KR100861126B1

KR100861126B1 - 슈퍼옥시드 음이온 생성 시약 및 이의 용도

Info

Publication number: KR100861126B1
Application number: KR1020070016514A
Authority: KR
Inventors: 이정국; 이해진; 김의진
Original assignee: 서강대학교산학협력단
Priority date: 2007-02-16
Filing date: 2007-02-16
Publication date: 2008-09-30
Anticipated expiration: 2027-02-16
Also published as: KR20080076502A

Abstract

본 발명은 슈퍼옥시드 음이온 생성 시약 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 산소 조건 하에서 과산화수소를 생성하지 않으면서 슈퍼옥시드 음이온을 생성하는 활성을 가진 로도박터(Rhodobacter)를 포함하는 광합성 세균 유래 단백질을 이용한 슈퍼옥시드 음이온 생성 시약으로 사용하여, 직접 슈퍼옥시드 음이온 제거물질을 검색하거나, 또는 시토크롬 C나 NBT(nitro blue tetrazolium)를 이용하여 간접적으로, 생성된 슈퍼옥시드 음이온에 의하여 시토크롬 C나 NBT가 환원된 것을 흡광도의 변화를 측정함으로써, 시료에 있는 슈퍼옥시드 디스뮤타제 양에 비례하여 슈퍼옥시드 생성 시약에 의해 생성된 슈퍼옥시드 음이온의 분해율의 상관관계를 이용하여 슈퍼옥시드 디스뮤타제의 활성 측정하는 방법에 관한 것이다.

슈퍼옥시드 음이온 생성 시약, 항산화활성 검색, 슈퍼옥시드 디스뮤타제 활성 측정

Description

슈퍼옥시드 음이온 생성 시약 및 이의 용도{Reagent generating superoxide anion and its application}

도 1은 슈퍼옥시드 생성 단백질의 발현벡터를 제작하는 과정을 나타낸 모식도 이다.

도 2는 슈퍼옥시드 음이온을 생성하는 활성을 가진 로도박터 유래 활성화된 단백질의 제조하여 아크릴아마이드겔 위에 전기영동한 결과이다.

도 3은 슈퍼옥시드 음이온을 생성하는 활성을 가진 로도박터 유래 단백질의 활성산소에 대한 안정성을 조사한 결과이다.

도 4는 로도박터 유래 단백질에 의한 슈퍼옥시드 음이온 생성시약을 사용하여 광합성 미생물 추출물의 슈퍼옥시드 음이온에 대한 항산화 효과를 검색한 결과이다.

도 5는 대장균 세포 추출물의 슈퍼옥시드 디스뮤타제 활성분석 결과이다.

활성산소는 유기체가 에너지를 얻기 위해서는 필수불가결하게 부수적으로 동반되어 생성되는 매우 반응성이 큰 물질로서, 활성산소는 일종의 강력한 독소로서 산화스트레스를 유발할 뿐만 아니라, 부분적으로 조절 가능한 소량이 생성될 때는, 생체 내에서 세포성장, 염증반응 유발, 세포방어 등의 정상적인 신호전달과정에서의 신호전달물질로서도 기능을 하는 것으로 알려지고 있다. 따라서, 활성산소의 특정 부위에서의 정상적인 생성과 분해는 다양한 생리 기능에도 필요하나, 이것의 정상적인 생성과 분해의 균형이 깨지게 되면, 직ㆍ간접적으로 암, 파킨스, 알쯔하이머 등의 퇴행성 뇌질환, 동맥경화, 염증반응 등의 매우 다양한 질병의 발생과 조절에 관여하는 것으로 알려져 왔다. 따라서, 특정부위에서, 과발생된 활성산소의 생성을 저해하거나, 분해를 촉진하여, 이의 부작용을 막아 주는데 관여하는 생체물질을 검색하여, 의약품이나 식품첨가제로 사용하려는 많은 시도가 이루어져 왔다. 그러나, 생체 내외에 생성된 활성산소들에 대한 분석의 어려움과, 짧은 반감기로 생체 내에서 활성산소에 대한 병리연구나 항활성산소제의 개발에 많은 제한이 있었다. 특히, 안정적이고, 특이적으로 슈퍼옥시드 음이온만을 안정적으로 생성시키는 시약은 복합생체 물질의 항활성산소 활성이나, 특히 슈퍼옥시드에 대한 항산화 활성을 화학적 발광(chemiluminescence)에 의해 슈퍼옥시드를 분석함으로서, 생체 복합 물질에서의 슈퍼옥시드에 항산화 활성을 측정하거나 검색할 수 있는 방법을 제공한다. 이를 위해 종래의 슈퍼옥시드 음이온 생성 화합물로는 메틸 바이올로젠, 플럼바진, 메나디온(menadione), 잔틴옥시다아제 등 산화환원 순환시약을 이용하여 슈퍼옥시드 음이온 생성체로서 사용하였으며, 그 중에서 잔틴옥시다아제가 가장 널리 사용되어져 왔으나 다음과 같은 몇몇 문제점이 있어 왔다. 첫째, 상기 시약들은 그 작용 도중 슈퍼옥시드 음이온뿐만 아니라 과산화수소를 동시에 생성시켜, 중성 pH에서는 전체 전자의 15% 이내만이 슈퍼옥시드 생성에 사용되어, 안정적인 슈퍼옥시드 생성 효율이 떨어지며, 둘째, 많은 양의 슈퍼옥시드 생성을 위해 많은 양의 잔틴옥시다아제를 사용하게 되면, 반응이 너무 빨리 진행되어, 정확하고 안정적으로 슈퍼옥시드 양을 측정하기 어렵게 된다. 셋째, 잔틴옥시다아제는 알데하이드 등의 많은 다른 기질을 산화시키며, 산화된 기질은 다시 잔틴옥시다아제를 억제할 수 있으며, 세포질 내 산화한원 효소들에 의해서도 잔틴의 산화환원 반응이 저해될 수 있어, 생체 추출물로 분석 슈퍼옥시드에 항산화 활성을 조사할 경우 특이성이 떨어지는 단점이 있다.

반면, 슈퍼옥시드 음이온만을 생성시키는 광합성 세균의 단백질은 공기 중에 서 환원제의 존재 하에서 거의 모든 전자가 산소에 제공되어 높은 효율로 슈퍼옥시드가 생성되며, 또한 이 효소반응을 저해하는 저해제도 거의 없어 슈퍼옥시드 음이온을 특이적으로 생성할 수 있어서, 활성산소 대사효소의 활성을 측정하는데 사용되는 슈퍼옥시드를 특이적이며, 안정적으로 생성하는 시약으로 효과적으로 사용될 수 있을 것이다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 산소 조건 하에서 슈퍼옥시드 음이온을 생성하면서 과산화수소는 생성하지 않는 광합성 세균 유래 단백질을 이용한 안정적이고, 특이적인 슈퍼옥시드 음이온 생성시약을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 산소 조건 하에서 슈퍼옥시드 음이온을 생성하면서 과산화수소는 생성하지 않는 광합성 세균 유래 단백질을 포함하는 슈퍼옥시드 음이온 생성시약을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 시약을 사용하여 복합 생체 추출물에서의 슈퍼옥시드에 대해 선택적인 항산화 활성을 직접 측정하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 시약을 사용하여 슈퍼옥시드 디스퓨타제의 활성을 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명은 산소 하에서 슈퍼옥시드 음이온을 생성하면서 과산화수소는 생성하지 않는 광합성 세균 유래 단백질을 포함하는 슈퍼옥시드 음이온 생성시약을 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 산소 농도 1 ~ 3%의 조건 하에서 과산화수소를 생성하지 않으면서 슈퍼옥시드 음이온을 생성하는 활성을 가진 로도박터(Rhodobacter)를 포함하는 광합성 세균 유래 단백질을 이용한 슈퍼옥시드 음이온 생성 시약으로 사용하여, 직접 슈퍼옥시드 음이온 제거물질을 검색하거나, 또는 시토크롬 C나 NBT(nitro blue tetrazolium)를 이용하여 간접적으로, 생성된 슈퍼옥시드 음이온에 의하여 시토크롬 C나 NBT가 환원된 것을 흡광도의 변화를 측정함으로써, 시료에 있는 슈퍼옥시드 디스뮤타제 양에 비례하여 슈퍼옥시드 생성 시약에 의해 생성된 슈퍼옥시드 음이온의 분해율의 상관관계를 이용하여 슈퍼옥시드 디스뮤타제의 활성 측정하는 방법에 관한 것이다.

대장균에서 재조합 BchZ를 대량 생산하기 위해 bchZ 유전자[서열번호 1]를 PCR을 통하여 N-말단에 스트랩-태그를 연결하기 위하여 도 1에 나타난 대로, PCR된 DNA조각을 SacI과 HincII로 오려내어, SacI과 EcoRV 지역을 절단된 pASK-IBA7plus 벡터(IBA)에 접합하여, 발현벡터 pAStZ를 제작하였다.

상기 유전자 재조합방법으로 대장균에서 대량 발현하여 분리 정제한 활성화된 단백질에 헤민을 결합하게 하고, 다이티오나이트(Na-dithionite)를 첨가해 활성화시킨 단백질은 공기 중에서, 슈퍼옥시드 음이온을 안정적으로 생성하여, 이를 슈 퍼옥시드 음이온 생성 시약으로 시험관에서 사용할 수 있다.

슈퍼옥시드 음이온 생성 시약를 이용하면, 후보물질이 슈퍼옥시드 음이온을 제거하는 활성이 있는지를 루미놀(luminol) 유도체인 L-012(Wako Chemical)를 사용하여, 슈퍼옥시드 음이온에 의해 직접적으로 생겨나는 화학적 발광의 양을 측정함으로써 생체 복합물질을 그대로 사용하여, 슈퍼옥시드 음이온을 제거하는 활성이 얼마나 있는지를 민감하게 직접적으로 분석, 검색할 수 있다.

또한, 슈퍼옥시드 음이온 생성 시약에 시토크롬 C나 NBT를 가하여, 생성된 슈퍼옥시드 음이온에 의하여 시토크롬 C나 NBT가 환원된 것을 흡광도의 변화로 측정하여, 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 분석하는 방법에 사용할 수도 있다. 또한, 상기 분석법은 수용성 NBT 유도체를 사용할 경우, 수용성 항산화제의 고속 선별에도 사용 가능하다.

따라서, 본 발명은 활성산소의 유해성으로부터 발생되는 다양한 질병들, 예로서, 알쯔하이머, 파킨슨병 등의 퇴행성 뇌질환과 순환기계 질환인 심장병과 동맥경화 등의 치료용 의약품만 아니라, 건강보조식품을 포함하는 식품 및 화장품의 첨가제로 사용되는 효과적인 항산화제 탐색과 활성분석에 유용하게 이용되리라 기대된다.

이하, 다음 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 특히, 본 발명은 특허 출원 제2005-118377호의 개량발명에 해당되며, 이의 발명을 참고하도록 한다.

실시예 1: 재조합 로도박터 유래 슈퍼옥시드 생성 단백질의 발현벡터 제조

대장균에서 재조합 BchZ를 대량 생산하기 위해 bchZ 유전자[서열번호 1]를 PCR을 통하여 N-말단에 스트랩-태그를 연결하였다. 전방 프라이머(primer)는 번역 시작 코돈인 ATG 코돈을 제거하였다. 이를 위하여 서열번호 1의 프라이머를 제작하여 사용하였다. 후방 프라이머는 서열번호 2를 제작하여 사용하였다. 표 1의 밑줄은 제한효소 위치를 만들기 위하여 임의로 변형시킨 염기서열을 나타내고, 굵게 표시한 염기 서열은 해당 제한효소의 인식서열이다.

서열번호	구분	서열목록(5' → 3')	비고
1	전방 프라이머	GGAGAGAGCTCATGCTCGTGC	SacI(SstI) 인식 서열 제조
2	후방 프라이머	GCGTGTTGACGTCTAGATCG

PCR로 얻어진 조각을 SacI과 HincII로 오려내어 pASK-IBA7plus 벡터(IBA)의 SacI과 EcoRV 지역을 절단하고 여기에 접합하여 pAStZ를 제작하였다. DNA 조각을 얻기 위한 절단을 위해 해당 제한효소(restriction endonuclease, TAKARA)를 사용하였고, 조각의 접합을 위해서는 T4 DNA 리가아제(ligase, TAKARA)를 사용하였다. 이 구조물을 대장균 BL21(DE3)로 형질전환한 후, 형질전환체를 얻기 위해 벡터 플라스미드를 선별할 수 있는 항생제 앰피실린을 첨가한 엘비배지에 도말하였으며 항생제 저항성을 가지는 균주들을 확보하였다. BchZ 단백질의 발현은 히스-태그 또는 스트랩(strep)-태그에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 다음, 스트랩-태그 제조사(IBA)가 권장하는 방법에 따라 단백질을 분리하였다. 대장균에서 제조된 단백질을 광합성 세균에서 제조한 단백질과 비교를 위하여, 슈퍼옥시드를 생성하는 단백질을 로도박터에서도 발현하였다. 이를 위하여, 세포 내에서 rrnB 프로모터에 의해 전사되고 N-말단에 히스-태그가 융합된 해당 단백질을 발현시키는 pRK-HisZ 발현 벡터를 대장균 S17-1로 형질전환한 다음 로도박터 스페로이데스에 접합법을 통해 가동화하였다.

실시예 2: 슈퍼옥시드 생성 시약 제조 및 이에 의한 슈퍼옥시드 생성

슈퍼옥시드 생성 시약 제조를 위해, 실시예 1에서 제조한 슈퍼옥시드 발현 균주들로부터 슈퍼옥시드 생성 단백질을 과발현시키고, 발현된 단백질을 분리하였다[서열번호 2]. pRK-HisZ 또는 pAStZ 구조물을 포함하는 각 균주들은 어둠 혐기 조건에서 1L 배양병을 부틸 합성 고무 뚜껑으로 막고 배지를 질소 가스로 치환하여 배양하였다. 분리과정은 5% 수소, 5% 이산화탄소, 90% 질소를 포함하고 있는 혐기상자에서 수행하였다. 세포 내에 있는 수용성의 과발현 단백질을 얻기 위해 초음파 파쇄기(sonicator, Sonifier 250, Branson, Sweden)를 이용하여 4 ℃에서 10 분간 세포를 파쇄하였고, 이를 4 ℃에서 12,000 g로 원심분리하여 수용성 세포질액을 얻은 후 니켈-친화 크로마토그래피(Qiagen)를 제조사의 방법에 따라 이용하여 분리하였다. 세포질액을 니켈 레진(resin)에 붙인 후 이미다졸(imidazole)과의 친화도 경쟁을 통해 BchZ 단백질을 수득하였으며, 단백질의 용출을 위하여 150 mM의 이미다졸과 300 mM 염화나트륨이 포함된 50 mM 인산이수소나트륨(NaH₂PO₄) 버퍼(pH 7.9)를 사용하였다. 스트렙-태그된 단백질의 분리를 위해 스트렙탁틴-아가로즈 컬럼에 스트렙-태그된 단백질 발현 대장균 배양액 추출물을 가한 뒤, 4배 부피의 완충용액으로 세척한 다음, 결합되어 있는 단백질을 2.5 mM 디스티오바이오틴(destiobiotin)이 첨가된 완충용액으로 단백질을 용출하여 얻는다. 활성화된 단백질을 얻기 위해, 1 mM의 다이티오나이트를 용출된 단백질 용액에 가한 뒤 30분간 둔 뒤, 미반응된 과량의 다이티오나이트를 완충용액[100 mM HEPES-KOH(pH 7.4), 5 mM 염화마그네슘(MgCl₂·6H₂O), 0.01 mM 디티오쓰레이톨(dithiothreitol)에서 투석으로 제거한 다음, 단백질 확인은 12% 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 전기영동을 통하여 이루어졌으며 로도박터와 대장균에서 분리된 BchZ를 57 kDa의 밴드로 확인할 수 있었다(도 2). 다이티오나이트로 처리된 슈퍼옥시드 생성 단백질을 각각 헤민(hemin)이 있거나 없는 조건에서 각각, 30분간 반응시킨 후, 투석하여 제조한 뒤, 이 단백질의 산소와 슈퍼옥시드에 대한 안정성을 측정하였다(도 3). 고무 뚜껑으로 반응 완충용액[100 mM HEPES-KOH(pH 7.4), 5 mM 염화마그네슘(MgCl₂·6H₂O), 0.1 mM 디티오쓰레이톨(dithiothreitol)]이 들어있는 밀폐된 5 mL의 유리병 내에 다음과 같이 수행하였다. 각 단백질을 넣은 후 이를 밀봉하고 질소로 치환시켰다. 이를 30 ℃에서 30 분간 배양하여 상기 단백질의 재조합을 유도한 후 생성된 슈퍼옥시드는 아래의 시토크롬 방법으로 정량 분석하였다. 20 μM의 시토크롬(cytochrome c)가하고, 시토크롬의 환원은 550 nm에서 흡광도의 증가를 통해 측정하였고, 21000 M^-1cm^-1의 흡광계수(extinction coefficient)를 이용하여 값을 얻어내었다. 이때, 슈퍼옥시드 음이온을 제거하는 슈퍼옥시드 음이온 디스뮤테이즈(superoxide dismutase; SOD)가 첨가된 반응과 그렇지 않은 반응에서의 시토크롬의 환원 정도 차이를 통하여 슈퍼옥시드 음이온의 생성 정도를 다음 표 1과 같이 확인할 수 있었다. 즉, 광합성 세균으로 부터의 제조한 슈퍼옥시드 생성 단백질(BchZ-ph)은 헤민과의 결합반응을 시켜 주지 않아도, 슈퍼옥시드 생성을 잘 시켜주는 반면, 대장균에서 대량 생산한 슈퍼옥시드 생성 단백질(BchZ)은 헤민과 결합시켜준 슈퍼옥시드 생성 단백질[BchZ(+heme)]에서만 슈퍼옥시드 생성이 잘 일어남을 알 수 있었다.

실시예 3: 슈퍼옥시드에 대한 직접적인 항산화 활성 측정

광합성 세균의 대사체를 대상으로 슈퍼옥시드에 대한 항산화 물질을 검색하기 위하여, 각종의 광합성세균들의 배양물을 에탄올과 디에틸에테르(diethylether), 클로르포름으로 각각 추출하고, 이 추출물들을 Pch-계열숫자로 명명하였다. 이들 중 Pch21/53/212를 0.1 ~ 1 mg/ml의 농도로 에탄올이나 디메틸설폭사이드 등에 녹여 사용하였다. 슈퍼옥시드에 대한 항산화 활성을, 실시예 2에서 기술한 바와 같이, 슈퍼옥시드 생성 단백질을 사용해 슈퍼옥시드를 생성하는 반응용액에, 이들 추출물과, 음성대조군(NCON)으로 디메틸설폭사이드, 양성대조군으로 퀴서틴(quercetin)을 각각 가하고, 슈퍼옥시드를 제거하는지를 슈퍼옥시드에 의한 100 μM 루미롤 유도체인 L-012(Wako Chemical)를 가하고, 10분간 슈퍼옥시드에 의한 화학적 발광양을 루미노미터(Luminometer)로 각각 연속 측정하였다. 단위시간당 생성된 화학적 발광양(CL)은 약 2분에서 10분까지 직선의 반응성을 보여, 아주 안정적인 반응성을 보여주었으며, 생성된 화학적 발광양은 10분에서 강력한 항산화제인 퀴서틴의 경우 100 이하의 낮은 값에서부터, 용매만 처리한 음성대조군의 경우 10분 동안 약 25만의 큰 반응성 기록하였으며, 각 분획 Pch 추출물은 각각의 항산화능이 클수록, 낮은 반응성을 보여주었다(도 4).

실시예 5: 슈퍼옥시드 디스퓨타제 활성분석

슈퍼옥시드에 의한 시토크롬 환원방법을 이용하여, 슈퍼옥시드 디스뮤타제 활성을 분석하였으며, 시토크롬 환원법은 기존 방법을 응용하여 다음과 같이 수행하였다[McCord and Fridovich, 1969, J. Biol. Chem. 244: 6049-6055].

시험관 내에서의 실시예 1에서 분리한 슈퍼옥시드 생성 단백질의 재조합은 반응 완충용액[100 mM HEPES-KOH(pH 7.4), 5 mM 염화마그네슘(MgCl₂ㆍ6H₂O), 0.1 mM 디티오쓰레이톨(dithiothreitol)]에서 수행하였다. 고무 뚜껑으로 밀폐된 5 mL의 유리병 내에 버퍼와 각 단백질을 넣은 후 이를 밀봉하고 질소로 치환시켰다. 이를 30 ℃에서 30분간 배양하여 상기 단백질의 재조합을 유도한 후 20 μM의 시토크롬(cytochrome c)과 대장균 세포 추출물을 각각 0, 10, 2, 5, 100 ㎍을 첨가하였다. 대장균 세포 추출물은 대장균 세포를 초음파 파쇄기를 이용하여 4 ℃에서 10 분간 세포를 파쇄하고, 이를 4 ℃에서 16,000 g로 원심분리한 상층액을 사용하였다. 시토크롬의 환원은 550 nm에서 흡광도의 증가를 통해 측정하였고, 21000 M^-1cm^-1의 흡광계수(extinction coefficient)를 이용하여 값을 얻어내었다. 이때, 슈퍼옥시드 음이온을 제거하는 슈퍼옥시드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase; SOD)가 첨가된 반응(Vi)과 그렇지 않은 반응(Vo)에서의 시토크롬의 환원되는 속도의 비율을 시간에 따라 도 5에서와 같이 그려보면, 슈퍼옥시드 음이온의 생성 정도를 결정할 수 있었다. 즉, (Vi/V0)-1 값이 1이 되는 활성을 슈퍼옥시드 디스뮤타제의 활성도 1규격(unit)으로 정의하였다. 슈퍼옥시드 디스뮤타제의 총 활성뿐만 아니라, 시아나이드(CN)에 저항성이 있는 슈퍼옥시드 디스뮤타제도 0.1 ~ 2.5 규격의 활성범위에서 매끄러운 직선의 반응성을 보여 주어, 이 분석법이 효과적으로 슈퍼옥시드 디스뮤타제 활성 분석에 사용될 수 있음을 보여주었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 광합성 유래 단백질을 혐기성 조건에 서 헤민을 가해 결합되도록 제조하면, 공기 중에서 다이티오나이트 환원제의 존재 하에서 거의 모든 전자가 산소에 제공되어 높은 효율로 슈퍼옥시드가 생성되며, 또한 이 효소반응을 저해하는 저해제도 거의 없어 슈퍼옥시드 음이온을 특이적으로 생성할 수 있다. 따라서, 후보물질이 슈퍼옥시드 음이온을 제거하는 활성이 있는 지를 루미노 유도체를 사용하여, 슈퍼옥시드 음이온에 의해 직접적으로 생겨나는 화학형광의 양을 측정함으로써 생체 복합물질을 그대로 사용하여, 슈퍼옥시드 음이온을 제거하는 활성이 얼마나 있는지를 민감하게 직접적으로 분석, 검색할 수 있다. 본 발명에 따른 슈퍼옥시드 음이온 생성 시약은 특이적이며, 안정적으로 슈퍼옥시드 음이온을 생성하므로, 시토크롬 C나 NBT를 가하여, 생성된 슈퍼옥시드 음이온에 의하여 시토크롬 C나 NBT가 환원된 것을 흡광도의 변화로 측정하여, 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 분석하는 방법에 사용할 수도 있다. 또한, 본 발명에 따른 검색법은 수용성 NBT를 사용할 경우, 수용성 항산화제의 고속 선별에도 사용 가능하다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Sogang University <120> Reagent generating superoxide anion and its application <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1476 <212> DNA <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 1 atgctcgtgc aggatcatga cagggcaggg ggctactggg gcgccgtcta tgccttctgt 60 gcggtgaagg ggcttcaggt ggtgatcgac ggccccgtgg gctgcgagaa cctgccggtg 120 acctcggtgc tgcattacac cgacgcgctg cccccgcacg agctgcccat cgtggtgacg 180 ggcctcggcg agagcgagat gagcgagggc accgaggcct cgatgagccg ggcctggaag 240 gtgctggatc cggcgctgcc cgcggtggtg gtcacgggct cgatcgccga gatgatcggc 300 ggcggcgtga cgccgcaggg cacgaacatc cagcgcttcc tgccccgcac catcgacgag 360 gaccagtggg aagcggccga ccgggcgatg acctggatct tctcggagtt cgggatgacc 420 aagggtcgca tgccgcccga agccaagcgc cccgaggggg cgaagccgcg ggtgaacatc 480 ctcgggccca tgtacggcgt cttcaacatg gcgtcggacc ttcacgagat tcgccgtctc 540 gtcgagggga tcggcgccga agtgaacatg gtgatgccct tgggcgcgca tctggccgag 600 atgcgacact tggtcaatgc cgacgccaac atcgtcatgt accgcgaatt cggccgcggg 660 ctggccgagg tgctgggcaa gccctacctc caggccccca tcggggtcga gagcacgacc 720 gccttcctgc gccgcctggg cgagattctg ggcctcgatc cggagccctt catcgagcgc 780 gagaagcact cgacgctgaa gcccgtgtgg gatctgtggc ggagtgtcac gcaggacttc 840 ttcgggacgg ccaatttcgg aatcgtggcg accgaaactt atgcaagagg catccgaaac 900 tatctcgaag gcgatctcgg gctgccctgc gccttcgccg tggcccgcaa gaggggctcg 960 aagaccgaca acgaagcggt gcgcggactg atccgccagc accgtccgct cgtgctcatg 1020 gggtcgatca acgagaagat ttaccttgcg gaactgaaag ccggtcacgg cccgcaaccc 1080 tctttcatcg ctgcctcttt cccgggtgcg gcgatccggc gcgctaccgg aacgcccgtt 1140 atgggatatg caggtgctac gtggttactg caggaagttt gcaacgccct gttcgacgcc 1200 ctgttccaca ttctgcccct cgggacggag atggacagcg ccgccgccac accgacgaca 1260 ctgcgccgcg acttcccgtg ggatgccgat gcgcaagcgg ccctggaccg catcgtagag 1320 gagcatccgg ttctcacccg gatcagcgcc gcgcgtgcct tgcgcgacgc cgccgagaag 1380 gctgccctcg atgccggtgc cgagagggtc gtgagagaga ctgtcgaagc cctgcgtggg 1440 ccgggcttcg gcgagaggaa gggagagaac caatga 1476 <210> 2 <211> 491 <212> PRT <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 2 Met Leu Val Gln Asp His Asp Arg Ala Gly Gly Tyr Trp Gly Ala Val 1 5 10 15 Tyr Ala Phe Cys Ala Val Lys Gly Leu Gln Val Val Ile Asp Gly Pro 20 25 30 Val Gly Cys Glu Asn Leu Pro Val Thr Ser Val Leu His Tyr Thr Asp 35 40 45 Ala Leu Pro Pro His Glu Leu Pro Ile Val Val Thr Gly Leu Gly Glu 50 55 60 Ser Glu Met Ser Glu Gly Thr Glu Ala Ser Met Ser Arg Ala Trp Lys 65 70 75 80 Val Leu Asp Pro Ala Leu Pro Ala Val Val Val Thr Gly Ser Ile Ala 85 90 95 Glu Met Ile Gly Gly Gly Val Thr Pro Gln Gly Thr Asn Ile Gln Arg 100 105 110 Phe Leu Pro Arg Thr Ile Asp Glu Asp Gln Trp Glu Ala Ala Asp Arg 115 120 125 Ala Met Thr Trp Ile Phe Ser Glu Phe Gly Met Thr Lys Gly Arg Met 130 135 140 Pro Pro Glu Ala Lys Arg Pro Glu Gly Ala Lys Pro Arg Val Asn Ile 145 150 155 160 Leu Gly Pro Met Tyr Gly Val Phe Asn Met Ala Ser Asp Leu His Glu 165 170 175 Ile Arg Arg Leu Val Glu Gly Ile Gly Ala Glu Val Asn Met Val Met 180 185 190 Pro Leu Gly Ala His Leu Ala Glu Met Arg His Leu Val Asn Ala Asp 195 200 205 Ala Asn Ile Val Met Tyr Arg Glu Phe Gly Arg Gly Leu Ala Glu Val 210 215 220 Leu Gly Lys Pro Tyr Leu Gln Ala Pro Ile Gly Val Glu Ser Thr Thr 225 230 235 240 Ala Phe Leu Arg Arg Leu Gly Glu Ile Leu Gly Leu Asp Pro Glu Pro 245 250 255 Phe Ile Glu Arg Glu Lys His Ser Thr Leu Lys Pro Val Trp Asp Leu 260 265 270 Trp Arg Ser Val Thr Gln Asp Phe Phe Gly Thr Ala Asn Phe Gly Ile 275 280 285 Val Ala Thr Glu Thr Tyr Ala Arg Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Glu Gly 290 295 300 Asp Leu Gly Leu Pro Cys Ala Phe Ala Val Ala Arg Lys Arg Gly Ser 305 310 315 320 Lys Thr Asp Asn Glu Ala Val Arg Gly Leu Ile Arg Gln His Arg Pro 325 330 335 Leu Val Leu Met Gly Ser Ile Asn Glu Lys Ile Tyr Leu Ala Glu Leu 340 345 350 Lys Ala Gly His Gly Pro Gln Pro Ser Phe Ile Ala Ala Ser Phe Pro 355 360 365 Gly Ala Ala Ile Arg Arg Ala Thr Gly Thr Pro Val Met Gly Tyr Ala 370 375 380 Gly Ala Thr Trp Leu Leu Gln Glu Val Cys Asn Ala Leu Phe Asp Ala 385 390 395 400 Leu Phe His Ile Leu Pro Leu Gly Thr Glu Met Asp Ser Ala Ala Ala 405 410 415 Thr Pro Thr Thr Leu Arg Arg Asp Phe Pro Trp Asp Ala Asp Ala Gln 420 425 430 Ala Ala Leu Asp Arg Ile Val Glu Glu His Pro Val Leu Thr Arg Ile 435 440 445 Ser Ala Ala Arg Ala Leu Arg Asp Ala Ala Glu Lys Ala Ala Leu Asp 450 455 460 Ala Gly Ala Glu Arg Val Val Arg Glu Thr Val Glu Ala Leu Arg Gly 465 470 475 480 Pro Gly Phe Gly Glu Arg Lys Gly Glu Asn Gln 485 490

Claims

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대장균에서 발현되고, 헤민(hemin)이 결합된 BchZ 단백질을 다이티오나이트(dithionite)의 환원제와 반응시켜 슈퍼옥시드 음이온을 안정적으로 생성하도록 제조된 것을 특징으로 하는 슈퍼옥시드 음이온 생성 시약.
상기 청구항 3의 시약에 슈퍼옥시드 음이온 제거활성 후보물질과 루미놀 유도체를 가하여 발광량을 측정하는 것을 특징으로 하는 슈퍼옥시드 음이온 제거 활성 물질을 검색하는 방법.
상기 청구항 3의 시약에 시토크롬 C 또는 NBT(nitro blue tetrazolium)를 가하여 생성된 음이온에 의해 시토크롬 C 또는 NBT가 환원된 것을 흡광도 변화로 측정하는 것을 특징으로 하는 슈퍼옥시드 디스뮤타제의 활성을 분석하는 방법.