KR100825995B1 - 나노크기의 중합체와 자가혈액젤을 포함하는 골이식물질 및그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 나노크기의 중합체 및 자가혈액젤을 포함하는 골 이식용 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 골 이식용 조성물은 환자 자신의 혈액을 사용한 자가혈액젤에 의해 면역유발 등의 문제가 발생하지 않으며, 이에 나노크기의 중합체를 혼합하는 경우 친수성, 점착성 및 부착성이 증대되어 개선된 골 재생 효과를 가지는 골 이식용 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 자가혈액젤을 제조하는 단계; 및 나노크기의 중합체에 자가혈액젤을 혼합하는 단계를 포함하는 상기 골 이식용 조성물의 제조방법을 제공한다.

자가혈액젤, 나노크기 중합체, 골 이식용 조성물

Description

나노크기의 중합체와 자가혈액젤을 포함하는 골이식물질 및 그 제조방법 {injectable bone using autologous fibrin glue combined with nano-size polymers and method for the production thereof}

도 1은 본 발명에 의한 나노크기의 중합체를 함유한 자가혈액젤의 전자현미경 사진이다.

도 2는 본 발명에 의한 나노크기의 중합체를 함유한 자가혈액젤 속에 골막에서 배양된 골세포를 배양한 현미경 사진이다.

도 3은 합성중합체를 이용하여 제조한 나노크기 섬유의 전자현미경 사진이다.

도 4는 합성중합체를 이용하여 제조한 나노크기 입자의 전자현미경 사진이다.

도 5는 본 발명에 의한 나노크기 및 마크로크기의 중합체를 함유한 자가혈액젤을 타이타늄 인공 치아표면에 각각 적용하여 비교실험한 사진이다.

본 발명은 골 조직 및 다른 조직들의 수복의 개선 및 재생에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 나노크기의 중합체를 함유한 자가혈액젤 및 그 제조방법에 관한 것이다.

골 이식물은 골에 결함이나 상처가 있을 때 자연적인 재생과정을 증대시키기 위하여 종종 이용된다. 이러한 골 이식물은 생 적합성이 있어야 하고 골 형성적, 즉 골 전도적임과 동시에 골 유도적이어야 이상적이며, 이식에 앞서 외과의사에 의해 쉽게 조작될 수 있어야 하고, 이식 후에 그 강도와 성질이 체내에서 그대로 유지될 수 있어야 한다.

생체조직공학에서 가장 흔히 사용되는 방법은 삼차원 다공성 지지체, 세포 및 조직재생유도인자를 함께 사용하여 조직을 재생시키는 방법이다. 지지체로는, 일정 시간이 경과한 후 흡수되는 생분해성 중합체를 사용한다.

최근에는 주사할 수 있는 젤을 이용하는 조직공학방법에 관심이 높아져 왔다. 젤을 이용한 조직공학방법은 삼차원 다공성 지지체를 이용하는 기존의 방법보다 여러 가지 장점을 제공하는데, 어떤 형태의 결손 부위에도 채워 넣을 수 있고, 성장인자 등 여러 가지 성분을 용이하게 혼합할 수 있으며, 고형의 지지체에 불가결한 여러 가지 화학성분을 포함하지 않을 뿐 아니라 특히, 젤 형태는 외과적 시술 없이 쉽게 주입할 수 있는 장점이 있다. 이러한 이유로 각종 주사형 젤 재료가 개발되어 왔으며, 지금까지 콜라젠 젤, 폴리에틸렌 옥사이드, 알지네이트 등이 사용되어왔다. 그러나, 이들은 분해속도 조절의 어려움, 높은 수축율, 생성조직 침투의 어려움, 면역반응 등의 여러 가지 단점을 가지고 있음이 보고되었다.

또한, 골 퍼티(putty), 페이스트(pastes) 및 젤을 이용하여 골 손실부위에 채우고자 하는 수개의 특허들이 존재한다(U.S. Pat. No. 5290558, U.S. Pat. No. 50733733, U.S. Pat. No. 5314476, U.S. Pat. No. 6030635, U.S. Pat. No. 7437018 및 U.S. Pat. No. 7067123 등 참조). 그러나 이러한 특허들은 골 이식용 조성물이 수축이 적고, 적절한 물성 강도를 가지며, 적절한 분해속도를 가지기 위해 나노크기의 중합체를 사용하는 것에 대해서는 전혀 개시하지 않고 있다.

최근 혈액에서 채취한 피브린 젤이 상품화되어 임상에서 사용되어 왔다. 그러나 이러한 피브린 젤은 여러 사람에게서 얻어진 혈액을 사용하여 제조하기 때문에 감염이나 후천성 면역결핍증과 같은 전염성 질환의 전이의 우려가 있고, 소의 트롬빈을 사용하기 때문에 응고 장애와 같은 과민반응 등이 나타날 수 있는 위험이 있을 뿐만 아니라 광우병 발생시 전면 사용 중단이 된다는 어려움이 있다. 따라서, 자가혈액의 혈소판을 이용하는 혈소판풍부혈장이 현재 임상에서 사용되고 있다.

본 발명자는 예비연구를 통하여 자가혈액에서 고농도의 성장인자와 고농도의 피브린을 제조할 수 있는 피브리노겐과 트롬빈을 추출하여 자가혈액젤을 제조하였 고, 이들을 이용하여 조직 재생이 타생체재료나 기존의 혈소판풍부혈장보다 더 효과적으로 이루어지는 것을 확인하였다. 이들을 이용할 경우 환자 자신의 혈액을 이용한 생체재료이므로 독성이 없으며 생체 적합성이 우수하고, 면역반응을 일으키지 않으며, 젤 형태로서 외과적 시술없이 또는 최소한의 침윤성으로 원하는 부위에 쉽게 적용 가능하다는 장점이 있다. 그러나, 이러한 자가혈액젤은 수축으로 인한 부피의 감소, 부적절한 물성 강도, 너무 빠른 분해속도 등이 단점으로 제시되었다.

따라서, 수축이 적고, 적절한 물성 강도를 가지며, 적절한 분해속도를 가지는 자가혈액젤을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

본 발명자는 상기한 종래 기술의 문제점 및 자가혈액젤의 문제점을 해결하기 위해, 자가혈액젤에 나노크기의 중합체를 혼합하여 골 이식물질을 제조하였다. 본 발명에 의한 골 이식물질을 이용할 경우 자가혈액젤의 문제가 해결될 뿐 아니라 재료의 친수성과 점착성이 증가하여 다양한 형태의 골 파괴 부위에 골 재생을 효과적으로 할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 나노크기의 중합체 및 자가혈액젤을 포함하는 골 이식용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 사용되는 중합체로는 주로 생체조직공학에서 사용되는 임의의 중합체를 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게 폴리락트산, 폴리글라이콜산, 폴리(락틱-코-글라이콜산), 폴리(락틱-코-글라이콜산)-글루코스, 폴리오르토에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리디옥사논, 폴리아미노산, 폴리하이드록시부티르산, 폴리카프로락톤, 폴리알킬카보네이트, 트리칼슘포스페이트 및 바이오글라스 또는 이들의 유도체, 또는 상기 중합체들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 트리칼슘포스페이트를 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 “나노크기”란, 그 크기가 특정 범위로 제한되는 것은 아니나, 일반적으로 당해 분야에서 수십 또는 수백 나노미터의 크기를 일컫는 것으로 통칭되고 있다. 본 발명의 중합체는 나노크기를 가지며, 바람직하게는 수십 내지 수백 나노미터, 더욱 바람직하게는 20내지 400nm의 직경을 가진다.

본 발명의 나노크기의 중합체는 공지의 방법에 따라 제조하거나 상업적으로 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 바람직한 나노크기 합성중합체의 형태는 나노입자 또는 나노섬유이다.

또한, 본 발명의 골이식용 조성물은 자가혈액젤을 포함한다.

본 발명에서 용어 “자가”는 조직 또는 세포가 수여자(recipient)로부터 기원하거나 또는 유도된 것을 의미한다. 상기 자가혈액젤은 환자 자신의 혈액을 이용하여 제조하는 것으로서 혈소판, 피브리노겐 및 트롬빈을 포함할 수 있다.

혈소판은 혈액응고, 지혈작용에 중요한 역할을 하는 혈액의 유형 성분인 혈구의 하나로서, 지름 2 내지 3㎛이고 혈액 1㎟속에 약 30만 내지 50만개가 존재하 며 점조성이 있고 형상은 조건에 따라 변한다. 이러한 혈소판이 골의 치유과정에 영향을 주는 이유는 성장요소인 혈소판 유래 성장인자(PDGF: platelet derived growth factor), 전환성장인자-베타(TGF-beta: transforming growth factor-beta), 그 밖의 여러 가지 성장인자를 분비하기 때문이다.

피브리노겐은 섬유소원이라고도 하며, 혈액응고의 중심적 역할을 하는 글로불린에 속하는 단백질이다. 척추동물의 혈장 속에 존재하고 주로 간에서 생성되며, 사람인 경우에는 1L 속에 2 내지 4g 함유되어 있다. 혈장 속의 농도는 생리적으로, 또 백혈구의 증가나 발열 등과 같은 병적인 경우, 또는 결핵이나 류머티즘열 등의 감염증 질환에 의해서도 쉽게 대폭 증감하며, 이것이 증가하면 적혈구 침강속도를 촉진하는 것 외에 혈액의 점성도에도 많은 영향을 준다. 피브리노겐은 글로불린의 일반적 성질을 가지는데, 혈장단백질 내에서는 가장 염석되기 쉬운 것 중의 하나이며, 같은 부피의 포화식염수를 가하면 거의 전부가 침전한다. 전자현미경에 의하면 분자는 아령 모양의 구조를 가지며, 분자량은 약 33만이다. 효소 트롬빈에 의하여 불용성인 피브린이 된다.

트롬빈은 혈액 응고에 관계되는 단백질 분해효소로서, 혈장 속에서는 프로트롬빈으로 존재하며 출혈시에 혈소판이 파괴되어 트롬보플라스틴이 혈장 중에 나오면 혈액의 칼슘이온의 존재하에 활성화되어 트롬빈이 된다. 혈액 응고의 본질인 혈액 속의 가용성 피브리노겐을 가수분해하여 불용성인 피브린으로 변화시키는 반응을 촉매한다. 피브리노겐에 대한 기질 특이성이 매우 높고 피브리노겐의 4개의 펩티드 결합을 자르는데, 그곳은 아르기닌과 글리신 잔기 사이이다. 최적 pH는 중성 또는 약알칼리성 부근이다. 주성분은 단백질로 최소분자량은 8000이며 중합하기 쉬운 성질을 가진다.

본 발명에 따른 골 이식용 조성물은 골 조직의 성장 촉진 등을 위해 골세포 또는 성장 인자를 추가로 포함할 수 있다. 성장인자의 예로는 세포 부착 매개자(cell attachment mediator), 생물학적 활성 리간드, 인테그린 결합 시퀀스, 골 형성 단백질(bone morphogenic protein), EGF(epidermal growth factor), FGF(fibroblast growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor), IGF-1, IGF-2, TGF-β 1 내지 3, VEGF(vascular endothelial growth factor), GDF(growth differential factor) 들이 있으며, 하나 또는 그 이상의 성장인자가 함께 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물에는 성장인자 외의 다른 생물학적 활성제가 추가적으로 포함될 수 있다. 이러한 생물하적 활성제에는 제한이 없으며, 유기분자, 무기물질, 단백질, 펩티드, 핵산(예, 유전자 단편, 유전자 조절 시퀀스 및 안티센스 분자), 핵단백질, 다당류, 당단백질 및 지질단백질이 포함된다. 본 발명의 조성물에 첨가될 수 있는 생물학적 활성 화합물에는 제한이 없으며, 항암제, 항생제, 진통제, 소염제, 면역억제제, 효소 저해제, 항히스타민제, 항경련제, 호르몬, 근육 이완제, 영양인자 및 백신 등이 포함된다.

본 발명에 따른 골 이식용 조성물에서 자가혈액젤과 나노크기의 중합체의 비율은 사용목적에 따라 다양하게 변화될 수 있다. 바람직하게는 자가혈액젤이 조성 물 전체 총 중량의 50%의 양으로 포함될 수 있다. 더욱 바람직하게는 자가혈액젤 및 나노크기의 중합체가 각각 조성물 전체 총 중량의 50% 및 25%로 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 나노크기의 중합체 및 자가혈액젤을 포함하는 골 이식용 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기 골 이식물질의 제조방법은 a) 자가혈액젤을 만드는 단계; 및 b) 젤과 나노크기의 중합체를 혼합하는 단계를 포함한다. 본 발명은 바람직한 한 양태로서 a) 자가혈액을 채취하여 얻은 혈장액 부피의 1/5로 트롬빈을 제조하고, 4/5로 피브리노겐을 제조하여 자가 혈액젤을 만드는 단계; 및 b) 상기 자가혈액젤과 나노크기의 중합체를 혼합하는 단계를 포함하는 골 이식용 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직한 또 다른 양태로서, a) 자가혈액젤을 만드는 단계; 및 b) 조성물 전체 중량의 50%의 양의 상기 자가혈액젤을 나노크기의 중합체와 혼합하는 단계를 포함하는 골 이식용 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기 방법으로 제조된 발명은 다음의 특징을 가진다. 즉, 합성중합체를 나노크기로 만듦으로써 재료의 친수성과 점착성이 증가하고 표면적이 커지며, 이들 나노크기의 합성중합체를 위한 지지체로 사용한 자가혈액젤은 환자 자신의 혈액에서 채취하여 제조하기 때문에 면역반응이 생기지 않을 뿐만 아니라, 혈소판이 포함되어 있어 혈소판 내에 함유된 성장 인자가 골 형성을 촉진하게 된다. 또한 나노크기의 합성중합체는 자가혈액젤과 잘 혼합되어 주사기를 사용하여 주입할 수 있어 골 이식물질이 다양한 형태의 골파괴된 부위에 쉽게 침투하여 골 재생이 효과적으로 이루어질 수 있다.

아래에서는 실시예에 의해 본 발명을 더욱 자세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 골 이식용 조성물의 제조

본 발명의 구체적인 일 실시예로서 상기 골 이식물질을 다음과 같은 방법에 의해 제조하였다. 먼저, 자가혈액젤을 제조하기 위해 일정량의 혈액을 채취하고 이를 원심분리기에서 원심분리하였다. 원심분리 후 상기 혈액은 세 층으로 나뉘는데 이중 가장 아래층인 혈구 세포층은 버리고, 매우 옅은 백색의 중간층인 혈소판층 및 상층액인 혈장층을 함께 취했다. 얻은 혈장액을 1:4의 비율로 나누어 1/5에 해당하는 혈장을 이용하여 트롬빈을 제조하고 4/5에 해당하는 혈장을 이용하여 피브리노겐을 제조했다. 트롬빈은 혈장에 시트르산 2.84mM을 첨가한 후 원심분리하여 상충액을 버리고 침전물을 얻은 후, 그 침전물에 CaCl2(0.1M 및 0.05M)를 첨가하여 침전물을 용해시키고, 이 용액에 NaHCO3 75mM를 첨가하여 pH를 중성으로 맞추어 얻을 수 있었다. 피브리노겐은 혈장에 트라넥사민 산(tranexaminc acid) 100mg/ml 과 99% 에틸알콜을 첨가하여 0℃에서 30분 내지 60분 동안 보관하고, 침전이 이루어지면 원심분리하여 상층액은 버리고 얻은 침전물을 37℃에 두어 용해시켜서 얻을 수 있었다.

상기와 같이 제조된 트롬빈 및 피브리노겐을 자가혈액젤 사용 직전에 혼합하여 자가혈액젤(피브린젤)을 제조하였다.

상기와 같이 피브린을 제조한 후, 이를 나노크기의 중합체(제조방법: 중합체용액을 용매인 메틸렌클로라이드에 녹여 에멀젼화시킨 후 용매를 제거하는 방법으로 나노크기의 중합체를 제조함 (Pharm Rel. 10, 750(1993))와 혼합했다. 이때 피브린, 나노크기의 중합체 및 식염수를 2:1:1의 비율로 혼합하였고, 혼합액을 젤로 굳힐 때 피브린을 첨가하였다. 모든 시약은 Sigma, St. Louise, MO 제품을 사용하였다.

실시예 2 : 자가혈액젤과 나노중합체의 혼합비율 측정

자가혈액젤과 나노중합체의 혼합비율에 따른 체적의 변화율을 측정하였다. 4 웰 플라스크(4 well flask)에 일정량의 젤을 넣고 배양용기에서 5% CO2, 37℃의 조건 하에서 상기 젤들의 체적변화를 측정하였다.

자가혈액젤과 나노중합체의 혼합비율에 따른 체적 변화율

자가혈액젤	제조시 체적(㎕)	10일 후 체적	작아진 비율(%)
50%fibrin	450	375	17%
25%fibrin	420	280	33%
100%fibrin	480	430	15%
50%fibrin+50% nanopolymer	240	220	9%
50%fibrin+25% nanopolymer	340	300	12%

상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 50% 자가혈액젤에 나노중합체를 혼합하였을때 체적의 변화가 적다.

실시예 3 : 자가혈액젤과 나노중합체의 혼합비율에 따른 젤 내 세포 증식 효과

골막에서 배양한 골세포를 자가혈액젤과 나노중합체의 혼합체와 함께 배양하여 세포의 증식 효과를 측정하였다(도 2).

4 웰 플라스크에 400㎕의 혼합체와 2×10⁵ 개의 골세포를 넣고 배양용기에서 5% CO2, 37℃의 조건 하에서 최소 필수 배지(minimal essential medium : MEM)을 기본 배지로 하여 여기에 20% 우태아혈청(FBS, Gibco)과 항생제를 첨가한 배지를 사용하여 1주간 배양하였다. 배양 후의 세포 증식은 전자현미경으로 관찰하였다. 도 2에서 젤 속에 살아 있는 골세포의 모습을 관찰할 수 있으며, 이것으로 골세포가 자가혈액젤과 나노중합체의 혼합체 내에서 증식하는 것을 알 수 있었다.

실시예 4 : 골 이식물질의 친수성, 점착성, 부착성 효과

자가혈액젤과 나노중합체의 혼합체를 타이타늄 인공치아표면에 적용하여 자가혈액젤과 마크로크기의 중합체와 비교하여 확인하였다(도 5).

나노크기의 트리칼슘포스페이트 중합체 및 마크로크기의 트리칼슘포스페이트 중합체와 50% 자가혈액젤을 혼합하여, 인공치아의 표면에 각각 주사하고 48시간을 기다린 후 절단하여 중합체와 굴곡이 심한 표면을 가진 인공치아 표면과의 접촉면적을 비교하였다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이 나노크기의 중합체가 마크로크기의 중합체보다 넓은 접촉면적을 보이므로 나노크기의 중합체가 인공치아표면에 대한 점착성 및 부착성이 우수함을 알 수 있다.

본 발명의 나노크기 중합체와 자가혈액젤을 포함하는 골 이식 물질은 마크로크기의 골 이식 물질과는 달리 친수성, 점착성, 부착성이 우수하여 다양한 형태의 골 파괴된 부위에 효과적으로 채워 넣을 수 있으며, 인체에 적용 시에 주사기를 사용하여 쉽게 주입할 수 있어 조직절개 및 박리를 최소한으로 하거나 하지 않고도 골 결손부위에 채워 넣을 수 있다.

또한, 본 발명의 나노크기의 중합체와 자가혈액젤을 포함하는 골이식물질은 다른 젤성 재료와는 달리 면역반응 문제를 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 골재생을 돕는 성장 인자가 다량 함유되어 있어 골재생의 치유기간을 단축시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 나노크기의 중합체와 자가혈액젤을 포함하는 골이식물질은 조직공학을 이용한 골, 연골 또는 피부 대체제의 제조시 스캐폴드로도 사용 가능하다.

Claims (16)

1. 나노 크기의 합성 중합체와 자가 혈액젤을 포함하는 골이식용 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 자가 혈액젤이 혈소판, 피브리노겐 및 트롬빈을 포함하는 것을 특징으로 하는 골이식용 조성물.
4. 제1항에 있어서, 합성 중합체가 폴리락트산, 폴리글라이콜산, 폴리(락틱-코-글라이콜산), 폴리(락틱-토-글라이콜산)-글루코스, 폴리오르토에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리디옥사논, 폴리아미노산, 폴리하이드록시부티르산, 폴리카프로락톤, 폴리알킬카보네이트, 트리칼슘포스페이트, 바이오글라스 및 이들의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물임을 특징으로 하는 골이식용 조성물.
5. 제1항에 있어서, 합성 중합체의 크기가 20 내지 400nm임을 특징으로 하는 골이식용 조성물.
6. 제1항에 있어서, 합성 중합체가 나노섬유 또는 나노입자 형태인 것을 특징으로 하는 골이식용 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 골세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 골이식용 조성물
8. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 성장 인자를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 골이식용 조성물.
9. 제8항에 있어서, 성장 인자가 세포 부착 매개자(cell attachment mediator), 생물학적 활성 리간드, 인테그린 결합 시퀀스, 골 형성 단백질(bone morphogenic protein), EGF(epidermal growth factor), FGF(fibroblast growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor), IGF-1, IGF-2, TGF-β 1 내지 3, VEGF(vascular endothelial growth factor) 및 GDF(growth differential factor)중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골이식용 조성물.
10. 삭제
11. 제1항에 있어서, 자가 혈액젤이 전체 조성물의 50 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 골이식용 조성물.
12. a) 자가 혈액젤을 제조하는 단계; 및 b) 젤과 나노크기 중합체를 혼합하는 단계를 포함하는, 제1항의 골이식용 조성물의 제조방법.
13. 제12항에 있어서, 혈액을 채취하여 얻은 혈장액 부피의 1/5로 트롬빈을 제조하고, 4/5로 피브리노겐을 제조하여 자가 혈액젤을 제조하는 것을 특징으로 하는 골이식용 조성물의 제조방법.
14. 제12항에 있어서, 자가 혈액젤이 혈소판, 피브리노겐 및 트롬빈을 포함하는 것을 특징으로 하는 골이식용 조성물의 제조방법.
15. 제12항에 있어서, 자가 혈액젤을 전체 조성물의 50 중량%로 포함하도록 혼합하는 것을 특징으로 하는 골이식용 조성물의 제조방법.
16. 제12항에 있어서, 합성 중합체가 폴리락트산, 폴리글라이콜산, 폴리(락틱-코-글라이콜산), 폴리(락틱-코-글라이콜산)-글루코스, 폴리오르토에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리디옥사논, 폴리아미노산, 폴리하이드록시부티르산, 폴리카프로락톤, 폴리알킬카보네이트, 트리칼슘포스페이트 및 바이오글라스 중에서 선택되거나 이들 유도체 또는 이들의 혼합물임을 특징으로 하는 골이식용 조성물의 제조방 법.

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