KR100868200B1 - 유전자 발현의 전신 광학 영상화 및 이를 사용하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전자 발현의 전신 외부 광학 영상화에 관한 것이다. 특히, 유전자 발현의 전신 외부 광학 영상화 방법, 및 특정 유전자의 프로모터에 작동적으로 연결된 형광단과 외부 광학 영상화를 이용하여 질병 또는 장애를 치료하기 위한후보 프로토콜 또는 약물을 평가하는 방법이 본원에 제공된다. 표적 프로모터를 조절하는 물질 또는 유전자를 스크리닝하는 방법이 또한 제공된다.
전신 외부 광학 영상화, 형광단, 프로모터, 형광 단백질
Description
본원은 35 U.S.C. 119 하에 2000년 3월 17일자로 출원된 미국 가특허원 제60/190,196호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨)을 우선권으로 주장하고 있다.
본 발명은 유전자 발현의 전신 외부 광학 영상화에 관한 것이다. 특히, 유전자 발현의 전신 외부 광학 영상화 방법, 및 특정 유전자의 프로모터에 작동적으로 연결된 형광단과 외부 광학 영상화를 이용하여 질병 또는 장애를 치료하기 위한후보 프로토콜 또는 약물을 평가하는 방법이 본원에 제공된다. 표적 프로모터를 조절하는 물질 또는 유전자를 스크리닝하는 방법이 또한 제공된다.
전신 영상화 기술은 본래 상태의 신체(intact body)내에서 "트레이서 분자"를 모니터하는데 사용하여 왔다. 예를 들면, 브레너(Brenner) 등은 전이성 악성 흑색종에 걸린 환자에게서 탈륨-201 신티그래프와 비교해서 요오드-123-2-하이드록시-3-요오도-6-메톡시-N-[(1-에틸-2-피롤리디닐)메틸]벤즈아미드(IBZM) 전신 영상화의 진단 값을 연구하였다[참조: Brenner et al., Eur. J. Nucl. Med.,26(12):1567-71(1999)]. 베나드(Benard) 등은 전신 PET 영상화에서 137Cs을 이용하여 약독화 교정하기 위한 처리 기술을 임상적으로 평가하였다[참조: Benard et al., J. Nucl. Med., 40(8):1257-63(1999)]. 문헌[참조: Jerusalem et al., Blood, 94(2):429-33(1999)]에는 호지킨병(Hodgkin's disease) 및 비-호지킨 림프종에서 치료후 평가를 위해 18F-플루오로데옥시글루코즈를 이용하여 전신 양전자 방출 단층촬영한 결과, 이는 전통적으로 컴퓨터 처리한 단층촬영 스캔 영상화 보다 높은 진단 값과 예후 값을 나타낸다고 기재되어 있다. 문헌[참조: Eustace et al., Magn. Reson. Imaging Clin. (N.Am.), 7(2):209-36(1999)]에는 전신 MR 영상화 기술의 실제적인 문제, 임상적 적용 및 앞으로의 방향에 대해 논의되어 있다. 문헌[참조: Engelson et al., Am. J. Clin. Nutr., 69(6):1162-9(1999)]에는 전신 자기 공명 영상화에 의해 정량화된 동체 확장을 보고한 HIV-감염 환자의 지방 분포도에 관해 논의되어 있다. 문헌[참조: Valk et al., Arch. Surg., 134(5):503-11(1999)]에서는 재발성 결장직장암을 관리하는데 있어서 [18F]플루오로데옥시글루코즈를 이용한 전신 양전자 방출 단층촬영(PET) 영상화를 사용하였다. 문헌[참조: Saunders et al., Ann. Thorac. Surg., 67(3):790-7(1999)]에서는 폐암 단계결정(staging)에 있어서 불소-18-플루오로데옥시글루코즈 전신 양전자 방출 단층촬영 영상화를 평가하였다.
미국 특허 제5,650,135호에는 포유류 대상체로부터 연구중인 특정 실재물(entity)의 국재(localization)를 탐지하는 비침입성 방법이 기재되어 있으며, 이러한 방법은 (a) 상기 실재물과 광발생 잔기와의 접합체 또는 이러한 광발생 잔기를 발현하는 형질전환된 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계; (b) 이러한 접합체 또는 형질전환된 세포가 상기 대상체에서의 국재를 이룰 수 있는 기간 후에, 상기 대상체를 광탐지기 장치의 탐지 필드 내에 고정화시키는 단계; (c) 이 대상체를 고정화 조건 하에 유지시키는 단계; (d) 유지시키는 동안, 광자 방출 영상이 완성될 때까지 상기 광탐지기 장치를 이용하여, 대상체 내에 국재된 광발생 잔기로부터 광자 방출을 측정하는 단계; 및 (e) 상기 포유류의 불투명 조직을 통하여 상기 영상을 탐지하는 단계를 포함한다. 미국 특허 제5,650,135호에는 또한 시간에 따른 포유류 대상체 내에서 연구중인 특정 실재물의 수준을 탐지하는 비침입성 방법이 기재되어 있으며, 이러한 방법은 (a) 상기 실재물과 광발생 잔기와의 접합체 또는 이러한 광발생 잔기를 발현하는 형질전환된 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계; (b) 상기 대상체를 광탐지기 장치의 탐지 필드 내에 놓아두는 단계; (c) 이 대상체를 상기 장치의 탐지 필드 내에 유지시키는 단계; (d) 유지시키는 동안, 상기 광탐지기 장치를 이용하여, 대상체 내에 국재된 광발생 잔기로부터 광자 방출을 측정하는 단계; 및 (e) 단계 (b) 내지 (d)를 일정한 간격으로 반복하는 단계(이러한 반복 단계는 시간에 따른 대상체 내의 실재물의 수준 변화를 탐지하는데 유효하다)를 포함한다.
최근에, 양(Yang) 등은 그린(green) 형광 단백질-발현 종양 및 전이물의 전신 광학 영상화를 수행하였다[참조: Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 97(3):1206-11(2000)]. 양 등은 살아 있는 마우스에서 형광 종양 성장과 전이 과정을 실시간으로 영상화하였다. 이러한 전신 광학 영상화 시스템은 외부적이고 비침입적이다. 이는 전례가 없을 정도로, 본래 상태의 동물 내에서 악성 종양의 성장과 확산을 지속적이고도 가시적으로 모니터해준다. 양 등은 극히 높은 수준의 애쿠오레아 빅토리아(Aequorea victoria) 그린 형광 단백질(GFP)을 안정적으로 발현하는 새로운 사람 및 설치류 종양을 확립하고, 이를 적당한 동물에 이식하였다. B16FO-GFP 마우스 흑색종 세포를 6주령 C57BL/6 마우스와 누드 마우스의 꼬리 정맥 또는 문맥 정맥 내로 주사하였다. 전신 광학 영상은 B16FO-GFP의 뇌, 간 및 뼈의 전이성 병변을 나타내었으며, 이는 이들 기관 각각에서의 종양 성장을 실시간으로 정량적으로 측정하는데 사용하였다. AC3488-GFP 사람 결장암을 외과적으로 절개하여 누드 마우스에게 정국소적으로 이식하였다. 전신 광학 영상은 1차적인 결장 종양의 성장과 이의 간 및 골격 내에서의 전이성 병변을 실시간으로 보여주었다. 영상화는 투사된 에피플루오레센스(epifluorescence) 현미경을 사용하거나 또는 형광 광 박스와 열전기적으로 냉각된 색 변화-커플링된 장치 카메라를 사용하였다. 전이물과 미세전이물이 영상화될 수 있는 깊이는 이들의 크기에 좌우되었다. 60-마이크로미터 직경의 종양은 0.5mm 깊이에서 탐지 가능한 반면, 1,800-마이크로미터 직경의 종양은 2.2mm 깊이에서 가시화될 수 있다. 강력한 GFP 형광에 의해 가능하였던, 점점 커지는 종양을 간단하고도 상당히 선택적으로 비침입적 영상화함으로써, 종양 성장과 전이물 형성을 상세히 영상화할 수 있다. 이로써 잠재적인 화학요법제에 의한 억제를 포함한 암 성장의 조절제(modulator)에 관한 연구를 촉진시켜야 한다.
유전자 발현을 모니터하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: Ausubel et al.(Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.]. 그러나, 본래 상태의 다세포 유기체, 예를 들면, 동물에서의 유전자 발현을 간단하고도 상당히 선택적이며 비침입적 방식으로 실시간으로 기록 및 분석해주는, 유전자 발현의 전신 외부 광학 영상화는 현재까지 이용가능하지 않다. 본 발명은 당업계에서 요구하는 상기 문제 및 기타 관련 문제에 역점을 두었다.
본 발명은 유전자 발현의 전신 외부 광학 영상화, 및 질병 또는 장애를 치료하기 위한 후보 프로토콜 또는 약물을 평가하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 특정 유전자의 프로모터에 작동적으로 연결된 형광단과 외부 광학 영상화를 이용한다. 표적 프로모터를 조절하는 물질 또는 유전자를 스크리닝하는 방법이 또한 제공된다.
특정한 양태에서는, a) 다세포 유기체에, 특정 유전자(이의 발현을 분석하고자 한다)의 프로모터에 작동적으로 연결된 형광단을 암호화하는 핵산을 전달하거나 또는 이러한 핵산을 함유하는 세포를 전달하는 단계; 및 b) 전신 외부 형광 광학 영상화(whole-body external fluorescent optical imaging)에 의해 상기 유기체 내의 각종 위치에서 상기 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 관찰함으로써, 상기 유전자의 발현을 모니터하는 단계를 포함하는, 유전자의 발현을 모니터하는 방법이 제공된다.
바람직한 양태에서는, 상기 유전자의 프로모터에 작동적으로 연결된 형광단을 암호화하는 핵산을 상기 유기체에 직접적으로 전달한다. 또한 바람직하게는, 상기 유전자의 프로모터에 작동적으로 연결된 형광단을 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터, 예를 들면, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스로부터 유도된 바이러스 벡터 내에 존재한다.
또 다른 바람직한 양태에서는, 상기 유전자의 프로모터에 작동적으로 연결된 형광단을 암호화하는 핵산을 함유하는 세포를 상기 유기체에 전달한다. 보다 바람직하게는, 상기 세포를 외과적 수술을 통하여 유기체에 전달하는데, 예를 들면, 외과적 정국소 이식(SOI)에 의해 목적하는 부위에 직접적으로 이식함으로써 전달한다.
또 다른 바람직한 양태에서는, 특정 유전자의 프로모터에 작동적으로 연결된 형광단은 사람화된(humanized) 형광단이다. 또한 바람직하게는, 상기 형광단은 그린 형광 단백질(GFP), 블루 형광 단백질(BFP) 또는 레드 형광 단백질(RFP)이다. 보다 바람직하게는, GFP가 사람화된 hGFP-S65T이다.
또 다른 바람직한 양태에서는, 분석하고자 하는 다세포 유기체가 식물 또는 동물(형질전환된 동물 포함)이다. 보다 바람직하게는, 동물이 포유류이다. 본 발명에 의해 사람을 분석할 수도 있다.
또 다른 바람직한 양태에서는, 분석하고자 하는 유전자가 조직 또는 기관 특이적 방식으로 발현된다. 보다 바람직하게는, 상기 유전자가 연결, 상피, 근육 또는 신경 조직에서 발현된다. 또한, 보다 바람직하게는, 상기 유전자가 동물 내부 기관, 예를 들면, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선, 내부 혈관 등에서 발현된다. 또한, 보다 바람직하게는, 분석하고자 하는 유전자가 종양 또는 암 관련 유전자, 예를 들면, 온코진(oncogene) 또는 종양 억제인자 유전자이다.
또 다른 바람직한 양태에서는, 하나 이상의 유전자의 발현을 동시에 모니터한다.
또 다른 특정한 양태에서는, a) 특정 질병 또는 장애와 연관된 유전자의 프로모터의 지시하에 형광단을 발현하는 비-사람 포유류 대상체에게 후보 프로토콜 또는 약물을 투여한 다음, 전신 외부 형광 광학 영상화에 의해 상기 포유류 대상체 내의 각종 위치에서 상기 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 관찰함으로써 상기 프로모터의 발현도를 측정하는 단계; b) 상기 유전자의 프로모터의 지시하에 상기 형광단을 발현하는 대조군 비-사람 포유류 대상체에서, 전신 외부 형광 광학 영상화에 의해 상기 포유류 대상체 내의 각종 위치에서 상기 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 관찰함으로써 상기 프로모터의 발현도를 측정하는 단계; 및 c) 상기 단계 a)와 b)에서 측정된 프로모터의 발현도를 비교하는 단계[이때, 단계 a)에서 측정된 발현도가 단계 b)에서 측정된 발현도와 상이한 경우, 이는 상기 프로토콜 또는 약물이 해당 질병 또는 장애를 치료하는데 유효하다는 것을 확인시켜 준다]를 포함하는, 질병 또는 장애를 치료하기 위한 후보 프로토콜 또는 약물을 평가하는 방법이 제공된다.
유전자의 과발현이 해당 질병 또는 장애와 연관이 있는 경우, 상기 프로토콜 또는 약물이 해당 질병 또는 장애를 치료하는데 유효한 경우, 단계 a)에서 측정된 발현도가 단계 b)에서 측정된 발현도 보다 낮다.
유전자의 발현 저하가 해당 질병 또는 장애와 연관이 있는 경우, 상기 프로토콜 또는 약물이 감염을 치료하는데 유효한 경우, 단계 a)에서 측정된 발현도가 단계 b)에서 측정된 발현도 보다 높다.
바람직하게는, 상기 질병 또는 장애가 암, 면역계 질병 또는 장애, 대사 질병 또는 장애, 근육 및 뼈 질병 또는 장애, 신경계 질병 또는 장애, 시그날 질병 또는 장애, 또는 수송체 질병 또는 장애이다.
바람직하게는, 상기 유전자의 프로모터의 지시하에 형광단을 발현하는 비-사람 포유류 대상체는 이러한 유전자의 프로모터에 작동적으로 연결된 형광단을 암호화하는 핵산 또는 이러한 핵산을 함유하는 세포가 상기 비-사람 포유류 대상체에게 전달됨으로서 생성된다. 또 다른 한편, 당해 스크리닝에 사용된 비-사람 포유류 대상체는 형질전환된 동물이다.
당해 스크리닝에 사용된 비-사람 포유류 대상체는 바람직하게는 널리 확증된 실험용 동물, 예를 들면, 마우스, 토끼 또는 비-사람 영장류이다.
당해 스크리닝에 사용된 형광단은 그린 형광 단백질(GFP), 블루 형광 단백질(BFP) 또는 레드 형광 단백질(RFP)이다.
한 가지 이상의 후보 프로토콜 또는 후보 약물을 바람직하게는 동시에 스크리닝한다.
비-사람 포유류 대상체가 감염성 유기체의 프로모터의 지시하에 형광단을 발현하는 경우, 상기 프로토콜 또는 약물이 이러한 감염성 유기체에 의해 유발된 감염을 치료하는데 유효한 경우, 단계 a)에서 측정된 발현도가 단계 b)에서 측정된 발현도 보다 낮다.
당해 스크리닝에 사용된 비-사람 포유류 대상체는 바람직하게는 감염성 질병에 걸린 동물 모델이다.
스크리닝 대상의 감염성 유기체는 바람직하게는, 진균, 예를 들면, 효모, 세균, 예를 들면, 진성세균(eubacteria) 또는 고세균(archaebacteria), 또는 바이러스, 예를 들면, 클래스 I 바이러스, 클래스 II 바이러스, 클래스 III 바이러스, 클래스 IV 바이러스, 클래스 V 바이러스 또는 클래스 VI 바이러스이다.
상기 감염이 세균에 의해 유발된 경우에는, 스크리닝하고자 하는 후보 약물이 바람직하게는 항생제이다.
또 다른 특정한 양태에서는, a) 특정 유전자의 프로모터의 지시하에 형광단을 발현하는 비-사람 다세포 유기체에게 시험 물질을 투여한 다음, 전신 외부 형광 광학 영상화에 의해 상기 다세포 유기체 내의 각종 위치에서 상기 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 관찰함으로써 상기 프로모터의 발현도를 측정하는 단계; b) 상기 유전자의 프로모터의 지시하에 상기 형광단을 발현하는 대조군 다세포 유기체에서, 전신 외부 형광 광학 영상화에 의해 각종 위치에서 상기 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 관찰함으로써 상기 프로모터의 발현도를 측정하는 단계; 및 c) 상기 단계 a)와 b)에서 측정된 프로모터의 발현도를 비교하는 단계[이때, 단계 a)에서 측정된 발현도가 단계 b)에서 측정된 발현도와 상이한 경우, 이는 상기 시험 물질을 상기 유전자 발현의 조절제로서 동정해준다]를 포함하는, 비-사람 다세포 유기체에서 상기 유전자 발현의 조절제를 스크리닝하는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 상기 프로모터가 다세포 유기체의 내인성 프로모터이다.
또 다른 특정한 양태에서는, a) 특정 유전자의 프로모터의 지시하에 형광단을 발현하는 비-사람 다세포 유기체에게 돌연변이-유발제 또는 처리제를 투여한 다음, 전신 외부 형광 광학 영상화에 의해 상기 다세포 유기체 내의 각종 위치에서 상기 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 관찰함으로써 상기 프로모터의 발현도를 측정하는 단계; b) 상기 유전자의 프로모터의 지시하에 상기 형광단을 발현하는 처리되지 않은 대조군 다세포 유기체에서, 전신 외부 형광 광학 영상화에 의해 각종 위치에서 상기 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 관찰함으로써 상기 프로모터의 발현도를 측정하는 단계; 및 c) 상기 단계 a)와 b)에서 측정된 프로모터의 발현도를 비교하는 단계[이때, 단계 a)에서 측정된 발현도가 단계 b)에서 측정된 발현도와 상이한 것은 상기 유전자를 변화된 수준으로 발현하는 다세포 유기체를 동정해준다]를 포함하는, 상기 유전자를 변화된 수준으로 발현하는 비-사람 다세포 유기체를 스크리닝하는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 상기 돌연변이-유발제 또는 처리제가 다세포 유기체의 생식주 세포에서의 돌연변이를 유발시켜, 목적하는 돌연변이가 상기 다세포 유기체의 자손에게 안정적으로 전이될 수 있도록 한다.
도 1A 및 1B는 뇌 및 간 각각에서 아데노바이러스-투여된 GFP의 발현도를 시 간에 따라 도시한 것이다. 국소 전달한지 6시간 후에 뇌에서 처음으로 형광이 가시화되었고, 꼬리 정맥 내로 주사한지 약 7시간 후에 간 형광이 탐지 가능하였다.
도 2A 및 2B는 렌티바이러스 벡터의 투여에 관한 것이다. 도 2A는 렌티바이러스 벡터 GFP-LV의 다이아그램이다. 도 2B는 대조군 관찰 방법의 다이아그램이고; 전신 측정은 광박스의 사용을 포함한다.
본 발명을 수행하는 양태
A. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 지칭된 모든 특허, 특허원, 공개특허공보 및 기타 공개문헌, 및 유전자 뱅크로부터의 서열 및 기타 데이터 베이스는 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "특정 핵산을 다세포 유기체에 전달하는 것"은 이러한 핵산을 다세포 유기체의 체내에 직접적으로 투여하거나, 또는 상기 핵산을 세포 내로 먼저 투여한 다음, 이러한 핵산을 함유하는 세포를 다세포 유기체의 체내에 투여하는 과정을 지칭한다. 이러한 유기체 내로의 전달 후, 상기 핵산은 숙주 유기체의 게놈과는 독립적으로 존재하거나, 또는 숙주 유기체의 게놈 내로 통합될 수 있다. 핵산이 숙주 유기체의 배선 세포(germline cell) 내로 통합되는 경우에는, 이러한 핵산이 숙주 유기체의 자손에게로 유전될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "전신 외부 형광 광학 영상화"는 숙주 유기체 내의 각종 위치에서 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 어떠한 과정(예를 들면, 외과적 수술) 없이도 외부적으로 모니터, 기록 및/또는 분석하여, 목적하는 관찰 부위를 노출시키고/시키거나 이를 숙주 유기체로부터 절제하는 영상화 과정을 지칭한다. 전신 외부 형광 광학 영상화를 달성하기 위해서는, 형광단에 의해 발생된 형광의 강도가 충분히 높을 필요가 있는데, 이는 형광 부위가 숙주 유기체 내의 내부적인 것일지라도, 이 부위를 노출시키거나 상기 숙주 체내로부터 절제하지 않고서도 형광 시그날을 외부적으로 분석할 수 있거나, 한편으론 해당 동물을 조절하지 않아도 되기 때문이다.
침입적 과정이 전혀 요구되지 않고 시그날 강도가 직접적인 관찰에 충분할 정도로 크기 때문에, 해당 동물은 완벽하게 움직일 수 있는 상태를 유지하고 제한될 필요가 없다. 완전하게 비-침입적인 관찰 프로토콜을 제공해주는 능력은 상당히 중요하다. 예를 들면, 절개 또는 물리적 제한 도구(예: 스트랩 또는 핀)에 의해 해당 동물에게 외상을 입힌 경우에는, 대사 변화로 인해, 기관 또는 조직 내에서의 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있다.
전신 외부 형광 광학 영상화는 신속하고 용이하게 자동화할 수 있기 때문에, 다수의 유전자 발현을 동시에 모니터하는데 사용할 수 있다. 또한, 이는 프로토콜, 물질(후보 약물 포함), 및 표적 유전자의 발현을 조절하는 시스-작용성 조절인자를 동정하기 위한 고출력 스크리닝 방법에 이용될 수 있다. 본원에 제공된 전신 외부 형광 광학 영상화를 이용하여, 단일 동물 또는 다수 동물에서, 단일 표적 유 전자 또는 다중 표적 유전자에 대한 다중 후보 프로토콜, 물질, 약물 및 시스-작용성 조절인자를 동시에 스크리닝할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "형광단"은 자체 형광을 발휘하기 위해 어떠한 기타 기질이나 조인자도 필요로 하지 않는 자가-형광인 단백질을 지칭한다. 이러한 형광단의 비-제한적 예로는 그린 형광 단백질(GFP), 블루 형광 단백질(BFP) 및 레드 형광 단백질(RFP), 및 이들의 작용성 단편, 유도체 및 동족체가 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "프로모터 영역 또는 프로모터 요소"는 이에 작동적으로 연결된 DNA 또는 RNA의 전사를 조절해주는 DNA 또는 RNA의 절편을 지칭한다. 프로모터 영역에는 RNA 폴리머라제 인식, 결합 및 전사 개시에 충분한 특이적 서열이 포함된다. 이러한 프로모터 영역 부위가 프로모터로서 지칭된다. 또한, 프로모터 영역에는 RNA 폴리머라제의 인식, 결합 및 전사 개시 활성을 조정해주는 서열이 포함된다. 이들 서열은 시스-작용성이거나, 또는 트랜스-작용성 인자에 반응할 수 있다. 프로모터는 조절 성질에 따라서 구성성이거나 조절될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "작동적으로 연결되거나 작동적으로 연합된"이란 뉴클레오타이드의 조절 및 유효인자 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서(enhancer), 전사 및 해독 종결 부위, 및 기타 시그날 서열과 DNA 간의 작용성 관계를 지칭한다. 예를 들면, 프로모터에 대한 DNA의 작동적 연결은, DNA를 특이적으로 인식하고, 이에 결합하여 이를 전사시키는 RNA 폴리머라제에 의해 프로모터로부터 DNA 전사가 개시되도록 해주는, DNA와 프로모터 간의 물리적 및 작용적 관계를 지칭한다. 발현 및/또는 시험관내 전사를 최적화하기 위해서는, 해당 클론의 해독되지 않은 5' 부위를 제거, 부가 또는 변화시켜, 여분의 잠재적으로 부적절한 대체 해독 개시(즉, 출발) 코돈, 또는 전사 또는 해독 수준에서 발현을 방해하거나 이를 저하시킬 수 있는 기타 서열을 제거하는 것이 필요할 수 있다. 또 다른 한편, 컨센서스 리보솜 결합 부위[참조: Kozak, J. Biol. Chem., 266:19867-19870(1991)]를 출발 코돈의 5' 바로 앞에 삽입하여 발현을 증진시킬 수 있다. 이러한 변형에 대한 요망하는 정도(또는 필요성)는 실험적으로 결정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "사람화된 형광단"은 이의 형광 특징들은 실질적으로 유지시키면서 이의 발현을 증진시키기 위해 사람 게놈 내의 코돈 활용 패턴에 따라서 이의 코돈을 변형시킨 형광단을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "다세포 유기체"는 이러한 다세포 유기체의 내부 부위가 이를 노출시키지 않고서는 비-형광 광학 영상화에 의해 외부적으로 탐지 가능할 수 없는 특정한 세포 수, 질량 및 내부 구조를 지닌 유기체를 지칭한다. 이러한 내부 부위의 외부 형광 광학 영상화를 위해서는 충분히 높은 내부 형광 강도가 필요하다.
본원에 사용된 바와 같이, "식물"은 배아를 생성하고, 엽록체를 함유하며, 셀룰로즈 세포 벽을 지니고 있고 운동력이 결여된 것을 특징으로 하는, 식물계의 각종 광합성의 진핵성 다세포 유기체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "동물"은 운동 능력이 있고, 비광합성 대사를 나타내며, 자극에 대해 현저히 반응하고, 제한된 성장과 고정된 신체상 구조를 지니고 있음을 특징으로 하는, 동물계의 다세포 유기체를 지칭한다. 동물의 비-제한적 예로는 조류, 예를 들면, 닭, 척추동물류, 예를 들면, 어류 및 포유류, 예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 암소, 황소, 양, 염소, 말, 원숭이 및 기타 비-사람 영장류가 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "조직 또는 기관 특이적 방식으로 발현된"이란 유전자가 특정한 조직 또는 기관에서만 일시적 또는 구성적으로 발현되지만, 기타 조직 또는 기관에서는 발현되지 못하는 유전자 발현 패턴을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "조직"은 유사한 세포 집단 및 이들을 둘러싸고 있는 세포내 물질을 지칭한다. 신체 내에는 4가지 기본적인 조직이 있다: 1) 상피 조직; 2) 혈액, 뼈 및 연골을 포함한 연결 조직; 3) 근육 조직 및 4) 신경 조직.
본원에 사용된 바와 같이, "기관"은 호흡, 분비 또는 소화와 같은 특정 기능을 발휘하는 신체 일부를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "질병 또는 장애"는 예를 들어, 감염 또는 유전적 결함으로부터 비롯되고 확인 가능한 증상을 특징적으로 나타내는, 유기체 내의 병리학적 상태를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 신생물(종양 형성)은 비정상적인 새로운 성장을 지칭하므로, 종양과 동일한 의미이며, 이는 양성 또는 악성일 수 있다. 과형성(hyperplasia)과는 달리, 신생물성 증식은 본래의 자극이 없는 경우에도 지속적으로 나타난다.
본원에 사용된 바와 같이, 암은 모든 유형의 악성 종양으로 인해 유발된 질 병에 대한 일반적인 용어를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "온코진"은 성장에 대한 정상적인 제한 수단으로부터 세포를 우선적 방식으로 방출시킴으로써, 단독으로 또는 기타 변화 요인들과 협력하여 세포를 종양 세포로 전환시킬 수 있는, 동물 세포의 정상 유전자(프로토-온코진)의 돌연변이되고/되거나 과발현된 변환물을 지칭한다. 온코진의 예에는, 예를 들면, abl, erbA, erbB, ets, fes(fps), fgr, fms, fos, hst, int1, int2, jun, hit, B-lym, mas, met, mil(raf), mos, myb, myc, N-myc, neu(ErbB2), ral(mil), Ha-ras, Ki-ras, N-ras, rel, ros, sis, src, ski, trk 및 yes가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "종양 억제인자 유전자"(또는 항-온코진, 암 감수성 유전자)는 세포 주기를 통상 음성적으로 조절하는 생성물을 암호화하고, 세포가 신속한 분열을 진행하기 전에 돌연변이되거나 불활성화되어야만 하는 유전자를 지칭한다. 종양 억제인자 유전자의 예에는 p16, p21, p53, RB(망막아종), WT-1(윌름 종양), DCC(결장암종에서 결실됨), NF-1(신경섬유육종) 및 APC(선종성 다발결장 폴립)이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "면역계 질병 또는 장애"는 면역계 결함으로 인해 유발된 병리학적 상태를 지칭한다. 면역계는 복잡하고 고도로 발달된 시스템이지만, 이의 임무는 간단한데, 즉 침입자를 찾아 이를 사멸시키는 것이다. 사람이 심각하게 결함이 있는 면역계를 지닌채 태어난다면, 바이러스, 세균, 진균 또는 기생충에 의한 감염으로 인해 사망하게 될 것이다. 중증 복합 면역결핍증에서 효소 결핍은 독성 물질이 면역계 세포 내에 축적되어, 이들 세포를 사멸시킴으로써 면역계를 파괴시키는 것을 의미한다. 면역계 세포 결여는 또한, 디죠지(DiGeorge) 증후군의 원인이 되는데: 흉선의 부적절한 발생은 T 세포 생성이 감소한다는 것을 의미한다. 대부분의 기타 면역 장애는 과도한 면역 반응 또는 '자가면역 공격'으로부터 비롯된 것이다. 예를 들면, 천식, 가족성 지중해열 및 크론병(Crohn disease)(염증성 장 질병) 모두는 면역계의 과반응으로부터 비롯된 것인 반면, 자가면역 다중선 증후군 및 몇몇 당뇨병 요인들은 '자체' 세포와 분자를 공격하는 면역계에서 기인된 것이다. 면역계의 주요 역할은 침입자와 자신의 신체내 세포를 구별하는 것인데, 이러한 구별을 하지 못하게 되면, '자체' 세포와 분자에 대한 반응으로 인해 자가면역 질병이 유발된다.
본원에 사용된 바와 같이, "대사 질병 또는 장애"는 대사 과정 상의 오류로 인해 유발된 병리학적 상태를 지칭한다. 대사는 신체가 에너지를 가동시키고, 미네랄 및 비타민의 도움을 받는 효소적 반응에 의해, 우리가 음식물로서 섭취하는 지방, 탄수화물 및 단백질로부터 필요로 하는 기타 분자를 합성할 수 있게 해주는 수단이다. 이러한 시스템 내에서의 오류는 상당한 수준이 허용되고 있는데; 종종 하나의 효소 상의 돌연변이로 인해, 이러한 질병을 앓지는 않는다. 수 많은 상이한 효소가 동일한 분자를 변형시키는데 적격할 수 있고, 각종 대사 중간체에 대한 동일한 최종 결과를 달성하기 위해서는 한 가지 이상의 방식이 있을 수 있다. 중요한 효소가 쓸모 없어진 경우, 또는 대사 경로에 대한 제어 기전이 영향을 받는 경우에만 질병이 발생할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "근육 및 뼈 질병 또는 장애"는 근육 및 연결 조직의 형성과 기능에 중요한 유전자의 결함에 의해 유발된 병리학적 상태를 지칭한다. 연결 조직은 본원에서 광범위한 의미로 사용되고, 이에는 뼈, 연골 및 건(tendon)이 포함된다. 예를 들면, 피블린(조직을 강력하지만 유연성 있게 만드는데 있어 중요한 연결 조직 단백질) 결함은 마르팡(Marfan) 증후군을 유발시키는 반면, 디아스트로픽(diastrophic) 이형성은 연골에서 발견된 설페이트 수송체의 결함에 의한 유발된 것이다. 근육 세포 자체 결함으로 인한 2가지 질병이 뒤시엔느 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy: DMD) 및 위축성 근경직증(DM)이다. DM은 근육 단백질 키나제 유전자에서의 뉴클레오타이드 반복 서열의 확장과 관련이 있는, 헌팅톤병과 유사한 또 다른 '동적 돌연변이' 질병이다. DMD는 세포 구조를 유지하는데 중요한 세포골격성 단백질인 디스트로핀의 결함과 관련이 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "신경계 질병 또는 장애"는 중추 신경계, 즉 뇌와 말초 신경계를 포함한 신경계의 결함에 의해 유발된 병리학적 상태를 지칭한다. 뇌와 신경계는 근육, 감각, 언어, 기억력, 사고 및 감정을 조화시키는 것에 관계하는 전기적 시그날의 복잡한 네트워크를 형성한다. 신경계에 직접적으로 영향을 미치는 몇몇 질병은 유전 성분을 지니고 있다: 몇몇은 단일 유전자 내의 돌연변이에 기인된 것이고, 다른 것은 보다 복잡한 유전 형질 양상을 지니는 것으로 입증되었다. 신경 퇴행성 장애의 발병학에 관한 본 발명자들의 이해가 깊어질 수록, 공통의 주제가 나타나기 시작한다: 알츠하이머 뇌 플라크, 및 파킨슨병에서 발견된 봉입체는 1가지 이상의 공통 성분을 함유하는 반면, 헌팅톤병, 취약 X 염색체 증후군 및 척수소뇌 위축은 모두 DNA 반복 서열의 확장을 나타내는 '동적 돌연변이' 질병이다. 아폽토시스는 기타 특이적인 세포내 시그날링 사건과 같이, 몇몇 신경 퇴행성 질병에서 자극된 분자상 기전 중의 하나로서 나타나는 것이다. 미엘린의 생합성 및 콜레스테롤 트래픽의 조절은 또한, 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease) 및 나이만-픽크병(Neimann-Pick disease) 각각에서 상징적으로 나타난다.
본원에 사용된 바와 같이, "시그날 질병 또는 장애"는 시그날 전달 과정 상의 결함으로 인해 유발된 병리학적 상태를 지칭한다. 세포내 및 세포간의 시그날 전달은 이들이 중요한 정보를 전송하여 이에 의존하여 작용할 수 있다는 것을 의미한다. 이들의 합성 부위로부터 방출된 호르몬은, 지방 조직(지방 세포)로부터 방출되어 혈액을 통하여 뇌로 수송되는 렙틴의 경우에서와 같이, 이들의 표적 부위에 대한 메시지를 수반한다. 여기서, 렙틴 시그날은 충분히 섭취되고 있다. 렙틴은 후속 세포내 시그날링 네트워크를 촉발시키는 시상하부 세포의 표면 상의 수용체에 결합된다. 세포내 시그날링 결함은 암, 모세혈관 확장성 운동실조증 및 코카인(Cockayne) 증후군을 포함한 몇몇 질병의 원인이 된다. 잘못된 DNA 수복 기전이 또한 발병을 자극하는데, 이는 세포 분할, DNA 합성 및 DNA 수복의 조절 모두가 뒤엉켜 연결되어 있기 때문이다. 많은 세포 시그날의 최종 결과는 DNA-결합성 단백질 상에서 작용함으로써 유전자의 발현(전사)을 변화시키는 것이다. 몇몇 질병은 이들 단백질의 결여 또는 이들 단백질 내에서의 돌연변이 결과에 따른 것이며, 이로써 상기 단백질이 정상적인 방식으로 DNA와 결합하지 못한다. 시그날링 네트워크는 많은 정상적 기능 국면에 영향을 주기 때문에, 그렇게 많은 질병이 최소한 몇몇 시그날링 결함에 근거한다는 것은 놀라운 일이 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "수송체 질병 또는 장애"는 수송체, 채널 또는 펌프의 결함으로 인해 유발된 병리학적 상태를 지칭한다. 세포 막 내에 있는 수송체, 채널 또는 펌프는 세포 내에서의 이온의 정확한 균형을 유지하는데 중요하고, 또한 시그날을 신경에서부터 조직 내로 전달하는데 있어 중요하다. 이온 채널 및 수송체의 결함에 따른 결과는 이들이 위치한 장소와 이들의 선적물에 따라서 다양하다. 예를 들면, 심장에서는, 칼륨 채널 상의 결함으로 인해, 전기적 임펄스를 적절히 전달할 수 없어, 긴 QT 증후군에서 보여지는 부정맥이 나타난다. 폐에서는, 상피 세포에서 발견되는 나트륨 및 클로라이드 수송체 상의 결함으로 인해, 낭포성 섬유증의 충혈이 야기되는 반면, 귀머거리를 초래하는 대부분의 통상적인 유전된 형태 중의 하나인 펜드레드(Pendred) 증후군은 설페이트 수송체의 결함과 연관이 있는 것으로 보인다.
본원에 사용된 바와 같이, "감염"은 잠재적으로 질병을 유발시키는 유기체가 다세포 유기체의 체내에 침입한 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "감염성 유기체"는 다세포 유기체를 감염시킬 수 있는 유기체를 지칭한다. 대부분의 감염성 유기체는 바이러스, 세균 및 진균과 같은 미생물이다.
본원에 사용된 바와 같이, "세균"은 비-구획화 환상 DNA 및 약 70S의 리보솜을 갖는 작은 원핵성 유기체(선형 치수는 약 1㎛이다)를 지칭한다. 세균 단백질 합성은 진핵 생물의 단백질 합성과 상이하다. 많은 항균성 항생제는 세균 단백질 합성을 방해하지만, 감염된 숙주에는 영향을 미치지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "진성세균"은 고세균을 제외한 대다수의 세균 아부문(subdivision)을 지칭한다. 대부분의 그램-양성 세균, 시아노박테리아(cyanobacteria), 미코플라스마(mycoplasma), 엔테로박테리아(enterobacteria), 슈도모나스(pseudomonas) 및 엽록체가 진성세균이다. 진성세균의 세포질 막은 에스테르-연결된 지질을 함유하는데; 세포 벽(존재하는 경우) 내에는 펩티도글리칸이 있고; 진성세균에서는 인트론이 전혀 발견되지 않았다.
본원에 사용된 바와 같이, "고세균"은 진성세균을 제외한 대다수의 세균 아부문을 지칭한다. 고세균에는 3가지 주요 목이 있다: 극도의 할로겐 염류 친화균, 메타노겐 및 황-의존적 극호열균. 고세균은 리보솜 구조, 인트론의 보유 여부(몇몇 경우), 및 막 조성을 포함한 기타 특징에 있어 진성세균과 상이하다.
본원에 사용된 바와 같이, "바이러스"는 DNA 또는 RNA와 단백질 코트로 이루어진, 살아있긴 하지만 비-세포 특성의 절대 세포내 기생충을 지칭한다. 바이러스의 직경은 약 20 내지 약 300nm의 범위이다. 클래스 I 바이러스(발티모어 분류)는 이들의 게놈으로서 이본쇄 DNA를 가지고; 클래스 II 바이러스는 이들의 게놈으로서 일본쇄 DNA를 가지며; 클래스 III 바이러스는 이들의 게놈으로서 이본쇄 RNA를 가지고; 클래스 IV 바이러스는 이들의 게놈으로서 양성의 일본쇄 RNA를 가지는데, 이러한 게놈 자체가 mRNA로서 작용하며; 클래스 V 바이러스는 mRNA 합성에 대한 주형으로서 사용된 이들의 게놈으로서 음성의 일본쇄 RNA를 가지고; 클래스 VI 바이러스는 양성의 일본쇄 RNA 게놈을 갖지만, 이는 복제에서 뿐만 아니라 mRNA 합성에서 DNA 중간체를 갖는다. 대다수의 바이러스는 이들이 식물, 동물 및 원핵 생물에서 유발시키는 질병에 의해 인식된다. 원핵 생물의 바이러스가 박테리오파아지로서 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "진균"은 뿌리, 줄기 또는 잎이 없는 불규칙적인 덩어리로 성장하고, 엽록소 또는 광합성할 수 있는 기타 색소가 결여되어 있는 진핵 유기체 분류를 지칭한다. 각 유기체(엽상체)는 단세포 내지 필라멘트성이고, 글루칸 또는 키틴, 또는 이들 둘다를 함유하는 세포벽에 의해 둘러싸이고 진핵을 함유하는 분지된 체강 구조(균사)를 보유하고 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "항생제"는 사멸 또는 억제시키고자 하는 미생물의 숙주에게는 실질적으로 해를 입히지 않으면서 특정 미생물의 성장을 억제시키는, 곰팡이 또는 세균으로부터 유도되거나 유기적으로 합성된 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "시험 물질"은 분석하고자 하는 프로모터에 대한 이의 효과가 본원에 기재되고/되거나 청구된 방법에 의해 결정되는, 화학적으로 규정된 화합물(예를 들면, 유기 분자, 무기 분자, 유기/무기 분자, 단백질, 펩타이드, 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 지질, 폴리사카라이드, 사카라이드 또는 이들 분자 중에서 특히 예를 들면, 당단백질 등의 하이브리드) 또는 화합물의 혼합물(예를 들면, 시험 화합물의 라이브러리, 천연 추출물 또는 배양 상등액 등)을 지칭한다.
본 기재 내용을 명료히 하고, 제한시키지 않게 하기 위해, 본 발명의 상세한 설명을 다음 섹션으로 나눈다.
B. 유전자 발현의 전신 외부 광학 영상화 방법
특정한 양태에서는, a) 특정 유전자(이의 발현을 분석하고자 한다)의 프로모터에 작동적으로 연결된 형광단을 암호화하는 핵산 또는 이러한 핵산을 함유하는 세포를 다세포 유기체에 전달하는 단계; 및 b) 전신 외부 형광 광학 영상화에 의해 상기 유기체 내의 각종 위치에서 상기 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 관찰함으로써, 상기 유전자의 발현을 모니터하는 단계를 포함하는, 유전자의 발현을 모니터하는 방법이 제공된다.
본 발명의 방법을 사용하여, 예후, 진단 및 스크리닝 목적을 포함한 적합한 모든 목적을 위해 유전자 발현을 모니터할 수 있다. 예를 들면, 비정상적인 유전자 발현이 식물 또는 동물과 같은 다세포 유기체 내의 질병 또는 장애와 연관이 있는 경우, 당해 방법은 비정상적인 유전자 발현을 모니터함으로써 예후 또는 진단에 사용할 수 있다. 본 발명의 모니터링 방법은 몇몇 국면에 있어서 지금까지 이용되어 온 유전자 발현 모니터링 방법에 비해 유리하다. 첫째, 당해 모니터링 방법은 어떠한 침입적 과정을 피할 수 있고, 이는 사람 임상용으로 특히 유리하다. 둘째, 당해 모니터링 방법은 지금까지 이용되어 온 모니터링 방법을 사용해서는 달성할 수 없었던, 식물 또는 동물에서의 유전자 발현을 생체내에서 실시간으로 지속적으로 모니터 및 분석할 수 있게 해준다. 셋째, 당해 모니터링 방법은 신속하고도 용이하게 자동화하기 쉬운데, 이는 상당수의 유전자 발현을 동시에 모니터하는데 중요하다. 많은 질병 또는 장애는 하나 이상의 유전자의 비정상적인 유전자 발현과 관련이 있기 때문에, 당해 모니터링 방법은 이들 질병 또는 장애를 예후 및 진단하는데 특히 적합하다. 예후나 진단 이외에도, 특정 유전자의 발현이 조직 또는 기관 건강 또는 기능성의 우수한 지시인자인 경우에는, 당해 모니터링 방법이 또한, 어떠한 침입적 과정을 사용하지 않고서도 이들 조직 또는 기관의 건강 또는 기능성을 모니터하는데 사용할 수 있다.
1. 핵산을 다세포 유기체에 전달하는 방법
특정 유전자(이의 발현을 분석하고자 한다)의 프로모터에 작동적으로 연결된 형광단을 암호화하는 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 이러한 핵산은 당해 분야에 공지된 어떠한 방법에 의해서도 다세포 유기체의 체내에 전달할 수 있다.
예를 들면, 숙주 다세포 유기체가 동물인 경우에는, DNA 또는 RNA 서열을 근육, 피부, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 눈, 선 및 연결 조직을 포함한 동물 체내 조직의 간질성 공간에 전달할 수 있다. 이러한 조직의 간질성 공간은 망상 섬유 또는 기관 조직 중의 세포간 유체, 뮤코폴리사카라이드 매트릭스, 관 또는 챔버 벽 내의 탄성 섬유, 섬유성 조직의 콜라겐 섬유, 또는 근육 세포를 둘러싸고 있거나 뼈 사이의 작은 구멍 내의 연결 조직 내의 동일한 매트릭스를 포함한다. 이는 유사하게는, 림프계 채널의 림프액 순환 혈장에 의해 점유된 공간이다.
DNA 또는 RNA 서열은 이들 세포를 포함하는 조직 내로 주사함으로써 편리하게 전달할 수 있다. 이는 분화되는 영구적인 비분열 세포에 전달되어 이 세포 내에서 발현되는 것이 바람직하지만, 전달 및 발현은 비-분화되거나 덜 완전하게 분화된 세포, 예를 들면, 혈액 또는 피부 섬유아세포의 줄기 세포에서 달성될 수 있다.
특정한 양태에서는, DNA 또는 RNA 서열을 숙주 동물의 조직에 직접적으로 전달한다. 바람직하게는, DNA 또는 RNA 서열을 근육, 피부 또는 점막에 직접적으로 전달한다. 근육 조직의 간질성 공간으로의 전달이 바람직한데, 이는 폴리뉴클레오타이드를 취하여 이를 발현하는 능력면에서 근육 세포가 특히 적격하기 때문이다.
DNA 또는 RNA 서열은 주사, 유전자 총 기술 또는 지질 매개된 전달 기술에 의해 숙주 동물의 조직에 직접적으로 전달할 수 있다. 주사는 바늘 또는 기타 주사용 장치를 통하여 수행할 수 있다. 유전자 총 기술은 미국 특허 제5,302,509호에 기재되어 있고 지질 매개된 전달 기술은 미국 특허 제5,703,055호에 기재되어 있다.
또 다른 특정한 양태에서는, DNA 또는 RNA 서열을 숙주 동물의 세포에 전달하고, DNA 또는 RNA 서열을 함유하는 당해 세포를 숙주 동물의 적합한 조직에 전달한다. 바람직하게는, DNA 또는 RNA 서열을 숙주 동물의 꼬리 또는 문맥 정맥에 전달한다.
DNA 또는 RNA 서열은 Ca3(PO4)2-DNA 형질감염[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Edition, Plainview, N.Y.Cold Spring Harbor Press, 1989], DEAE 덱스트란-DNA 형질감염[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Edition, Plainview, N.Y.Cold Spring Harbor Press, 1989], 전기천공(예를 들면, Bio-Rad로부터의 프로토콜), "LIPOFECTIN"™ 시약을 이용한 형질감염(예를 들면, BRL-Life Science로부터의 프로토콜), 유전자 총 기술(미국 특허 제5,302,509호) 또는 바이러스 유전자 전달 시스템[참조: Kaplitt et al., Viral Vectors, Academic Press, Inc., 1995]을 포함한 수 많은 방법[참조: Koprowski & Weiner, DNA vaccination/genetic vaccination, 1998. Springer-verlag Berlin Heidelberg]에 의해 숙주 동물의 세포에 전달할 수 있다.
금 입자를 이용한 유전자 총 전달이 미국 특허 제5,302,509호에 기재되어 있다. 특정한 양태에서는, 바이오-래드 헬리오스 유전자 총 시스템이 DNA 전달에 사용된다[BIO-RAD Inc. New England]. 이러한 헬리오스 유전자 총은 생체내에서 신속하고도 직접적인 유전자 전이를 제공해주는, 편리하고 손으로 잡을 수 있는 장치이다. 상기 장치는 조정 가능한 헬륨 펄스를 이용하여, DNA 코팅된 금 미소운반체를 작은 플라스틱 카트리지의 내부 벽으로부터 표적 세포에 직접적으로 스위핑한다. 관류 프렙스테이션(tubing prepstation) 및 관류 커터는 한번에 50개 카트리지 "총알"을 제조하는 간단한 방식을 제공해준다.
바람직한 양태에서는, 상기 유전자의 프로모터에 작동적으로 연결된 형광단을 암호화하는 핵산을 상기 유기체에 직접적으로 전달한다. 보다 바람직하게는, 상기 유전자의 프로모터에 작동적으로 연결된 형광단을 암호화하는 핵산을 바이러스 벡터, 예를 들면, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스로부터 유도된 바이러스 벡터로 유기체, 또는 이러한 유기체에 전달될 세포에 전달한다.
당해 분야에 공지된 어떠한 바이러스 벡터도 사용할 수 있다. 예를 들면, 파보바이러스로부터 유도된 벡터(미국 특허 제5,252,479호 및 제5,624,820호), 파라믹소바이러스, 예를 들면, 시미안 바이러스 5(SV5)로부터 유도된 벡터(미국 특허 제5,962,274호), 레트로바이러스, 예를 들면, HIV로부터 유도된 벡터(미국 특허 제5,753,499호 및 제5,888,767호) 및 바큘로바이러스, 예를 들면, 핵 다면성 바이러스로부터 유도된 벡터(미국 특허 제5,674,747호)를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 아데노바이러스로부터 유도된 벡터를 사용할 수 있다(미국 특허 제5,670,488호, 제5,817,492호, 제5,820,868호, 제5,856,152호, 제5,981,225호).
미국 특허 제5,670,488호에는 하나 이상의 E4 개방 판독 프레임이 결실되어 있지만, 시험관내에서의 바이러스 복제를 증진시키기에 충분한 E4 서열을 보유하고 있는 아데노바이러스 게놈을 포함하고, 또한 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있으며 상기 아데노바이러스 게놈 내로 삽입된 관심있는 DNA 서열을 부가적으로 포함하는 아데노바이러스 벡터가 기재되어 있다.
미국 특허 제5,817,492호에는 다음을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터가 기재되어 있다: 레컴비나제(recombinase) 효소에 대한 기질로서 작용하는 2개의 DNA 서열, 동물 세포에서 사용 가능한 복제 오리진, 프로모터, 외래 유전자 및 폴리(A) 서열[여기서, 상기 복제 오리진, 프로모터, 외래 유전자 및 폴리(A) 서열은 상기 2개 DNA 서열 사이에 위치하고, 상기 벡터는 E1A 유전자 영역 결실을 함유한다].
미국 특허 제5,820,868호에는 E3 다중 유전자 암호화 영역의 일부 또는 전부가 외래 유전자를 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편으로 대체되는 소의 재조합 생(live) 아데노바이러스 벡터(BAV)가 기재되어 있다. 또한, E3 다중 유전자 암호화 영역의 일부 또는 전부가 외래 유전자를 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편으로 대체되고 이러한 이종 뉴클레오타이드 서열이 상기 외래 유전자 또는 소의 아데노바이러스 게놈과 통상적으로 연관이 없는 프로모터의 조절하에 임의적으로 존재하는 재조합 생 아데노바이러스 벡터(BAV)가 기재되어 있다.
미국 특허 제5,856,152호에는 (a) 복제 및 비리온 캡시드화에 필요한 아데노바이러스 5' 및 3' 시스-요소를 포함하는 아데노바이러스 서열; (b) 아데노-관련 바이러스의 5' 및 3' ITR을 포함하는, (a)의 아데노바이러스 서열에 의해 플랭킹된 아데노-관련 바이러스 서열; 및 (c) 표적 세포에서의 이의 발현을 지시해주는 조절 서열에 작동적으로 연결된 선별된 유전자[이러한 유전자 및 조절 서열은 (b)의 아데노-관련 바이러스 서열에 의해 플랭킹된다]를 포함하는 하이브리드 바이러스 벡터가 기재되어 있다.
미국 특허 제5,981,225호에는 5'에서 3' 배향으로, 필수적으로 다음 성분들, 즉 (i) 제1 아데노바이러스 역방향 말단 반복 서열; (ii) 아데노바이러스 VAI 유전자 및/또는 VAII 유전자; (iii) 아데노바이러스 표적 세포에서 작용성인 프로모터에 작동적으로 연결된, 아데노바이러스에 대해 외래인 유전자; 및 (iv) 제2의 아데노바이러스 역방향 말단 반복 서열로 이루어진 유전자 전이 벡터가 기재되어 있는데, 상기 요소 (ii)와 (iii)의 순서는 반전될 수 있고; 요소 (i) 및 요소 (iv) 중 의 하나 또는 둘 다는 부가적으로, 아데노바이러스 패키징 시그날을 포함하며; 상기 벡터가 아데노바이러스 게놈 DNA 또는 아데노바이러스 게놈 DNA를 함유하는 아데노바이러스 입자를 갖는 아데노바이러스 숙주 세포 내로 각각 공동-형질감염되거나 공동-감염되지 않는 한은, 상기 벡터가 그 내부에서 이러한 벡터를 캡시드화시킨 재조합 아데노바이러스 입자를 시험관내에서 생성할 수 없다.
또 다른 바람직한 양태에서는, 상기 유전자의 프로모터에 작동적으로 연결된 형광단을 암호화하는 핵산을 함유하는 세포를 유기체에 전달한다. 보다 바람직하게는, 상기 세포를 외과적 수술을 통하여 유기체에 전달하는데, 예를 들면, 외과적 정국소 이식(SOI)에 의해 목적하는 부위에 직접적으로 이식함으로써 전달한다[참조: Chang et al., Anticancer Res., 19(5B):4199(1999); and An et al., Prostate, 34(3):169-74(1998)].
특정 프로모터를 형광단 리포터 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 커플링시킨 핵산 분자를 도입함으로써, 이와 같이 도입된 핵산 분자를 내인성 프로모터에 대한 대용물로서 사용할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 이러한 내인성 유전자가 특정한 조건 맥락에서 과발현 또는 발현 저하되는 경우에는, 도입된 작제물의 행위가 상기 내인성 프로모터의 행위를 모사할 것이다. 리포터-암호화 뉴클레오타이드 서열을 프로모터에만 작동적으로 연결시킬 필요는 없으며; 리포터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을, 통상적으로 프로모터의 조절 하에 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 내로 도입하거나, 또 다른 단백질과 커플링시킬 수 있다. 리포터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 해당 유전자(이의 발현 을 모니터하고자 한다)에 대한 조절 서열에 작동적으로 연결하는 어떠한 방법도 본 발명의 범주 내에 속한다.
상기 작제물을 도입하는 수 많은 방식이 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 첫 번째, 관심있는 조절 서열/프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 암호화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 직접적으로 주사함으로써, 바람직하게는 바이러스 벡터, 예를 들면, 아데노바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 다세포 유기체에 도입할 수 있다. 이와 같이 도입된 작제물은 내인성이 아니기 때문에, 상기 작제물의 발현은 본질적으로 내인성 유전자에 대한 대용물로서 작용한다. 즉, 내인성 유전자에 영향을 미치는 것과 동일한 영향이 또한, 상기 도입된 작제물에 미칠 것이다. 따라서, 상기 발현에 대한 각종 처리 효과를 포함한, 상기 작제물의 발현을 관찰함으로써 얻은 결론은 대응물 내인성 유전자를 추정할 수 있고, 이와 동등하게 유효하다.
두 번째, 리포터 암호화 뉴클레오타이드 서열을, 위치-특이적 기술, 예를 들면, 동종 재조합 기술을 사용하여 연구 및 삽입하고자 하는 프로모터에 상기 서열을 표적시킴으로써 이를 특정 조직의 세포 내로 도입할 수 있다. 이러한 방법을 사용할 경우, 내인성 프로모터의 발현을 직접적으로 관찰할 수 있을 뿐만 아니라 이에 대한 각종 처리 효과를 관찰할 수 있다.
세 번째, 첫 번째 방법에 대해 기재된 바와 같은 작제물을 배아 조직에 제공하여, 리포터 작제물 자체가 내인성인 형질전환된 유기체를 수득할 수 있다. 예를 들면, 문헌[참조: Fukumura, D., et al., Cell(1998) 94:715-725; 본원에 참조문헌 으로써 인용됨]에는 VEGF 프로모터 활성에 대한 리포터로서 GFP를 사용하는 형질전환된 마우스가 기재되어 있다.
3가지 방법 모두에 대한 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
2. 형광단
당해 분야에 공지된 어떠한 형광단도 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 바람직한 양태에서는, 특정 유전자의 프로모터에 작동적으로 연결된 형광단은 사람화된 형광단이다. 또한 바람직하게는, 상기 형광단은 그린 형광 단백질(GFP), 블루 형광 단백질(BFP) 또는 레드 형광 단백질(RFP)이다. 보다 바람직하게는, GFP가 사람화된 hGFP-S65T이다.
GFP를 암호화하는 본래의 유전자는 생물발광성 해파리 애쿠오레아 빅토리아로부터 클로닝하였다[참조: Morin et al., J Cell Physiol., 77:313-318(1972)]. 이 유전자를 입수하여 이용하는 것이 가능해짐으로써, GFP를 유전자 발현용 마커로서 사용할 수 있었다. GFP 자체는 분자량이 27kD인 283개 아미노산 단백질이다. 이는 이의 본래의 공급원으로부터 부가의 어떠한 단백질도 요구하지 않을 뿐만 아니라 형광을 발하기 위해 이의 본래의 공급원에서만 이용 가능한 기질이나 조인자도 요구하지 않는다[참조: Prasher et al., Gene, 111:229-233(1992); Yang et al., Nature Biotechnol., 14:1252-1256(1996); and Cody et al., Biochemistry, 32:1212-1218(1993)]. GFP 유전자의 돌연변이체가 발현을 증진시키고 여기 및 형광을 변화시키는데 유용한 것으로 밝혀졌다. GFP-S65T(65에서의 세린이 트레오닌으로 대체됨)가 본 발명의 방법에 특히 유용하고, 이는 490nm에서 단일 여기 피크 를 갖는다[참조: Heim et al., Nature, 373:663-664(1995); 및 미국 특허 제5,625,048호]. 기타 돌연변이체가 또한 문헌[참조: Delagrade et al., Biotechnology, 13:151-154(1995); Cormack et al., Gene, 173:33-38(1996); and Cramer et al., Nature Biotechnol., 14:315-319(1996)]에 기재되었다. 부가의 돌연변이체가 또한 미국 특허 제5,625,048호에 기재되어 있다. 적합한 변형에 의해, GFP에 의해 방출된 빛의 스펙트럼을 변화시킬 수 있다. 따라서, 용어 "GFP"가 본원에 사용되긴 하지만, 이러한 정의 내에 포함된 단백질이 외관상 반드시 그린일 필요는 없다. 각종 형태의 GFP는 그린 이외의 색상을 나타내고, 이들 역시 "GFP"의 정의 내에 속하며, 본 발명의 방법 및 물질에 유용하다. 또한, 본원에서의 "GFP"의 정의 내에 속하는 그린 형광 단백질이 기타 유기체, 예를 들면, 씨 팬지(sea pansy), 레닐라 레리포르미스(Renilla reriformis)로부터 분리하였다는 것을 인지해야 한다. 적합하고 편리한 어떠한 형태의 GFP 유전자도 본 발명에 사용할 수 있다. 일반적으로 GFP를 사용하여 세포를 표지시키는 기술이 미국 특허 제5,491,084호(상기 참조)에 기재되어 있다.
기타 GFP, BFP 및 RFP를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 예를 들면, 다음 유전자 뱅크 수탁 번호의 핵산에 의해 암호화된 그린 형광 단백질을 사용할 수 있다: U47949(AGP1); U43284; AF007834(GFPuv); U89686[사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 합성 그린 형광 단백질(cox3:GFPm-3) 유전자]; U89685[사카로마이세스 세레비지애 합성 그린 형광 단백질(cox3:GFPm) 유전자]; U87974[합성 작제물 변형된 그린 형광 단백질 GFP5-ER(mgfp5-ER)]; U87973[합성 작제물 변형된 그린 형광 단백질 GFP5(mgfp5)]; U87625[합성 작제물 변형된 그린 형광 단백질 GFP-ER(mgfp4-ER)]; U87624[합성 작제물 그린 형광 단백질 (mgfp4) mRNA]; U73901(애쿠오레아 빅토리아 돌연변이체 3); U50963(합성); U70495[가용성-변형된 그린 형광 단백질 (smGFP)]; U57609(향상된 그린 형광 단백질 유전자); U57608(향상된 그린 형광 단백질 유전자); U57607(향상된 그린 형광 단백질 유전자); U57606(향상된 그린 형광 단백질 유전자); U55763(향상된 그린 형광 단백질(egfp)); U55762(향상된 그린 형광 단백질(egfp)); U55761(향상된 그린 형광 단백질(egfp)); U54830(합성 이. 콜라이 Tn3-유도된 트랜스포손 그린 형광 단백질(GF)); U36202; U36201; U19282; U19279; U19277; U19276; U19281; U19280; U19278; L29345(애쿠오레아 빅토리아); M62654(애쿠오레아 빅토리아); M62653(애쿠오레아 빅토리아); AAB47853((U87625) 합성 작제물 변형된 그린 형광 단백질 (GFP-ER)); AAB47852((U87624) 합성 작제물 그린 형광 단백질).
유사하게, 다음 유전자 뱅크 수탁 번호의 핵산에 의해 암호화된 블루 형광 단백질을 사용할 수 있다: U70497(가용성-변형된 블루 형광 단백질(smBFP)); 1BFP(그린 형광 단백질의 블루 변이체); AAB16959(가용성-변형된 블루 형광 단백질).
또한 유사하게, 다음 유전자 뱅크 수탁 번호의 핵산에 의해 암호화된 레드 형광 단백질을 사용할 수 있다: U70496(가용성-변형된 레드-이동된 그린 형광 단백질(smRSGFP)); AAB16958(U70496 가용성-변형된 레드-이동된 그린 형광 단백질).
시간에 따라 색상을 변화시키는 발색단이 본원에 참조문헌으로써 삽입된 문헌[참조: Teiskikh, A., et al., Science(2000) 290:1585-1588]에 보고되었다. 이 로써, 시간 의존적 발현을 추적할 수 있다.
3. 다세포 유기체
본 발명의 방법은 적합한 모든 다세포 유기체에서 유전자 발현을 모니터하는데 사용할 수 있다. 바람직한 양태에서는, 분석하고자 하는 다세포 유기체가 식물 또는 동물(형질전환된 동물 포함)이다. 보다 바람직하게는, 동물이 사람을 포함한 포유류이다. 본 발명의 모니터링 방법에 의해 분석할 수 있는 동물로는 마우스, 랫트, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 암소, 황소, 양, 염소, 말, 원숭이 및 기타 비-사람 영장류가 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
4. 조직 또는 기관 특이적 유전자 발현
본 발명의 방법은 조직 또는 기관 특이적 방식으로 발현되는 유전자의 발현을 모니터하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 방법은 특정 유전자의 발현 패턴이 조직 및/또는 기관의 건강 및/또는 기능성과 연관이 있는 경우에, 이들 조직 및/또는 기관의 건강 및/또는 기능성을 모니터하는데 사용할 수 있다. 바람직하게는, 모니터하고자 하는 유전자가 연결, 상피, 근육 또는 신경 조직에서 발현된다. 또한 바람직하게는, 모니터하고자 하는 유전자가 눈의 부속 기관, 환나선형 기관, 청각 기관, 치비츠(Chievitz)기관, 뇌실주위 기관, 코르티(Corti) 기관, 임계 기관, 법랑질 기관, 말단 기관, 외부 암컷 생식기, 외부 수컷 생식기, 부낭 기관, 루피니(Ruffini)의 플라워-스프레이 기관, 생식기, 골기(Golgi) 건 기관, 미각 기관, 청력 기관, 내부 암컷 생식기, 내부 수컷 생식기, 삽입 기관, 야콥슨(Jacobson) 기관, 신경혈액 기관, 신경건 기관, 후각 기관, 이석 기관, 하수 기관, 로젠뮐러(Rosenmuller) 기관, 감각 기관, 후각 기관, 나선형 기관, 부교련 기관, 뇌궁하부(subfornical) 기관, 과잉 기관, 촉감 기관, 표적 기관, 미각 기관, 촉각 기관, 뇨 기관, 종말판 혈관 기관, 진정 기관, 진정와우 기관, 흔적 기관, 시력 기관, 시각 기관, 서비골 기관, 유주 기관, 웨버(Weber) 기관, 및 주케르칸들(Zuckerkandl) 기관에서 발현된다. 보다 바람직하게는, 모니터하고자 하는 유전자가 내부 동물 기관, 예를 들면, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선, 내부 혈관 등에서 발현된다.
기타 양태에서는, 형광단, 예를 들면, GFP, BFP 또는 RFP가 동물에서 조직 특이적 유전자 발현을 모니터하기 위해 조직 특이성을 나타내는 다음 동물 전사 조절 영역에 작동적으로 연결될 수 있다: 췌장 포상 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역[참조: Swift et al., Cell 38:639-646(1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409(1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515(1987)]; 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역[참조: Hanahan et al., Nature 315:115-122(1985)]; 림프계 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역[참조: Grosschedl et al., Cell 38:647-658(1984); Adams et al., Nature 318:533-538(1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444(1987)]; 고환, 유방, 림프계 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 조절 영역[참조: Leder et al., Cell 45:485-495(1986)]; 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역[참조: Pinckert et al., Genes and Devel. 1:268-276(1987)]; 간에서 활성인 알파-페토프로테인 유전자 조절 영역[참조: Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648(1985); Hammer et al., Science 235:53-58(1987)]; 간에서 활성인 알파-1 안티트립신 유전자 조절 영역[참조: Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171(1987)]; 골수성 세포에서 활성인 베타 글로빈 유전자 조절 영역[참조: Mogram et al., Nature 315:338-340(1985); Kollias et al., Cell 46:89-94(1986)]; 뇌의 희돌기교세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 영역[참조: Readhead et al., Cell 48:703-712(1987)]; 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역[참조: Sani, Nature 314:283-286(1985)]; 및 시상하부의 성선자극 세포에서 활성인 성선자극성 방출 호르몬 유전자 조절 영역[참조: Mason et al., Science 234:1372-1378(1986)].
5. 종양 또는 암 관련 유전자 발현
본 발명의 방법은 종양 또는 암에서 특이적으로 발현되는 유전자의 발현을 모니터하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 분석하고자 하는 유전자가 종양 또는 암 관련 유전자, 예를 들면, 온코진 또는 종양 억제인자 유전자이다. 예를 들면, 다음 표 1에 열거된 온코진의 발현을 본 발명의 방법에 의해 모니터할 수 있다.
| 두문자어(Acronym) | 바이러스 | 종 | 종양 기원 | 주해 |
| abl | 아벨슨 백혈병 | 마우스 | 만성 골수성 백혈병 | TyrPK(src) |
| erbA | 적모구증 | 닭 | 사람 글루코코르티코이드 수용체와 동족체 | |
| erbB | 적모구증 | 닭 | TryPK EGF/TGFc 수용체 | |
| ets | E26 골수아세포증 | 닭 | 핵 | |
| fes(fps)a | 스나이더-텔른 육종 | 고양이 | TryPK(src) | |
| 가드너-아른스타인 육종 | ||||
| fgr | 가드너-래쉬드 육종 | 고양이 | TyrPK(src) | |
| fms | 맥도노프 육종 | 고양이 | TyrPK CSF-1 수용체 | |
| fps(fes)a | 후지나미 육종 | 닭 | TyrPK(src) | |
| fos | FBJ 골육종 | 마우스 | 핵, TR | |
| hst | NVT | 사람 | 위 종양 | FGF 동족체 |
| intl | NVT | 마우스 | MMTV 유발 암종 | 핵, TR |
| int2 | NVT | 마우스 | MMTV-유발 암종 | FGF 동족체 |
| jun | ASV17 육종 | 닭 | 핵, TR | |
| hit | 하디-주커만 4 육종 | 고양이 | TyrPK GFRL | |
| B-lym | NVT | 닭 | 부르잘 림프종 | |
| mas | NVT | 사람 | 표피 암종 | 안지오텐신 II에 대한 반응 강화 |
| met | NVT | 마우스 | 골육종 | TyrPK GFR L |
| mil(raf)b | 밀 힐 2 급성 백혈병 | 닭 | Ser/ThrPK | |
| mos | 몰로니 육종 | 마우스 | Ser/ThrPK | |
| myb | 골수아세포증 | 닭 | 백혈병 | 핵, TR |
| myc | MC29 골수구종증 | 닭 | 림프종 | 핵, TR |
| N-myc | NVT | 사람 | 신경모세포종 | 핵 |
| neu(ErbB2) | NVT | 랫트 | 신경모세포종 | TryPK GFR L |
| ral(mil)b | 3611 육종 | 마우스 | Ser/ThrPK | |
| Ha-ras | 하비 뮤린 육종 | 랫트 | 방광, 포유류 및 피부 암종 | GTP-결합 |
| Ki-ras | 키르스텐 뮤린 육종 | 사람 | 폐, 결장 암종 | GTP-결합 |
| N-ras | NVT | 사람 | 신경모세포종, 백혈병 | GTP-결합 |
| rel | 세망 내피증 | 칠면조 | ||
| ros | UR2 | 닭 | TyrPK GFR L | |
| sis | 시미안 바이러스 | 원숭이 | 하나의 PDGF 쇄 | |
| src | 라우스 육종 | 닭 | TyrPK | |
| ski | SKV770 | 닭 | 핵 | |
| trk | NVT | 사람 | 결장암종 | TyrPK GFR L |
| yes | Y73, Esh 육종 | 닭 | TyrPK(src) |
유사하게, 다음 종양 억제인자 유전자의 발현을 본 발명의 방법에 의해 모니 터할 수 있다: p16, p21, p27, p53, RB, WT-1, DCC, NF-1 및 APC.
비정상적으로 높은 수준의 온코진 발현과 비정상적으로 낮은 수준의 종양 억제인자 유전자 발현이 종종 종양 발생의 우수한 지시인자이기 때문에, 본 발명의 방법은 암을 예후 또는 진단하고, 종양 발생을 모니터하며 암 치료법의 효능을 평가하는데 사용할 수 있다.
C. 질병 또는 장애를 치료하기 위한 후보 프로토콜 또는 약물을 평가하는 방법
본 발명의 방법은 특정한 조절 서열에 대해 유전자 발현을 평가하기 때문에, 각종 화합물, 처리(예: 조사) 또는 유전적 환경의 기타 혼란의 효과를 대상으로 하여, 본 발명의 방법을 사용하여 이들의 발현에 대한 효과를 평가할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 유전자 독성제를 동정할 수 있다.
특정한 양태에서는, a) 특정 질병 또는 장애와 연관된 유전자의 프로모터의 지시하에 형광단을 발현하는 비-사람 포유류 대상체에게 후보 프로토콜 또는 약물을 투여한 다음, 전신 외부 형광 광학 영상화에 의해 상기 포유류 대상체 내의 각종 위치에서 상기 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 관찰함으로써 상기 프로모터의 발현도를 측정하는 단계; b) 상기 유전자의 프로모터의 지시하에 상기 형광단을 발현하는 대조군 비-사람 포유류 대상체에서, 전신 외부 형광 광학 영상화에 의해 상기 포유류 대상체 내의 각종 위치에서 상기 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 관찰함으로써 상기 프로모터의 발현도를 측정하는 단계; 및 c) 상기 단계 a)와 b)에서 측정된 프로모터의 발현도를 비교하는 단계[단계 a)에서 측정된 발현도는 단계 b)에서 측정된 발현도와 상이하고, 이는 상기 프로토콜 또는 약물이 해당 질병 또는 장애를 치료하는데 유효하다는 것을 확인시켜 준다]를 포함하는, 질병 또는 장애를 치료하기 위한 후보 프로토콜 또는 약물을 평가하는 방법이 제공된다.
바람직한 양태에서는, 유전자의 과발현이 해당 질병 또는 장애와 연관이 있고, 상기 프로토콜 또는 약물이 해당 질병 또는 장애를 치료하는데 유효한 경우, 단계 a)에서 측정된 발현도가 단계 b)에서 측정된 발현도 보다 낮다.
또 다른 바람직한 양태에서는, 유전자의 발현 저하가 해당 질병 또는 장애와 연관이 있는 경우, 상기 프로토콜 또는 약물이 감염을 치료하는데 유효한 경우, 단계 a)에서 측정된 발현도가 단계 b)에서 측정된 발현도 보다 높다.
또 다른 바람직한 양태에서는, 특정 질병 또는 장애와 연관된 유전자의 프로모터의 지시하에 형광단을 발현하는 비-사람 포유류 대상체는 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 형광단을 암호화하는 핵산 또는 이러한 핵산을 함유하는 세포를 상기 비-사람 포유류 대상체에게 전달함으로서 생성된다(상기 섹션 B 참조).
어떠한 비-사람 포유류 대상체도 본 발명의 스크리닝 방법에 사용할 수 있다. 바람직하게는, 당해 스크리닝에 사용된 비-사람 포유류 대상체는 널리 확증된 실험용 동물, 예를 들면, 마우스, 토끼 또는 비-사람 영장류이다. 또한, 바람직하게는, 당해 스크리닝에 사용된 비-사람 포유류 대상체는 감염성 질병에 걸린 동물 모델이다. 또한 바람직하게는, 당해 스크린에 사용된 비-사람 포유류 대상체는 형 질전환된 동물이다.
섹션 B에 기재된 것을 포함한, 당해 분야에 공지된 어떠한 형광단도 본 발명의 스크리닝 방법에 사용할 수 있다. 바람직한 양태에서는, 당해 스크리닝에 사용된 형광단은 그린 형광 단백질(GFP), 블루 형광 단백질(BFP) 또는 레드 형광 단백질(RFP)이다.
본 발명의 방법을 사용하여 공지된 모든 질병 또는 장애를 치료하기 위한 후보 프로토콜 또는 약물을 스크리닝할 수 있다. 바람직한 양태에서는, 스크리닝하고자 하는 상기 질병 또는 장애가 암, 면역계 질병 또는 장애, 대사 질병 또는 장애, 근육 및 뼈 질병 또는 장애, 신경계 질병 또는 장애, 시그날 질병 또는 장애, 및 수송체 질병 또는 장애이다.
또 다른 바람직한 양태에서는, 비-사람 포유류 대상체가 감염성 유기체의 프로모터의 지시하에 형광단을 발현하고 단계 a)에서 측정된 발현도가 단계 b)에서 측정된 발현도 보다 낮은데, 이는 상기 프로토콜 또는 약물이 이러한 감염성 유기체에 의해 유발된 감염을 치료하는데 유효하다는 것을 확인시켜 준다.
당해 스크리닝에 사용된 비-사람 포유류 대상체는 감염성 질병에 걸린 동물 모델이다.
스크리닝 대상의 감염성 유기체는 진균, 예를 들면, 효모, 세균, 예를 들면, 진성세균 또는 고세균, 또는 바이러스, 예를 들면, 클래스 I 바이러스, 클래스 II 바이러스, 클래스 III 바이러스, 클래스 IV 바이러스, 클래스 V 바이러스 또는 클래스 VI 바이러스이다.
감염을 치료하기 위한 약물 후보를 발견하기 위한 본 발명의 스크리닝 방법을 사용하여 어떠한 물질도 스크리닝할 수 있다. 바람직한 양태에서는, 조합 라이브러리가 당해 스크리닝 검정에 사용된다. 조합 라이브러리의 합성 방법 및 이러한 조합 라이브러리의 특징이 당해 분야에 공지되어 있다[참조: Combinatorial Libraries: Synthesis, Screening and Application Potential(Cortese Ed.) Walter de Gruyter, Inc., 1995: Tietze and Lieb, Curr. Opin. Chem. Biol., 2(3):363-71(1998); Lam, Anticancer Drug Des., 12(3):145-67(1997); Blaney and Martin, Curr. Opin. Chem. Biol., 1(1):54-9(1997); and Schultz and Schultz, Biotechnol. Prog., 12(6):729-43(1996)].
감염이 세균에 의해 유발된 경우, 적합한 약물 후보를 발견하기 위한 본 발명의 스크리닝 방법을 사용하여 공지된 항생제를 스크리닝할 수 있다. 바람직하게는, 스크리닝하고자 하는 항생제는 아미노글리코시드(예: 스트렙토마이신, 젠타마이신, 시소마이신, 토브라마이신, 아미카신), 안사마이신(예: 리파마이신), 항진균제 폴리엔(예: 니스타틴, 피마리신, 암포테리신 B, 페실로신), 벤조푸란 유도체(예: 그리세오풀빈), β-락탐 항생제 페니실린[예: 페니실린 G 및 이의 유도체, 경구용 페니실린, 페니실리나제-고정된 페니실린 광범위한 스펙트럼 페니실린, 프로테우스(Proteus) 및 슈도모나스(Pseudomonas)에 대한 페니실린 활성제], 세팔로스포린(예: 세팔로틴, 세팔로리딘, 세팔렉신, 세파졸린, 세포탁심), 클로람페니콜 그룹(예: 클로람페니콜, 티암페니콜, 아지드암페니콜), 이미다졸 플루코나졸, 이트라코나졸, 리노사미드(예: 린코마이신, 클린다마이신), 마크롤리드(예: 아지트로마 이신, 에리트로마이신, 올레안도마이신, 스피라마이신, 클라리트로마이신), 펩타이드, 펩톨리드, 폴리펩타이드(예: 폴리믹신 B 및 E, 바시트라신, 티로트리신, 카프레오마이신, 반코마이신), 퀴놀론(예: 날리딕스산, 오플록사신, 시프로플록사신, 노르플록신), 테트라사이클린(예: 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 미노사이클린, 독시사이클린) 및 기타 항생제(예: 포스포마이신, 푸시드산)이다.
D. 유전자 발현 조절제 및 조절인자를 스크리닝하는 방법
상기 언급된 스크리닝 방법을 사용하여, 유전자 발현 조절제, 즉 다세포 유기체에서 표적 유전자의 발현을 조정하는 트랜스-작용성 물질, 또는 조절인자, 즉 표적 유전자의 발현을 조절하는 다세포 유기체의 시스-작용성 유전자를 동정할 수도 있다. 질병 또는 장애 치료용 프로토콜 또는 약물을 동정하는 것 이외에도, 본원에 기재된 스크리닝 방법은 산업, 농업, 환경 보호 및 기타 많은 분야에서 광범위하게 적용된다. 예를 들면, 형질전환된 동물(예: 형질전환된 황소)가 상업적으로 사용되고 있다. 형질전환된 유전자의 발현을 증가시키는 적합한 물질을 발견하는 것이 요망되고 이러한 물질을 동물 사료에 가할 수 있다. 유사하게, 표적 형질전환된 유전자의 발현을 증진시키는 형질전환된 암소 내의 유전자(들)를 발견 및 변형시키는 것이 요망된다.
일단 표적 유전자의 발현 수준을 변화시키기로 결정한 경우에는, 형광단을 이러한 표적 유전자의 프로모터 또는 기타 전사 조절 영역에 작동적으로 연결한 다음, 다세포 유기체에서 발현시킬 수 있다. 이어서, 이러한 형광단을 발현하는 다세포 유기체를 시험 물질로 처리하여, 형광단 발현을 조정하는 물질을 동정할 수 있다. 또 다른 한편, 형광단을 발현하는 다세포 유기체 자체를 돌연변이처리하여, 그 자체 내에서 형광단 발현을 변화시키는 유전자를 동정할 수 있다. 이러한 스크리닝 원리들은 세균 또는 효모와 같은 단세포성 유기체에서 유전자 발현의 시스- 또는 트랜스-작용성 조절인자를 동정하기 위해 오래전부터 사용하여 왔다. 그러나, 신속하고도 간단한 스크리닝 방법이 없기 때문에, 이러한 스크리닝은 식물 및 동물과 같은 다세포 유기체에 대해서는 실제적이지 못하다. 본원에 기재된 유전자 발현의 전신 외부 광학 영상화로 인해, 이러한 스크리닝 또는 돌연변이체-하운트(haunt)가 다세포 유기체에 대해 실제적으로 사용될 수 있다.
특정한 양태에서는, a) 특정 유전자의 프로모터의 지시하에 형광단을 발현하는 비-사람 다세포 유기체에게 시험 물질을 투여한 다음, 전신 외부 형광 광학 영상화에 의해 상기 다세포 유기체 내의 각종 위치에서 상기 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 관찰함으로써 상기 프로모터의 발현도를 측정하는 단계; b) 상기 유전자의 프로모터의 지시하에 상기 형광단을 발현하는 대조군 다세포 유기체에서, 전신 외부 형광 광학 영상화에 의해 각종 위치에서 상기 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 관찰함으로써 상기 프로모터의 발현도를 측정하는 단계; 및 c) 상기 단계 a)와 b)에서 측정된 프로모터의 발현도를 비교하는 단계[단계 a)에서 측정된 발현도는 단계 b)에서 측정된 발현도와 상이하고, 이는 상기 시험 물질을 상기 유전자 발현의 조절제로서 동정해준다]를 포함하는, 다세포 유기체에서 상기 유전자 발현의 조절제를 스크리닝하는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 상기 프로모터가 다세포 유기체의 내인성 프로모터이다.
또 다른 특정한 양태에서는, a) 특정 유전자의 프로모터의 지시하에 형광단을 발현하는 비-사람 다세포 유기체에게 돌연변이-유발제 또는 처리제를 투여한 다음, 전신 외부 형광 광학 영상화에 의해 상기 다세포 유기체 내의 각종 위치에서 상기 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 관찰함으로써 상기 프로모터의 발현도를 측정하는 단계; b) 상기 유전자의 프로모터의 지시하에 상기 형광단을 발현하는 처리되지 않은 대조군 다세포 유기체에서, 전신 외부 형광 광학 영상화에 의해 각종 위치에서 상기 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 관찰함으로써 상기 프로모터의 발현도를 측정하는 단계; 및 c) 상기 단계 a)와 b)에서 측정된 프로모터의 발현도를 비교하는 단계[단계 a)에서 측정된 발현도는 단계 b)에서 측정된 발현도와 상이하고, 이는 상기 유전자를 변화된 수준으로 발현하는 다세포 유기체를 동정해준다]를 포함하는, 상기 유전자를 변화된 수준으로 발현하는 다세포 유기체를 스크리닝하는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 상기 돌연변이-유발제 또는 처리제가 다세포 유기체의 생식선 세포에서의 돌연변이를 유발시켜, 목적하는 돌연변이가 상기 다세포 유기체의 자손에게 안정적으로 전이될 수 있도록 한다.
또한, "빅 블루(Big Blue)" 형질전환된 마우스에 대해 당해 분야에 기재된 각종 프로토콜을 본 발명의 시스템에 활용할 수 있다.
다음 실시예는 단지 예시 목적일 뿐이며 이로써 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다.
실시예 1
아데노바이러스를 사용한 각종 조직에서의 유전자 발현의 가시화
암컷 누드/누드, 누드/+, 또는 C57BL/6의 6주령 숫컷 마우스 4마리를 사용하였다. 모든 동물 연구는 승인 번호 A3873-1 하에 동물 보호 및 사용에 관한 국립 보건원 안내에 요약된 원리와 과정에 따라서 수행하였다. 마우스에게 오토클레이브된 실험용 설치류 식이(Tecklad LM-485, Western Research Products, Orange, CA)를 공급하였다.
이용된 벡터는 향상된 GFP와 앰피실린 내성 유전자를 발현하는 아데노바이러스(vAd) 벡터 AdCMV5GFPAE1/AE3[vAd-그린 형광 단백질(GFP)][Quantum, Montreal, Canada]이었다.
상기 벡터를 각종 조직에 제공하여, 이들 조직에서의 CMV 프로모터의 발현을 가시화하였다. 목적하는 모든 프로모터의 조절 하에서의 리포터의 발현은, 상기 언급된 바와 같이, 상기 벡터를 적당히 변형시킴으로써 가시화할 수 있다.
간: 복부 상단 중선을 절개한 다음 문맥 정맥을 노출시킨 후, 1ml 39G1 라텍스-무함유 주사기(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 사용하여, 마우스당 총 용적 100㎕(8 x 1010pfu/ml)의 vAd-GFP를 상기 문맥 정맥에 주사하였다. 문맥 정맥의 구멍을 멸균 면으로 약 10초 동안 눌러 출혈을 멈추게 하였다. 한겹의 7-0 수술 봉합사를 이용하여 복부 벽 절개선을 봉합하였다. 수술 동안 동물을 케타민으로 마취시켰다. 상기 언급된 수술 과정 모두는 7X 배율 현미경[Leica MZ6, Nussloch, Germany]를 사용하여 수행하였다. 동물들은 HEPA 여과 하의 보호 시설에 두었다.
뇌: 두피 상단 중선을 절개한 후에 두개골의 정수리 뼈를 노출시켰다. 1ml 27G1/2 라텍스-무함유 주사기(Becton Dickinson)를 사용하여, 마우스당 8 x 1010 플라크 형성 단위(pfu)/ml vAd-GFP를 함유하는 20마이크로리터를 상기 뇌에 주사하였다. 상기 두개골의 구멍을 골 왁스(bone wax)로 막았다. 한겹의 7-0 수술 봉합사를 이용하여 두피 절개선을 밀봉하였다. 수술 동안 동물을 이소플루오란으로 마취시켰다.
췌장: 복부 상단 중선을 절개한 후에 췌장을 노출시켰다. 1ml 30G1/2 라텍스-무함유 주사기(Becton Dickinson)를 사용하여, 마우스당 8 x 1010 pfu/ml vAd-GFP를 함유하는 100마이크로리터를 상기 췌장에 주사하였다. 상기 구멍을 멸균 면으로 약 10초 동안 눌러 지혈시켰다. 한겹의 7-0 수술 봉합사를 이용하여 절개선을 봉합하였다. 수술 동안 동물을 케르셀(Kersel)로 마취시켰다. 상기 언급된 수술 과정 모두는 7X 배율 입체 현미경을 사용하여 수행하였다.
전립선: 복부 하단 중선을 절개한 후에 방광과 전립선을 노출시켰다. 1ml 30G1/2 라텍스-무함유 주사기(Becton Dickinson)를 사용하여, 마우스당 8 x 1010 pfu/ml vAd-GFP를 함유하는 30마이크로리터를 상기 전립선에 주사하였다. 상기 전립선 내의 구멍을 멸균 면으로 약 10초 동안 눌러 지혈시켰다. 한겹의 6-0 수술 봉합사를 이용하여 복부 벽 절개선을 봉합하였다. 수술 동안 동물을 이소플루오란으로 마취시켰다. 상기 언급된 수술 과정 모두는 7X 배율 입체 현미경를 사용하여 수행하였다.
골수: 골수 주사를 위해, 이소플루오란을 흡입시켜 동물을 마취시켰다. 뒷다리 상의 피부를 1cm 절개하여 경골을 노출시켰다. 이어서, 라텍스-무함유 주사기(Becton Dickinson)의 27-게이지 바늘을 상기 골수 강에 삽입하였다. 마우스당 총 용적 20㎕(8 x 1010pfu/ml)의 vAd-GFP를 상기 골수 강에 주사하였다. 상기 뼈의 구멍을 골 왁스로 막고, 6-0 수술 봉합사를 이용하여 절개선을 봉합하였다.
가시화: 고배율로 가시화하기 위해, 50-W 수은 램프가 장착된 레이카(Leica) 형광 입체 현미경 모델 LZ12를 사용하였다. D425/60 밴드-패스 필터와 470 DCXR 이색성 거울을 통하여 GFP를 선택적으로 여기시켰다. 하마마쓰(Hamamatsu) C5810-3-칩 냉각 색 변화-커플링된 장치 카메라(Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater, NJ) 상의 롱-패스 필터 GG475(Chroma Technology, Brattleboro, VT)를 통하여 방출된 형광을 수집하였다. 대비와 밝기에 따라 상을 현상하고, IMAGE PRO PLUS 3.1 소프트웨어(Media Cybernetics, Silver Springs, MD)를 사용하여 이를 분석하였다. 1,024 x 724 픽셀의 상을 IBM PC에 직접 포착하거나, 또는 고해상 소니 VCR 모델 SLV-R-1000(Sony, Tokyo) 상의 비디오 출력을 통하여 지속적으로 포착하였다.
전체 동물을 가시화시킨 보다 저배율에서의 영상화는, 블루 광섬유 광학기기(Lightools Research, Encinitas, CA)에 의해 발광된 광박스에서 수행하고, 상기 언급된 바와 같이 열전기적 냉각된 색 변화-커플링된 장치 카메라를 사용하여 영상화하였다.
정량화: GFP 형광 강도는 시간에 따라 영상화 영역을 가로지르는 여기성 발광 변수를 고려하여 측정한다. 이들 인자는 GFP에 의해 야기된 고유 그린 형광에 비해 증가된 것을 교정하기 위한 기선으로서 마우스 피부의 고유 레드 형광을 사용함으로써 교정한다. GFP 광도에서는 레드 발광이 비교적 거의 없기 때문에, 상기와 같이 수행할 수 있다. 결과적으로, 그린 형광은 피부 영상 내의 레드 및 그린 채널 조성에 기준한 레드와 비교하여 계산하였다. 그린 대 레드 채널 비(γ)는 GFP 존재 및 부재하에 피부 영상 내의 각 픽셀에 대해 결정하였다. GFP 부재하의 영상 전반에 걸친 마우스 피부에 대한 γ값은 상당히 일정한데, 이는 0.7 내지 1.0이었다. 해당 동물 내의 GFP 형광 분포도는 레드 성분에 비해 그린 성분을 증가시켰는데, 이는 높은 γ값에 반영되었다. GFP 형광의 총 양은 γ값이 1 보다 큰 픽셀 수에 각 픽셀의 γ값을 곱함으로써 대략적으로 산정하였다. 이러한 결과는 GFP 부재하에 피부에 대한 γ최대값 보다 큰 통합 GFP 형광[τGFP]에 대략 상응한다. GFP 부재하에 γ값이 >1.0인 마우스 피부 영상 내의 픽셀 수는 0.02% 미만이고, GFP 발현에 따라 증가하였다. [τGFP] 값은 바이러스 주사 후의 시간의 함수로서 뇌 및 간 각각에 대해 도 1A 및 1B에 제시되어 있다.
살아 있는 본래 동물에 대해 고배율로 사진찍은 각종 기관의 상, 또는 사망후 해부하여 직접 관찰한 유사한 기관을 비교하였다. 이들 상은 유전자 발현이 각종 기관에 분포되어 있다는 것을 보여준다. 모든 경우에 있어, 외부적으로 만들어진 상은 노출된 기관의 상과 유사하다.
살아 있는 동물을 광박스에서 관찰한 경우, 해당 유전자의 발현을 모니터하는 것이 또한 가능한데, 이로써 살아 있는 동물과 이러한 동물 내에서 일어나고 있는 바와 같은 발현을 실시간으로 관찰할 수 있다. 예를 들면, 72시간째에 누드 마우스 간에서 획득한 GFP 발현의 광박스 결정치는 이러한 결과를 명확히 제시해준다. 유전자 전달한지 24시간 후에 누드 마우스 뇌에서도 유사한 결과가 관찰된다. 이 방법은 피부 아래 0.8mm 깊이에서 마우스 간에서의 GFP 형광 강도가 노출된 기관의 약 25%라는 점에서 다소 민감하다. GFP 발현 기관의 평균 형광이 이를 둘러싸고 있는 피부의 평균 형광의 20% 이상인 경우에는 유전자 발현이 외부적으로 측정 가능하고, GFP 발현의 최대 수준에서는, 상기 간에서의 강도가 등뒤 형광 및 복부 피부 형광 강도를 100배 이상 초과하였다.
실시예 2
렌티바이러스 벡터를 이용한 유전자의 가시화
렌티바이러스 벡터는 시험관내에서 광범위한 스펙트럼의 비분열 세포, 예를 들면, 뉴런, 망막, 간, 근육 및 조혈 줄기 세포를 형질도입하는 것으로 밝혀졌다[참조: Naldini, L. et al., Science (1996) 272:263-267; Kafri T. et al., Nat. Genet (1997) 17:314-317; Takahashi, M. et al., J. Virol (1999) 73:7812-7816; Miyoshi, H. et al., Science (1999) 283:682-686]. 간세포가 세포 주기 내로 진행되지 않는다면, 이들 세포는 렌티바이러스 형질도입에 반응하지 않는 것으로 보고되었지만[참조: Park, F. et al., Nat. Genet (2000) 24:49-52], 발현 가시화를 위해 렌티바이러스 유전자를 간에 전달하는 것이 실제적이라는 것이 다음에 나타나 있다.
HIV1 이용한 렌티바이러스 벡터(GFP-LV로 명명됨)를 사용하였다. 이 벡터는 U-3 영역 내의 자가-불활성화 돌연변이물, 전사후 요소 및 내부 CMV 프로모터를 함유한다. 이는 cppt, 즉 HIV-pol로부터 유도된 중앙 폴리퓨린 트랙 및 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 전사후 요소(WPRE)를 함유하기도 한다. 이 벡터의 다이아그램이 도 2A에 도시되어 있다.
1 x 109IU의 벡터 GHP-LV를 누드 마우스(Hsd:asymic nude-nu)의 문맥 정맥 내로 주사하였다. 주사한지 6일 후, 도 2B에 도시된 바와 같이, 생체내 형광 광학 영상화를 이용하여 그린 형광을 간에서 시험할 수 있었다. 21일째, 상기 벡터가 주사된 마우스의 간의 모든 로브는 균일한 그린 형광을 나타내었다.
1 x 109IU의 GHP-LV를 또한 복강내 주사하고, 이 방법을 수행한 결과, 간 및 비장에서 높은 수준으로 형질도입되었다.
웨스턴 블롯(Western blot) 결과, 0.5 내지 2.5 x 109IU의 범위에서 GFP 발현의 용량 의존성이 입증되었다. 주사한지 3주 후의 간에서의 벡터 통합은 PCR로써 확인되었다.
분할 세포를 표지하기 위해 5'브로모-2'데옥시우리딘(BrdU) 15mgs/kg을 매일 복강내 주사함으로써, 상기와 같이 형질도입된 세포가 신속하게 분할하지 않는다는 것을 확인하였다. 십이지장 내의 세포가 높은 표지화를 보여주긴 하지만, 간 세포의 약 3% 만이 대조군 또는 렌티바이러스-처리된 간에서 BrdU 양성이었다.
실시예 3
부가의 적용 분야
실시예 1 및 2에 예시된 과정 이외에도, 본 발명의 방법을 사용하여, 예를 들면, 문헌[참조: Niwa, M., et al., Cell(1999) 99:691-702; 이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]에 기재된 바와 같이, 폴딩되지 않은 단백질 반응(UPR)에 의해 조절되는 대조군 서열의 발현을 모니터할 수 있다. 또 다른 적합한 연구용 표적은 문헌[참조: Yamaguchi, S., et al., Nature(2001) 409:684; 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]에 기재된 덜 편리한 기술을 사용하여 연구해 온 약 24시간 주기 리듬 조절 유전자이다.
당업자에게는 여러 변형들이 명백하기 때문에, 본 발명은 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한된다.
Claims (52)
- a) 비-사람 다세포 동물에게, 발현을 촉진하는 능력을 분석하고자 하는 내인성 유전자의 프로모터에 작동적으로 연결된 형광단을 암호화하는 핵산을 전달하거나 이러한 핵산을 함유하는 세포를 전달하는 단계; 및b) 전신 외부 형광 광학 영상화(whole-body external fluorescent optical imaging)에 의해 상기 동물 내의 각종 위치에서 상기 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 관찰함으로써, 발현을 촉진하는 상기 프로모터의 능력을 모니터하는 단계를 포함하고, 이때 상기 형광단이 자체 형광성이어서 이것이 형광 발생하는데 있어 기질 또는 조인자를 필요로 하지 않는 단백질인, 비-사람 다세포 동물에서 상기 프로모터 조절하에 있는 내인성 유전자의 발현을 촉진하는 프로모터의 능력을 모니터하는 방법.
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- 제1항에 있어서, 핵산을 함유하는 세포가 외과적 수술을 통하여 비-사람 다세포 동물에게 전달되는 방법.
- 제6항에 있어서, 세포가 외과적 정국소 이식(SOI)에 의해 목적하는 부위로의 직접 이식을 통해 비-사람 다세포 동물에게 전달되는 방법.
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- a) 내인성 유전자의 프로모터의 지시하에 형광단을 발현하는 비-사람 다세포 동물에게 시험 물질을 투여한 다음, 전신 외부 형광 광학 영상화에 의해 상기 다세포 동물 내의 각종 위치에서 상기 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 관찰함으로써 상기 프로모터의 발현도를 측정하는 단계;b) 상기 유전자의 프로모터의 지시하에 상기 형광단을 발현하는 대조군 비-사람 다세포 동물에서, 전신 외부 형광 광학 영상화에 의해 각종 위치에서 상기 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 관찰함으로써 상기 내인성 프로모터의 발현도를 측정하는 단계; 및c) 상기 단계 a)와 b)에서 측정된 프로모터의 발현도를 비교하는 단계를 포함하고, 이때 상기 시험 물질이 상기 유전자 발현을 조정하는 경우, 단계 a)에서 측정된 발현도는 단계 b)에서 측정된 발현도와 상이하고, 상기 형광단이 자체 형광성이어서 이것이 형광 발생하는 데 있어 기질 또는 조인자를 필요로 하지 않는 단백질인, 비-사람 다세포 동물에서 유전자 발현 조절제를 스크리닝하는 방법.
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- a) 내인성 유전자의 프로모터의 지시하에 형광단을 발현하는 비-사람 다세포 동물에게 돌연변이-유발제를 투여하거나 돌연변이 처리한 다음, 전신 외부 형광 광학 영상화에 의해 상기 다세포 동물 내의 각종 위치에서 상기 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 관찰함으로써 상기 프로모터의 발현도를 측정하는 단계;b) 상기 유전자의 프로모터의 지시하에 상기 형광단을 발현하는 처리되지 않은 대조군 다세포 동물에서, 전신 외부 형광 광학 영상화에 의해 각종 위치에서 상기 형광단에 의해 발생된 형광의 존재, 부재 또는 이의 강도를 관찰함으로써 상기 내인성 프로모터의 발현도를 측정하는 단계; 및c) 상기 단계 a)와 b)에서 측정된 프로모터의 발현도를 비교하는 단계를 포함하고, 이때 상기 다세포 유기체가 이상 수준으로 상기 유전자를 발현하는 경우, 단계 a)에서 측정된 발현도는 단계 b)에서 측정된 발현도와 상이하고, 상기 형광단이 자체 형광성이어서 이것이 형광 발생하는데 있어 기질 또는 조인자를 필요로 하지 않는 단백질인, 이상 수준으로 유전자를 발현하는 비-사람 다세포 동물을 스크리닝하는 방법.
- 제39항에 있어서, 돌연변이-유발제의 투여 또는 돌연변이 처리가 당해 다세포 동물의 배선(germ line) 세포에서의 돌연변이를 유발시켜, 이러한 돌연변이가 상기 다세포 동물의 자손에게 안정적으로 전이될 수 있도록 하는 방법.
- 제1항, 제6항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 형광단이 그린 형광 단백질(GFP), 블루 형광 단백질(BFP) 및 레드 형광 단백질(RFP)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
- 제1항, 제6항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 마우스, 랫트, 토끼, 또는 비-사람 영장류인 방법.
- 제1항, 제6항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 유전자가 조직 또는 기관 특이적 방식으로 정상적으로 발현되는 방법.
- 제43항에 있어서, 조직이 연결 조직, 상피 조직, 근육 조직 및 신경 조직으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
- 제37항에 있어서, 형광단이 그린 형광 단백질(GFP), 블루 형광 단백질(BFP) 및 레드 형광 단백질(RFP)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
- 제37항에 있어서, 동물이 마우스, 랫트, 토끼, 또는 비-사람 영장류인 방법.
- 제37항에 있어서, 내인성 유전자가 조직 또는 기관 특이적 방식으로 정상적으로 발현되는 방법.
- 제47항에 있어서, 조직이 연결 조직, 상피 조직, 근육 조직 및 신경 조직으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
- 제39항 또는 제40항에 있어서, 형광단이 그린 형광 단백질(GFP), 블루 형광 단백질(BFP) 및 레드 형광 단백질(RFP)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
- 제39항 또는 제40항에 있어서, 동물이 마우스, 랫트, 토끼, 또는 비-사람 영장류인 방법.
- 제39항 또는 제40항에 있어서, 내인성 유전자가 조직 또는 기관 특이적 방식으로 정상적으로 발현되는 방법.
- 제51항에 있어서, 조직이 연결 조직, 상피 조직, 근육 조직 및 신경 조직으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
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