KR100897379B1

KR100897379B1 - 혈관신생-저해 키메릭 단백질 및 그 사용

Info

Publication number: KR100897379B1
Application number: KR1020067026641A
Authority: KR
Inventors: 정 리우
Original assignee: 쳉두 캉홍 바이오테크놀로지스 코. 리미티드
Priority date: 2004-06-08
Filing date: 2005-06-08
Publication date: 2009-05-14
Anticipated expiration: 2025-06-08
Also published as: BRPI0512286B8; US20080206238A1; ATE548384T1; PL1767546T3; WO2005121176A1; CA2569108C; EP1767546B1; JP2008503243A; DK1767546T3; PT1767546E; BRPI0512286A; US7750138B2; US20100215655A1; KR20070029204A; CA2569108A1; EP1767546A1; EP1767546A4; JP4680997B2; BRPI0512286B1; RU2355414C2

Abstract

본 발명은 DNA 시퀀스 인코딩 혈관신생-저해 재조합 키메릭 단백질, 키메릭 단백질 그 자체, 키메릭 단백질의 약리학적 사용 및 재조합 단백질과 그들의 제형을 포함하는 약리학적 조성물과 연관된다.

혈관신생저해, 키메릭 재조합 단백질

Description

혈관신생-저해 키메릭 단백질 및 그 사용 {ANGIOGENESIS-INHIBITING CHIMERIC PROTEIN AND THE USE}

본 발명은 유전자 공학 기술, 좀 더 상세하게는 혈관신생-저해 재조합 키메릭 단백질을 인코딩하는 DNA 서열, 인코딩된 키메릭 단백질, 그 키메릭 단백질을 포함하는 치료적 적용, 상기 키메릭 단백질을 함유하는 의약조성물 및 제형과 관련된다.

혈관신생은 기존의 혈관들로부터 새로운 혈관들이 자라는 과정이다. 대부분의 성인 혈관계는 휴지상태이고, 혈관신생은 오직 몇몇의 생리적이고 병리적인 메카니즘, 예를 들어 종양, 당뇨병성 망막병증, 관절염, 빈혈기관들, 자궁내막 증식증 등에서 발생한다. 혈관신생은 종양의 발달시기 동안 종양 세포의 빠른 성장에서 중요한 역할을 한다.(Hanahan and Folkman: 종양 형성기간 동안의 혈관신생 스위치의 패턴과 신생 메카니즘, Cell, 1996, 86:353-364). 동물 암 모델과 인간 임상시험의 연구에서 종양 혈관신생의 저해는 종양의 생장과 발달을 효과적으로 저해할 수 있고, 따라서 환자의 생명을 연장할 수 있음이 이미 증명되었다. 혈관신생은 많은 생물학적 인자들에 의해 성립되고 조절된다. 혈관신생을 성립시키는 주된 세포들은 혈관의 내부 벽을 형성하는 혈관내피세포들이다. 다양한 성장인자들은 혈관내피세포들의 표면에 있는 관련 리셉터들에 결합할 수 있고, 세포 내 신호전달을 통해 세포 진행 과정을 조절할 수 있고, 따라서 혈관신생을 성립시킨다.

다양한 성장인자들 가운데서, VEGF(혈관내피세포성장인자)는 가장 중요한 혈관신생인자이다.(Ferrara: VEGF와 종양 혈관신생 인자에 관한 탐구, Nat. Rev. Cancer, 2002, 10: 795-803; Ferrara: 생리학적 및 병리학적 혈관신생에 있어서 혈관내피성장인자들의 역할: 치료법적 함의, Semin. Oncol., 2002, 29(6 sumppl): 10-14). VEGF는 세포의 많은 유형에 의해 분비될 수 있으나, 종종 종양세포에 과다발현(over-expressed)된다. VEGF는 적절한 리셉터에 결합함으로써 기능한다. 주된 두 종류의 VEGF 리셉터가 있다: FLT-1(fms 유사 타이로신 키나아제)와 KDR. 분자 구조의 관점에서, 이 두 리셉터 모두는 세 개의 다른 기능 부분으로 구성된다: 첫 번째 부분은 세포 외 부분으로, VEGF에 대해 특정한 친화도를 갖는 일곱 개의 이뮤노글로불린 유사(Ig-like) 영역(d1-d7)으로 구성되며, 이것은 VEGF에 결합하기 위한 주된 부분이다; 두 번째 부분은 소수성 아미노산 잔기를 포함하는 막관통 부분이다; 세 번째 부분은 리셉터가 VEGF에 의해 활성화된 후에 인산화되고, 세포 내 신포 전달을 촉진하며, 내피 세포와 혈관신생의 기능 효과를 이끄는 타이로신 키나아제 기능 그룹을 포함하는 세포 내 영역이다.

FLT-1 및 KDR은 대체로 혈관내피세포에 분포된다. 따라서, VEGF의 혈관내피세포에 대한 매개활성은 매우 특이적이다. VEGF는 내피세포분화를 촉진시키고, 세 포 이동을 이끌고, 세포사멸(apoptosis)을 저해하고, 혈관 형태 변화를 유발하며,고효율의 혈관신생 인자의 전구체가 된다.

종양조직에서 VEGF의 발현 수위는 정상 조직에서의 그것보다 더 높다. 게다가, 종양 세포의 빠른 성장은 종종 종양 내부에 저산소증으로 이르고, 저산소증은 나아가서 VEGF의 발현을 야기시킨다. 따라서, VEGF는 종양 혈관신생을 촉진하는 주된 인자다. 많은 동물 연구는 VEGF과 그것의 리셉터의 결합을 저해하는 것이 종양 혈관신생을 효과적으로 저해할 수 있고, 따라서 종양 성장을 저해한다는 것을 보여준다. 당뇨병성 망막병증과 관절염 등과 같은 다른 혈관신생관련 질병에서, VEGF는 또한 이러한 질병의 발달에 밀접하게 포함된다(Ferrara: 생리학적 및 병리학적 혈관신생에서 혈관내피성장인자의 역할: 치료적 암시. Semin. Oncol. 2002, 29(6 sumppl): 10-14).

암과 다른 질병에서 VEGF의 중요한 역할 때문에, 특별히 VEGF를 저해하는 단백질이나 화학 물질들은 치료적 가능성을 갖는다. 예를 들어, 연구들은 VEGF에 대한 중화항체들은 종양 성장을 효과적으로 저해할 수 있음을 보여준다(Jain: 종양 혈관신생 및 접근용이성: 혈관내피성장인자의 역할, Semin. Oncol., 2002, 29(6 suppl): 3-9). 따라서, 개발하는 새로운 효과적인 VEGF 저해제는 임상 연구에 있어서 중요하다. FLT-1 및 KDR이 VEGF의 자연적인 바인더(binder)이기 때문에, 가용성 FLT-1(FLT-1의 세포 외 영역)과 가용성 KDR(KDR의 세포 외 영역)의 항-혈관신생 역할을 조사한 연구들이 있었다(Yoko Hasumi: 가용성 FLT-1 발현은 난소암이 있는 누드 마우스에서 암의 복수증을 억제한다. 암 연구 62, 2002: 2019-2023). 가용성 FLT-1은 혈관내피세포들의 성장을 생체 밖에서 효과적으로 저해할 수 있었으나 그것은 짧은 혈청 반감기를 가지고 있었고 효과적인 혈청농축에 도달할 수 없다. 비슷하게, 가용성 KDR은 또한 혈관내피세포들의 성장을 생체 밖에서 저해할 수 있었으나, 동물 모델에서 그것의 항-종양 활성은 만족스럽지 않았다(Yoko Hasumi: 가용성 FLT-1 발현은 난소암이 있는 누드마우스에서 암의 복수증을 억제한다. 암 연구 62, 2002: 2019-2023).

선행기술의 단점을 극복하기 위해, 본 발명은 VEGF의 생물학적 활성을 효과적으로 막고 혈관신생을 저해하기 위해 FLT-1 및 KDR의 다른 단편을 포함하는 새로운 키메릭 단백질을 제공한다.

본 발명의 첫 번째 양상은 VEGF의 생물학적 활성을 막고 혈관신생을 저해하는 새로운 재조합 키메릭 단백질을 제공하는 것이다.

발명의 두 번째 양상은 상기 언급된 키메릭 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 제공하는 것이다.

발명의 세 번째 양상은 키메릭 단백질의 코딩 DNA 서열를 포함하는 벡터(vector)와 그것의 재조합 호스트(host)를 제공하는 것이다.

발명의 네 번째 양상은 VEGF 활성을 막고 혈관신생을 저해하는 약제를 제조함에 있어서의 키메릭 단백질을 용도 및 상기 키메릭 단백질 및 적당한 의약 담체를 함유하는 의약 조성물 및 이의 투여 형태 뿐만 아니라 의약조성물의 치료적 적용을 제공한다.

발명의 주된 요점은 바람직하게는 인간 이뮤노글로불린 Fc(고안 방법은 도 1에 나타나 있다)를 포함하는 서로 다른 FLT-1(fms-like tyrosine kinase) 또는 KDR(kinase insert domain-containing receptor) 단편을 가진 일련의 키메릭 단백질을 고안하고, 구축하고, 그 후 VEGF 결합 에세이를 포함하는 에세이를 사용하여 VEGF에 대해 높은 친화도를 갖는 키메릭 단백질을 선택하고, 마침내 적절한 VEGF 저해제를 얻는 것이다. 키메릭 단백질의 고안은 전형적인 분자 클로닝 기술에 기초한다. 자세한 실험 방법론은 Molecular Cloning, 2판 또는 3판 (Joseph Sambrook)과 같은 실험실 매뉴얼에서 발견될 수 있다.

본 발명에 따르면, 재조합 DNA 기술에 의해 만들어진 키메릭 단백질은 VEGF 리셉터 FLT-1 및 KDR의 다른 단편을 포함하는데, 여기서 키메릭 단백질들은 다음의 군들로부터 선택된다:

a. KDR의 1차 이뮤노글로불린(Ig) 유사 도메인, FLT-1의 2차 이뮤노글로불린 유사 도메인 및 KDR의 3차 이뮤노글로불린 유사 도메인으로 구성되는 그룹, KDRd1-FLTd2-KDRd3로 표기;

b. FLT-1의 2차 이뮤노글로불린 유사 도메인, KDR의 3차 및 4차 이뮤노글로불린 유사 도메인으로 구성되는 그룹, FLTd2-KDRd3,4로 표기;

c. FLT-1의 2차 이뮤노글로불린 유사 도메인, KDR의 3차 이뮤노글로불린 유사 도메인 및 FLT-1의 4차 이뮤노글로불린 유사 도메인으로 구성되는 그룹, FLTd2-KDRd3-FLTd4로 표기;

d. FLT-1의 2차 이뮤노글로불린 유사 도메인, KDR의 3차, 4차 및 5차 이뮤노글로불린 유사 도메인으로 구성되는 그룹, FLTd2-KDRd3,4,5로 표기;

e. FLT-1의 2차 이뮤노글로불린 유사 도메인, KDR의 3차 이뮤노글로불린 유사 도메인 및 FLT-1의 4차 및 5차 이뮤노글로불린 유사 도메인으로 구성되는 그룹, FLTd2-KDRd3-FLTd4,5로 표기.

FLTd2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.1로 나타낸다. FLTd4의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.2로 나타낸다. KDRd1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.3로 나타낸다. KDRd3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.4로 나타낸다. KDRd4의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.5로 나타낸다.

여기서 사용된 것처럼, FLT는 FLT-1 서열로 불리고, KDR은 KDR 서열로 불린다; di는 FLT-1 또는 KDR에 있는 i ^th 이뮤노글로불린 유사 도메인이라고 불린다.

바람직하게는, 본 발명은 인간 이뮤노글로불린 Fc를 포함하는 키메릭 단백질의 클래스를 제공하며, 다음의 군으로부터 적절히 선택된다:

KDRd1-FLTd2-KDRd3-Fc로 지정되는 FP2';

FLTd2-KDRd3,4-Fc로 지정되는 FP3';

FLTd2-KDRd3-FLTd4-Fc로 지정되는 FP4';

FLTd2-KDRd3,4,5-Fc로 지정되는 FP5';

FLTd2-KDRd3-FLTd4,5-Fc로 지정되는 FP6'.

여기서 사용된 것처럼, Fc(fragment crystallizable region of IgG)는 IgG, IgM 및 IgA 또는 하위 클래스 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4와 같은 인간 이뮤노글로불린 Fc로부터 유래된 인간 이뮤노글로불린 Fc 단편으로 불린다. Fc 영역은 전장 Fc 서열이거나 또는 CH2, CH3 또는 힌지 영역으로부터의 Fc 서열의 단편일 수 있다.

도 1에서 보여지는 것처럼, 종래기술에서 알려진 키메릭 단백질(FP1'으로 지정된)은 FLT-1의 2차 Ig유사 도메인(FLTd2), KDR의 3차 Ig유사 도메인(KDRd3) 및 인간 이뮤노글로불린 Fc으로 구성된다. 발명에서 제공된 키메릭 단백질FP2'는 KDR의 1차 Ig유사 도메인(KDRd1)의 아미노산 시퀀스를 FP1'에 추가했는데, 이것은 VEGF를 위한 결합 사이트를 증가시키고 VEGF에 대한 친화도를 강화시킨다. 키메릭 단백질 FP3' 및 FP4'는 KDR의 4차 Ig유사 도메인(KDRd4) 또는 FP1'에 기초한 FLT-1의 4차 Ig유사 도메인(FLTd4)의 시퀀스를 각각 추가했다. FP5' 및 FP6'는 KDR의 4차 및 5차 Ig유사 도메인(KDRd4,5) 및 FP1'에 기초한 FLT-1의 4차 및 5차 Ig유사 도메인(FLT-1d4,5)을 각각 추가했다. 이러한 추가된 시퀀스들은 키메릭 단백질들의 이합체화와 VEGF 결합에 유리하도록 3차원 구조를 접는 것, VEGF에 대한 친화도를 강화하는 것을 도울 수 있다.

좀 더 바람직하게는, 본 발명은 SEQ ID NO.7로 나타나는 아미노산 시퀀스를 갖는 키메릭 단백질 FP3'를 제공한다.

본 발명에서 기술된 키메릭 단백질은 전형적인 재조합 DNA 기술을 통해서 얻어질 수 있다. 먼저, 상기 언급된 키메릭 단백질의 재조합 DNA 코딩 시퀀스가 얻어질 수 있고, FLT-1 및 KDR의 코딩 DNA 시퀀스는 GenBank, NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 얻을 수 있다. 두 번째로, 상기 언급된 키메릭 단백질의 DNA 코딩 시퀀스는 PCR 합성 이후에 벡터(vector)로 클로닝된다. 여기의 벡터들은 일반적으로 분자생물학의 플라스미드, 바이러스 또는 DNA 단편 등이 사용될 수 있다. 분비 신호 시퀀스는 전술한 키메릭 펩타이드(peptide)의 DNA 시퀀스의 말단에 세포 밖으로의 분비를 확실히 하기 위해 삽입된다. 벡터 시퀀스는 유전자 전사를 가능하게 하는 프로모터, 단백질 번역을 위한 개시 및 종결 신호 및 폴리A 시퀀스를 포함한다. 벡터는 박테리아의 증식을 위한 항체 저항 유전자를 포함한다. 또한, 벡터는 안정한 트랜스펙트된 세포라인(transfected cell lines)을 선택하기 위한 진핵세포선택유전자를 포함한다.

FLT-1 및 KDR에 있는 모든 Ig유사 도메인의 아미노산 시퀀스에 절대적인 경계가 없기 때문에, 이러한 도메인들의 시퀀스 길이는 다양성을 가질 수 있다. 게다가 본 발명에 설명된 키메릭 단백질의 시퀀스는 비슷한 다양성을 가질 수 있다. 이러한 모든 시퀀스 변이체들은 본 발명의 범위를 넘지 않는 것으로 이해되어져야 한다.

상기 언급된 키메릭 단백질의 플라스미드 형성 이후에, 플라스미드는 키메릭 단백질을 발현하기 위해 숙주세포를 트랜스펙트하기 위해 사용될 수 있다. 포유동물세포, 박테리아, 효모 및 곤충 세포들을 포함하여(그러나 제한되지는 않는) 이러한 키메릭 단백질을 위한 많은 발현 시스템이 있다. 그들 중에서, 포유동물세포와 곤충세포는 진핵세포이고, 박테리아와 효모세포는 원핵세포이다. 포유동물세포로부터 발현된 단백질은 글리코실화(glycosylated)된다. 본 발명의 키메릭 단백질이 글리코실화 되는 사이트(site)를 포함하고 있기 때문에, 포유동물세포는 그들을 발현하는 데 가장 좋은 세포이다. 큰 스케일(scale)의 단백질 생산에 적합한 293 세포, CHO 세포, SP20 세포, NS0 세포, COS 세포 BHK 세포, PerC6 세포 및 등과 같은 많은 포유동물세포들이 있다. 세포의 많은 다른 형태들은 또한 이러한 단백질들을 발현하고 생산하는 데 사용될 수 있고, 이것들은 모두 발명의 범위 안에 있다. 상기 언급된 키메릭 단백질을 인코딩하는 플라스미드는 세포 내부로 트랜스펙트되어질 수 있다. 형질전환의 방법은 제한되지 않는 예로서, 전기천공(electroporation), 리포좀(liposome)-매개 트랜스펙션, 칼슘 침전(Calcium precipitation)등이 있다.

포유동물세포 이외의 발현 시스템은 예를 들어 박테리아, 효모, 곤충 세포 등의 이러한 키메릭 단백질들을 발현하기 위해 또한 사용될 수 있다. 이것들은 모두 본 발명의 범위 안에 있는 것으로서 고려되어야 한다. 이러한 발현 시스템들은 포유동물세포의 그것과 비교하여 더 높은 단백질 생산 수율을 가지나, 그들은 글리코실화되지 않거나, 포유동물세포의 그것과 다르게 글르코실화된 탄화수소 체인을 가진 단백질을 생산한다.

키메릭 단백질의 발현 후에, 세포 배양 배지(cell culture media)에서의 키메릭 단백질 농도는 ELISA 또는 다른 에세이로 측정될 수 있다. 키메릭 단백질이 이뮤노글로불린 Fc 부위를 포함하기 때문에, 이것들은 단백질 A 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)를 사용함으로써 정제될 수 있다.

재조합 숙주 세포의 배양 배지에서 다양한 키메릭 단백질들이 얻어진 후에, 이들은 이들의 VEGF에 대한 친화도를 비교하기 위해 VEGF 결합 실험에서 에세이된다. 그들의 VEGF 저해 활성은 VEGF로 인한 인간 혈관내피세포증식실험에서 좀 더 에세이 되었다. 실험 결과는 본 발명에 따라 구성된 모든 키메릭 단백질이 종래 기술의 FP1'과 비교할 때 VEGF에 높은 친화력을 가지고 결합할 수 있음을 나타냈다(도 2). 또한, 이들은 내피세포의 VEGF 활성을 효과적으로 막을 수 있었고 내피세포의 성장을 저해할 수 있었다. 한층 나아간 실험은 FP3'가 VEGF에 대해 가장 좋은 활성저해를 가지며, 발명에서 가장 효과적인 VEGF-저해 키메릭 단백질이라는 것을 나타냈다.

따라서, 본 발명에서 구성된 키메릭 단백질은 VEGF에 대해 극도의 저해활성을 가지며, 모두 항-혈관신생의 생물학적 활성을 가지고, 따라서 혈관신생 또는 VEGF 관련 질병, 제한되지 않는 다양한 종양, 당뇨병성 망막병증, 관절염, 빈혈기관들, 자궁내막 증식증 등을 치료하는 데 사용될 수 있다.

생체 내에서 키메릭 단백질의 항-혈관신생 효과를 보다 구체화하기 위해서, 몇몇 동물 모델 실험이 또한 이루어졌다. 이러한 실험의 결과는 B16F10 흑색종 BALB/C 누드 마우스 모델과 인간 PC-3 전립선 종양 이종이식 마우스 모델에서, 본 발명의 키메릭 단백질은 종래 기술에서의 FP1'보다 훨씬 더 나았고, 종양 성장을 효과적으로 저해했으며 동물의 수명을 연장했다는 것을 보여줬다. 따라서, 발명의 키메릭 단백질은 높은 항암 활성을 갖는다.

본 발명은 또한 상기 설명된 키메릭 단백질과 적절한 의학적 담체(carrier)를 포함하는 의학적 조성물을 제공한다. 언급한 조성물은 주사용 투약 형태 및 좀 더 바람직하게는 동결건조된 형태로 제형화될 수 있다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 5개의 키메릭 단백질의 구조와 선행기술의 FP1'을 나타낸다. 그들은 유전자 공학 기술을 사용하여 FLT-1, KDR 및 이뮤노글로불린 Fc 부위의 다른 단편들로 구성된다.

도 2는 본 발명의 바람직한 실시예에서 5개의 키메릭 단백질의 VEGF 결합의 결과를 선행기술의 FP1'의 그것과 비교하여 나타내는데, 여기서 OD 값은 VEGF에 대한 키메릭 단백질의 결합 신호를 말한다. 결과는 모든 5개의 키메릭 단백질이, 그들 중에 FP3'가 가장 높은 친화도를 갖는 FP1'보다 훨씬 높은 친화도를 가지고 VEGF에 결합했음을 나타낸다.

도 3은 발명의 키메릭 단백질이 FP1'과 비교하여 인간 혈관내피세포의 성장을 생체 밖에서 효과적으로 저해할 수 있음을 나타낸다.

도 4는 키메릭 단백질 FP3'이 마우스에서의 B16F10 흑색종 종양 성장을 효과적으로 저해할 수 있음을 나타낸다.

도 5는 키메릭 단백질 FP3'이 마우스에서의 인간 PC-3 전립선 종양 성장을 효과적으로 저해할 수 있음을 나타낸다.

도 6은 발명의 키메릭 단백질 FP3'의 항-종양 성장 활성과 선행 기술에서의 FP1'의 그것을 마우스에서 비교한다.

다음의 예시들은 구성의 상세한 설명, 실험 방법론 및 발명에 설명된 키메릭 단백질의 적용을 제공한다. 그러나 이러한 예들은 발명의 보호범위를 제한하는 것 으로 해석되어서는 아니된다.

실시예 1: 키메릭 단백질을 인코딩하는 DNA 시퀀스의 클로닝 및 재조합 벡터의 구축

이뮤노글로불린 Fc 코딩 DNA 시퀀스 이외에, 본 발명의 다양한 키메릭 단백질의 DNA 시퀀스를 코딩하는 것은 FLT-1 및 KDR의 cDNA로부터 유래된다. FLT-1 및 KDR이 혈관내피세포에서 주로 발현되기 때문에, 전체 RNA는 인간 탯줄정맥내피세포(HUVEC)에서 RNA 정제 키트(QIAGEN)를 사용하여 추출되었다; 그 후 cDNA가 AMV 역전사효소(Promega)를 사용하여 RNA로부터 합성되었다; 그 후 다양한 FLT-1 및 KDR 단편들은 다른 프라이머(primer)들을 가지고 PCR 증폭되었다; 마지막으로 FLT-1, KDR 및 인간 이뮤노글로불린 Fc(IgG1 Fc)의 시퀀스들은 다양한 키메릭 단백질들을 인코딩하는 재조합 DNA 시퀀스를 구성하기 위해 PCR에 의해 함께 융합된다. 모든 6개의 키메릭 단백질의 구조들(선행기술의 FP1'을 포함하여)은 도 1에 나타난다.

예 1 FP3' 코딩 시퀀스의 구축 및 재조합 벡터

HUVEC 세포(Clonetics)는 EGM-2 배지(Clonetics)로 T-175 플라스크에서 배양되었다. 1 x 10⁷세포들이 수집되었고 Qiagen의 RNA 정제 키트를 사용하여 전체 RNA 추출의 대상이 되었으며, 그 후 cDNA는 Invitrogen cDNA 키트를 사용하여 합성되었다. cDNA 생산물은 -80℃에서 사용시까지 저장되었다. 다음의 특정한 프라이머들은 HUVEC cDNA의 다양한 FLT-1 및 KDR 도메인을 PCR 증폭하는데 사용되었다.

인간 IgG1 Fc는 다음의 Lymph Nodes cDNA(BD Clontech)의 특정한 프라이머들을 사용해서 PCR 증폭되었다.

프라이머:

FLT-1 d2 전방위: 5'-cctttcgtagagatgtacagtga-3'

FLT-1 d2 후방위: 5'-tatgattgtattggtttgtccat-3'

KDR d3-4 전방위: 5'-gatgtggttctgagtccgtctca-3'

KDR d3-4 후방위: 5'-cggtgggacatacacaaccaga-3'

인간 IgG1 Fc 전방위: 5'-gacaaaactcacacatgcccact-3'

인간 IgG1 Fc 후방위: 5'-tcatttacccggagacagggagag-3'

Ig-유사 도메인 및 인간 IgG1 Fc 단편은 95℃에서 30초 동안 변성 상태로 PCR 증폭되었고, 56℃에서 45초 동안 어닐링(annealing)되고, 72℃에서 2분 동안 사슬을 연장하고, 30 사이클을 수행하였다. PCR 생산물은 그 후 TA 복제 키트를 사용하여 플라스미드 pCR2.1(Invitrogen)에 클로닝되었다. E. coli(JM109)로의 형질전환 후에, 백색 콜로니들이 선택되어졌고, LB 미디어에서 하룻밤 동안 배양되었다. DNA 플라스미드들은 Qiagen 키트를 사용하여 준비되었고 효소 소화와 DNA 시퀀싱의 대상이 되었다.

FLT-1, KDR 및 IgG Fc의 cDNA는 EcoRI 사이트를 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR 쏘잉(sewing)을 통해 함께 융합되었다. EcoRI으로 소화된 후에, DNA 단편은 Qiagen 정제 키트로 정제되었고 플라스미드 pcDNA3.1로 복제되었다. E.coli(JM109)로 형질 변환된 후에, 양성 콜로니들이 가려내졌고, LB 배지에서 하룻밤 동안 배양되었다. DNA 플라스미드들은 Qiagen 플라스미드 정제 키트로 추출되었고 그 후 효소 소화와 DNA 시퀀싱의 대상이 되었다. 얻어진 FP3' DNA 코딩 시퀀스는 SEQ ID NO.6로 나타낸다. 확인된 플라스미드는 FP3'를 발현하는 안정한 세포 라인을 얻기 위해 293 세포 또는 CHO 세포가 트랜스펙트(transfect)되는 데 사용되었다. FP3'의 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NO.7로 나타낸다.

예 2 FP1' 유전자 및 재조합 벡터의 구축

FP1'은 예 1에서와 비슷하게 구성되었다. 단 하나의 차이점은 목적하는 재조합 DNA가 FLT-1의 2차 Ig-유사 도메인, KDR의 3차 Ig-유사 도메인 및 예 1에서 보여진 것과 같은 인간 IgG1 Fc를 함께 융합함으로써 구성되었다는 데 있다.

예 3 FP2' 유전자의 구성 및 재조합 벡터

FP2'는 예 1에서와 비슷하게 구성되었다. 단 하나의 차이점은 목적하는 재조합 DNA가 KDR의 1차 Ig-유사 도메인, FLT-1의 2차 Ig-유사 도메인, KDR의 3차 Ig-유사 도메인 및 예 1에서 보여진 것과 같은 인간 IgG1 Fc를 함께 융합함으로써 구성되었다는 데 있다.

예 4 FP4' 유전자의 구성 및 재조합 벡터

FP4'는 예 1에서와 비슷하게 구성되었다. 단 하나의 차이점은 목적하는 재조합 DNA가 FLT-1의 2차 Ig-유사 도메인, KDR의 3차 Ig-유사 도메인, FLT-1의 4차 Ig-유사 도메인 및 예 1에서 보여진 것과 같은 인간 IgG1 Fc를 함께 융합함으로써 구성되었다는 데 있다.

예 5 FP5' 유전자의 구성 및 재조합 벡터

FP5'는 예 1에서와 비슷하게 구성되었다. 단 하나의 차이점은 목적하는 재조합 DNA가 FLT-1의 2차 Ig-유사 도메인, KDR의 3차-5차 Ig-유사 도메인 및 예 1에서 보여진 것과 같은 인간 IgG1 Fc를 함께 융합함으로써 구성되었다는 데 있다.

예 6 FP6' 유전자의 구성 및 재조합 벡터

FP6'은 예 1에서와 비슷하게 구성되었다. 단 하나의 차이점은 목적하는 재조합 DNA가 FLT-1의 2차 Ig-유사 도메인, KDR의 3차 Ig-유사 도메인, FLT-1의 4차-5차 Ig-유사 도메인 및 예 1에서 보여진 것과 같은 인간 IgG1 Fc를 함께 융합함으로써 구성되었다는 데 있다.

실시예 2: 세포 내에서 키메릭 단백질의 발현

예 7 키메릭 단백질 FP3'의 발현

상기 언급된 재조합 플라스미드의 구축 후에, Qiagen의 플라스미드 키트를 사용하여 양질의 플라스미드 DNA가 얻어졌고, 그 후 FUGEN6 트랜스펙션 키트(Roche)를 사용하여 293 세포(ATCC)로 트랜스펙트되었다. 단백질 필요량에 따라 키메릭 단백질을 발현하기 위해 두 개의 다른 방법이 사용되었다.

첫 번째 방법은 일시적 트랜스펙션의 방법이다. 키메릭 단백질의 적은 양이 이 방법을 사용하여 생산되었다. 첫 번째로, 293 세포는 조직배양접시에 10% FBS를 가진 DMEM 배지에서 배양되었다. 60-80% 세포 일치점에서, 플라스미드 DNA의 혼합 및 FUGEN6 시약이 배양에 더해졌다. 배양 배지는 그 다음날 세럼-프리(serum-free) DMEM으로 교환되었고, 세포들의 배양은 배지가 수집되기 전에 3일 동안 더 진행되었다. 이러한 배지는 발현된 키메릭 단백질을 포함했고, 키메릭 단백질의 농도는 ELISA에 의해 에세이되었다.

두 번째 방법은 안정한 트랜스펙션의 방법이다. 안정한 셀 라인이 대량의 키메릭 단백질을 생산하기 위해 형성되었다. 숙주 세포는 다시 293 세포(ATCC)였다. 재조합 플라스미드를 트랜스펙팅(transfecting)하는 단계는 상기 설명된 일시적 트랜스펙션과 동일했다. 그러나, 두 번째 날, 세포는 네오마이신(neomycin)이 있는 DMEM에 배양되었고 한계 희석(limited dilution)에 의해 클로닝되었다. 약 21일 후에, 네오마이신 저항성 클론들을 골라내고 대량으로 배양되었다. 마지막으로, 키메릭 단백질들은 쉐이커 플라스크(shaker flask)에서 발현되었다. 키메릭 단백질의 농도는 ELISA에 의해 에세이되었다.

FP3'는 배양된 미디어로부터 친화 크로마토그래피 및 겔여과 등을 포함하는 에세이를 사용하여 정제되었다. FP3의 분자량은 140KD 이었다.

예 8 다른 키메릭 단백질의 발현

키메릭 단백질 FP1', FP2', FP4', FP5' 및 FP6'는 예 7의 방법에 따라 얻어졌다.

실시예 3: 키메릭 단백질의 VEGF에 대한 결합 실험

키메릭 단백질의 VEGF에 대한 친화도는 본 발명의 VEGF 결합 에세이에서 결정되었다. 첫 번째로, 재조합 VEGF 단백질(Chemicom)은 96-웰(well) ELISA 플레이트(plate)에서 코팅되었고, 플레이트의 불특정 단백질 결합 사이트는 그 후 5% 우유 용액을 사용하여 블로킹하였다. 두 번째로, 각각의 웰에 다양한 키메릭 단백질의 다른 농도들이 첨가되었고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이트되었다. 워싱(washing)한 후에, 토끼 항-인간 Ig-HRP(Sigma)이 각각의 웰에 첨가되었고, 마지막으로 플레이트에 비색 효소(colorimetric enzyme)기질이 첨가되었다. 흡수 OD 리딩은 ELISA 플레이트 리더(ELISA plate reader)를 사용하여 기록되었다. 더 높은 OD 값은 VEGF에 대한 키메릭 단백질의 더 강한 결합 친화도를 나타냈다.

도 2에서 보여지는 것처럼, 본 발명의 실시예에서 구성되고 발현된 5개의 키메릭 단백질 모두는 VEGF에 결합할 수 있었고, 선행 기술의 FP1'보다 더 좋은 친화도를 가졌다. 결합은 1 ㎍/ml의 낮은 농도에서 감지할 수 있었다. 바람직하게는, FP3'는 가장 좋은 친화도를 가졌고 가장 좋은 VEGF 저해제였다. 그것의 최고 결합 농도의 절반은 FP1'의 그것보다 대략 5배 정도 낮았다. FP5'는 VEGF에 대해 FP3'의 그것보다 약간 더 낮은 친화도를 가졌다. 이 결과는 KDR의 4차 Ig-유사 도메인이 키메릭 단백질의 VEGF에 대한 블로킹(blocking) 활성을 실제적으로 증대시킬 수 있었다는 것을 시사한다. 그러나 예를 들어 5차 Ig-유사 도메인과 같은 KDR 도메인을 더 많이 첨가하는 것은 VEGF에 대한 저해 효과를 더 이상 강화할 수 없었다. 다른 3 개의 키메릭 단백질은 FP3'와 FP5'와 비교하여 더 낮은 친화도를 나타냈으나, FP1'보다는 더 높은 친화도를 나타냈다.

실시예 4: 키메릭 단백질은 인간 혈관내피세포의 증식을 생체 밖에서 효과적으로 저해했다.

발명의 이러한 바람직한 실시예는 키메릭 단백질이 혈관내피세포의 VEGF-유도된 성장을 효과적으로 블로킹할 수 있었음을 입증한다. 실험에서, HUVEC 세포(Clonetics)는 2% FBS와 VEGF의 15 ng/ml를 포함한 EBM 배지가 있는 96-웰 조직 배양플레이트에 접종되어졌다. 키메릭 단백질을 포함하는 293 세포 상청액(supernatant)의 다른 양이 플레이트에 첨가되었다. 키메릭 단백질을 포함하지 않는 트랜스펙트되지 않은 293 세포 배지가 음성 대조군(negative control)으로써 사용되었다. 모든 HUVEC 세포는 세포 밀도가 세포 계수(cell counting)에 의해 결정되기 전에 37℃에서 3일 동안 배양되었다.

HUVEC 증식 실험은 발명에 따라 구성된 모든 5 개의 키메릭 단백질이 선행 기술의 FP1'보다 훨씬 효과적으로 혈관내피세포의 증식을 저해할 수 있음을 나타낸다(도 3). 실험에서 HUVEC 세포 증식은 VEGF 활성에 의해 유도되었기 때문에, 그것은 따라서 모든 5 개의 키메릭 단백질들이 VEGF의 리셉터 활성을 저해하는 것이 가능했고, 그것들 모두가 항-혈관신생 활성을 가지고 있었음이 시사되었다. 그들 중에서, FP3'는 HUVEC 세포 성장에 대해 약 3 ng/ml의 IC50 하에서 가장 좋은 저해 효과를 가졌다. 선행기술의 FP1'의 IC50는 약 12 ng/ml이었고, FP2', FP4', FP5' 및 PF6'의 IC50은 모두 약 5-8 ng/ml이었다.

실시예 5: 키메릭 폴리펩타이드가 마우스에서 종양 성장을 저해했다.

예 9 키메릭 단백질을 포함하는 주사 제형의 준비

주사 제형은 주사 제형을 위해 FP3 24 mg/ml, PB 5mM, NaCl 100mM 및 수크로오스(sucrose) 20%를 사용하여 어떠한 일반적인 방법론에 따라 준비되었다.

예 10 키메릭 단백질은 쥐에서 B16F10 흑색종 세포의 성장을 효과적으로 저해했다.

VEGF 저해제로서, 발명의 키메릭 단백질의 적용은 항암 치료에서 사용된다. 그것의 높은 블로킹 효과가 VEGF에 영향을 미치기 때문에, FP3'가 동물 모델에서 항-종양 실험에서 작용하도록 선택되었다.

동물 모델은 B16F10 흑색종 세포를 가진 뮤라인(murine)으로, 이 세포는 급격히 빠르게 성장하는 종양 세포의 일종이다. 실험에서, 1 x 10⁵ B16F10 세포가 들어있는 0.05 ml이 BALB/C 누드 마우스의 등의 피하로 1차 주입되었다. 그 후 정제된 키메릭 단백질 400㎍이 각각의 마우스의 복막 내부로 일주일에 두 번 주입되었다(쥐의 평균 무게는 22g이었다). 같은 양의 정제된 인간 이뮤노글로불린 Fc가 음성 대조군 마우스에게 주입되었다. 키메릭 단백질 FP3'가 흑색종 세포의 성장을 효과적으로 저해했음을 표시하는 종양 성장 커브(curve)는 도 4에서 나타났다(P < 0.01).

예 11 키메릭 단백질은 쥐에 있는 제노그래프된(xenograph) 전립선 암 PC-3 세포의 성장을 효과적으로 저해했다.

누드 마우스에서의 인간 종양 세포 성장의 제노그래프 모델은 동물 모델 중 하나로, 인간 종양과 가장 비슷한 것이다. 누드 마우스는 면역 거부반응이 없기 때문에, 많은 인간 종양 세포는 누드 마우스에서 자랄 수 있고 종양을 형성할 수 있다. 키메릭 단백질 FP3'는 BALB/C 누드 마우스에서 인간 전립선 종양 PC-3 세포(ATCC)의 성장 저해를 위해 시험 되었다. 이 모델에서, 1 x 10⁵ PC-3 세포가 들어있는 0.05ml이 누드 마우스의 등의 피하로 1차 주입되었다. 그 후 정제된 키메릭 단백질 400㎍이 각각의 마우스의 복막 내부로 일주일에 두 번 주입되었다. 같은 양의 정제된 인간 이뮤노글로불린 Fc가 음성 대조군 마우스에게 주입되었다. 실험 결과는 도 5에서 나타났다. 대조군 마우스에서, 종양은 피하 주입 이후 45일 뒤에 1000mm³ 이상 자랐다. 그러나 마우스에게 투여된 키메릭 단백질에서, FP3'가 현저한 치료적인 항-종양 효과가 있음을 증명하면서 종양 성장을 거의 완전하게 저해했다(P < 0.01).

실시예 6: 키메릭 단백질 FP3'과 선행기술 FP1'의 마우스에서의 종양 성장 억제 비교연구

FP3'의 최고의 항암 활성을 한층 더 증명하기 위해, FP1'과 FP3'의 효과는 종양 성장 실험에서 비교되었다. 10 마리의 건강한 BALB/C 누드 마우스들이 선택되었고 각각의 등의 피하로 1 x 10⁵ 래트 글리오블라스토마 C6 세포가 들어있는 0.05ml이 주입되었다. 그 후 정제된 PF1' 또는 PF3' 2.5 mg/kg이 복막 내부로 일주일에 두 번, 각각 31일이 될 때까지 주입되었다. 같은 양의 정제된 인간 이뮤노글로불린 Fc가 주입되었다. 실험 결과는 도 6에서 나타난다. FP1'과 FP3'은 모두 종양에 있어서 현저한 치료적 효과가 있다. 35일째에, Fc로 치료된 대조군 마우스의 종양 부피는 24일째에 이미 1312.3에 도달한 반면에 FP1'과 FP3'가 투여된 마우스의 종양 부피는 각각 1167.3과 557.6이었다. 따라서, FP3'은 선행기술의 FP1'보다 더 현저한 효과(P < 0.05)를 가졌다.

모두를 종합하였을 때, 발명을 따라 구성된 VEGF에 대하여 높은 친화도를 가지는 키메릭 단백질은 생체 밖에서 혈관내피세포증식을 저해하는 것이 가능했으며, 종양 성장을 생체 내에서 효과적으로 저해할 수 있었다. 혈관 신생이 모든 종양 성장에서 중요하기 때문에, 발명의 키메릭 단백질은 많은 종양에 대한 치료적 적용에 사용될 수 있다.

<110> CHENGDU KANGHONG BIOTECHNOLOGIES CO., LTD. <120> ANGIOGENESIS-INHIBITING CHIMERIC PROTEINS AND THE USE <130> PI-6K1080CN <150> CN200410044965.7 <151> 2004-06-08 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr 1 5 10 15 Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile 20 25 30 Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly 35 40 45 Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala 50 55 60 Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly 65 70 75 80 His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr 85 90 <210> 2 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Ile Thr Val Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr Val Ala 1 5 10 15 Gly Lys Arg Ser Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser 20 25 30 Pro Glu Val Val Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser 35 40 45 Ala Arg Tyr Leu Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile Ile 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Claims

VEGF 리셉터 FLT-1(fms-like tyrosine kinase) 및 KDR(kinase insert domain-containing receptor)의 다른 단편들로 구성되는 키메릭 단백질의 형태로서, 하기 군에서 선택되어지는 것을 특징으로 하는 키메릭 단백질;

a. KDR의 1차 Ig-유사 도메인, FLT-1의 2차 Ig-유사 도메인 및 KDR의 3차 Ig-유사 도메인으로 구성되고, KDRd1-FLTd2-KDRd3로 표기;

b. FLT-1의 2차 Ig-유사 도메인 및 KDR의 3차 및 4차 Ig-유사 도메인으로 구성되고, FLTd2-KDRd3,4로 표기;

c. FLT-1의 2차 Ig-유사 도메인, KDR의 3차 Ig-유사 도메인 및 FLT-1의 4차 Ig-유사 도메인으로 구성되고, FLTd2-KDRd3-FLTd4로 표기;

e. FLT-1의 2차 Ig-유사 도메인, KDR의 3차 Ig-유사 도메인 및 FLT-1의 4차 및 5차 Ig-유사 도메인으로 구성되고, FLTd2-KDRd3-FLTd4,5로 표기:

상기에서, FLTd2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.1로 나타내어지고, FLTd4의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.2로 나타내어지며, KDRd1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.3로 나타내어지고, KDRd3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.4로 나타내어지며, KDRd4의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.5로 나타내어진다.
청구항 1의 키메릭 단백질과 다음의 그룹에서 선택된 인간 이뮤노글로불린 Fc(fragment crystallizable region of IgG)로 구성되는 것을 특징으로 하는 키메릭 단백질:

KDRd1-FLTd2-KDRd3-Fc로 표기되는 FP2';

FLTd2-KDRd3,4-Fc로 표기되는 FP3';

FLTd2-KDRd3-FLTd4-Fc로 표기되는 FP4';

FLTd2-KDRd3-FLTd4,5-Fc로 표기되는 FP6'.
제 2항에 있어서, 인간 이뮤노글로불린의 클래스 또는 서브 클래스로부터 유래된 이뮤노글로불린 Fc를 특징으로 하는 키메릭 단백질.
제 3항에 있어서, 이뮤노글로불린 Fc 단편이 전장 Fc인 것을 특징으로 하는 키메릭 단백질.
제 2항에 있어서, FP3'는 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO. 7로 나타내어지는 것을 특징으로 하는 키메릭 단백질.
제 1항 내지 제 4항 중에서 선택된 어느 하나의 키메릭 단백질을 인코딩하는 재조합 DNA.
DNA 시퀀스가 SEQ ID NO. 6으로 나타내어지는 것을 특징으로 하는 제5항의 키메릭 단백질을 인코딩하는 재조합 DNA.
제 6항의 재조합 DNA 시퀀스를 포함하는 벡터로서, 상기 벡터가 플라스미드, 바이러스, 또는 DNA 절편인 벡터.
제 7항의 재조합 DNA 시퀀스를 포함하는 벡터로서, 상기 벡터가 플라스미드, 바이러스, 또는 DNA 절편인 벡터.
제 8항의 재조합 벡터를 함유하는 재조합 숙주로서, 상기 숙주세포가 진핵 세포이거나 또는 원핵 세포인 재조합 숙주.
제 1항 내지 제 5항 중에서 선택된 어느 하나의 키메릭 단백질 및 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 종양, 당뇨병성 망막병증, 관절염, 빈혈 및 자궁내막 증식증 중에서 선택되는 혈관신생-관련 질병 치료용 약리학적 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 약리학적 조성물은 주사 용액인 약리학적 조성물.
제 9항의 재조합 벡터를 함유하는 재조합 숙주로서, 상기 숙주세포가 진핵 세포이거나 또는 원핵 세포인 재조합 숙주.