KR100835866B1

KR100835866B1 - 항산화 물질의 산화촉진 부작용을 감소시키는 방법

Info

Publication number: KR100835866B1
Application number: KR1020070001413A
Authority: KR
Inventors: 전희영; 김정기; 신현정; 이상준
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2007-01-05
Filing date: 2007-01-05
Publication date: 2008-06-09
Anticipated expiration: 2027-01-05

Abstract

본 발명은 항산화 물질의 산화촉진제로서의 부작용을 방지한 항산화 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 포도당을 포함한 단당류, 유당을 포함한 이당류 및 말티톨을 포함한 알코올당으로 이루어진 군으로부터 선택된 당류를 함유함으로써 항산화 물질의 산화촉진제(pro-oxidant)로서의 부작용을 억제하고 항산화 효과를 상승시킨 항산화 조성물에 관한 것이다.

당류, 항산화 물질, 자유기 소거제, 산화 촉진제, 노화 방지

Description

항산화 물질의 산화촉진 부작용을 감소시키는 방법{Method for preventing prooxidative side effects of antioxidant}

도 1은 본 발명의 시험예 1에 의한 트롤록스(trolox) 농도 변화에 따른 흡광도 저해율의 표준 곡선(standard curve)을 나타낸 그래프이다.

도 2는 단일 항산화 물질 투여에 따른 자유기 소거 활성의 변화를 나타낸 그래프이다(*: p-value<0.05, **: p-value<0.01).

도 3은 본 발명의 시험예 2에 의한 트롤록스(trolox) 농도 변화에 따른 흡광도 저해율의 표준 곡선(standard curve)을 나타낸 그래프이다.

도 4는 EGCG와 당류의 혼합 조성물 투여에 따른 자유기 소거 활성의 변화를 나타낸 그래프이다(*: p-value<0.05, **: p-value<0.01).

도 5는 EGCG와 당류의 혼합 처리에 따른 활성 산소 소거능을 피부 각질 세포주를 이용하여 평가한 그래프이다.

도 6은 gallic acid와 당류의 혼합 처리에 따른 활성 산소 소거능을 피부 각질 세포주를 이용하여 평가한 그래프이다.

도 7은 본 발명의 시험예 4에 의한 트롤록스(trolox) 농도 변화에 따른 흡광도 저해율의 표준 곡선(standard curve)를 나타낸 그래프이다.

도 8는 단일 항산화성 조성물과 당 혼합물의 혼합 처리에 따른 자유기 소거 활성의 변화를 나타낸 그래프이다(*: p-value<0.05, **: p-value<0.01).

본 발명은 항산화 물질의 산화촉진제로서의 부작용을 방지한 항산화 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 포도당을 포함한 단당류, 유당을 포함한 이당류 및 말티톨을 포함한 알코올당으로 이루어진 군으로부터 선택된 당류를 함유함으로써 항산화 물질의 산화촉진제(pro-oxidant)로서써의 부작용을 억제하고 항산화 효과를 상승시킨 항산화 조성물에 관한 것이다.

노화의 진행에 있어 산화적 스트레스가 중추적인 역할을 한다는 가설은 더 이상의 논란의 여지가 없을 만큼 널리 받아들여지는 사실이다. 산화적 스트레스는 에너지 대사과정, 면역 반응 등에서 필수 불가결하게 생성되며, 외부의 유해 환경에 의해서도 유발되는 활성 산소계(ROS, reactive oxygen species)에 의해 발생하는 피할 수 없는 자극으로 생체 내에는 이러한 자극을 소거, 완화하기 위한 항산화 시스템이 존재한다. 그러나 노화가 진행됨에 따라 이러한 항산화 시스템의 불균형이 초래되고 과도한 산화적 스트레스는 바람직하지 않은 연쇄반응을 일으켜 건강을 해치고, 암, 당뇨, 동맥경화, 혈전과 같은 각종 질병을 유발하기도 한다(Laure Rittie et al., Ageing Research Reviews, 1, 705-720, 2002; Heinrich U, Skin Pharm & Physiology, 19 224-231, 2006).

따라서 활성 산소계의 형성을 억제하거나, 형성된 활성 산소계를 제거하는 항산화 물질에 대한 관심이 날로 증가하고 있고 항산화 효능을 가지는 조성물에 대한 연구도 활발히 이루어지고 있다.

그러나 최근 들어 이러한 항산화 물질의 추가적인 섭취에 따른 부작용에 대한 보고가 점점 증가하고 있고, 단일 항산화제의 섭취를 지나치게 증가할 경우에는 오히려 일부 효소의 활성을 억제시키는 등의 부작용에 의해 체내에서 생성된 활성 산소를 적절하게 제거시키지 못하여 이들에 의한 조직의 손상을 유발할 수도 있다는 사실이 몇몇의 연구를 통해 보고되었다(Marta Wrona et al., Free Radical Biology & Medicine,, 35(10), 1319-1329, 2003; Eun Jeong Choi et al., Food and Chemical Toxicology, 43, 793-798, 2005). 그 예로, 강력한 항산화 효능을 가진 것으로 알려져 있는 퀘르세틴(quercetin)의 경우 6주동안 male sparague-Dawley rat에 20mg/kg을 투여하였을 때 체내 항산화 물질인 GSH(glutathione)의 함량을 낮추고 GR(glutathione reductase)의 활성을 저하시킴으로써 산화 촉진제(pro-oxidant)로서의 기능을 나타냄이 보고되었다(Choi EJ et al., Food and Chemical toxicology, 43, 793-798). 또 다른 항산화 물질인 카로틴의 경우 여러 연구를 통하여 부작용이 보고되었는데, 사람의 피부세포 실험을 통해 적정 용량 이상을 지속적으로 사용하였을 때 세포 내에서 산화촉진제(pro-oxidant)로 작용할 수 있음이 보고되었으며(Eichler O et al., Photochem. Photobiol., 75(5), 503-506, 2002), 임상실험을 통해서 역시 단일 물질로 사용시 예기치 못한 산화 촉진제로서의 성질을 나타내는 것이 확인되었다(Biesalski1 HK. and Obermueller-Jevic UC., Arch biochem biophys., 389, 1-6, 2001).

이처럼 항산화 물질의 체내 효용성에 대한 의문이 제기되면서 항산화제의 생체 내에서의 실제적인 작용을 평가하고 항산화제의 복용에 따른 부작용을 경감시키고자 하는 노력이 증가하고 있다.

당류는 에너지원이나 감미원으로써 항산화제에 첨가되는 형태로 항산화성 조성물에 활용되어왔다(일본특허 출원번호 제2001-320553호, 한국특허 출원번호 제 2005-0017865호). 현재까지 당류의 자체 항산화능의 유효성이 고지된 바가 없으나 클로로겐산(chlorogenic acid)에 첨가해 줌으로서 항산화 활성 항산화 활성을 향상시킨다는 것은 보고된 예가 있다(일본특허 제302700호). 그러나 in vivo상에서 나타날 수 있는 항산화 물질의 산화 촉진제로써의 부정적인 작용을 방지, 완화시켜주는 기능에 대해서는 고지된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 산화 촉진제로서의 부작용이 보고된 항산화 물질의 체내 항산화 활성 평가를 통하여 그들이 산화 촉진제로서 작용할 수 있음을 확인하고, 이를 당류와 함께 처리할 경우 산화 촉진제로서의 부정적인 작용을 방지할 수 있을 뿐 아니라, 항산화 물질을 단독으로 사용했을 때보다 항산화 효과의 상승 작용이 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 항산화 물질의 산화촉진제로서의 부정적인 작용을 방지하고 항산화 효과를 상승시킬 수 있는 항산화 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항산화 물질을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 섭취 시 항산화 물질이 산화 촉진제로서 작용하는 부작용을 감소시키기 위해 유효한 양의 당류를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 효능의 효율성이 제고된 항산화성 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 기존의 비타민 C, 에피갈로카테킨-3-갈레이트(epigallocatechin-3-gallate;EGCG), 프로안토시아니딘(proanthocyanidin), 갈릭산(gallic acid) 등 산화 촉진제(pro-oxidant)로서의 부정적인 작용이 보고된 항산화 물질에 당류를 함유함으로써 상기 항산화 물질의 산화촉진제로서의 부작용을 방지하고 항산화 효과를 증진시킬 수 있다.

본 발명에 함유되는 당류는 포도당을 포함한 단당류, 유당을 포함한 이당류 및 말티톨을 포함한 알코올당으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항산화 조성물은 전체 조성물 내에 당류를 항산화 조성물 중량 대비 동량 이상이 사용되면 항산화 물질의 산화촉진제로서의 부작용을 방지해주는 기능을 유효하게 나타낸다.

이하, 시험예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 하지만 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

[ 시험예 1] 단일 항산화 물질 투여에 따른 혈액 항산화능의 변화

하기와 같은 방법으로 단일 항산화 물질 투여에 따른 혈액 내 자유기(free radical) 소거능의 변화를 평가하는 실험을 수행하였다.

단계 1. 실험동물과 시료의 준비와 처리

구체적인 실험 방법은, 실험 동물로 평균 체중 290~300g의 Sparague-Dawley계 수컷 흰쥐 30마리를 준비하고, 6마리씩 5그룹으로 나누어 각각 대조군과 실험군 1~4로 정하고, 일반 배합 사료로 1주일간 예비 사육한 후, 평가 24시간 전에 절식을 시킨 후, 하기 표 1에 의한 방법으로 준비한 시료 1~5를 표 2와 같은 방법으로 각 그룹에 경구 투여하였다.

구 분	내 용
시료 1	증류수에 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)를 5%w/v가 되도록 용해하였다.
시료 2	비타민 C를 90mg/ml이 되도록 5%w/vCMC 용액에 용해하였다.
시료 3	EGCG를 90mg/ml이 되도록 5%w/v CMC 용액에 용해하였다.
시료 4	프로안토시아니딘을 90mg/ml이 되도록 5%w/v CMC 용액에 용해하였다.
시료 5	갈릭산을 90mg/ml이 되도록 5%w/v CMC 용액에 용해하였다.

구 분	내 용
대조군	각각의 실험 동물에 시료 1을 1ml씩 경구 투여하였다.
실험군 1	각각의 실험 동물에 시료 2을 1ml씩 경구 투여하여 항산화 물질이 300mg/kg로 섭취되도록 하였다.
실험군 2	각각의 실험 동물에 시료 3을 1ml씩 경구 투여하여 항산화 물질이 300mg/kg로 섭취되도록 하였다.
실험군 3	각각의 실험 동물에 시료 4을 1ml씩 경구 투여하여 항산화 물질이 300mg/kg로 섭취되도록 하였다.
실험군 4	각각의 실험 동물에 시료 5을 1ml씩 경구 투여하여 항산화 물질이 300mg/kg로 섭취되도록 하였다.

단계 2. 혈액 샘플의 채취와 혈장(plasma) 분리

경구 투여 후 10분, 40분, 90분, 180분의 시간이 경과했을 때 각 실험군의 실험 동물로부터 안구의 혈관에서 혈액 샘플을 1ml씩 취하였으며 이를 원심분리기를 이용하여(3000rpm, 10분) 혈구와 혈장으로 분리하였고 상등액을 취하여 1.7ml 마이크로 E-튜브에 담아 분석 직전까지 냉동시켜 보관하였다.

단계 3. 혈장의 자유기 소거능 평가

ABTS(2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline 6-sulfonic acid))를 pH5.0인 0.05M의 인산염-구연산(phosphate-citrate) 버퍼에 최종 농도가 150μM이 되도록 첨가하여 ABTS 용액을 제조하였다. 상기 ABTS 용액에 과산화수소(H₂O₂)와 과산화효소(메트마이오글로빈)을 각기 75μM과 2.5μM이 되도록 첨가하여 반응시켜 ABTS 라디칼(ABTS^ㆍ＋)을 생성시켰다. 혈장 샘플 20μl를 180μl의 ABTS 라디칼 용액에 첨가하고 완전히 혼합한 후, 상온에서 차광을 시킨 후 60분간 반응시키고, 반응이 완료된 후 600nm에서 시료의 흡광도를 측정하였다. 이와 동시에 pH5.0인 0.05M의 인산염-구연산(phosphate-citrate) 버퍼에 트롤록스(trolox)를 최종농도가 10mM, 2mM, 1mM, 100μM, 10μM가 되도록 첨가하여 트롤록스 시료를 제조하여 상기 ABTS 라티칼 용액을 사용하여 위와 동일한 방법으로 반응시키고 흡광도를 측정하여 표준곡선(standard curve)을 작성하였고, 그 결과는 도 1에 나타내었다. 혈장샘플의 자유기 소거능은 작성된 표준곡선으로부터 도출된 수학식 1을 이용하여 TEAC(Trolox Equivalence Antioxidant Activity) 값으로 나타내었으며, 그 결과는 표 3과 도 2에 나타내었다.

※ TEAC는 평가 샘플의 자유기 소거능을 이와 동등한 활성을 발휘하는 트롤록스의 용량으로 표시해 주는 것으로 항산화 물질 간 활성의 상대비교가 가능하게 해주는 단위이다(Miller NJ. et al., Clinical Science, 84, 407-412, 1993).

시간(분)	10	40	90	180
대조군	0.0±5.1	0.0±10.9	0.0±12.8	0.0±18.9
실험군1	0.0±14.7	212.3±10.5	4.4±17.8	-71.2±9.8
실험군2	-56.6±20.9	69.2.6±4.8	-136.5±12.5	-109.3±11.8
실험군3	-8.6±5.8	90.6±9.9	-85.9±13.4	-152.6±9.4
실험군4	7.9±11.6	137.4±12.8	-65.4±14.7	-97.2±9.7

도 2에서 알 수 있듯이, 항산화 물질을 투여한 후 일정시간이 경과할 때까지는 자유기 소거 활성을 나타내지만 시간이 지남에 따라 산화촉진제로서 작용함을 알 수 있다.

[ 시험예 2] 당류와 항산화 물질의 혼합 조성물 투여에 따른 혈액 항산화능의 변화

시험예 1에서 항산화 물질이 생체 내에서 산화 촉진제로서 작용하는 것을 확인하였으므로 당류가 이러한 산화 촉진제로서의 부정적인 작용에 미치는 영향을 알아보기 위하여 당류와 항산화 물질의 혼합 조성물 투여에 따른 혈액 내 자유기 소거능의 변화을 평가하는 실험을 수행하였다.

단계 1. 실험동물과 시료의 준비와 처리

실험 동물의 준비는 상기 시험예 1과 같은 방법으로 준비하였고, 하기 표 4에 의한 방법으로 시료를 준비하여 표 5와 같은 방법으로 각 그룹에 경구 투여하였다.

구 분	내 용
시료 1	증류수에 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)를 5%w/v가 되도록 용해하였다.
시료 3	EGCG를 90mg/ml이 되도록 5%w/v CMC 용액에 용해하였다.
시료 6	EGCG와 포도당(glucose)이 각각 90mg/ml이 되도록 5%w/v CMC 용액에 용해하였다.
시료 7	EGCG와 유당(lactose)이 각각 90mg/ml이 되도록 5%w/v CMC 용액에 용해하였다.
시료 8	EGCG와 말티톨(maltitol)이 각각 90mg/ml이 되도록 5%w/v CMC 용액에 용해하였다.

구 분	내 용
대조군	각각의 실험 동물에 시료 1을 1ml씩 경구 투여하였다.
비교예 1	각각의 실험 동물에 시료 3을 1ml씩 경구 투여하여 EGCG가 300mg/kg로 섭취되도록 하였다.
실시예 1	각각의 실험 동물에 시료 6을 1ml씩 경구 투여하여 EGCG와 포도당(glucose)이 각각 300mg/kg로 섭취되도록 하였다.
실시예 2	각각의 실험 동물에 시료 7을 1ml씩 경구 투여하여 EGCG와 유당(lactose)이 각각 300mg/kg로 섭취되도록 하였다.
실시예 3	각각의 실험 동물에 시료 8을 1ml씩 경구 투여하여 EGCG와 말티톨(maltitol)이 각각 300mg/kg로 섭취되도록 하였다.

단계 2. 혈액 샘플의 채취와 혈장(plasma) 분리

상기 시험예 1과 같은 방법으로 혈장을 분리하여 냉동시켜 보관하였다.

단계 3. 혈장의 자유기 소거능 평가

혈장의 자유기 소거능 평가는 상기 시험예 1과 같은 방법으로 평가하였다. 이때 표준곡선(standard curve)을 작성하기 위한 트롤록스(trolox)의 시료는 0.05M의 인산염-구연산(phosphate-citrate) 버퍼에 트롤록스를 최종농도가 10mM, 5mM, 1mM, 100μM가 되도록 첨가하여 제조하여 시험예 1과 동일한 방법으로 반응시키고 흡광도를 측정하여 표준곡선(standard curve)을 작성하였고 그 결과는 도 3에 나타내었다. 혈장샘플의 자유기 소거능은 작성된 표준곡선(standard curve)으로부터 도출된 수학식 2을 이용하여 TEAC(Trolox Equivalence Antioxidant Activity) 값으로 나타내었으며, 그 결과는 표 6과 도 4에 나타내었다.

시간(분)	10	40	90	180
대조군	0.0±22.5	0.0±13.9	0.0±9.1	0.0±13.4
비교예 1	-56.6±20.9	69.2.6±4.8	-136.5±12.5	-109.3±11.8
실시예 1	61.8±10.6	124.2±12.6	178.6±19.7	22.1±5.3
실시예 2	64.7±7.1	76.9±15.6	127.3±11.9	130.7±8.6
실시예 3	72.2±12.1	125.6±13.8	42.3±9.7	27.2±5.5

도 4에서 알 수 있듯이 당류와 항산화 물질을 혼합하여 처리함으로써 항산화 물질을 단독으로 사용하였을 때 나타나는 산화 촉진제로서의 부정적인 작용을 방지할 뿐 아니라 자유기 소거 활성을 향상시키는 것을 확인하였다.

[ 시험예 3] 당류와 항산화 물질의 복합 처리에 따른 활성 산소 소거능 평가

시험예 2에서 항산화 물질과 당류를 혼합 사용하였을 때 항산화 물질이 산화 촉진제로서의 부정적인 작용을 방지되는 것을 확인하여 당류의 항산화 물질의 작용에 대한 영향성을 in vitro에서 UV에 의해 발생되는 활성 산소 소거능을 평가하는 실험을 통해 재차 평가하였다.

단계 1. 세포 배양과 물질 처리

본 실험에 사용한 Hacat 세포주(human keratinocyte cell line)는 Dr. N.E. Fusenig(Heidelberg, Germany)에게 기증 받아 사용하였으며, 10% FBS, 100IU/ml 페니실린과 100g/ml 스트렙토 마이신을 포함하는 DMEM(Dulbeccos Modification of Eagles Medium, Sigma Co.)을 배양액으로 하여 37℃ 배양기에서 공기(95%)와 CO₂(5%)의 혼합기체를 지속적으로 공급하여 주며 배양하였다. Hacat세포를 배양용기에 이식하고 24시간 후 배양액을 FBS free DMEM으로 교체하고 활성을 측정하고자하는 시료를 배양 세포에 처리하였다. 시험 시료를 넣고 24시간 배양 후에 HCSS(HEPES-buffered control salt solution)로 세척하여 남아있는 배지를 제거하고 HCSS에 20μM로 준비된 DCFH-DA(2',7'-dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, Inc)를 100μl 가하고 37℃, 5% CO₂조건에서 20분간 배양하고 HCSS로 세척한다. HCSS를 100μl 가한 후 초기에 ROS로 산화된 DCF(dichlorofluorescein)의 형광도를 형광플레이트 리더(Ex=485nm, Em=530nm)로 형광 강도를 측정하였다. 이후 UVA(5, 10 J/m²)과 UVB(10, 20, 30mJ/cm²)를 각각의 실험조건의 세기로 처리하고 처리직후 및 처리 3시간까지의 형광도를 형광플레이트 리더(Ex=485 nm, Em=530nm)로 형광 강도를 측정하였다. 각 실험군은 표 7 및 표 8과 같이 처리하였다.

※ HCSS(HEPES-buffered control salt solution) 조성

NaCl 120mM(7.0128g/L), KCl 5mM(0.37275g/L), MgCl₂ 1.6mM(327ul/L), CaCl₂ 2.3mM(0.2553g/L), 글루코스 15mM(2.703g/L), HEPES 20mM(4.766g/L), NaOH 10mM(0.4g/L)

구분	내용
비교예 2	EGCG를 최종 농도가 10μM가 되도록 처리하였다.
실시예 4	EGCG와 포도당(glucose)의 최종 농도가 각각 10μM가 되도록 처리하였다.
실시예 5	EGCG와 유당(lactose)의 최종 농도가 각각 10μM가 되도록 처리하였다.
실시예 6	EGCG와 말티톨(maltitol)의 최종 농도가 각각 10μM가 되도록 처리하였다.

구분	내용
비교예 3	갈릭산(Gallic acid)을 최종 농도가 10μM가 되도록 처리하였다.
실시예 7	갈릭산과 포도당(glucose)의 최종 농도가 각각 10μM가 되도록 처리하였다.
실시예 8	갈릭산과 유당(lactose)의 최종 농도가 각각 10μM가 되도록 처리하였다.
실시예 9	갈릭산과 말티톨(maltitol)의 최종 농도가 각각 10μM가 되도록 처리하였다.

시료의 활성 산소계 소거능은 수학식 3을 이용하여 나타내었으며 그 결과는 표 9~10과 도 5~6에 나타내었다.

구 분	활 성
비교예 2	84.3±0.7
실시예 4	87.8±1.5
실시예 5	88.7±1.5
실시예 6	87.3±1.0

구 분	활 성
비교예 3	64.4±1.9
실시예 7	75.0±1.0
실시예 8	73.4±2.5
실시예 9	71.9±1.5

도 5와 도 6에서 볼 수 있듯이 항산화 물질의 단독 처리했을 때 보다 당을 함께 처리했을 때 활성 산소계 소거능이 우수하게 나오는 것을 확인할 수 있다.

[ 시험예 4] 당류와 항산화 물질의 혼합 조성물 투여에 따른 혈액 항산화능의 변화

시험예 2와 3에서 항산화 물질이 산화 촉진제로서 작용하는 것을 방지하고 그 효능을 향상시키는 것을 확인하였으므로 항산화성 조성물과 당 혼합물을 적절히 배합하여 사용함으로써 그 효과를 평가하는 실험을 수행하였다.

단계 1. 실험동물과 시료의 준비와 처리

실험 동물의 준비는 상기 시험예 1과 같은 방법으로 준비하였고, 항산화성 조성물과 당 혼합물을 각각 하기 표 11 및 표 12에 의한 조성으로 제조하여 하기 표 13에 의한 방법으로 시료를 준비하였고, 표 14와 같은 방법으로 각 그룹에 경구 투여하였다.

조 성	분 량(중량 %)
녹엽식물 추출 카로틴	24.24
아스코르빈산	24.78
아스코르빈산나트륨	27.41
비타민E 혼합분말	14.42
니코틴산아미드	4.47
비오틴 혼합분말	1.28
토마토 추출 혼합 분말	3.4

조 성	분 량(중량 %)
포도당	46.20
유당	25.02
말티톨	22.34
타피오카전분	6.44

구분	내용
시료 1	증류수에 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)를 5%w/v가 되도록 용해하였다.
시료 9	항산화성 조성물을 90mg/ml이 되도록 5%w/v CMC 용액에 용해하였다.
시료 10	당 혼합물을 90mg/ml이 되도록 5%w/v CMC 용액에 용해하였다.
시료 11	항산화성 조성물과 당 혼합물이 각각 90mg/ml이 되도록 5%w/v CMC 용액에 용해하였다.

구분	내용
대조군	각각의 실험 동물에 시료 1을 1ml씩 경구 투여하였다.
비교예 4	각각의 실험 동물에 시료 9을 1ml씩 경구 투여하여 항산화성 조성물이 300mg/kg로 섭취되도록 하였다.
실시예 10	각각의 실험 동물에 시료 10을 1ml씩 경구 투여하여 당 혼합물이 300mg/kg로 섭취되도록 하였다.
실시예 11	각각의 실험 동물에 시료 11을 1ml씩 경구 투여하여 항산화성 조성물과 당 혼합물이 각각 300mg/kg로 섭취되도록 하였다.

단계 2. 혈액 샘플의 채취와 혈장(plasma) 분리

단계 3. 혈장의 자유기 소거능 평가

혈장의 자유기 소거능 평가는 상기 시험예 1과 같은 방법으로 평가하였다. 이때 표준곡선(standard curve)을 작성하기 위한 트롤록스(trolox)의 시료는 0.05M의 인산염-구연산(phosphate-citrate) 버퍼에 트롤록스를 최종농도가 10mM, 5mM, 1mM, 500μM, 100μM가 되도록 첨가하여 제조하여 시험예 1과 동일한 방법으로 반응시키고 흡광도를 측정하여 표준곡선을 작성하였고, 그 결과는 도 7에 나타내었다. 혈장샘플의 자유기 소거능은 작성된 표준곡선으로부터 도출된 수학식 4를 이용하여 TEAC(Trolox Equivalence Antioxidant Activity) 값으로 나타내었으며, 그 결과는 표 15과 도 8에 나타내었다.

시간(분)	10	40	90	180
대조군	0.0±22.5	0.0±13.9	0.0±9.1	0.0±13.4
비교예 4	-34.8±8.7	157.2±17.1	-44.1±8.4	-80.1±5.4
실시예 10	-10.3±7.3	-16.3±15.6	-17.7±7.7	-2.7±12.6
실시예 11	22.2±12.8	195.6±13.9	148.9±14.7	113.0±5.9

도 8에서 알 수 있듯이 당류 자체는 자유기 소거 활성이 없으나 이를 항산화 물질과 혼합하여 사용하였을 때 항산화 물질을 단독으로 사용하였을 때 나타나는 산화 촉진제로써의 부정적인 작용을 방지할 뿐만 아니라 항산화 물질을 단독으로 사용하였을 때보다 자유기 소거활성에 상승 작용이 나타나는 것을 확인할 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 당류와 항산화 물질의 복합 조성물은 항산화 물질이 체내에서 산화 촉진제로서 부정적으로 작용할 수 있음을 확인하고 이를 당류와 혼합하여 사용함으로써 산화 촉진제로서의 부정적인 작용을 방어하는 효과를 얻을 수 있을뿐 아니라 항산화 효과를 상승시킨다. 따라서 본 발명 에 따른 항산화 조성물은 통상의 음료, 건강 보조 식품, 피부 미용제 등에 적용할 경우 자유기의 소거제(항산화제)로써 건강 증진 및 노화 방지에 커다란 효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

항산화 물질을 포함하는 조성물에 포도당, 유당 및 말티톨로 이루어지는 군으로부터 선택되는 당류를 상기 조성물 중 항산화 물질의 중량에 대해 동량 이상 혼합처리하는 것을 특징으로 하는 항산화 물질의 산화촉진 부작용을 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 항산화 물질은 비타민 C, 에피갈로카테킨-3-갈레이트(epigallocatechin-3-gallate;EGCG), 프로안토시아니딘(proanthocyanidin) 또는 갈릭산(gallic acid)임을 특징으로 하는 방법.
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