KR100896710B1

KR100896710B1 - 골 밀도 유전자 마커

Info

Publication number: KR100896710B1
Application number: KR1020070115684A
Authority: KR
Inventors: 송영욱; 서유신
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2007-11-13
Filing date: 2007-11-13
Publication date: 2009-05-11
Anticipated expiration: 2027-11-13

Abstract

본 발명은 골밀도의 진단에 관한 것으로서, 골밀도의 진단에 이용되는 XPD 유전자 내의 SNP 또는 결손 변이에 관한 것이다. 본 발명의 유전적 마커는 골밀도와 밀접한 관련이 있으며, 골밀도 또는 골 발달 질환의 진단 또는 예후를 신속하고 정확하게 실시할 수 있도록 해 준다. 본 발명의 유전적 마커를 이용하면, 골 발달 질환, 특히 골다공증이 쉽게 발병될 수 있는 사람을 선별할 수 있으며, 또한 골다공증 환자의 치료에 따른 병의 호전 또는 악화(예후)를 유전자 수준에서 정확하게 판단할 수 있다.

골밀도, 골다공증, XPD, SNP, 진단

Description

골 밀도 유전자 마커{Genetic Markers for Bone Density}

본 발명은 골밀도의 진단에 관한 것으로서, 골밀도의 진단에 이용되는 유전적 마커에 관한 것이다.

폐경기성 골다공증 및 노인성 골다공증은 골다공증의 가장 일반적인 두 가지 타입이다. 골다공증은 여성뿐만 아니라 남성들에서도 발병하며, 노인들의 건강에 심각한 영향을 미친다.

골다공증의 가장 일반적인 타입은 폐경기와 관련이 있다. 대부분의 여성들에서, 월경 중단 후 약 3-6년 사이에 골의 소주 부분(trabecular compartment)에서 골질량(bone mass)가 20-60% 정도 감소한다. 이러한 빠른 골 손실은 일반적으로 골 재흡수의 증가와 관련이 있다.

한편, 골다공증의 치료로서 에스트로겐 대체요법이 많이 이용되고 있다. 이 요법은 치료 효능은 있으나, 부작용이 심각한 문제점이 있다. 에스트로겐 대체요법으로서, 라록시펜, 타목시펜, 칼시토닌 및 비스포스포네이트 등이 알려져 있다.

골다공증의 발병 또는 골밀도와 관련된 유전자적 연구가 있었으며, 예를 들어, 비타민 D 수용체 좌위(VDR)(Morrison et al, Nature , 367:284-287 (1994)), PTH 유전자(Howard et al, J. Clin . Endocrinol. Metab ., 80:2800-2805 (1995); Johnson et al, J. Bone Miner . Res ., 8:11-17 (1995); Gong et al, J. Bone Miner . Res ., 10:S462 ((1995)) 및 에스트로겐 수용체 유전자(Hosoi et al, J. Bone Miner . Res ., 10:S170 (1995); Morrison et al, Nature , 367:284-287 (1994))에 대한 연구가 있었다.

인간 지놈 프로젝트가 완성된 이후, 개별적인 유전 변이에 대한 관심이 집중되고 있다. 이러한 유전 변이(대부분은 SNP로 구성되어 있다)는 사람들의 개별적인 표현형 변화의 상당한 부분을 초래하며, 예컨대, 노화-관련 특징들에서의 차이 등을 초래한다.

골밀도 또는 골질량이 환경적 요인보다는 유전적인 요인에 의해 주로 결정된다는 것은 잘 알려져 있지만, 골밀도의 차이와 연관된 유전자 좌위에 대한 연구는 잘 되어 있지 않다. 또한, 골밀도 또는 골질량의 지표가 될 수 있는 유전자다형염기에 대한 보고는 거의 없는 상태이다.

따라서, 골밀도 표현형(phenotype)과 관련된 유전적 마커게 대한 요구가 당업계에 대두되어 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서 에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 골다공증과 같은 골 발달 질환(bone development disorders)의 효율적인 진단을 위하여 골밀도(bone mineral density: BMD)와 상관관계를 갖는 유전자 마커를 발견하고자 노력하였다. 그 결과, XPD(ERCC2) 유전자에서 골밀도를 유전자 수준에서 구별해 주는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP) 현상을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 골밀도와 관련된 SPNs를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 골밀도 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 2 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 3 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 4 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 5 서열에서 49-51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 6 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 7 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 8 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 9 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열 목록 제 10 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 또는 서열목록 제 11 서열에서 51번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기로 이루어진 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상보적인 서열을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 A인 것, 서열목록 제 2 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 A인 것, 서열목록 제 3 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 A인 것, 서열목록 제 4 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 C인 것, 서열목록 제 5 서열에서 49-51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 6 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 T인 것, 서열목록 제 7 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 C인 것, 서열목록 제 8 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 C인 것, 서열목록 제 9 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 A인 것, 서열목록 제 10 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 C인 것, 또는 서열목록 제 11 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 G인 것을 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기로 이루어진 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 골밀도 진단용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 골다공증과 같은 골 발달 질환(bone development disorders)의 효율적인 진단을 위하여 골밀도(bone mineral density: BMD)와 상관관계를 갖는 유전자 마커를 발견하고자 노력하였다. 그 결과, XPD(ERCC2) 유전자에서 골밀도를 유전자 수준에서 구별해 주는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP) 현상을 발견하였다.

본 명세서에서, 용어 “골밀도”는 골미세 조직의 형태학적 및 기능적 측면을 설명하는 용어로 단위면적당 골질량이 차지하는 정도를 의미한다. 단위면적당 골질량의 정도를 BMD로 표현되며, 정상골밀도, 골결핍증(감소증) 및 골다공증으로분류된다.

본 발명의 SNP는 골밀도가 관련된 모든 질환 또는 질병, 즉 골 발달 질환의 진단에 될 수 있다. 본 명세서에서 용어 “골 발달 질환”은 골 발달에서의 이상상태(disorders)를 의미하며, 예컨대, 질병 과정에서의 골 발달 변화, 노화 과정에서의 골 발달 변화에 의한 이상 상태를 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 SNP에 의해 진단될 수 있는 골 발달 질환은 골다공증, 골다공증-가성신경교종, 엥겔만 질환, 리빙 질환(Ribbing's disease), 고포스파타아제혈증(hyperphosphatasemia), 반 부켐 질환(Van Buchem's disease), 국한성유선상과골증, 골화석증, 경결구축, 골반문증, 말단비대증, 파제트병, 섬유형성이상, 골형성 부전증, 고칼슘뇨증 및 골연화증이다. 가장 바람직하게는, 골 발달 질환은 골다공증이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기한 SNP 및 결손 변이 중에서, 서열목록 제 1 서열에서 51번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기가 골밀도의 유전적 마커로서 유용하다. 서열목록 제 1 서열은 XPD 유전자의 엑손 5에 있는 IVS(intervening sequence)에 발생된 SNP를 포함하는 서열이다. 서열목록 제 1 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 G인 경우에는 골밀도가 높은 성향을 나타내는 인간을 나타내며, 이러한 SNP를 갖는 인간은 골다공증이 유발될 가능성이 낮다.

본 명세서에서 용어, “뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

한편, 본 발명은 상술한 바와 같이, 서열목록 제 1 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 G, 서열목록 제 2 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 C, 서열목록 제 3 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 C, 서열목록 제 4 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 T, 서열목록 제 6 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 A, 서열목록 제 7 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 T, 서열목록 제 8 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 T, 서열목록 제 9 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 C, 서열목록 제 10 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 T, 서열목록 제 11 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 A로 변화된 것의 대립형(allele)에 관한 것이나, 이러한 대립형 뉴클레오타이드가 이중가닥의 gDNA (genomic DNA)에서 발견되는 경우, 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다.

이러한 측면에서, 본 명세서의 모든 서열은, 특별한 언급이 없는 한, gDNA에서 센 스 가닥에 있는 서열을 기준으로 한 것이다.

본 발명의 유전적 마커를 이용하여 골밀도를 진단하는 경우, 우선 생체시료(biosmaple)로부터 핵산 분자를 분리한다.

본 명세서에서, 용어 “핵산 분자”는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산분자는 다양한 생체시료로부터 얻을 수 있으며, 예컨대, 조직, 세포, 혈액, 림프, 골수액, 타액, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수, 양막액 및 세포 조직액으로부터 얻을 수 있다.

본 발명의 유전적 마커를 이용하여 골밀도 또는 골 발달 질환을 진단하는 경우, 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다.

출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다 (참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol . Rep ., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem . 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 식물세포로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다 (참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명의 유전적 마커를 이용하여 이러한 마커가 있는 지 여부를 규명하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석 (SSCA, Orita et al., PNAS , USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석 (Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동 (DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res ., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann . Rev . Genet ., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석 또는 TDGS(two-dimensional gene scanning)도 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다.

다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다.

예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용된다. 상기 리보프로브와 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰된다.

혼성화 시그널을 이용하는 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 자가면역질환 여부를 결정한다.

본 명세서에서, 용어 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게 (perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 (substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 상술한 유전적 마커를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 프로브의 3‘-말단 또는 5’-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스 (duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3‘-말단 또는 5’-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건 (stringent condition)은 온도, 이온세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

골밀도 또는 골 발달 질환을 진단하기 위하여, 유전적 마커를 증폭하기 위해서는, 상술한 유전적 마커를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 기본적으로 이용한다. 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 증폭 기술은 PCR 증폭 (참조: Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822)), 리가아제 체인 반응 (LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560 (1989)), 중합효소 리가아제 체인 반응 (Barany, PCR Methods and Applic ., 1:5-16(1991)), Gap-LCR (WO 90/01069), 리페어 체인 반응 (EP 439,182), 3SR (Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173(1989)) 및 NASBA (U.S. Pat. No. 5,130,238)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 PCR 증폭 단계에 따라 증폭한다.

증폭 기술이 적용되는 경우에는, 프라이머의 디자인이 중요하다. 바람직하게는, 프라이머쌍 중에서 전방향 또는 역방향 프라이머는 서열목록 제 1 서열 내지 제 11 서열에서 변이가 발생하는 위치에 인접한 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 전방향 프라이머의 3‘-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 보다 바람직하게는, 상기 전방향 프라이머의 3‘-말단은 상기 SNP 염기 에 상보적인 염기를 갖으며, 바로 인접한 서열은 타깃 서열에 매칭되지 않는 비상보적인 염기를 갖는다.

PCR 방법의 조건 및 사용되는 시약과 효소는 당업계에서 통상적으로 공지된 것을 이용할 수 있다. 한편, PCR에 의해 증폭된 산물은 아가로스-겔 전기영동과 같은 통상적인 전기영동 방법으로 확인된다. 즉, PCR 증폭 반응물을 아가로스-겔에 로딩하여, 밴드가 출현하는 지 여부를 관찰하여 자가면역질환 여부를 판정한다.

본 발명은 골밀도 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 상술한 프라이머 또는 프로브를 필수 구성요소로 하는 바, 프라이머 또는 프로브에 대한 상세한 설명은 본 발명의 키트에 이용되는 프라이머 또는 프로브에도 적용된다. 따라서, 반복적인 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 키트에 포함되는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 서열목록 제 1 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 A인 것, 또는 서열목록 제 2 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 A인 것을 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기로 이루어진 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는다.

예를 들어, 서열목록 서열목록 제 1 서열에서 51번째 위치한 SNP G 염기는 골밀도의 증가와 상관관계가 있는 SNP이다. 특히, GG 동형접합체(homozygote)인 경우 골밀도, 특히 대퇴골 골밀도의 증가와 큰 상관관계가 있다.

또한, 서열목록 제 2 서열에서 51번째에 위한 SNP C 염기는 골밀도의 감소와 상관관계가 있는 SNP이다. 특히, CC 동형접합체(homozygote)인 경우 골밀도, 특히 대퇴골 골밀도의 감소와 상관관계가 있다.

한편, 본 발명의 SNPs는 골밀도에 대한 반수체 분석(haplotyping)에 이용될 수 있다. 하기의 실시예에 기재된 바와 같이, 서열목록 서열목록 제 1 서열에서 51번째 염기가 G이고, 서열목록 제 2 서열에서 51번째 염기가 A인 반수체는 골밀도, 특히 대퇴골 골밀도의 증가와 큰 상관관계가 있다.

본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 유전적 마커는 골밀도와 밀접한 관련이 있으며, 골밀도 또는 골 발달 질환의 진단 또는 예후를 신속하고 정확하게 실시할 수 있도록 해 준다. 본 발명의 유전적 마커를 이용하면, 골 발달 질환, 특히 골다공증이 쉽게 발병될 수 있는 사람을 선별할 수 있으며, 또한 골다공증 환자의 치료에 따른 병의 호전 또는 악화 (예후)를 유전자 수준에서 정확하게 판단할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

시료

403명의 50세 이상 폐경 후 여성의 PMBC(blood mononuclear cell)로부터 얻은 gDNA(Peter B. Kaufman, et al., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Inc (1995) and Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001))를 이용하였다.

프라이머 디자인

프라이머3 http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer)을 이용하여 XPD(ERCC2) 유전자를 증폭하기 위한 롱 디스턴스 PCR 프라이머를 디자인 하였고, Scan Gene Primer 프로그램을 이용하여 숏 디스턴스 PCR 프라이머, GC 클램프스 및 변성 구배 젤 전 기영도의 최적 구배 범위를 결정하였다.

디자인된 프라이머의 서열은 다음 표 1 및 2에 기재되어 있다.

롱 디스턴스 PCR 프라이머

증폭 부위	전방향 프라이머	역방향 프라이머
ERCC2 L1	CTTGGCGACAGAGAAAGACC	GCCCAGCCAAGTACAATGAT
ERCC2 L2	ATGGTGCCTTAGAGGGTACAGA	TAGTGTGAGCTGACCCCATAGA
ERCC2 L3	GAATTGCAGGTAGGTTTTGGAG	GGATTAGCCAAGTTCACTCACC
ERCC2 L4	GGGGGTCAAGGTTCATTTTT	GAGCTGGAGGGTGGATGTAA

숏 디스턴스 PCR 프라이머

증폭 부위	전방향 프라이머	역방향 프라이머
Exon 2.1	CTGACCCAGCAGCCCCTGCC	CCTTGGCGTCCAGCGTGCGT
Exon 2.2	TACCCCGAGCAGTTCTCCTA	CGGGTCGGGCCCACCGGCCA
Exon 3	CCCTGTGTGTTGCCCCTCTG	TTTGTCTGCCTTTACGGGTT
Exon 4	GACTGAGTCCGCTTGTTATC	AGCACCAGGATGAGTCCCAG
Exon 5	GGGCAGGGGTTTGTGCCTCC	TGGGCTAAGGGCAAGGAGAA
Exon 6	GTGGTTGGGTTTCCACCCTG	CAGGGAGGCTGCCTGCCCCA
Exon 7	CTGACCCCTGGCACTCTTGT	CTCACACTCGCCCCTCTGCC
Exon 8	AGTGGCAGGGCCCTGGTAAC	GAGGGGCTGGCATCCCTTTG
Exon 9	GGCCTGCCTGAGCCGGCTCT	GGGCGGGCACCACCGCCAGA
Exon 10	CCCTCCCAGCCCCAGCTCAT	AAGGGACTGGGGGGCAGCGG
Exon 11	CCCGTCGCCGCTGATAGCGT	ATAACCGGGACCTGCCGGGC
Exon 12	TGATGGCGGAGGCAGGGCTG	CCAACAACCCTCTAGACCCT
Exon 13	GGGTAATCTCACCCCTCCTT	CCTCACCGGGCAGGGTCCCA
Exon 14.1	CGGGCCCTCACTGCCCTCAT	CCCAGATGTGATGATGACAG
Exon 14.2	GCCTCGCTGGCCATCAAACC	GACTAGGAGGGGACGGGGAA
Exon 15.1	CCTGGTCCCTGCCCAGTCCT	CCGGCCCCAGCCCTAGCCTC
Exon 16.1	CTGCCTCGCTTATCGTGACC	GGAACCCACAGAAACCAGCC
Exon 17.1	TCCTAGTTCTAAGACAGAGA	TAGCGGTGCAGTGCCAGGGA
Exon 18.1	TGCCCTGAACCCACCCTGAC	CCCGACCCCTCTCCACGCTG
Exon 19.1	CTAACTTGCGTCTCGGTCTC	ACCTGGGGAGGAAGAGCCCA
Exon 20.1	CACTTGTAACCCCCCTCGCC	GGGAGGTGGGGGAGCCACTC
Exon 21.1	CCCACAGTGTTAGGATCAAG	CGGAAACAGCCTGGTTCTTGG
Exon 22.1	CGAATGACCTTCTGTCCCTG	TCAGCCTGGGAGGGTGCCGG
Exon 23.1	GGGCCCCTGCCCAACAGTGC	CGCCGCTGGGAACCAGGGCC

PCR 반응

롱 디스턴스 PCR 및 숏 디스턴스 PCR 반응은 각각 Expand Taq 중합효소(Roche) 및 Red Taq 중합효소(Sigma)를 이용하여 실시하였다.

롱 디스턴스 PCR은 다음의 온도 사이클로 실시하였다: 94℃ 2분 변성, 94℃ 30초, 60℃ 1분 및 68℃ 5분 30 사이클, 그리고 68℃ 10분 최종 연장반응.

숏 디스턴스 PCR은 다음의 온도 사이클로 실시하였다: 94℃ 2분 변성, 94℃ 30초, 60℃ 30초 및 72℃ 30초 30 사이클, 그리고 72℃ 10분, 98℃ 10분, 50℃ 30분 및 37℃ 30분.

TDGS 분석

TDGS(Two-Dimensional Gene Scanning) 분석은, ERCC2의 전체 코딩 부위 및 인접한 인트론 부위를 커버하도록 디자인 하였다(엑손 1은 제외). 2-단계 PCR 반응에 의하여 모든 단편들을 증폭하도록 최적화 하였다: 초기 멀티플렉스 롱 디스턴스 PCR는 숏 디스턴스 PCR 단편들에 대한 모든 부위를 포함하는 4가지의 증폭 단편들을 얻도록 실시되었고, 이어 2가지 롱 디스턴스 PCR 산물을 조합하여 주형으로 이용하여 3 멀티플렉스 숏 디스턴스 PCR 반응을 실시함으로써, 29종의 개별적 증폭 단편을 얻었다.

각각의 숏 PCR 프라이머쌍 중에서 하나의 프라이머를 GC 클램프에 결합시키고, 다른 하나의 5’-말단은 HEX로 레이블링하여 젤 상에서 단편들의 검출 효율을 증가시켰다. 숏 디스턴스 PCR을 실시한 다음, 헤테로듀플렉싱을 실시하여 PCR 증폭 단편들이 98℃에서 완전히 변성되도록 하고 이어 리내츄레이션(renaturation) 하여 두가지 호모듀플렉스 및 헤테로듀플렉스 단편을 생성시켰으며, 이는 목적의 부위에 대립형질(allele) 중 하나에서 변이를 가지는 것을 나타낸다.

PCR 산물을 각각의 멀티플렉스 숏 디스턴스 PCR 그룹으로부터 취하고, 이를 합한 다음 TDGS 젤에 로딩하고, 이어 일차적으로 크기에 따라 분리한 다음 자동화 2차원 전기영동 장치(OptiAnalizer 8008HT, Accelerated Genomics, Inc.)를 이용하여 멜팅 온도에 따라 분리하였다. 전체 단편들을 형광 스캐너(FMBIO II Fluorescent Image Scanning Unit, Hitachi Genetic Systems, Inc.)로 가시화 하였다. 2-D 젤 분석의 결과가 단독 밴드를 나타내는 대신에 멀티-밴드를 보이는 경우, DNA 뉴클레오타이드 시퀀싱을 실시하여 변이를 동정하였다. 5% 이상의 마이너 대립형질 빈도로 엑손 5, 6, 22 및 23에서 검출되는 변이의 경우, 지노타이핑을 모든 시료에 대하여 실시하여 DDGE(Denaturing Detergent Gradient Gel Electrophoresis)로 이들 변이의 지노타입을 결정하였다.

TDGS에 의해 분석된 SNP는 다음 표 3과 같다:

엑손 번호	뉴클레오타이드 변이
5	IVS5-35 A>G
6	499 A>C(R156R) IVS6+9 A>C
12	IVS12-19 C>T
14	IVS14+16 delC
15	1430 T>A (Y467N)
19	IVS19-22 C>T
22	2161 C>T (D711D)
23	2251 A>C (Q751K) IVS23+& C>T IVS23+9 G>A

첫 번째 SNP는 XPD 유전자의 엑손 5에 존재하는 것으로서, 엑손 5의 첫 번째 뉴클레오타이드로부터 업스트림쪽으로 35 뉴클레오타이드 이격된 뉴클레오타이드에서 발생된 것으로서, IVS(intervening sequence)에 있는 서열이다. 이 SNP는 A가 G로 변이가 일어난 것이다.

두 번째 SNP는 XPD 유전자의 엑손 6에 존재하는 것으로서, 엑손 6의 499번째 뉴클레오타이드에서 발생한 것으로서, A가 C로 변이가 일어난 것이다. 단백질 수준에서는 변화가 없으며, Arg이 유지된다.

세 번째 SNP는 XPD 유전자의 엑손 6에 존재하는 것으로서, 엑손 6의 첫 번째 뉴클레오타이드로부터 다운스트림쪽으로 9 뉴클레오타이드 이격된 위치에서 발생된 것으로서, IVS에 있는 서열이다. 이 SNP는 A가 G로 변이가 일어난 것이다.

네 번째 SNP는 XPD 유전자의 엑손 12에 존재하는 것으로서, 엑손 12의 첫 번째 뉴클레오타이드로부터 업스트림쪽으로 19 뉴클레오타이드 이격된 위치에서 발생된 것으로서, IVS에 있는 서열이다. 이 SNP는 C가 T로 변이가 일어난 것이다.

다섯 번째 SNP는 XPD 유전자의 엑손 14에 존재하는 것으로서, 엑손 14의 첫 번째 뉴클레오타이드로부터 다운스트림쪽으로 16 뉴클레오타이드 이격된 위치에서 발생된 것으로서, IVS에 있는 서열이다. 이 SNP는 C가 결손된 변이가 일어난 것이다.

여섯 번째 SNP는 XPD 유전자의 엑손 15에 존재하는 것으로서, 엑손 15의 1430번째 뉴클레오타이드에서 발생한 것으로서, T가 A로 변이가 일어난 것이다. 단백질 수준에서는 Tyr이 Asn로 변이가 발생된 것이다.

일곱 번째 SNP는 XPD 유전자의 엑손 19에 존재하는 것으로서, 엑손 19의 첫 번째 뉴클레오타이드로부터 업스트림쪽으로 22 뉴클레오타이드 이격된 위치에서 발생된 것으로서, IVS에 있는 서열이다. 이 SNP는 C가 T로 변이가 일어난 것이다.

여덟 번째 SNP는 XPD 유전자의 엑손 22에 존재하는 것으로서, 엑손 22의 2161번째 뉴클레오타이드에서 발생한 것으로서, C가 T로 변이가 일어난 것이다. 단백질 수준에서는 변화가 없으며, Asp이 유지된다.

아홉 번째 SNP는 XPD 유전자의 엑손 23에 존재하는 것으로서, 엑손 23의 2251번째 뉴클레오타이드에서 발생한 것으로서, A가 C로 변이가 일어난 것이다. 단백질 수준에서는 Gln이 Lys로 변이가 발생된 것이다.

열 번째 SNP는 XPD 유전자의 엑손 23에 존재하는 것으로서, 엑손 23의 첫 번째 뉴클레오타이드로부터 다운스트림쪽으로 7 뉴클레오타이드 이격된 위치에서 발생된 것으로서, IVS에 있는 서열이다. 이 SNP는 C가 T로 변이가 일어난 것이다.

열한 번째 SNP는 XPD 유전자의 엑손 23에 존재하는 것으로서, 엑손 23의 첫 번째 뉴클레오타이드로부터 다운스트림쪽으로 9 뉴클레오타이드 이격된 위치에서 발생된 것으로서, IVS에 있는 서열이다. 이 SNP는 G가 A로 변이가 일어난 것이다.

통계적 분석

우선, 첫 번째 SNP인, XPD 유전자의 엑손 5에서의 A>G 변이에 대하여 통계적분석을 실시하였다. 403명의 50세 이상 폐경 후 여성의 골밀도는 DEXA(dual energy X-ray absoptiometry)로 측정하였다. 첫 번째 SNP에서 GG 지노타입 즉, G 염기에 대하여 동형접합체(homozygous) 지노타입을 나타내는 여성과 그렇지 않은 여성을 분석하였다. 또한, 두 번째 SNP에서 CC 지노타입 즉, C 염기에 대하여 동형접합체(homozygous) 지노타입을 나타내는 여성과 그렇지 않은 여성을 분석하였다. 통계적 분석 결과는 다음 표 4와 같다.

분석 항목	엑손 5 nonGG (n=301)/ GG (n=102)	p 값	엑손 6 nonCC (n=289)/ CC (n=114)	p 값
L1-4 골 밀도 (g/cm²)	0.96 ± 0.17/ 1.00 ± 0.18	0.027	0.98 ± 0.18/ 0.94 ± 0.17	0.033
L1-4 T 점수	-1.29 ± 0.14/ -0.91 ± 1.49	0.023	-1.09 ± 1.47/ -1.44 ± 1.39	0.031
L1-4 Z 점수	-0.49 ± 1.27/ -0.31 ± 1.33	0.215	-0.39 ± 1.31/ -0.59 ± 1.21	0.153
대퇴골 총 골밀도(g/cm²)	0.87 ± 0.13/ 0.93 ± 0.14	0.000	0.90 ± 0.13/ 0.85 ± 0.13	0.003
대퇴골 총 T 점수	-0.54 ± 1.31/ -0.06± 1.14	0.001	-0.33 ± 1.35/ -0.65 ± 1.04	0.028
대퇴골 총 Z 점수	0.46 ± 0.92/ 0.74 ± 0.96	0.008	0.58 ± 0.95/ 0.41 ± 0.88	0.105

상기 표 4에서, L1-4는 1-4번의 요추를 나타낸다. 상기 표 4는 요추 및 대퇴골의 골밀도, T 점수 및 Z 점수에 대한 단변량(univariate) 분석 결과이다. 데이터는 평균± 표준편차로 나타나 있다.

상기 표 4에서 볼 수 있듯이, GG 지노타입을 가지는 여성의 경우, L1-4 골밀도, L1-4 T 점소, L1-4 Z 점수, 대퇴골 총 골밀도, 대퇴골 총 T 점수 및 대퇴골 총 Z 점수가 nonGG 지노타입을 가지는 여성보다 유의성 있게 증가 하였다. 특히, GG 지노타입을 가지는 여성은 nonGG 지노타입을 가지는 여성보다 대퇴골 골밀도 지수가 크게 증가하였음을 알 수 있다.

한편, 엑손 6에 존재하는 두 번째 SNP에 대한 분석에서, CC 지노타입을 가지는 여성의 경우, L1-4 골밀도, L1-4 T 점수, L1-4 Z 점수, 대퇴골 총 골밀도, 대퇴골 총 T 점수 및 대퇴골 총 Z 점수가 nonCC 지노타입을 가지는 여성보다 감소 하였다.

연령, 체중 및 신장(height)을 고려한 다변량 분석(multivariate) 분석에서, 엑손 5에서의 GG 지노타입을 가지는 여성은 대퇴골 총 골밀도, 대퇴골 총 T 점수 및 대퇴골 총 Z 점수(p=0.003, p=0.010 및 p=0.013)가 nonGG 지노타입을 가지는 여성보다 유의성 있게 증가 하였다. 반대로, 엑손 6에서 CC 지노타입을 가지는 여성의 경우 대퇴골 총 골밀도가 AA 및 AC 지노타입을 가지는 여성보다 감소 하였다(p=0.045).

따라서, 엑손 5에서의 SNP 염기 G는 GG 동형접합체에서 골밀도가 증가된 사람을 보여주는 지노타입으로 이용될 수 있음을 알 수 있다. 반대로, 엑손 6에서의 SNP 염기 C는 CC 동형접합체에서 골밀도가 감소된 사람을 보여주는 지노타입으로 이용될 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 SNPs 중에서, 첫 번째 SNP인 XPD 유전자의 엑손 5에서의 A>G 변이, 그리고 두 번째 SNP인 엑손 6에서의 A>C 변이에 대한 반수체 분석(haplotyping)을 실시하였다. 분석 결과는 다음 표 5와 같다.

분석 항목	GA 반수체형(n=280)/ nonGA 반수체형(n=123)	단변량 분석	다변량 분석
분석 항목	GA 반수체형(n=280)/ nonGA 반수체형(n=123)	p 값	p 값
L1-4 골밀도 (g/cm²)	0.98 ± 0.18/ 0.94 ± 0.16	0. 024	0.157
L1-4 T 점수	-1.08 ± 1.48/ -1.44 ± 1.36	0.022	0.147
L1-4 Z 점수	-0.37 ± 1.33/ -0.62 ± 1.18	0.073	0.098
대퇴골 총 골밀도 (g/cm²)	0.90 ± 0.13/ 0.86 ± 0.12	0.002	0.021
대퇴골 총 T 점수	-0.28 ± 1.10/ -0.75± 1.59	0.001	0.008
대퇴골 총 Z 점수	0.59 ± 0.96/ 0.39 ± 0. 87	0.045	0.052

상기 표 5는 엑손 5에서의 G 변이 및 엑손 6에서의 A를 모두 갖는 반수체에 대한 분석 결과이다. 다변량 분석(multivariate) 분석에서는 연령, 체중 및 신장(height)이 고려되었다. 데이터는 평균± 표준편차로 나타나 있다.

다변량 분석 결과에 따르면, GA 반수체(엑손 5 IVS-35G/엑손 6 499A)는 증가된 대퇴골 골밀도와 상관 관계가 있음을 명확히 보여준다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Genetic Markers for Bone Density <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 101 <212> DNA <213> human <400> 1 ctggggaaga gactgggacc tggcagggca ggggtttgtg cctccaatga gcacaagctc 60 cccctgcccc ccaactttgg agtaggtgat tgaagagctt c 101 <210> 2 <211> 101 <212> DNA <213> human <400> 2 acctgtcctg cctccctccc tcagccctgc cctccagtaa cctcatagaa ccggcagtgg 60 ggcaggctgg tgtcatgctg gtactgcgcc cgcacatagg a 101 <210> 3 <211> 101 <212> DNA <213> human <400> 3 taccagcatg acaccagcct gccccactgc cgattctatg aggttactgg cgggcagggc 60 tgagggaggg aggcaggaca ggtagcctgg ggcaggcagc c 101 <210> 4 <211> 101 <212> DNA <213> human <400> 4 cggaggcagg gctgctggtc ctgctcatgc ttccgtctgc cccccgaccc tgtctctcct 60 ccccgccaga ttctgtgctg aacgcctccg gtccctgctg c 101 <210> 5 <211> 100 <212> DNA <213> human <400> 5 ttgagcgttt ccagtctgtc atcatcacat ctggggtaag gacccttccc gtcccctcct 60 agtccctgac ctccctccat gggcctcctg gtccctgccc 100 <210> 6 <211> 101 <212> DNA <213> human <400> 6 ctgagatccc tcccactgtc ccgccacaga cactgtcccc gctggacatc aaccccaaga 60 tcctggactt ccaccccgtc accatggcaa ccttcaccat g 101 <210> 7 <211> 101 <212> DNA <213> human <400> 7 ccagcgtgga gaggggtcgg ggaggtggct ctgaggagtg acctaacttg tgtctcggtc 60 tccccacctc aggcctgcga gaatggccgc ggggccatcc t 101 <210> 8 <211> 101 <212> DNA <213> human <400> 8 cgctggatcc aggagcacct cacagatgcc aacctcaacc tgaccgtgga tgagggtgtc 60 caggtggcca agtacttcct gcggcagatg gcacagccct t 101 <210> 9 <211> 101 <212> DNA <213> human <400> 9 tggccccacc cgccccactc agagctgctg agcaatctgc tctatcctct ccagcgtctc 60 ctctgattct agctgctcca ggctgagcag ggacaggccc a 101 <210> 10 <211> 101 <212> DNA <213> human <400> 10 aggagacgct gaagaggata gagcagattg ctcagcagct ctgagtgggg tgggtggggc 60 cataaacggt tcctggtgac tcctgagtct tgcctggccc t 101 <210> 11 <211> 101 <212> DNA <213> human <400> 11 gagacgctga agaggataga gcagattgct cagcagctct gagtggggcg agtggggcca 60 taaacggttc ctggtgactc ctgagtcttg cctggccctg g 101

Claims

서열목록 제 1 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 2 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 3 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 4 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 5 서열에서 49-51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 6 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 7 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 8 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 9 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 10 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 또는 서열목록 제 11 서열에서 51번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기로 이루어진 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상보적인 서열.
서열목록 제 1 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 A인 것, 서열목록 제 2 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 A인 것, 서열목록 제 3 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 A인 것, 서열목록 제 4 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 C인 것, 서열목록 제 5 서열에서 49-51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 6 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 T인 것, 서열목록 제 7 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 C인 것, 서열목록 제 8 서 열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 C인 것, 서열목록 제 9 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 A인 것, 서열목록 제 10 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 C인 것, 또는 서열목록 제 11 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 G인 것을 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기로 이루어진 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 골밀도 진단용 키트.
제 2 항에 있어서, 상기 프라이머 또는 프로브는 서열목록 서열목록 제 1 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 A인 것, 또는 서열목록 제 2 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 A인 것을 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기로 이루어진 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 키트.