 포함되어 있고, 특정한 점 돌연변이 특이적인 염기서열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열이 3’-말단에 포함되어 있으므로, 상기 실시예 2-2에서 수득한 유전자 절편이 특정한 점 돌연변이를 갖는 경우, 이에 적합한 ASPE 프라이머가 결합하여, 특정한 태그를 포함하고 바이오틴으로 표지된 증폭산물을 수득할 수 있다.
실시예 2-4: 플렉스 맵 비드를 이용한 혼성화반응
2x 혼성화반응 완충용액(PnE hybridization buffer, YeBT Co., LTD, Korea) 의 존재하에, 상기 실시예 2-3에서 수득한 바이오틴이 표지된 증폭산물을 안티-태그가 표지된 플렉스 맵 비드와 혼성화반응을 수행하였다(95℃에서 5분간 반응 후, 37℃에서 30분간 반응).
반응이 종료된 후, 반응물을 96웰 플레이트(multi-screen cat# MABVN1250, Millipore, 프랑스)로 옮기고, TM 혼성화반응 완충용액(0.2M NaCl, 0.1M Tris, 0.08% Triton X-100, pH 8.0)를 이용하여 3회 세척하였다. 그런 다음, 각 웰에 500배로 희석한 피코에리트린이 결합된 스트렙타비딘 용액 100ul씩 분주하고, 15분간 암실에서 250rpm으로 교반하면서 반응시켜서, 바이오틴으로 표지된 증폭산물과 혼성화반응을 수행한 플렉스 맵 비드가 이에 결합된 스트렙타비딘에 표지된 피코에리트린으로 인하여 형광을 발색시키도록 하였다.
실시예 2-6: 플렉스 맵 비드에서 발색된 형광의 검출
상기 실시예 1에서 제작한 플렉스 맵 비드에는 총 28종류의 안티-태그가 표지되어 있으며, 각 안티-태그를 구별할 수 있도록 각각의 플렉스 맵 비드는 서로 다른 형광값(532nm)을 갖는다.
또한, 하나의 점 돌연변이를 검출하기 위하여는, 하나의 정상 유전자를 검출할 수 있는 비드와 하나 또는 두개의 돌연변이를 검출할 수 있는 비드가 사용되므로, 각각의 돌연변이를 검출할 수 있는 비드에서 하나의 형광값이 검출된다면, 이는 동형의 정상유전자 또는 돌연변이 유전자가 존재함을 의미하고, 둘 이상의 형광 값이 검출된다면 이형의 돌연변이 유전자가 존재함을 의미하므로, 상기 결과를 통하여, 환자의 시료에 돌연변이 유전자가 존재하는 지의 여부를 확인할 수 있고, 돌연변이 유전자가 존재한다면 어떠한 돌연변이가 존재하는지를 확인할 수 있다.
상기 실시예 2-5에서 피코에리트린이 결합된 스트렙타비딘으로 표지된 플렉스 맵 비드를 형광검출기(Luminex 100, Luminex Co., Ltd., USA)에 가하여 형광값(mean fluorescent intensity, MFI)을 측정하였다(참조: 도 1). 이때, 상기 형광검출기는 2종류의 파장(532nm, 633nm)을 갖는 레이저를 이용하여 형광값을 측정하게 되는데, 532nm의 레이저는 플렉스 맵 비드의 종류를 구별하는데 사용되고, 633nm의 레이저는 플렉스 맵 비드에 결합된 피코에리트린의 형광값을 측정하는데 사용된다.
도 1은 본 발명의 CAH 진단키트로 환자의 시료에 존재하는 점 돌연변이를 분석한 결과를 나타내는 그래프로서, 분석결과는 최종적으로 각각의 플렉스 맵 비드로부터 검출된 형광값(MFI)으로 표시하였다. 도 1에서, X축의 값은 플렉스 맵 비드에 표지된 각각의 안티-태그(서열번호 45 내지 72)를 의미하고, Y축은 플렉스 맵 비드로부터 검출된 형광값을 의미한다. CAH를 유발시키는 CYP21 유전자 내에서 돌연변이가 발생하는 부위 및 발생형태는 하기의 표 1과 같이 알려져 있으므로, 상기 얻어진 실험결과를 이에 대입하여, CAH환자임을 판별할 수 있었다.
| 점 돌연변이 | 정상 유전형 | 변이 유전형 |
| P30L | C | T |
| I2G | a or c | G |
| 8bp del | G | T |
| I172N | T | A |
| I235N | T | A |
| V236E | T | A |
| M238K | T | A |
| V281L | G | T |
| F306T | G | T |
| Q318X | C | T |
| R356Q | C | T |
도 1의 결과를 상기 표 1의 내용에 대입하여 분석하면, P30L 부분은 c(동형)이고, I2G부분은 c/g(이형)이며, 8bp del 부분은 g(동형)이고, I172N, I235N, V236E 및 M238K는 t(동형)이며, V281L 및 F306T는 g(동형)이고, Q318X는 c(동형)이며, R356Q는 c/t(이형)임을 확인하였다.
따라서, 상기 시료는 I2G 와 R356Q 부분에 돌연변이가 있는 CAH 환자의 것임을 진단할 수 있었다.
실시예 2-7: 유전자의 큰 결손의 확인
정상인의 혈액으로부터 수득한 DNA 및 실시예 2-1 에서 수득한 환자의 DNA를 각각 주형으로 하고, 서열번호 42 내지 44의 염기서열을 갖는 결손 확인용 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여(94℃에서 5분 1사이클 이후, 94℃에서 15초, 66℃에서 1분, 72℃에서 3분 20초 조건으로 35사이클 수행 후, 72℃에서 7분의 조건), 증폭산물을 수득하고, 상기 증폭산물을 1% 아가로즈 젤에 전기영동하여 상기 증폭산물의 크기를 비교하였다(참조: 도 2).
도 2는 본 발명의 CAH 진단키트로 정상인과 CAH 환자의 CYP21 유전자에 존재하는 큰 결손의 존재여부를 분석한 전기영동사진으로서, 1번 레인은 정상인의 DNA이고, 2번 레인은 CAH 환자의 DNA이며, M은 마커를 각각 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 정상인의 경우에는 큰 결손이 없어 2.5kbp의 크기를 갖는 증폭산물을 얻을 수 있으나, CAH 환자의 경우에는 2.5kbp 및 3.5kbp의 크기를 갖는 증폭산물을 얻을 수 있으므로, CAH 환자의 경우 한쪽 유전자에 큰 결손이 존재함을 확인할 수 있었다.
결국, 상기 실시예 2-6 및 2-7의 결과를 종합하면, 실시예 2-1의 CAH 환자는 I2G 와 R356Q 부분에 점 돌연변이가 있고, 한쪽 유전자에 큰 결손이 있는 CYP21 유전자를 갖고 있음을 확인할 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 대립유전자 특이 프라이머 연장을 위한 프라이머, CYP21 유전자 1차 증폭용 프라이머, CYP21 유전자 2차 증폭용 프라이머, CYP21 유전자 결손 확인용 프라이머, 안티-태그 염기서열이 표지된 플렉스 맵 비드, 바이오틴이 표지된 dNTP 및 형광물질이 표지된 스트렙타비딘을 포함하는 선천성 부신피질 과형성증(CAH) 진단키트를 제공한다. 본 발명의 선천성 부신피질 과형성증(CAH) 진단키트를 사용하면, 지금까지 알려진 선천성 부신피질 과형성증을 나타낼 수 있는 모든 돌연변이 유전자를 간편하고 정확하게 검출할 수 있으므로, 보다 효과적인 선천성 부신피질 과형성증의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
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ctcatggacc tccatttc 18
Claims (2)
- (i) 서열번호 1 내지 28의 염기서열을 갖는, 대립유전자 특이 프라이머 연장(allele specific primer extension, ASPE)을 위한 프라이머;(ii) 서열번호 41 및 42의 염기서열을 갖는, CYP21 유전자 1차 증폭용 프라이머;(iii) 서열번호 29 내지 36, 39 및 40의 염기서열을 갖는, CYP21 유전자 2차 증폭용 프라이머;(iv) 서열번호 42 내지 44의 염기서열을 갖는, CYP21 유전자의 결손 확인용 프라이머;(v) 서열번호 45 내지 72의 염기서열을 갖는 안티-태그 염기서열이 표지된 플렉스 맵 비드(FlexMap Bead);(vi) 바이오틴이 표지된 dNTP; 및,(vii) 바이오틴을 검출할 수 있는 형광물질이 표지된 스트렙타비딘을 포함하는, 선천성 부신피질 과형성증(congenital adrenal hyperplasia, CAH) 진단키트.
- 제 1항에 있어서,형광물질은 플루오레신(fluorescein), 이소티오시아네이트(isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 피코에리트린(phycoerythrin), 피코시아닌(phycocyanin), 알로 피코시아닌(allophycocyanin), o-프탈데히드(o-phthaldehyde) 및 플루오레스카민(fluorescamin)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는선천성 부신피질 과형성증 진단키트.
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