KR100812658B1 - 향상된 세포독성 및 수율의 항-이지에프알브이 3,에스씨에프브이에스, 이에 기초한 면역독소, 및 이의 이용방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 EGFRvⅢ으로 알려진 상피 성장 인자 수용체의 변이형에 대한 항체를 제공한다. 이 변이는 단지 또는 주로 글리오블라스토마 세포의 표면 및 유방, 난소 및 비소세포 폐암종에서 발견된다. 본 발명에 의해서 제공된 항체는 종래의 MR1로 지칭되는 scFv를 포함하는 항체에 비해서 EGFRvⅢ에 대해 더 높은 친화성을 가지며, 좀더 높은 세포독성과 수율을 가지는 면역독소를 형성한다. 특히, 본 발명은 MR1-1로 지칭되는 항체를 제공하는데, 그것은 V_H 및 V_L 쇄의 CDR3에서 MR1을 변이시켜 항체에 특히 좋은 세포독성을 제공한다. 본 발명은 MR1이 V_H 또는 V_L 또는 양자의 CDR1 및 CDR2에서 변이된 추가적인 항체에 모체 MR1 항체보다 EGFRvⅢ에 대해서 더 좋은 결합을 제공한다.

Description

향상된 세포독성 및 수율의 항-이지에프알브이 3, 에스씨에프브이에스, 이에 기초한 면역독소, 및 이의 이용 방법{ANTI-EGFRvIII SCFVS WITH IMPROVED CYTOTOXICITY AND YIELD, IMMUNOTOXINS BASED THEREON, AND METHOD OF USE THEREOF}

본 출원은 2000년 2월 25일에 출원된 미국 특허 가출원 60/185,039의 이익을 청구하고, 그것의 내용은 참고로서 도입된다.

"EGFRvⅢ"로 명명되는 표피성장인자 수용체의 돌연변이형이 약 50∼60%의 글리오블라스토마(glioblastoma)에서 고발현되고, 약 70∼80%의 유방 및 난소 암종 및 약 16%의 비소세포 폐 암종에서 존재하는 것으로 나타난다 (Wikstrand 등, Cancer Res. 55:3140-3148 (1995); Moscatello 등, Cancer Res. 55:5536-5539 (1995)). 돌연변이는 801 염기 결실을 가진 EGFR mRNA의 발현이라는 결과에 이르는 세포외 영역의 아미노 말단 부근의 엑손 2-7의 인프레임(in frame) 결실로 이루어진다. 돌연변이 단백질은 스플라이스 접합부에서 새로운 글리신 코돈을 함유한다 (상기 Moscatello 등). 돌연변이 수용체는 세포표면에서 발현되고, 결실 접합부에서 새로운 종양 특이 세포 표면 에피토프(epitope)(서열)을 생성한다. 수용체는 in vivo 글리오블라스토마의 종양형성을 향상시키는 구성성 티로신 키나제 활성을 가진다 (Nishikawa 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7727-7731 (1994)). 종양-특이 세포외 서열 때문에, 돌연변이 수용체는 암치료에 관해서, 특히 면역독소의 사용을 통하여 매력적인 잠재적 표적이다.

면역독소들은 항체 또는 항체의 부분 같은 표적화 모이어티(targeting moiety)를 Pseudomonas 외독소 같은 단백질 독소에 융합시켜 만들어진다. 많은 종양에서 과발현된 Lewis Y-관련 항원에 대해 특이적인 항체로 만들어진 면역독소가 종양 퇴행(tumor regression)를 나타냈던 상 I 임상시험에 의해서 설명되는 것처럼(Pai 등, Nat Med. 2:350-353 (1996)), 면역독소는 인간의 고형 종양에 대해 활성을 가지는 것으로 증명되었다. 그러나, 순수 마우스 단클론 항체로 만들어진, Pai 등의 연구에서와 같은 면역독소들은 어떤 단점들을 가진다. 이것들은 상대적으로 커서 이들의 종양 투과를 제한한다. 또한, 항체와 독소 사이의 연관의 이종성이 자주 존재하고, 접합체를 대량으로 생산하는 것이 어렵다. 유사하게, 당해 기술분야에서 알려진 EGFRvⅢ에 대한 여러 항체가 미국특허 제5,212,290호, WO 96/16988, 및 Reist 등, Cancer Res. 55:4375-4382 (1995)에 예시된 것처럼, 면역독소를 구성하는데 제한을 가진다. 표적화를 위해 클론 Fvs가 사용되는 완전 재조합 면역독소들을 만듦으로써 이러한 문제들을 극복하고자 하는 시도가 제한되었는데, 대부분의 항체 가변영역들이 약한 V_H-V_L 연합으로 인한 불안정성 때문에 또는 약한 결합 친화력 때문에 Fvs로서 불충분하게 기능하기 때문이다.

MR1은 EGFRvⅢ에 특이적으로 결합하는 단쇄 항체 가변영역(single chain antibody variable domain: scFv)이다. MR1 scFv는 항체 파지 디스플레이 라이브러리(antibody phage display library)(Lorimer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14815-14820 (1996))로부터 분리되었다. MR1을 함유한 scFv 라이브러리는, EGFRvⅢ 특이 펩티드 플러스 EGFRvⅢ-발현 종양 이종이식(xenografts)으로부터 친화력 크로마토그래피에 의해서 정제된 EGFRvⅢ의 세포외 영역으로 면역된 마우스의 비장 mRNA로부터 제조되었다 (Lorimer 등, Clin. Cancer Res. 1:859-864 (1995)). MR1은 EGFRvⅢ-양성 암 세포에 특이적으로 표적화될 수 있는 치료제를 개발하기 위한 가능성(prospect)으로서 개발되었다. MR1의 서열은 GenBank에 수납번호 U76382로 기탁되었다.

면역독소 MR1(Fv)-PE38은 MR1의 scFv를 영역 Ia의 전부와 영역 Ib의 아미노산 365-380이 결실된 Pseudomonas 외독소 A, PE38의 절단형(truncated form)에 융합시킴으로써 구성되었다 (Lorimer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14815-14820 (1996)). 몇몇 다른 재조합 PE38 면역독소들은 지금 임상시험 중이다 (Kreitman 등, Blood 94(10):3340-48 (1999); Pai-Scherf 등, Clin. Cancer Res. (in press) (1999); Pai 등, Clin. Application Immunotoxines 234:83-96 (1998)). 일반적으로, scFv 유전자들은 짧은 연결제(short linker)에 의해 PE38 유전자와 연결되고, T7-계 발현벡터로 클론화된다. 재조합 면역독소들은 E. coli에서 발현되고, 내포체(inclusion body)에서 축적된다. 내포체들이 광범위하게 세척된 후, 그것들은 구아니딘 하이드로클로라이드에서 용해되고, 단백질이 변성되고 이온교환 크로마토그래피와 겔-여과에 의해서 정제된다. 결과적인 분자들은 활성이고 scFv에 의해서 세포 특이 항원으로 유도된다. 세포 사멸은 독소의 활성에 의해서 야기된다.

치료제로서 유용하기 위해서, 면역독소들은 항원에 대해 높은 친화력을 가져서 그 결과 항원을 발현시키는 세포들에 대한 높은 세포독성을 가져야 한다. 쉬운 가공과 비용면에서, 만일 면역독소가 높은 수율로 생산될 수 있다면, 이것 또한 유리하다. MR1(scFv)-PE38은 가장 높은 친화력이 있고, EGFRvⅢ을 발현시키는 세포들에 대하여 이용가능한 최고의 세포독성 면역독소이지만, 결코 이상적이지 않다. 이것은 8nM의 Kd와 3% 미만의 수율을 가진다. 그러므로 좀더 높은 친화력으로 EGFRvⅢ에 결합하는 항체들을 개발하는 것이 유리하고, 이것은 PE38 또는 다른 독소들과 짝을 이룰 때 EGFRvⅢ-발현 세포들에 보다 높은 세포독성을 지닌 면역독소들을 형성할 것이다. 또한, 좀더 높은 수율로 면역독소를 형성하는 항체들을 발견하는 것이 유용할 것이다.

단클론 항-EGFRvⅢ 항체들로부터 추가적인 scFv를 개발함으로써 이러한 문제들을 해결하기 위한 몇몇 시도들이 실패하였다. MR1은 당해 기술분야에서 항-EGFRvⅢ 면역독소들을 표적화하는데 이용가능한 유일한 scFc로 존속한다.

발명의 요약

한편으로, 본 발명은 EGFRvⅢ로 알려진 표피성장인자 수용체의 돌연변이형에 대한 향상된 결합을 가지는 항체를 제공한다. 특히, 본 발명은 돌연변이된 항체 중쇄 가변부위(V_H) 또는 돌연변이된 경쇄 가변부위(V_L) 또는 양자를 가지는 폴리펩티드를 제공하고, 이 폴리펩티드는 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3.5nM, 3nM 의 또는 미만의 EGFRvⅢ에 대한 Kd를 가지며, 돌연변이된 V_H 또는 V_L은 각각 상보성 결정부위(conplementary determing region)(CDR)에서 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 치환에 의해서 모체(parental) 항체 MR1 V_H 또는 V_L과 다른 서열을 가지며, 아미노산은 R이 A 또는 G, Y가 C 또는 T, 및 W가 A 또는 T인 AGY 또는 RGYW로부터 선택된 핫-스팟 모티프(hot spot motif)에 속하는 뉴클레오티드를 포함하는 코돈에 의해서 엔코딩된다. 몇몇 실시예에서, 치환은 CDR3 V_H 또는 CDR3 V_L에서 발생할 수 있다. 다른 실시예에서, 치환은 또한 CDR1 V_H 또는 CDR2 V_H, 또는 양자, 또는 CDR1 V_L 또는 CDR2 V_L 또는 양자, 또는 CDR1, 2, 3 및 V_H, V_L의 조합에서 발생할 수 있다. 예를 들면, 일실시예에서, 치환은 CDR3 V_L, CDR2 V_L 및 CDR1 V_H에서 발생할 수 있다.

바람직한 폴리펩티드는 S98 및 T99로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 아미노산의 CDR3 V_H에서 치환을 가진다. 다른 바람직한 실시에서, 치환들은 P98-Y99, P98-N99, P98-W99, P98-I99, P98-F99 및 P98-V99로 이루어진 그룹에서 선택된다. 폴리펩티드는 W가 92 위치에서 F로 치환된 CDR3 V_L에서 치환을 더 가질 수 있다. 특히 바람직한 실시에서, 폴리펩티드는 S98P-T99Y의 중쇄에서 치환을 가지며, 경쇄에서 ("MR1-1"로 지칭된 항체를 규정하는) 치환 F92W를 포함한다.

상기의 폴리펩티드는 항체("scFv")의 단쇄 가변부위, 이황화물 안정화된 Fv, Fab, F(ab')₂, 또는 항원을 인식하고 항원에 결합하는 능력을 보유한 항체의 다른 단편일 수 있다. 이들은 박테리오파지의 표면 단백질을 또한 포함할 수 있다.

바람직한 실시예에서, 전술한 폴리펩티드들은 EGFRvⅢ에 대한 Kd가 MR1보다 적어도 1nM 낮다. 폴리펩티드들은 7, 6, 5, 4, 3.5, 3 또는 더 낮은 Kd를 가질 수 있다.

전술한 폴리펩티드들은 또한 어떤 효과기 분자, 치료적 모이어티, 또는 검출성 표지에 짝을 이루거나, 부착되거나, 연결될 수 있다. 치료적 모이어티는 독소 또는 독소의 세포독성 부분("독성 모이어티")일 수 있으며, 이것은 폴리펩티드과 접합하여 세포독소를 형성한다. 독성 모이어티는 디프테리아 독소 또는 이것의 세포독성 단편, 사포린, 포크위드(pokeweed) 항바이러스 단백질, 리신 또는 이것의 세포독성 단편, 또는 브리오딘(bryodin) 1일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 독소는 Pseudomonas 외독소("PE") 또는 PE의 세포독성 단편이다. 특히 바람직한 실시에서, PE는 PE38이다. 폴리펩티드와 독성 모이어티의 조합에 의해서 형성된 면역독소는 7ng/㎖ 이하, 6ng/㎖ 이하, 5ng/㎖ 이하, 4 ng/㎖ 이하, 또는 약 3.5ng/㎖ 이하의 IC₅₀을 가질 수 있다. 면역독소는 재조합적으로 발현될 때 적어도 3%의 수율을 가질 수 있으며, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 또는 이상을 가질 수 있다.

본 발명은 돌연변이된 항체 중쇄 가변부위(V_H) 또는 돌연변이된 경쇄 부위(V_L) 또는 양자를 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 분자를 제공하고, 이 폴리펩티드는 7nM 이하의 EGFRvⅢ에 대한 Kd를 가지며, 돌연변이된 V_H 또는 V_L 는 상보성 결정부위(CDR)에서 적어도 하나의 아미노산 치환에 의해서 모체 항체 MR1 V_H 또는 V_L과 다른 서열을 가지고, 아미노산은 AGY 또는 RGYW로부터 선택된 핫스팟 모티프에 속하는 뉴클레오티드를 포함하는 코돈에 의해서 엔코딩되며, 여기서 R은 A 또는 G, Y는 C 또는 T, 및 W는 A 또는 T이다. 몇몇 실시에서, 치환은 CDR3 V_H 또는 CDR3 V_L에서 일어날 수 있다. 다른 실시예서, 치환은 CDR1 V_H 또는 CDR2 V_H 또는 양자, 또는 CDR1 V_L 또는 CDR2 V_L 또는 양자, 또는 CDR1, 2 및 3 V_H 및 V_L의 임의의 조합에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 일실시예에서, 치환은 CDR3 V_L, CDR2 V_L 및 CDR1 V_H에서 일어날 수 있다.

바람직한 실시에서, 핵산 분자는 S98 및 T99 로 구성되는 그룹에서 선택된 적어도 하나의 아미노산의 MR1 에 비교되는 CDR3 V_H 에서 치환을 가지는 폴리펩티드를 엔코드한다. 바람직한 실시에서, 치환은 P98-Y99, P98-N99, P98-W99, P98-I99, P98-F99 및 P98-V99 로 이루어진 그룹에서 선택된다. 핵산 분자는 또한 92 위치에서 F로 치환된 W 를 포함하는 MR1 에 비교되는 CDR3 VL에서 치환을 가지는 폴리펩티드를 엔코드할 수 있다.

핵산은 항체("scFv")의 단쇄 가변부위, 이황화 안정화된 Fv, Fab, F(ab')₂, 또는 항원을 인식하고 그것에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 다른 단편인 폴리펩티드를 엔코딩할 수 있다. 폴리펩티드는 또한 박테리오파지의 표면 단백질을 포함할 수 있다. 상기 핵산 분자는 작동적으로 프로모터에 연결될 수 있다.

다른 실시에서, 본 발명은 항원을 가지는 세포를 사멸시키는 방법을 제공하고, 이 방법은 세포를 독성 모이어티와 표적화 모이어티를 포함하는 면역독소와 접촉시키는 것을 포함하며, 표적화 모이어티는 돌연변이된 항체 중쇄 가변부위(V_H) 또는 돌연변이된 경쇄 가변부위(V_L) 또는 양자를 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 이 폴리펩티드는 7nM 이하의 EGFRvⅢ에 대한 Kd를 가지며, 돌연변이된 V_H 또는 V_L은 상보성 결정부위들(CDR들)에서 적어도 하나의 아미노산의 치환에 의해서, 각각 모체 항체 MR1 V_H 또는 V_L과 다른 서열을 가지며, 아미노산은 AGY 또는 RGYW로부터 선택된 핫스팟 모티프에 속하는 뉴클레오티드를 포함하는 코돈에 의해서 엔코딩되고, 여기서 R은 A 또는 G, Y 는 C 또는 T, 및 W는 A 또는 T이다. 몇몇 실시에서, 치환은 CDR3 V_H 또는 CDR3 V_L에서 일어날 수 있다. 다른 실시예서, 치환은 CDR1 V_H 또는 CDR2 V_H 또는 양자, 또는 CDR1 V_L 또는 CDR2 V_L 또는 양자, 또는 CDR1, 2 및 3, V_H 및 V_L의 임의의 조합에서 일어날 수 있다.

바람직한 실시에서, 방법은 S98 및 T99로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 아미노산의 CDR3 V_H에서 치환을 가지는 폴리펩티드를 포함하는 표적화 모이어티를 포함한다. 다른 바람직한 실시에서, 표적화 모이어티는 P98-Y99, P98-N99, P98-W99, P98-I99, P98-F99 및 P98-V99로 이루어진 그룹에서 선택된 치환을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 특히 바람직한 실시에서, 표적화 모이어티는 MR1-1이다.

표적화 모이어티는 항체("scFv")의 단쇄 가변부위, 이황화 안정화된 Fv, Fab, F(ab')₂, 또는 항원를 인식하고 그것에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 다른 단편일 수 있다.

항원을 가지는 세포는 악성 세포, 예를 들면 신경교종 세포, 유방 암종 세포, 허파암종세포, 또는 난소암종세포 일수 있다.

도 1은 돌연변이 라이브러리의 PCR 구축에 대한 전략을 보여준다. A. pCANTAB5E-MR1은 상향 프라이머, S1 및 표적화된 영역에서 축퇴(NNS)를 함유하는, 하향 프라이머 CDR3H b, d 또는 f를 이용하는 증폭의 주형으로서 이용되었다. B. pCANTAB5E-MR1은 상향 프라이머로서 단계 A에서의 반응생성물을 이용하고, 하향 프라이머 AMBN을 이용하는 증폭의 주형으로 사용되었다. C. 반응 B로부터의 생성물은 소화되고, pCANTAB5E로 클론화되었다.

도 2는 MR1, MR1-1 및 V_H CDR3에서 S98P-T99Y 돌연변이를 갖는 MR1의 BIAcore 센소그램(sensorgram)을 나타낸다.

도 3은 MR1-1-표적화된 면역독소로 처리된 EGFRvⅢ으로 감염된 인간 글리오블라스토마 세포의 두개내 종양을 가진 무흉선 래트(athymic rat)의 생존을 나타낸다. Y-축은 주어진 시간에서 생존하는 동물의 퍼센티지를 나타낸다. X-축은 생존시간을 일수로 나타낸다. 범례: MR-1-1은 MR1-1-PE38 면역독소를 나타낸다. 채워진 다이아몬드, 6㎍의 MR1-1-PE38 면역독소가 24시간 주입에 의해 7일간 투입된 동물. 열린 삼각형: 동일한 스케줄로 2㎍의 MR1-1-PE38 면역독소가 투입된 동물. 열린 원: 동일한 스케줄로 살린 대조구가 투입된 동물.

도 4는 MR1-1-표적화된 면역독소 또는 살린 대조구로 처리된 EGFRvⅢ 으로 감염된 인간 글리오블라스토마 세포의 두개내 종양을 가지는 무흉선 래트의 생존을 나타낸다. Y-축은 주어진 시간에서 생존하는 동물의 퍼센티지를 나타낸다. X-축은 생존시간을 일수로 나타낸다. 범례: MR-1-1은 MR1-1-PE38 면역독소를 나타낸다. 열린 다이아몬드, 0.2㎍의 MR1-1-PE38(0.2% HSA를 가지는 200㎕의 PBS에서) 면역독소가 24시간 주입에 의해 7일간 투입된 동물. 열린 삼각형: 동일한 방법으로 0.6㎍의 MR1-1-PE38 면역독소가 투입된 동물. 열린 원: 동일한 방법으로 2.0㎍의 MR1-1-PE38 면역독소가 투입된 동물. "X", 동일한 방법으로 살린 대조구가 투입된 동물.

도 5는 MR1-1-표적화된 면역독소 또는 살린 대조구로 처리되고, EGFRvⅢ으로 감염된 인간 글리오블라스토마 세포의 수막강내 주사로부터 종양성 수막염을 가지는 무흉선 래트의 생존을 나타낸다. Y-축은 주어진 시간에서 생존하는 동물의 퍼센티지를 나타낸다. X-축은 생존시간을 일수로 나타낸다. 범례: MR-1-1은 MR1-1-PE38 면역독소를 나타낸다. 삼각형: 0.2% HA를 가지는 40㎕의 PBS에서 2㎍의 MR1-1-PE38 면역독소가 총 투여량 6㎍를 위해, 종양 개시 후 3, 5 및 7일에 투입된 동물. 다이아몬드: 0.2% HA를 가지는 40㎕의 PBS에서 1㎍의 MR1-1-PE38 면역독소가 총 투여량 3㎍를 위해, 종양 개시 후 3, 5 및 7일에 투입된 동물. 원: 대조구로서 종양시작 후 0.2% HA를 가지는 40㎕의 PBS가 3, 5, 및 7일에 투입된 동물.

도 6은 MR1-1-표적화된 면역독소 또는 살린 대조구로 처리되고, EGFRvⅢ으로 감염된 인간 글리오블라스토마 세포의 오른쪽 옆구리에 주사된 무흉선 래트에서 시간에 따른 종양의 부피를 나타낸다. Y-축은 ㎣로 종양의 부피를 나타낸다. X-축은 처리개시로부터 시간을 일수로 나타낸다(동물들은 "0"일이 되기 전에 7일 종양세포로 주사되었다). 범례: MR-1-1은 MR1-1-PE38 면역독소를 나타낸다. 사각형: 총 3㎍의 투여량을 위해서 0, 2 및 4일에 20㎕에서 MR1-1-PE38 면역독소의 1㎍ 볼러스(bolus) 주사로 투입된 동물. 정-위치 삼각형: 총 6㎍의 면역독소 투여량을 위해서 0, 2 및 4일에 20㎕ 살린에서 MR1-1-PE38 면역독소의 2㎍ 볼러스 주사로 투입된 동물. 역삼각형: 총 9㎍의 면역독소 투여량을 위해서 0, 2 및 4일에 20㎕ 살린에서 MR1-1-PE38 면역독소의 3㎍ 볼러스 주사로 투입된 동물. 다이아몬드: 대조구로서 0, 2 및 4일에 살린의 20㎕ 볼러스 주사로 투입된 동물.

1. 서

본 발명은 scFv 항체 및 MR1의 친화성보다 EGFRvⅢ에 대해 높은 친화성을 갖는 다른 항체를 제공한다. 이것은 분자의 표적화 부분으로서 MR1을 이용하는 동일한 항체독소의 세포독성보다 EGFRvⅢ-발현 세포에 대해서 더 높은 세포독성을 갖는 항체독소를 제공한다. 항체는 MR1로부터 만들어지나, 이들의 상보성 결정 부위들(CDR들)의 핫스팟 부위에서 변이된다. 놀랍게도, 표적화 모이어티로서 이러한 MR1의 돌연변이된 형태를 도입하는 항체독소는 EGFRvⅢ에 대해 높은 친화성을 가지며, 또한 분자의 표적화 부분으로서 MR1을 이용하는 유사한 항체독소에 비해 상당히 높은 수율로 생산될 수 있다.

CDR 에서 무작위하게 항체 라이브러리를 구축하는데 있어서의 제한 인자는 CDR 를 구성하는 다수의 잔기이다. x-레이 구조는 대부분의 항체에서 이용될 수 없기 때문에, 통상적으로 돌연변이가 보다 높은 친화성 변이체를 생산하는 경향이 있는 몇몇 CDR 잔기를 확인하려는 어떠한 시도도 없었다. 결과적으로, 보다 높은 친화성 변이체의 분리를 확증하기 위해서는 극도로 많은 무작위화된 라이브러리를 구축하는 것이 필요하다.

전형적인 연구에 있어서, 돌연변이는 MR1의 중쇄 가변부위(V_H)의 CDR3에서 만들어졌다. MR1의 V_H CDR3는 11 아미노산 잔기를 가진다. V_H 부위의 마지막 두 잔기, D101 및 Y102는 돌연변이화 연구에서 제외되었는데, 이것들은 두 가지 이유로 항원 결합에 참여하는 경향이 없는 것으로 고려되었기 때문이다. 우선, 이들 두 잔기는 통상적으로 V_L 쇄와의 계면에 위치한다. 결과적으로 이것들은 노출되지 않는다. 다음으로, 이들 잔기는 J 분절(segment)에 의해서 기여되고, V_H CDR2의 3'-접합부위를 따른다. 결과적으로, 이것들은 V_H CDR3의 나머지보다 상대적으로 더 보존된다.

CDR3 V_H의 각 위치에서 다른 9개의 아미노산이 각각의 다른 천연 아미노산에 의해 치환되었다. 연구들은 단지 핫스팟(항체 친화력 성숙(maturation) 동안 과돌연변이를 겪는 것으로 알려진 영역으로서, R은 A 또는 G, Y는 C 또는 T, 및 W는 A 또는 T인 모티프 RGYW에 의해 가장 잘 특징화됨)으로 알려진 영역에서의 돌연변이만이 모체 항체 MR1보다 높은 세포독성을 갖는 항체에 이른다는 것을 나타냈다. 돌연변이들은 또한 이러한 돌연변이된 scFv가 항체독소에 도입되면, 모체 MR1 scFv로 만들어진 유사한 항체독소와 비교하여 면역독소의 수율을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 다른 전형적인 연구에서, 돌연변이들은 경쇄 가변부위의 MR1 CDR3에서 이루어졌다. 이러한 연구에서, 돌연변이들은 단지 아미노산 핫스팟에서만 만들어졌다. 다시 한번, 돌연변이들은 모체 항체 MR1보다 높은 세포독성 및 수율을 갖는 항체를 가져온다.

이러한 결과에 기초하여, 돌연변이가 보다 높은 친화성 변이체를 생성하는 것들을 확인하기 위해서 CDR 에서의 모든 잔기를 무작위화 할 필요는 없다. V_H 및 V_L CDR1, 2 의 핫스팟에서 돌연변이는 EGFRvIII 에 대한 향상된 친화성, 면역독소에 도입되었을 때 EGFRvIII-발현세포에 대한 향상된 세포독성, MR1-계 면역독소에 비해서 그러한 scFv 를 도입하는 세포독소에 대한 향상된 수율이라는 결과에 이른다. 향상된 특성은 아미노산의 치환에 기인하므로, 동일한 양호한 효과가 이러한 MR1 의 돌연변이된 형태가(VH 및 VL CDR3 에서 돌연변이된 것을 포함하는) 이황화 안정된 Fvs(dsFvs), 또는 Fab', F(ab')₂ 또는 Fab 로 도입될 때, 또한 발견될 것이다.

증가된 세포독성 활성은 증가된 친화성과 상관될 필요는 없다(아래의 표 4 및 표 5). 이러한 상관관계의 부족에 대한 어떤 명확한 설명도 없다. 결합 친화성이에에도, 이것은 전형적으로 22 ℃에서 측정되고, "핫스팟" 돌연변이에 의해서 영향을 받을 수 있는 많은 측면들이 독성 공정에 있다. 그러한 측면들은 37 ℃에서의 안정성, 내재화율, 단백질 분해 공정 및 전좌를 위해서 요구되는 구획으로의 이식을 포함한다. 이러한 하나이상의 관점이 영향을 받는 것이 가능하다. 그러나, EGFRvIII 에 대한 보다 높은 친화성을 가지는 항체는 다양한 목적에 유용하며, 특히 시료에서 EGFRvIII-발현 세포의 존재 혹은 부재를 결정하는 in vitro 측정 및 진단적 이용에 유용하다. 예를 들어, in vitro 이용에서, EGFRvIII 에 대해서 보다 높은 친화성을 가지는 scFv와 같은 항체는 방사선핵종 또는 어떤 많은 다른 인식가능한 표지에 접합될 수 있으며, 환자로부터의 바이옵시(biopsy) 시료에서 EGFRvIII 를 발현하는 세포의 존재를 추적하여, 환자가 그러한 세포들의 존재에 의해서 특징되는 암을 가지는지를 결정하거나 또는 그러한 암을 가지는 것으로 알려진 환자로부터 아직 뿌리뽑히지 않았는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 유사하게, in vivo 이용에서, scFv, dsFv 또는 본 발명의 다른 항체들은 방사선핵종 또는 다른 검출가능한 표지에 접합될 수 있고, 환자에게서 EGFRvIII를 발현시키는 세포의 존재를 검출하는데 사용되고, 이에 의해서 다시 환자가 그러한 세포의 존재에 의해서 특징되는 암을 가지고 있는지, 또는 암이 그러한 암을 가졌다고 알려진 환자로부터 아직 근절되지 않았는지를 진단하는데 사용될 수 있다.

마지막으로, CDR 돌연변이체로부터 관측되는 놀라운 차이점은 활성 단위체 단백질의 최종 수율이었다. 재조합 독소는 내포체에서 비용해성의 응집된 단백질(면역독소)로서 축적된다. 활성 단량체는 6M 구아니딘 HCl에서 내포체를 용해하고, 이어서 환원 시스템에서 조절된 재생 및 다량체 및 응집체로부터 단량체의 분리에 의해서 생산된다. 연구들은 CDR에서 1 또는 2 아미노산 돌연변이가 면역독소의 수율을 아래에서 설명되고 정의되는 것처럼 매우 증가시킬 수 있다는 것을 나타냈다 (표 6). MR1(Fv)-PE38의 수율은 단지 2%이지만, 중쇄 CDR3 S98P-T99S 돌연변이에서는 17%까지 극적으로 증가하였다. 생각건대, 이러한 돌연변이들이 접힘 경로(folding pathway)에 깊은 영향을 미친다. 일반적으로, 중쇄의 초기 돌연변이유발에서 분리된 모든 중쇄 돌연변이체는 모체 MR1보다 좋은 수율을 가졌다. 따라서 CDR3의 중쇄는 적절한 접힘을 위해 매우 중요하고, 파지 발현시스템은 보다 효율적으로 접히는 단백질을 위해 어떻게든 선택할 수 있다. 결과적으로, 더 나은 접힌 Fvs를 함유하는 파지가 보다 많은 수로 존재하는 것으로 여겨지고, 항원에 대하여 팬닝(panning) 동안 우선적으로 풍부해진다.

이러한 결과에 기인하여, 파지 디스플레이는 양친 MR1 scFv 에 비해서 마찬가지로 증가된 생산수율을 나타내는 VH 및 VL 의 CDR1 또는 2 에서 돌연변이된 Fvs 를 선택하는데 사용될 수 있다.

in vivo 시험이 인간 종양의 동물 모델에서 MR1에 의해 표적화된 전형적인 면역독소의 효과를 나타내기 위해서 실시되었다. 종양을 설립하기 위해서, 무흉선 래트 및 마우스가 EGFRvⅢ를 발현시키기 위해서 감염시킨 인간 글리아블라스토마 세포주(U87MG)의 세포로 두개내적으로, 수막강내적으로, 또는 피하적으로 주사되었다 (감염된 EGFRvⅢ-발현 세포주는 U87MG.ΔEGFRvⅢ로 명명되고, Nishikawa 등, Proc Natl Acad Sci(USA)91(16):7727-7731(1994)에서 기술되었다). 일단 종양이 설립되면, 래트 또는 마우스는 다양한 용량의 항체독소를 볼러스 주사 또는 연속적인 주입으로 처리되었다. 하기 실시예 및 도 3 내지 6에 기술된 바와 같이, 종양의 위치 및 면역독소의 투입 방법에 관계없이, 1 또는 2㎍의 투여량이 주어진 동물들은 살린 대조구가 주어진 동물보다 현저하게 적은 종양 성장을 나타냈고, 보다 긴 생존시간을 나타냈다.

2. 정의

단위, 접두사, 및 기호들은 시스테미 인터내셔널 데 유니트(systeme international de unites)(SI) 에서 사용하는 형태로 표기되었다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수를 포함한다. 다른 표시가 없다면, 핵산은 좌측에서 우측으로 5' 에서 3' 으로 기술된다; 아미노산 서열은 좌측에서 우측으로 아미노에서 카르복시 방향으로 기술된다. 여기서 제공되는 제목들은 발명의 실시예 또는 다양한 측면의 제한이 아니며, 전체로서 명세서에 참조로서 도입될 수 있다. 따라서, 하기에서 바로 아래에 정의되는 용어들은 전체로서 명세서에 대한 참조문헌에 의해서 더 자세히 정의된다.

공지의 서열로부터 돌연변이된 잔기들은 서열에서 지정된 위치에서 정규로 발견되는 잔기, 돌연변이된 잔기의 서열에서 위치, 및 원래 잔기 대신 치환된 잔기를 단일 문자 코드로 기입함으로써 규약에 의해서 지명된다. 따라서, MR1 CDR3 V_H에 관해서, "S98P"이라는 용어는 MR1의 정상 CDR3 중쇄의 98 위치에서 정규로 발견되는 세린이 프롤린으로 돌연변이되었다는 것을 나타낸다. "S98" 같이 숫자 뒤에 잔기의 명시가 없는 명칭은 펩티드의 정상 서열의 그 위치에서 정규로 발견되는 잔기를 언급하거나 또는 특이 잔기가 지금 그 위치에 존재한다는 것을 언급한다 (즉, 지정된 잔기가 그 위치에서 정규로 존재하는 잔기 대신 치환되었다). 어떤 이용이 여기서 의도되었는가는 문맥에서 명백할 것이다. 여기서 특별히 번호 매겨진 MR1-1의 아미노산 잔기에 대한 언급은 갱신된 Kabat 등, SEQUENCE OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, U.S. Department of Health and Human Services, (1987)에 따라서 번호 매겨졌다: 이 참고문헌은 여기 이후에는 "Kabat"로 언급되고, 그것의 내용은 여기서 참고로 도입되었다. scFv의 서열은 정렬될 때, Kabat 시스템에 따라서 번호 매겨진다.

"EGFRvⅢ"은 MR1 scFv에 의해 인식되고 아미노 말단 부근 2-7 엑손의 801 염기쌍 인프레임 결실에 의해 특징되는 표피성장인자 수용체의 돌연변이형을 의미한다. 수용체의 이러한 형태는 당해 기술분야에서 알려져 있으며, 발명의 배경에서 언급된 Wickstrand 등, Moscatello 등, 및 Lorimer 등의 참고문헌에 의해 예시되어 있다. 용어에 있어서 변화로 인해, EGFRvⅢ은, 미국 특허 제5,212,290호에서 예시된 것과 같이, 당해 기술분야의 몇몇 이전 연구에서 원래 타입 Ⅱ 돌연변이로 불렸다.

여기서 사용되는 바와 같이, "항체"는 특정 항원과 면역학적으로 반응성인 면역글로블린 분자에 대한 언급을 포함하고, 다클론 및 단클론 항체를 사용하는 것을 포함한다. 용어는 또한 키메라 항체(예를 들면, 인간화된 쥐 항체), 이종접합(heteroconjugate) 항체(예를 들면, 양특이성 항체) 같은 유전학적으로 처리된 형태를 포함한다. 용어는 여기서 특히 재조합 단쇄 Fv 단편(scFv), 이황화물 안정화된 Fv 단편(dsFv)(여기서 참고로 도입된 U.S.S.N. 08/077,252 참조) 또는 pFv 단편(U.S. 특허 가출원 60/042,350 및 60/048,848 참조) 을 언급한다. "항체"라는 용어는 또한 항원-결합 능력을 가지는 단편을 포함하는 항체의 항원 결합 형태를 포함한다 (예를 들면, Fab', F(ab')₂, Fab, Fv 및 rIgG. 또한 Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) 참조. 또한 Kuby, J., Immunology, 3nd Ed, W.H. Freeman & Co., New York (1998) 참조). 용어의 어떤 특별한 의미 또는 의미들이 의도되는지는 문맥에서 명백할 것이다.

특별한 항원과 면역학적으로 반응성인 항체는 파지 또는 유사한 벡터에서 재조합 항체의 라이브러리의 선택과 같은 재조합 방법, 예를 들어, Huse et al., Science 246: 1275- 1281(1989): Ward et al., Nature 341:544 - 546(1989); 및 Vaughan et al., Nature Biotech. 14:309-314(1996) 참조, 또는 항원을 가지거나 또는 항원을 엔코딩하는 DNA를 가진 동물을 면역화시키는 것에 의해서 발생될 수 있다.

전형적으로, 면역글로블린은 중쇄 및 경쇄를 가진다. 각각 중쇄 및 경쇄는 불변부위(constant region) 및 가변부위를 함유한다 (부위는 또한 "영역"으로 알려진다). 경쇄 및 중쇄 가변부위들은 세 개의 다변이부위들(hypervariable regions)이 삽입된 4개의 "골격"(framework)부위들 및 소위 "상보성 결정부위들" 또는 "CDR들"을 함유한다. 골격부위들 및 CDR들의 범위는 규정되었다(상기 Kabat 참조). 상이한 경쇄 또는 중쇄의 골격부위들의 서열들은 종 내에서 상대적으로 보존된다. 중쇄 및 경쇄의 조합된 골격부위들인 항체의 골격부위들은 3차원 공간에서 CDR들을 위치시키고 정렬시키는데 소용된다.

CDR들은 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는데 1차적인 원인이 된다. 각 쇄의 CDR들은 N-말단으로부터 시작하여 차례로 번호 매겨진 CDR1, CDR2 및 CDR3로서 전형적으로 언급되고, 또한 특정 CDR이 위치되는 쇄에 의해서 전형적으로 확인된다. 따라서 V_H CDR3은 그것이 발견되는 항체의 중쇄의 가변부위에 위치되는 반면, V_L CDR1은 그것이 발견되는 항체의 경쇄의 가변부위로부터 CDR1이다.

"V_H" 또는 "VH"에 대한 언급들은 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab의 중쇄를 포함하는, 항체의 면역글로블린 중쇄의 가변부위를 언급한다. "V_L" 또는 "VL"에 대한 언급들은 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab의 경쇄를 포함하는, 항체의 면역글로블린 경쇄의 가변부위를 언급한다.

"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 라는 어구는 전통적인 2쇄 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역들이 1쇄를 형성하기 위해서 합쳐진 항체를 언급한다. 전형적으로, 연결 펩티드(linker peptide)는 두 쇄들 사이에 삽입되어 적절한 접힘과 활성 결합자리의 창조를 가능하게 한다.

용어 "연결 펩티드"는 간접적으로 중쇄의 가변영역을 경쇄의 가변영역에 직접적으로 결합시키는데 소용되는 항체 결합 단편(예컨대, Fv 단편) 내의 펩티드에 대한 언급을 포함한다.

용어 "모체 항체"(parental antibody)는 모체 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체들 또는 그것들의 단편들을 얻기 위해서 돌연변이되거나 변이될 관심 항체를 일반적으로 언급한다. 여기서 사용되는 것과 같이, "모체 항체"라는 용어는 만일 문맥에 의해서 요구되거나 또는 지시되지 않는다면, "MR1"(GenBank Accession Number U76382)로서 명명된 scFv를 언급한다.

용어 "핫스팟"(hotspot)은 CDR의 뉴클레오티드 서열의 부분 또는 특별히 높은 자연 돌연변이의 자리인 가변영역의 골격부위의 부분을 의미한다. CDR들이 자체가 다변이성 부위들로 인식되더라도, 돌연변이들은 CDR들 전체를 통해서 균일하게 분포되지 않다는 것이 알려져 있다. 특별한 자리들, 또는 핫스팟들은 집중된 돌연변이들을 겪는 이러한 위치들로서 확인되었다. 핫스팟들은 다수의 구조적 특징들과 서열들에 의해 특징된다. 이러한 "핫스팟 모티프"(hotspot motifs)는 핫스팟들을 확인하는데 이용될 수 있다. 특히 잘 특징되는 두 개의 공통서열(consensus sequence) 모티프들은 테트라뉴클레오티드 서열 RGYW 및 세린 서열 AGY이고, 여기서 R은 A 또는 G, Y는 C 또는 T, 및 W는 A 또는 T이다.

"표적화 모이어티"(targeting moiety) 또는 "표적화 분자"는 면역접합체를 관심 세포들에 표적화하는 능력을 가진 면역접합체의 부분이다. 전형적으로, 표적화 모이어티는 관심 세포들의 특이 항원을 인식하는, 항체, scFv, dsFv, Fab, 또는 F(ab')₂이다.

"독성 모이어티"(toxic moiety)는 면역독소에 도입될 때 관심 세포들에 면역독소 세포독성을 부여하는 세포독소 또는 세포독소의 부분이다.

"면역독소"는 scFv 같은 표적화 분자, Pseudomonas 외독소("PE") 같은 독성 모이어티, 또는 이것들의 세포독성 단편을 포함하는 분자이다.

여기서 논의되는 면역독소는 전형적으로 E.coli 에서 내포체에서 발현되며, 내포체가 정제된 후, 6M 구아딘 HCl에서 용해되고, 단백질이 되졉혔다. 여기서 사용된 "수율"이라는 용어는 이 절차를 통해서 모집되는 적절하게 접혀진 단위체 면역독소의 양을 언급한다. 이것은 MonoQ 이온교환크로마토그래피 후의 단백질 밀리그램/ 재접혀진 내포체 단백질 밀리그램으로 결정되는 퍼센트로서 표현된다.

"치료 부분" 은 치료제로서 활동하도록 의도된 면역접합체의 부분이다.

"치료제"라는 용어는 현재 알려지거나 혹은 항-종양성, 항-염증제, 사이토키닌, 항-감염성제, 효소 활성제 또는 금지제, 또는 알로스테릭(allosteric) 조절제, 또는 환자에게 원하는 치료적 효과를 유도하기 위해 투입되는 다른 제제 또는 항체로 활동하기 위해서 후에 개발되는 다수의 화합물들을 포함한다. 치료제는 또는 독소 또는 방사선동위원소일수 있으며, 여기서 의도되는 치료적 효과는, 예를 들면 암세포의 사멸이다.

"검출가능한 표지"는 면역접합체에 관해서는, 그 존재를 검출할수 있게 하는특성을 가지는 면역접합체의 부분을 의미한다. 예를 들면, 면역 접합체는 존재하는 세포가 면역조직화학적 분석에서 검출되도록 하는 방사선 동위원소로 표지될 수 있다.

"효과기 모이어티" 또는 "효과기 분자" 는 표적화 모이어티에 의해서 표적화된 세포에 대해서 효과를 가지거나 혹은 면역접합체의 존재를 확인하도록 의도된 면역접합체의 부분을 의미한다. 따라서 효과기 모이어티는 예를 들면, 치료적 모이어티, 독소, 방사선표지, 또는 형광표지일 수 있다.

"면역접합체"라는 용어는 직접적으로(예를 들면, 공유 결합을 통해서),또는 간접적으로(예를 들면, 연결 펩티드를 통해서) 효과기 분자에 부착된 목표분자(scFv 와 같은)를 포함하는 키메라 분자를 의미한다. 면역접합체의 부분집합에서, 효과기 분자는 독소이며, 키메라 분자는 보다 더 상세하게는 "면역독소"로 용어화된다.

"효과적인 량" 또는 "효과적이게 하는 양" 또는 "치료적으로 효과적인 양"은 원하는 효과, 예를 들면, 세포 단백질 합성을 적어도 50 % 억제시키거나 혹은 세포를 죽이는 것을 나타내기에 충분한 치료제의 복용량에 대한 언급을 포함한다.

용어 "독소"는 아브린(abrin), 리신(ricin), Pseudomonas 외독소(PE), 디프테리아 독소(DT), 보툴리늄(botulinum) 독소, 또는 이것들의 수식된 독소에 관한 언급을 포함한다. 예를 들면, PE 및 DT는 전형적으로 간 독성을 통해서 죽음을 야기하는 매우 독성인 화합물이다. 그러나 PE 및 DT는 독성의 본래의 표적화 성분(예를 들면, PE의 영역 Ia 또는 DT의 B쇄)을 제거하고 그것을 항체 같은 상이한 표적화 모이어티로 대체함으로써 면역독소로서 사용하기 위한 형태로 변형될 수 있다.

용어 "IC₅₀"은 단백질 합성을 50% 억제하는데 필요한 독소 또는 면역독소의 (ng/㎖로 표현된 )농도이다.

"접촉"이라는 용어는 직접적으로 물리적 관련을 가지게 하는 언급을 포함한다.

"발현 플라스미드"는 원하는 분자를 엔코딩하는 뉴클레오티드서열을 포함하며, 이것은 프로모터와 작동적으로 연결된다.

여기서 사용될 때, "폴리뉴클레오티드", "폴리펩티드" 및 "단백질" 는 상호 교환가능하게 사용되며, 아미노산 잔기의 폴리머에 대한 언급을 포함한다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 자연 발생적인 아미노산, 또는 자연적으로 발생한 아미노산 폴리머에 상응하는 인위적인 화학적 유사물인 아미노산 폴리머에 적용된 다. 용어는 또한 단백질이 기능성으로 남아있는 보존적인 아미노산 치환을 함유하는 폴리머에 적용된다.

"잔기" 또는 "아미노산 잔기" 또는 "아미노산"이라는 용어는 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드(집합적으로"펩티드")로 도입되는 아미노산에 대한 언급을 포함한다. 아미노산은 자연적으로 발생한 아미노산 일 수 있으며, 다른 제한이 없다면, 자연적으로 발생한 아미노산처럼 유사한 방법으로 기능할 수 있는 자연 아미노산의 알려진 유사물을 포함할 수 있다.

여기서 언급된 아미노산 및 유사물은 하기 표 1 의 약어와 같이 기술될 수 있다.

[표 1]

아미노산 명명

이름 3-문자 1-문자

------------------------------------------------------

알라닌 Ala A

아르기닌 Arg R

아스파라긴 Asn N

아스파라긴산 Asp D

시스테인 Cys C

글루탐산 Glu E

글루타민 Gln Q

글리신 Gly G

히스티딘 His H

이소루신 Ile I

루신 Leu L

리신 Lys K

메티오닌 Met M

페닐알라닌 Phe F

프롤린 Pro P

세린 Ser S

트레오닌 Thr T

트립토판 Trp W

티로신 Tyr Y

발린 Val V

" 보존적인 치환" 은 단백질을 기술할 때, 실질적으로 단백질의 활성을 변화시키지 않는 단백질 아미노산 조성의 변화를 언급한다. 그래서, 특정한 아미노산 서열의 "보존적으로 변형된 변화" 는 단백질 활성에 심각하지 않는 이들 아미노산의 아미노산 치환 또는 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산으로 아미노산을 치환하여(예를 들면, 산성, 염기성, 양으로 대전, 음으로 대전, 극성 또는 비극성 등등), 임계적인 아미노산의 치환조차도 실질적으로 활성을 변형시키지 않게 하는 것을 언급한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적인 치환 표는 본 분야 에서 잘 알려져 있다. 표 2에서 다음의 여섯그룹은 각각 전형적으로 서로에 대해서 보존적인 치환인 아미노산을 함유하고 있다.

[표 2]

1) 알라닌(A) 세린(S), 트레오닌(T);

2) 아스파라긴산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 리신(K)

5) 이소루신(I), 루신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).

또한 Creighton, Proteins, W.H. Freeman and company, New York(1984)를 참조하라. 그러나 페닐알라닌 및 트립토판이 일반적으로 서로에 대해서 보존적인 치환인 것으로 고려되는 반면, scFv MR1의 V_L CDR3의 핫스팟에서 페닐알라닌에 대한 트립토판의 치환은 그것의 양친 scFv보다 활성인 면역독소를 만든다. 따라서 이러한 아미노산이 CDR 밖의 항체의 부분에 대해서는 보존적인 치환으로 고려되는 반면, 이들 두 아미노산은 핫스팟 내에서는 서로 간에 보존적인 치환이 아니다. 이러한 결과에 기인하여, 핫스팟 내에서 어떤 아미노산 치환도 이들이 시험 예를 들어, 이들이 결과적인 분자의 결합 친화성, 표적화 모이어티로서 그 분자로 만들어진 면역독소의 수율 혹은 양자에 영향을 미치는지를 여부를 결정하기 위해서 여기서 시행된 분석법에 의해서 시험되지 않는다면, 보존적이라고 고려될 수 없다.

펩티드의 문맥에서 "실질적으로 유사"라는 용어는 펩티드가 10 - 20 아미노산의 비교 창에서 기준 서열에 대해서 적어도 90 %, 바람직하게는 적어도 95 % 의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하는 것을 가르킨다. 서열 동일성의 퍼센트는 비교창에서 두개의 최적으로 정열된 서열을 비교하는 것에 의해서 결정되며, 여기서 비교창에서 폴리뉴클레오티드 서열의 부분은 두서열의 최적 배열에 대해서 기준 서열(추가 또는 결실을 포함하지 않는다)에 비교하여 추가 또는 결실(즉, 갭(gap))을 포함할 수 있다.

퍼센트는 양 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 매치된(matched) 위치의 수를 산출하고, 매치된 수를 비교창에 있어서 위치의 총수로 나눈다음 결과에 100 을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 산출하는 것에 의해 계산된다.

"이황화물 결합"(disulfide bond) 또는 "시스테인-시스테인 이황화물 결합"이라는 문구는 시스테인들의 황 원자들이 산화되어 이황화물 결합을 형성하는 두 시스테인들 사이의 공유적 상호작용을 언급한다. 이황화물 결합의 평균 결합 에너지는 수소 결합에 관한 1∼2㎉/㏖과 비교되는 약 60㎉/㏖이다. 본 발명의 문맥에서, 이황화물 결합을 형성하는 시스테인들은 단쇄 항체의 골격부위 내에 존재하고, 항체의 형태를 안정화시키는 역할을 한다.

"접합", "합침", "결합", 또는 "연결" 이라는 용어는 두 폴리펩티드를 하나의 연속적인 폴리펩티드 분자로 만드는 것을 언급한다. 본 발명의 문맥에서, 이 용어들은 항체 부분이 효과기 분자(EM)과 합쳐지는 것을 언급함을 포함한다. 연결 은 화학적 또는 재조합 방법에 의해서 이루어질 수 있다. 화학적 방법은 항체부분과 효과기 분자사이의 반응을 언급하며, 하나의 분자를 형성하는 두 분자사이에 하나의 공유 결합이 존재하게 된다.

여기서 사용될 때, "재조합"은 단백질을 발현할 수 있는 DNA 의 내인성 복사본을 그들의 자연상태에서는 가지지 않은 세포를 이용하여 생산된 단백질에 대한 언급을 포함한다. 세포들은 그들이 적절한 분리된 핵산 서열의 도입에 의해서 유전적으로 변형되었기 때문에 재조합된 단백질을 생산한다. 이 용어는 이종의 핵산의 도입, 또는 그 세포에 고유하지 않는 형태로의 원핵산의 변경에 의해서 변형된 세포, 핵산, 또는 벡터에 대한 언급, 그리고 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유도되었다는 언급을 포함한다. 그래서, 예를 들면, 재조합 세포는 세포의 원(비-조합) 형태내에서는 발견되지 않는 유전자를 발현시키거나, 원형에서는 발견되지 않는 유전자의 돌연변이를 발현시키고 또는 비정상적으로 발현되지 않는다면, 저발현되거나 혹은 전혀 발현되지 않는 원유전자를 발현시킨다.

여기서 사용되는 "핵산" 또는 "핵산서열"은 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체에 대한 언급을 포함하며, 다른 제한이 없다면, 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 핵산을 혼성화하는 자연 뉴클레오티드의 알려진 유사체를 포함한다. 다른 언급이 없다면, 특별한 핵산 서열은 이들의 상보성 서열 및 보존적 변이체 즉 코돈의 워블(wobble) 위치에 존재라는 핵산 및 단백질로 전사될 때, 아미노산의 보존적 치환의 결과에 이르는 변이체를 포함한다.

여기서 사용되는 것과 같이, 특정한 핵산에 관한 "엔코딩"은 특정한 단백질로의 전사에 대한 정보를 포함하는 핵산에 대한언급을 포함한다. 정보는 코돈의 이용에 의해서 구체화된다. 전형적으로 아미노산 서열은 핵산에 의해서, "보편적인" 유전자 코드를 이용하여 엔코드된다. 그러나, 보편적이 코드의 변이체, 예를 들면 어떤 식물, 동물, 및 곰팡이 미토콘드리아, 박테리아 Mycoplasma capricolum(Proc. Nat'l Acad. Sci.USA 82:2306 - 2309(1985)), 또는 섬모충 Macronucleus 가, 핵산이 이러한 유기체들의 전사 기구를 이용하여 발현될 때, 사용될 수 있다.

"인프레임 융합"(fusing in frame)이라는 문구는 접합된 핵산 서열이 원래 폴리펩티드 쇄들을 포함하는 단쇄 단백질로 전사되도록 폴리펩티드들을 엔코딩하는 둘 이상의 핵산 서열들을 접합시키는 것을 언급한다.

여기서 사용되는 것과 같이, "발현된"은 핵산의 단백질로의 전사에 대한 언급을 포함한다. 단백질은 발현되고, 세포내에 잔존하고, 세포표면막의 성분이 되거나 혹은 세포외 매트릭스 또는 배지로 분비될 수 있다.

"숙주 세포"는 발현 벡터의 복제 또는 발현을 지지할 수 있는 세포로 의미된다. 숙주세포는 E.coli 와 같은 원핵 세포, 효모, 곤충, 양서류, 포유류세포와 같은 진핵 세포일수 있다.

"파지 디스플레이 라이브러리"(phage display library)라는 문구는 박테리오파지 집단을 언급하며, 각각은 표면 단백질에 재조합적으로 인프레임 융합된 외래 cDNA를 함유한다. 박테리아 숙주, 전형적으로 E.coli에서 복제 후, 관심 외래 cDNA를 함유하는 파지는 파지 표면상에 외래 단백질을 발현시킴으로써 선택된다.

둘 이상의 핵산들 또는 폴리펩티드 서열들의 문맥에서 용어 "동일한" 또는 "동일성"은, 다음 서열 비교 알고리즘들 중 하나를 사용하거나 시각 조사에 의해 측정시 최대 일치를 위해 정렬되어 비교될 때, 동일하거나 특정 퍼센티지의 동일한 아미노산 잔기들 또는 뉴클레오티드들 가진 둘 이상의 서열들 또는 아서열들(subsequences)을 나타낸다.

두 핵산 혹은 폴리펩티드의 "실질적으로 동일"이라는 문구는 문맥에 있어서, 최대 일치를 위해서 비교되고 정열되었을 때, 하기의 서열 비교 알고리즘 또는 육안관측 중의 하나를 이용하여 측정될 때, 적어도 60 % 이상, 바람직하게는 80 %, 가장 바람직하게는 90 - 95 % 이상의 뉴클레오티드 혹은 아미노산 잔기 동일성을 가지는 두 이상의 서열 혹은 부분서열을 의미한다. 바람직하게는, 실질적으로 동일은 적어도 약 50 잔기의 길이인 서열의 부위상에서, 바람직하게는 적어도 100 잔기의 부위상에서 존재하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 적어도 약 150 잔기상에서 실질적으로 동일한 것이다.

서열 비교에서, 전형적으로 하나의 서열은 기준서열로서 기능하며, 시험 서열이 그것에 대해서 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 경우에, 시험 및 기준 서열은 검퓨터에 입력되고, 부분서열 좌표가 지정되고 및, 필요하다면 서열알고리즘 프로그램 파라메터가 지정된다. 서열 비교 알고리즘은 다음 기준서열에 관한 시험 서열의 서열 동일성 퍼센트를, 지정된 파라메타에 기준하여 프로그램을 계산한다. 그러한 정렬용의 다수의 프로그램이 본 분야에서 알려져있다.

두 핵산 서열 혹은 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 것을 알려주는 다른 기준은 제 1 핵산에 의해서 엔코드된 폴리펩티드가 면역학적으로 제 2 핵산에 의해서 엔코드된 폴리펩티드와, 하기와 같이, 교차 반응성이라는 것이다. 그래서, 폴리펩티드는 전형적으로 제 2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하며, 예를 들며, 두 펩티드가 단지 보존적인 치환에 의해서 다른 경우이다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다고 하는 다른 기준은 하기의 엄격한 조건하에서 서로간에 두 분자가 혼성화된다는 것이다.

"in vivo"라는 용어는 세포가 얻어지는 유기체 체내를 언급한다. "Ex vivo" 또는 "in vitro" 는 세포가 얻어지는 유기체 체외를 언급한다.

"유해한 세포" 또는 "유해성" 이라는 문구는 종양 또는 종양세포를 언급하며, 이들은 침입적이며 및/또는 전이를 할수 있음며, 즉 암세포이다.

여기서 사용되는 것과 같이, "포유류 세포' 는 인간, 쥐, 마우스, 기니 돼지, 침팬치, 또는 마카스를 포함하는 포유류로부터 유도된 세포에 대한 언급을 포함한다. 이 세포들은 in vivo 혹은 in vitro 적으로 배양될 수 있다.

"선택적으로 반응성"이라는 용어는 항원에 관해서는 전체적으로 혹은 부분으로, 그 항원을 결여한 세포 또는 조직에 대해서는 아니지만 항원을 함유하는 세포 또는 조직과는 우선적으로 결합하는 것을 의미한다. 어느 정도의 비-특이적 상호작용이 분자와 비-표적세포 또는 조직과의 사이에서 발생할 수 있다는 것은 물론 인식된다. 그럼에도, 선택적인 반응성은 항원의 특이적 인식을 통해서 고려될 때 구별될 수 있다. 선택적인 반응성 항체가 항원에 결합한다 할지라도, 그들은 낮은 친화성로 그렇게 할 수 있다. 반면, 특이적 결합은 보다 항체와 항원을 지니는 세포 사이에 있어서, 항원을 결여한 세포와 고정된 항체사이에서 훨씬 더 강한 결합의 결과에 이른다. 특이적 결합은 전형적으로 2배, 바람직하게는 5배, 보다 바람직하게는 10배, 가장 바람직하게는 100배 정도 더, EGFRvⅢ가 결여된 조직 또는 세포에 비교해서 EGFRvⅢ를 지니는 세포 또는 조직에 대해서 결합항원의 양이 큰 결과에 이른다. 그러한 조건하에서 단백질에 대한 특이적 결합은 특정한 단백질에 대한 특이성에 대해서 선택적인 항체를 요구한다. 다양한 면역측정 형식이 특정한 단백질에 대해서 특이적으로 면역활성인 항체를 선택하는데 적절하다. 예를 들면, 고체-상 ELISA 면역측정은 통상적으로 어떤 단백질에 특이적으로 면역활성인 모노클로날 항체를 선택하는데 사용될 수 있다. Harlow & Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York(1998)를 면역측정 형식의 기술 및 특이적 면역활성을 결정하는데 사용될 수 있는 조건에 대해서 참조하라.

"면역학적 반응 조건" 용어는 특별한 에피토프에 대해서 발생한 항체가실질적으로 모든 다른 에피토프에 대한 결합보다 검출가능하게 더 많은 정도까지 및/또는 실질적으로 배제하는 정도까지 그 에피토프에 결합하게 하는 조건에 대한 언급을 포함한다. 면역학적 반응 조건들은 항체 결합반응의 형식에 의존하며, 전형적으로 면역측정 프로토콜에서 이용되는 것들 또는 in vivo 에서 마주치게되는 조건들이다. 상기 Harlow & Lane 을 면역측정 형식 및 조건의 기술에 대해서 참조하라. 바람직하게는 본 발명의 방법에서 사용되는 면역학적 반응조건은 전형적으로 살아있는 포유류 또는 포유류 세포내에 존재하는 조건(예를 들면, 온도, 삼투몰농도, pH)에 대한 언급을 포함하는 "생리학적 조건" 이다. 일부 기관들이 극한 조건을 겪는다는 것이 인식될지라도, 유기체내 및 세포내 환경은 통상적으로 pH 7 근방에 존재하며(즉, pH 6.0 에서 pH 8.0, 보다 전형적으로는 pH 6.5 - 7.5), 주용매로서 물을 함유하고, 0 ℃ 에서 50 ℃ 사이에 존재한다. 삼투몰농도는 세포의 생존과 번식을 지탱하는 범위에 존재한다.

III. MR1 보다 EGFRvIII 에 대해서 더 높은 친화성을 가지는 항체의 생성.

항체는 그들의 CDR 들에서 잔기를 통해 항원과 결합한다. 결과적으로, CDR 들의 돌연변이 유발은 항체의 Fab 및 Fv 의 친화성 향상을 위해서 넓게 이용된다. CDR 돌연변이 유발에 대한 많은 다른 접근들이 있다. 이들의 대부분, 예를 들면 코돈-계 돌연변이 유발(Yelton et al., J. Immunol. 155:1994 - 2004(1995)), CDR walking(Barbas et al.,Trends Biotech. 14 :230 - 234(1996); Yang et al.,J. Mol. Biol. 254: 392 - 40(1995)), 에라성 복제(Low et al., J. Mo;.Biol. 260: 359 - 386(1996)) 및 합성 CDR 구축(de Kruif et al., J. Mol. Biol. 248:97 - 105(1995)) 은 기술적으로 만들기 어려우며, 다루기 어려운 많은 라이브러리의 구축을 요구한다. 항체 친화성 돌연변이에 있어서의 경향은 상대적으로 작은 크기의 라이브러리로부터 높은 친화성 바인더(binder)를 분리하는 것이다(Pini et al., J.Biol. Chem. 273: 21769 - 21776(1998): Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 95 : 6037 - 6042 (1998)): Chowdhury et al.,Nature Biotechol. 17: 568 -572(1999)).이러한 모든 접근들은 CDR 에서 돌연변이를 가지는 항체의 발현 라이브러리의 구축과 더 좋은 바인더를 포함한다.

파지 디스플레이 기술은 많은 펩티드 또는 단백질 라이브러리을 체질하는 유용한 도구이다 (Winter 등, Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994); McCafferty, J., Nature 348:552-554 (1990); Barbas 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991)). 단쇄 Fvs는 파지미드(phagemid) 벡터에서 M13 유전자 3 단백질과의 융합으로서 파지 입자들에서 발현될 수 있다. 융합 단백질은 E.coli에서 발현되고, 헬퍼 파지의 존재 하에서, 배양 배지에서 수집될 수 있는 M13 파지의 팁(tip)에서 디스플레이된다. 특이 하원에 결합하는 scFv 융합 단백질을 디스플레이하는 파지는 예를 들면 자기구슬(magnetic bead) 같은, 항원이 짝지워지는 표면 또는 항원을 발현시키는 세포들 상에 파지 라니브러리를 패닝(panning)함으로써 선택된다. 결합하지 않은 파지는 씻겨나가고, 결합 파지는 용출되고 재-감염 E.coli에 의해서 증폭된다. 수 회의 패닝은 특이 바인더들의 농축에 이른다. 패닝 조건을 좀더 엄격하게 함으로써 보다 좋은 바인더들이 열등한 바인더들로부터 보다 효과적으로 분리될 수 있다.

파지 디스플레이 기술은 MR1보다 높은 친화력으로 EGFRvⅢ에 결합하는 항체를 개발하는데 활용될 수 있다. 당해 기술분야에서 알려진 것과 같이, 원래 항체는 두 개의 중쇄들과 두 개의 경쇄들을 포함하며, 각 쇄는 각각 1, 2 및 3으로 지정된 3개의 CDR들을 가진다. 각 CDR은 항원 결합에 기여하는 것으로 알려지지만, 그렇게 균일하게 기여하지는 않는다. 일반적으로 Kuby, J. Immunology, W.H. Freeman & Co., New York (3nd Ed.1998) 참조. 어떤 CDR의 아미노산이 친화력을 증가시키는 돌연변이를 발견하기 위해서 돌연변이될 수 있지만, 평균으로, 각 쇄의 CDR3이 쇄의 CDR1 및 CDR 2보다 항원 결합에 더 큰 기여를 한다. 일반적으로, 상기 Kuby, 117쪽 참조. 그래서 CDR3 V_H 및 V_L 쇄들의 돌연변이가 특히 유리할 수 있다. 더구나, MR1의 CDR3 V_H는 상대적으로 마우스 CDR3에 대해서 길고, 이것은 다른 scFv에 대해 MR1 scFv의 상대적 안정성에 부분적으로 기여할 수 있다.

서에서 논의된 이유들 때문에, 항원 결합에 기여하지 않는 경향이 있어서 V_H CDR₃ 의 마지막 두 아미노산이 배제한 후, V_H CDR3 에서 잔존하는 9 개 잔기가 각각의 다른 19 개 천연 아미노산으로 치환되었다. 단지 아미노산 위치 98 및 99 각각에서 세린 및 트레오닌의 한 돌연변이만이 결과적인 면역독소의 향상된 세포독성의 결과에 이른다(V_H 및 V_L CDR3 의 아미노산 서열은 하기 표 5, 6, 7 에서 단일 문자 코드에서 설명된다. V_H 를 설명하는 서열은 두 잔기, D101 및 Y102 를 보여주기 않으며, 이것은 항원 결합에 기여하는 경향이 없는 것으로 고려되었다). V_H CDR3 에서 바람직한 치환은 P98-Y99 이었으며, 이것은 3.5 ng/ml 의 PE38 면역독소에서 IC₅₀ 을 주었으며, P98-N99, P98-W99 및 P98-V99, 이들 전부는 4.5 ng/ml 의 IC₅₀ 을 가졌으며, P98-F99 는 6 ng 의 IC₅₀, 및 P98-V99, 이것은 6.5 ng 의 IC₅₀을 가졌다. 4 클론, P98-S99, W98-V99, S98-W99, 및 P98-T99 는 양친 클론에 동일한 IC₅₀ 을 가졌다. (규약에 의해서, "P98-Y99"와 같은 용어는 아미노산 프롤릴이 지정된 폴리펩티드의 98 위치에 나타나고, 이 MR1 V_H CDR3 경우에, 티로신 99 위치에 나타남을 가르키며, 그러나 분자의 나머지가 양친 항체 MR1, 이경우 통상적인 폴리펩티드의 그것이라는 것을 가르킨다.)

V_L CDR3의 돌연변이에 관해서, 단지 한 돌연변이, F92W가 모체보다 활성인 면역독소를 제공하였다. 그것의 IC₅₀은 1.3ng/㎖이었다. 이 경우, "모체" 분자는 V_H CDR3에서 P98-Y99 치환들이 있는 MR1이었고, V_L CDR3에서 추가 치환 없이 그것은 3.5ng/㎖의 IC₅₀을 가졌다. V_H 및 V_L 쇄들 모두의 CDR3(V_H S98P-T99Y-V_LF92W)에서의 돌연변이들을 결합시킨 이 돌연변이된 MR1은, 면역독소의 표적화 부분으로서 사용됐을 때, 시험된 최고의 세포독성 형태였고, 이제 "MR1-1"으로 칭해진다.

이러한 결과들은 여러 CDR에서의 돌연변이들이 부가적인 효과를 가질 수 있고 결과적인 면역독소의 세포독성을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 이러한 결과의 관점에서, MR1의 V_H 및 V_L 쇄들의 CDR 1 및 2의 핫스팟들에서 아미노산들의 돌연변이들은 EGFRvⅢ에 대해 더 향상된 친화력 갖는 항체들 및 MR1과 비교시 더 향상된 세포독성을 갖는 면역독소들을 마찬가지로 가져온다.

클론을 분석하는 최선의 시간은 가공에서 초기이다. 클론의 손실 위험 때문에 농축 피크(enrichment peaks) 후 팬닝은 불리하다. 낮은 친화력 그러나 높은 발현을 갖는 Fvs가 우선적으로 농축되는 것이 가능하지만, 좋은 바인더가 손실될 수 있다. 이것을 지지하는 증거가 경쇄 CDR3 라이브러리를 패닝하는 동안 관측되었다: 낮은 친화력(K_d 22nM)을 갖는 돌연변이체 F92S가 세 번째 라운드 후 시험된 10 클론들 중 중 7 클론들에서 발견되었지만, 가장 좋은 바인더, F92W는 단지 한번 존재하였다. 반대로, 두 번째 라운드에서 F92S가 17 클론들 중 2 클론들에서만 발견되었지만, F92W는 17 클론들 중 6 클론들에서 존재하였다.

IV. 항-EGFRvIII 항체

본 발명은 종전의 항체보다 높은 친화성을 가지고 EGFRvⅢ에 결합하며, EGFRvⅢ과 선택적으로 반응하는 항체를 제공한다. 특히, 본 발명은 EGFRvⅢ에 관해서는 이 항원에 대해 표적화된 종전의 가장 잘 알려진 scFv인 MR1보다 낮은 Kd를 갖는 항체를 제공한다. 더구나, 이들 항체는 MR1로부터 제조된 동일한 면역독소보다 높은 세폭독성을 EGFRvⅢ-발현 세포에 대해서 가지는 면역독소를 형성한다. 본 발명은 더 높은 친화성 및 더 큰 세포독성을 EGFRvⅢ에 대해서 MR1보다 더 가지는 항체 형성 방법을 제공한다. 하기에서 공개되는 면역접합체는 본 발명의 항체를 이용하여 EGFRvⅢ를 표적화한다. 이러한 항체들은 선택적으로 면역학적 조건에서 포유류 세포의 표면에 디스플레이된 EGFRvⅢ 결정기에 반응하고 세포외 주위로부터 항체에 접근할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 항-EGFRvⅢ 항체는 scFv 또는 이황화물 안정화된 Fv 항체 같은 재조합 항체이다. Fv 항체는 전형적으로 약 25kDa이고, 중쇄 및 경쇄 모두에서 3 CDR들을 갖는 완전 항원-결합 자리를 함유한다. 만일 V_H 및 V_L 쇄들이 비-접촉적으로(non-contiguously) 발현된다면, Fv 항체의 쇄들은 비공유 상호작용에 의해서 함께 전형적으로 유지된다. 그러나 이러한 쇄들은 희석시 분해되는 경향이 있고, 그래서 쇄들을 글루타르알데히드, 세포간 이황화물, 또는 펩티드 연결제를 통해 가교시키는 방법이 개발되었다. 이황화물 안정화된 Fvs는 예를 들면 미국특허 제5,747,654호에서 교사된다.

특히 바람직한 실시예에서, 항체는 단쇄 Fv(scFv)이다. scFv 항체의 V_H 및 V_L 부위들은 2쇄 항체들에서 발견된 것과 유사한 항체 결합 자리를 만들기 위해서 접혀지는 단쇄를 포함한다. 일단 접혀지면, 비공유 상호작용이 단쇄 항체를 안정화시킨다. 좀더 바람직한 실시예에서, scFv는 재조합적으로 생산된다. 당업자는 본 발명의 항체들의 보존성 변이체들이 만들어질 수 있음을 인식할 것이다. scFv 단편들에서 사용되는 그러한 보존성 변이체들은 V_H 및 V_L 부위들 사이에서 정확한 접힘과 안정화를 위해 필요한 결정적인 아미노산 잔기들을 보유할 것이다.

본 발명의 몇몇 실시예에서, scFv 항체는 경쇄를 통해 효과기 분자(EM)에 직접적으로 연결된다. 그러나 scFv 항체들은 아미노 또는 카르복실 말단을 통해서 EM에 연결될 수 있다.

몇몇 항체 실시예의 V_H 및 V_L 부위들은 함께 직접적으로 연결될 수 있는 한편, 당업자는 부위들이 하나 이상의 아미노산으로 구성된 펩티드 연결제에 의해서 분리될 수 있다는 것을 인식할 것이다.

펩티드 연결제들과 이것들의 사용은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 본문에 참고로서 도입되는, Huston 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 8:5879 (1988); Bird 등, Science 242:4236 (1988); Glockshuber 등, Biochemistry 29:1362 (1990); US 특허 제4,964,778호, US 특허 제5,132,405호, 및 Stemmer 등, Biotechniques 14:256-265 (1993) 참조. 일반적으로 펩티드 연결제는 부위들을 연결하거나 약간의 최소 거리 또는 다른 공간 관계를 V_H와 V_L 사이에서 유지하는 것 이상의 특이 생물학적 활성을 가지지 않는다. 그러나 펩티드 연결제의 구성 아미노산은 접힙, 순전하(net charge), 또는 소수성 같은 몇몇 분자 특성에 영향을 미치기 위해서 선택될 수 있다. 단쇄 Fv(scFv) 항체들은 길이에 있어 50 이하의 아미노산의 펩티드, 일반적으로는 40 이하의 아미노산, 바람직하게는 30 이하의 아미노산, 및 좀더 바람직하게는 20 이하의 아미노산을 옵션으로 포함한다. 몇몇 실시예에서, 펩티드 연결제는 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser의, 바람직하게는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 그러한 서열들의 콘카타머(concatamer)이다. 그러나 일부 아미노산 치환들이 연결제 내에서 만들어질 수 있다는 것은 인지되어야 한다. 예컨대, 발린은 글리신 대신에 치환될 수 있다.

A. scFv 의 생성

전술한 바와 같이, 바람직한 실시예에서, 항체(예컨대 면역독소의 표적화 모이어티)는 scFv이다. scFv를 만드는 방법은 설명되어 왔다. 상기 Huse 등; Ward 등, Nature 341:544-546 (1989); 및 상기 Vaughan 등 참조. 간단히 말해서, B-세포들로부터의 mRNA가 분리되고, cDNA가 제조된다. cDNA는 잘 알려진 PCR 같은 기법에 의해서 면역글로블린들의 중쇄 및 경쇄의 가변부위들에 대해 특이적인 시발체들(primers)을 사용하여 증폭된다. PCR 생성물들은 예컨대 아가로스 겔 전기영동에 의해서 정제되고, 핵산 서열들이 결합된다. 연결제 펩티드가 요망되면, 펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열들이 중쇄 및 경쇄 핵산 서열들 사이에 삽입된다. 서열들은 공지된 기법 예컨대, 둔단연결(blunt end ligation), PCR 생성물의 종단에서 제한 자리의 삽입, 또는 중첩 확장의 스플라이싱에 의해서 결합된다 (Chowdhury 등, Mol. Immunol. 34:9 (1997)). 증폭 후, scFv를 엔코딩하는 핵산이 다시 공지된 기법에 의해서 벡터에 삽입된다. 바람직하게는, 벡터는 원핵생물에서 복제될 수 있고, 원핵 및 진핵생물에서 발현될 수 있다. 바람직한 실시예에서, scFv 유전자들은 짭은 연결제에 의해 PE38 유전자와 결합하고, T7-계 발현 벡터로 클론화된다. 특히 바람직한 실시예에서, scFv는 E.coli BL21(λDE3)에서 T7 프로모터의 조절 하에서 발현된다.

전술한 바와 같이, EGFRvⅢ에 특이적으로 결합하는 scFv는 패닝에 의해서 발견된다. 패닝은 몇몇 방법에 의해서 수행될 수 있다. 본 발명에 관한 바람직한 방법에서, 패닝은 표면 상에 EGFRvⅢ을 발현시키는 세포들을 사용하여 편리하게 수행될 수 있다. 세포들을 사용하는 패닝을 수행하는 프로토콜은 하기 실시예에 설명된다. 패닝은 또한 고체 표면을 EGFRvⅢ으로 코팅하고 적절한 조건 하에서 적절한 시간 동안 표면상에서 파지를 배향함으로써 고체 표면상에서 수행될 수 있다. 편리하게는, 표면은 자기구슬일 수 있다. 결합하지 않은 파지는 고체 표면에서 세척되고, 결합한 파지는 용출된다.

가장 높은 친화성을 가지는 항체를 발견하는 것은 선택공정의 효율에 의해서 지시되고, 체질될 수 있는 클론의 수와 그것이 행해지는 엄격성에 달려있다. 전형적으로 보다 높은 엄격함은 보다 선택적인 팬닝에 상응한다. 그러한 조건이 너무 엄격하면, 파지는 결합하지 않을 것이다.1 회의 팬닝후, EGFRvIII 코팅된 판, 또는 표면에 EGFRvIII를 발현하는 세포에 고정된 파지는 E.coli 에서 확장되고, 몇회의 팬닝을 겪는다. 이러한 방법으로, 많은 배의 농축이 3 회 팬닝에서 발생한다. 그래서, 비록 각회의 농축이 낮을 때 조차도, 수회의 팬닝은 희박한 파지의 분리와 가장 높은 친화성을 가지는 scFv 를 엔코드하는 유전물질 또는 파지상에서 더 잘 발현되는 것의 분리에 이른다.

선정된 팬닝의 방법에 관계없이, 파지 디스플레이에 의해서 제공되는 유전자형 및 표현형사이의 물리적인 연결은 클론의 많은 라이브러리를 가질 때조차도, 하원에 결합하기 위한 cDNA 라이브러리의 모든 구성을 시험하는 것이 가능하게 한다.

B. 항체의 결합 친화성

본 발명의 항체는 모체 항체 MR1보다 적어도 1nM 낮은 Kd로 EGFRvⅢ의 에피토프에 결합된다. 표적 항원에 대한 결합 친화성은 전형적으로 표준 항체-항원 측정 예를 들면, 경쟁적 측정, 포화 측정, 또는 ELISA 또는 RIA 같은 면역측정에 의해서 측정되거나 또는 결정된다.

그러한 분석법은 항체의 분해상수를 결정하는데 사용될 수 있다. "분해상수"라는 문구는 항원에 대한 항체의 친화력의 척도를 나타낸다. 항체의 분해상수(Kd=1/K, 여기서 K는 친화력 상수)가 마이크로몰 범위 내, 바람직하게는 < 100nM, 가장 바람직하게는 < 0.1nM이면, 항체와 항원 사이의 결합 특이성이 존재한다. 항체 분자들은 보다 낮은 범위에서 Kd를 전형적으로 가진다. Kd=[Ab-Ag]/[Ab][Ag]로서, 여기서 [Ab]는 항체의 평형에서 농도이고, [Ag]는 항원의 평형에서 농도이고, [Ab-Ag]는 평형에서 항원-항체 복합체의 농도이다. 전형적으로, 항원과 항체 사이의 결합 상호작용은 정전기적 인력, 반데르발스 힘 및 수소결합 같은 가역적 비공유 결합이다. 결합 특이성을 정의하는 방법은 단일 중쇄 및/또는 경쇄, CDR들, 단백질 융합, 또는 중쇄 및/또는 경쇄의 단편들에 적용되고, 이것들은 EGFRvⅢ에 특이적이다.

C. 면역측정

항체는 검출 및/또는 정량화될 수 있으며, 일련의 잘 인식된 면역학적 결합 측정을 이용한다(US 4,366,241; 4,376,110; 4,517,288 및 4,837,168 을 참조하라). 일반적인 면역측정의 검토를 위해서, 또한 METHOD IN CELL BIOLOGY, VOL.37, Asia, ed. Academic Press, Inc. New York(1993); BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY 7TH EDITION, Stites & Terr, eds.(1991)을 참조하라. 면역학적 결합 측정(또는 면역측정)은 전형적으로 특이적으로 결합하고, 종종 항체를 비유동화시키는 리간드(예를 들면 EGFRvIII)를 이용한다. 본 발명의 면역측정에서 사용되는 항체는 위에서 상세하게 논의된다.

면역측정은 또한 특이적으로 결합하고 리간드와 항체에 의해서 형성된 결합복합체를 표식하는 표식제를 이용한다. 표식제는 그 자체로서, 항체-분석물 (analyte) 복합체, 즉 항-EGFRvIII항체를 포함한다. 선택적으로, 표식제는 항체/EGFRvIII 단백질 복합체에 특이적으로 결합하는 세번째 부분일수 있으며, 예를 들면, 다른 항체이다.

한편으로는, 경쟁적 측정은 표식제가 표식을 지니는 제 2 항-EGFRvIII 항체인 경우에 고려된다. 두 항체는 이후 고정화된 EGFRvIII에 대해 경쟁한다. 실시예에서, 답해져야할 문제는 MR1 대한 제 1 항체의 친화성을 비교하는 것이며, 제 2 항체는 MR1 일 수 있다. 선택적으로, 비-경쟁적 형식에서, EGFRvIII 항체는 표식이 없지만, 그러나 항-EGFRvIII 항체가 유도된 종들의 항체, 예를 들면 뮤린에 대해서 특이적이고, 항-EGFRvIII 항체에 결합하는 제 2 항체가 표지된다.

면역글로블린 항상 부위, 예를 들면 단잭질 A 또는 단백질 G 에 특이적으로 결합할 수 있는 다른 단백질들은 표식제로 또한 사용될 수 있다. 이러한 단백질들은 통상의 포도상구균 박테리아의 세포벽 구성성분이다. 이들은 다양한 변종으로부터 의 면역글로블린 일정부와 강한 비-면역유전적 반응성을 나탄낸다(일반적으로, Kronval et al., J.Immunol. 111:1401-1406(1973); 및 Akerstrom et al., J. Immunol. 135:2589 - 2542(1985)을 참조하라)

측정을 통해서, 배양 및/또는 세척단계는 시약의 각 조합후에 요구될 수 있다. 배양단계는 5 초에서 수시간에 걸쳐 변할 수 있으며, 5 분에서 24 시간이 바람직하다. 그러나, 배양시간은 측정형식, 항체, 용액의 부피, 농도, 등등에 달려있 다. 비록 측정이 예를 들면 4 ℃ 에서 40 ℃ 의 온도범위를 넘어서 수행될 수 있다하더라도 통상적으로, 측정은 주위온도에서 수행될 수 있다.

본발명의 면역 측정의 상세한 사항은 사용되는 특정한 형에 따라 변할 수 있을지라도, 항체를 함유하고 있는 시료내에서 항-EGFRvIII 항체를 검출하는 방법은 일반적으로 시료를 면역학적으로 반응적인 조건하에서 EGFRvIII/항체 복합체와 접촉하게 하는 단계를 포함한다.

V. 면역접합체의 생산

본 발명에서 생성된 항-EGFRvIII 항체는 효과기 분자(EM)에 EM 카르복실 말단, EM 아미노 말단을 통해서, 시스테인과 같은 EM 의 내부아미노산 잔기 또는 이들의 조합을 통해서 연결될 수 있다. 유사하게, EM 은 항체의 큰, 작은, Fc(항상부) 또는 골격부에 결합될 수 있다. 연결은 항체의 아미노 또는 카르복실 말단 또는 내부 아미노산 잔기를 통해서 발생할 수 있다. 만일 그것의 PE 또는 세포독성 단편이 EM 으로 사용된다며, 카르복실 말단에서 혹은 근방에서 연결은 동일한 방법으로 분자를 시토졸로 유도하는 단일 서열로서 기능하는 서열을 유지하거나 혹은 부가(만일 연결이 C-말단에 존재하면) 하기 위해서 만들어 질수 있다. REDLK(단일 문자 코드에서 자연적인 PE 의 서열), KDEL, RDEL, 및 KDEL 의 반복과 같은 적절한 신호 아미노산 서열은 본 분야에서 공지되어 있다. WO 91/18099 를 참조하라. 더구나, 복수의 EM 분자들(예를 들며 2 - 10 으로부터 어느 하나)은 항-EGFRvIII 항체에 결합할 수 있고 및/또는 복수 항체(예를 들면 2 - 5 로부터 어느 하나)는 EM 에 결합할 수 있다. 특별히, 바람직한 실시예에서, KDEL은 C- 말단이다. 효과기 분자의 항체로의 연결에 의해서 형성된 분자는 면역 접합체로 알려져 있다.

치료제는 특별한 표적분자 또는 표적분자를 지닌 세포에 대해서 지정된 특별한 생물학적 활성을 가지는 제제이다. 당업자는 치료제는 빈블라스틴, 다우노마이신 등과 같은 다양한 약물, 자연의 또는 변형된 Pseudomonas 외독소 또는 Diphtheria 독소 같은 세포독소, 스스로 약물학적 조성물을 함유하는 캡슐화 제제(예를 들면 리포좀), ¹²⁵I, ³²P,¹⁴C, ³H 및 ³⁵S 및 다른 표식과 같은 방사선 제제, 표적 모이어티 및 리간드를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다.

특별한 치료제의 선택은 특별한 표적분자 혹은 세포 및 발생하기를 원하는 생물학적 효과에 달려있다. 그래서 예를 들면, 치료제는 특별한 표적세포의 사멸을 야기하는데 이용되는 세포독소일 수 있다. 역으로, 비치명적인 생물학적 반응을 야기하는 것을 단지 원한다면, 치료제는 비치명적인 약물학적 제제, 혹은 비치명적인 약물학적 제제를 함유한 리포솜에 접합될 수 있다.

여기서 제공된 치료제들 및 항체들을 사용하여, 당업자는 기능적으로 동일한 핵산들 예컨대, 서열에서 다르지만 동일한 EM 또는 항체 서열을 엔코딩하는 핵산들을 함유하는 다양한 클론들을 쉽게 구성할 수 있다. 따라서 본 발명은 항체들 및 접합체들 및 그것들의 융합 단백질들을 제공한다.

A. 재조합 방법

본 발명의 핵산 서열은 예를 들면, 적절한 서열을 클론화하는 것을 포함하는 적절한 방법에 의해서 제조되거나 또는 Narang et al., Meth. Enzymol. 68: 90 - 99 (1979) 의 포스포트리에스터 방법; Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109 - 151(1979)의 포스포디에스터 방법; Beaucage et al., Tetra. Lett. 22: 1859 - 1862(1981)의 디에틸포스포아미디트 방법; Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22(20):1859-1862(1981) 에서 기술된 고체 상 포스포아미디트 트리에스터 방법, 예를 들면, Needham-VanDevanter et al., Nucl. Acids Res. 12: 6159 - 6168(1984)에서 기술된 자동화된 합성기를 이용하는 방법; 및 US 4,458,066 의 고체지지 방법과 같은 직접 화학 합성에 의해서 제조될 수 있다. 화학 합성은 단일 가닥 올리고뉴크레오티드를 생성한다. 이것은 이중가닥 DNA 로 상보적인 서열의 혼성화 또는 단일 가닥을 주형으로 이용하면서 DNA 폴리머라제로 폴리머화하는 것에 의해서 생성될 수 있다. 당업자는 DNA 의 화학합성이 약 100 염기의 서열에 제한되고, 더 긴 서열은 짧은 서열의 결찰에 의해서 얻어질 수 있다는 것을 인식할 것이다.

바람직한 실시예에서, 본 발명의 핵산 서열은 클론화 기법을 이용하여 제조된다. 적절한 클론화 및 서열화 기법의 예들 및 많은 클론화 연습을 통해 숙련되게 하기에 충분한 지시사항들이 하기에서 발견된다; Sambrook et al., MOLECULAR CLONING ; A LABORATORY MANUAL(2 ND ED.) Vols 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)), Berger and Kimmel(eds.), GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, Academic Press, Inc., San Diego CA(1987)), 또는 Ausubel et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing and Wiley- Interscience, NY(1987). 생물학적 시료의 제조업자로부터의 생산물 정보 및 실험 장비는 또한 유용한 정보를 제공한다. 그러한 제조업자들은 SIGMA chemical company(Sanit Louis, M0), R & D systems(Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology(Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc.(Palo Alto,CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company(Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc.(Gaithersberg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland), Invitrogen(San Diego, CA) 및 PE Applied Biosystems(Foster City, CA), 및 당업자에게 알려진 많은 다른 상업적인 출처를 포함한다.

천연 효과기 분자(EM) 또는 항-EGFRvⅢ 항체를 엔코딩하는 핵산들은 본 발명의 EM, 항체들, 또는 면역접합체들을 형성하기 위해서 변형될 수 있다. 자리-지정(site-directed) 돌연변이 생성에 의한 변형이 당해 기술분야에서 공지된다. EM 및 항-EGFRvⅢ 항체들을 엔코딩하는 핵산들은 in vitro 방법으로 증폭될 수 있다. 증폭 방법은 폴리머라제 쇄 반응(PCR), 리가제 쇄 반응(LCR), 전사-계 증폭 시스템(TAS), 및 자가-보유 서열 복제 시스템(3SR)을 포함한다. 매우 다양한 클론화 방법들, 숙주세포들, 및 in vitro 증폭 방법들이 당업자에게 잘 공지되어 있다.

바람직한 실시예에서, 면역접합체는 항-EGFRvIII scFv 항체를 엔코딩하는 cDNA 에 EM 을 엔코딩하는 cDNA 를 포함하는 벡터에 삽입하는 것에 의해서 제조된다. 삽입이 이루어져, scFv 및 EM 이 프레임에서 판독되고, 그것은 하나의 연속적인 폴리펩티드로서 Fv 기능부와 EM 기능부를 함유한다. 특별히 바람직한 실시예에 서, 디프테리아 독소 단편을 엔코딩하는 cDNA 가 scFv 에 결찰되고, 그래서 독소는 scFv 의 카르보닐 말단에 위치된다. 가장 바람직한 실시예에서, 세포독성 단편은 PE38 이다.

본 발명의 EM 또는 항-EGFRvIII 항체, 또는 면역접합체를 엔코딩하는 핵산이 일단 분리되고 클론화되면, 박테리아, 식물, 이스트, 곤충, 및 포유류 세포와 같은 재조합적으로 설계된 세포에서 원하는 단백질을 발현시킬 수 있다. 당업자는 E.coli, 다른 박테리아 숙주, 이스트 및 COS, CHO, HeLa 및 골수종 세포주와 같은 다양한 보다 고등의 진핵세포를 포함하는 단백질의 발현에 이용할 수 있는 다양한 발현 시스템에서 지식이 있을것이 기대된다. 진핵 또는 원핵에서 단백질의 발현을 위해서 공지된 다양한 방법을 상세하게 서술하는 어떠한 시도도 이루어지지 않았다. 간단하게는, 본 발명의 단백질을 엔코딩하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 작동적으로 DNA 또는 cDNA 를 프로모터(이것은 구성적이거나 혹은 유도가능한 것이다)에 연결하고, 이후 발현 카세트에 도입하는 것에 의해서 성취될 것이다. 카세트는 진핵 또는 원핵 생물에서 복제와 통합에 적절할 수 있다. 전형적인 발현 카세트는 전사와 번역 종료기, 개시서열, 및 단백질을 엔코딩하는 DNA 의 발현의 제어에 유용한 프로모터를 함유한다. 편의적으로, 카세트는 하나이상의 항생물질 저항 유전자를 함유한 플라스미드에 놓여질 수 있다. 고수준의 클론화된 유전자의 발현을 얻기 위해서, 최소한 전사를 감독하는 강력한 프로모터, 변역 개시를 위한 리보솜 결합 부위, 및 전사/번역 종료기를 함유하는 발현 카세트를 구성하는 것이 바람직하다. E.coli 에서, 이것은 T7, trp,lac 또는 λ 프로모터와 같은 프 로모터, 리보솜 결합부위 및 바람직하게는 전사 종료 신호를 포함한다. 원핵 세포에 있어서는, 제어서열은 프로모터 및 바람직학 면역글로블린 유전자로부터 유도된 엔헨서(enhancer), SV40, 사이토메갈로바이러스, 아데닐중합체형성 서열을 포함할 수 있고, 스플라이스 도너 또는 억셉터 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 카세트는 선택된 숙주세포로 E.coli 에 대한 칼슘 클로라이드 변형 또는 전기천공 및 포유류세포에 대한 칼슘포스페이트 처리, 전기천공 또는 리포펙션(lipofection) 과 같은 공지된 방법에 의해서 이동된다. 카세트에 의해서 형질변환된 세포는 카세트에 함유된 내성 유전자, 예를 들면 amp, kan, gpt, neo 및 hyg 유전자에 의해서 주어지는 항생물질에 대한 내성에 의해서 선택될 수 있다. 카노미신(kanomycin) 내성 및 앰피실린(ampicillin) 내성이 파지 작업에 바람직한 실시예이다.

당업자는 생물학적 활성을 감소시키지 않고서 변형들이 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산에 대해 수행될 수 있다는 것을 인식할 것이다 (즉, 항-EGFRvⅢ 항체, PE, 또는 이것들의 조합으로부터 형성된 면역접합체). 일부 변형들은 클로닝, 발현 또는 표적화 분자의 융합 단백질로의 도입을 용이하게 하기 위해 수행될 수 있다. 그러한 변형들은 당업자에게 공지되었고, 예컨대, 개시 자리를 제공하기 위해 아미노산 말단에 추가된 메티오닌, 또는 편리하게 위치된 제한 자리들 또는 종료 코돈 또는 정제 서열들을 생성하기 위해서 양 말단에 놓인 추가 아미노산들(예컨대, 폴리 His)을 포함한다.

재조합 방법 이외도, 본 발명의 면역접합체들, EM, 및 항체들이 표준 펩티드 합성을 사용하여 전체적으로 또는 부분적으로 또한 구성될 수 있다. 길이에 있어 약 50 아미노산들 이하의 본 발명의 폴리펩티드 고체상 합성은 서열의 C- 말단 아미노산을 비용해성 지지체에 부착시키고, 이후 서열에서 남아있는 아미노산들의 연속적인 추가에 의하여 이루어질 수 있다. 고체상 합성에 관한 기법은 Barany & Merrifield, THE PEPTIDE ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY. VOL.2: SPECIAL METHOD IN PEPTIDE SYNTHESIS, PART A. pp.3-234; Merrifield 등, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963), 및 Stewart 등, SOLID PHASE PEPTIDE SYTHESIS, 2nd Ed., Pierce Chem. Co., Rockford, Ⅲ (1984)에 기술되어 있다. 더 긴 길이의 단백질은 짧은 단편의 아미노산 및 카르복실 말단 축합에 의해서 합성될 수 있다. 카르복실 말단의 활성화에 의한 펩티드 결합의 형성 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들면, N,N'-디실로헥실카보디이미드 커플링 시약의 사용에 의함).

B. 정제.

일단 발현되면, 본 발명의 재조합 면역 접합체, 항체, 및/또는 효과기 분자는 당해분야의 표준절차에 의해서, 암노늄 설페이트 침전, 친화성 컬럼, 이온 교환, 겔 여과 컬럼, 및 배치 크로마토그래피, 등등( 일반적으로, R.Scopes, PROTEIN PURIFICATON, Springe-Verlag, N. Y.(1982) 를 참조)을 포함하면서 정제될 수 있다. 실질적으로 적어도 약 90 에서 95% 동일성의 순수한 조성물이 바람직하고, 98 - 99 % 또는 그이상의 동일성이 약리학적 이용을 위해서는 가장 바람직하다. 일단 정제되며, 부분적으로 또는 바라는 동일성까지, 만일 치료적으로 사용된다며, 폴리펩티드는 실질적으로 내독소가 없어야 한다.

E.coli 같은 박테리아로부터, 단쇄 항체들의 발현 및/또는 단쇄 항체를 포함하는 적절한 활성 형태로의 되접기(refolding)하는 방법이 설명되어 왔고 잘 공지되었으며 본 발명의 항체에 적용가능하다. 본문에 참고로서 도입된, Buchner 등, Anal. Biochem. 205:263-270 (1992); Pluckthun, Biotechnology 9:545 (1991); Huse 등, Science 246:1275(1989) 및 Ward 등, Nature 341:544 (1989) 참고.

종종, E.coli 또는 다른 박테리아로부터의 기능성 이종단백질들은 내포체로부터 분리되고, 강한 변성제를 이용한 용해 및 연속적인 되접기를 요구한다. 용해단계에서, 당해분야에서 공지된 것처럼, 환원제가 이황화 결합을 감소시키기 위해서 존재하여야 한다. 환원제를 가지는 예시적인 완충액은 0.1 M Tris pH 8, 6 M 구아니딘, 2 mM EDTA, 0.3 M DTE(디이소에리트리톨)이다. 이황화 결합의 재산화는 저분자량 시올 시약의 존재하에서 환원 및 산화 형태로 발생할 수 있으며, 여기서 참고 문헌으로 도입된 Saxena et al., Biochemistry 9: 5015-5021(1970), 및 특히 상기 Buchner et al. 에 기술되어 있다.

복원(Renaturation)은 전형적으로 변성되고, 환원된 단백질을 되접기 완충제에 희석(예를 들면 100 배)하는 것에 의해서 수행된다. 전형적인 완충제는 0.1 M Tris pH 8, 0.5 M L-아르기닌, 8 mM 산화 글루타시온(GSSG), 및 2 mM EDTA 이다.

2쇄 항체 정제 프로토콜로 변형으로서, 중쇄 및 단쇄 부위들이 별도로 용해되고 환원된 후 되접기 용액에서 결합되었다. 한 단백질이 다른 단백질의 5배 몰 양을 초과하지 않는 몰비로 이들 두 단백질들이 혼합될 때, 바람직한 수율이 얻어진다. 레독스-셔플링(redox-shuffling)이 완료된 후 과량의 산화된 글루타시온 또는 다른 산화 저분자량 화합물들을 되접기 용액에 첨가하는 것이 바람직하다.

VI. Pseudomonas 외독소 및 다른 독소

독소들이 면역독소들을 생산하기 위해서 본 발명의 항체들과 함께 사용될 수 있다. 전형적인 독소는 리신, 아브린, 디프테리아 독소, 및 그것들의 서브유닛들 및 보툴리늄 독소 A 내지 F를 포함한다. 이들 독소들은 쉽게 상업적으로 이용가능하다 (예를 들면, Sigma chemical company, st. Louis, MO). 디프테리아 독소는 Corynebacterium diphtheriae로부터 분리되었다. 리신은 Ricinus communis(Castor bean)로부터의 Lectin RCA60이다. 용어는 또한 그것들의 독성 변이체들을 언급한다. 예를 들면, US 특허 제5,079,163호 및 제4,689,401호 참조. Ricinus communis 아글루티닌(RCA)는 각각 대략 65 및 120kD인 그것들의 분자량에 따라서 RCA₆₀ 및 RCA₁₂₀으로 명명된 두 가지 형태로 발생한다 (Nicholson & Blaustein, J. Biochim. Biophys. Acta 266: 543(1972)). A쇄는 단백질 합성을 불활성화하고 세포들을 죽이는 것에 원인이 된다. B쇄는 리신을 세포-표면 갈락토스 잔기들에 결합시키고 A쇄의 시토졸로의 이송을 용이하게 한다 (Olsnes 등, Nature 249:627-631 (1974) 및 US 특허 제3,060,165호).

아브린은 Abrus precatorius로부터 독성 렉틴을 포함한다. 독성 아브린 a, b, c 및 d는 약 63 내지 67kD의 분자량을 가지며, 두 개의 이황화물-연결된 폴리펩티드 쇄들 A 및 B로 구성된다. A쇄는 단백질 합성을 저해한다: B쇄(아브린-b)는 D-갈락토스 잔기들에 결합한다 (Funatsu 등, Agr. Biol. Chem. 52:1095 (1988); 및 Olsnes, Methods Enzymol. 50:330-335 (1978) 참조).

바람직한 실시예에서, 독소는 Pseudomonas 외독소 A(PE) 이다. 자연의 PE 는 극도로 활성인 단위체 단백질(분자량 66 kD)로서, Pseudomonas aeruginosa 에 의해 분비되고, 이것은 원핵세포에서 단백질 합성을 억제시킨다. 자연의 PE 서열은 US 5,602,095 에서 제공되고, 참고문헌으로 도입되었다. 활동 방법은 연장인자 2(EF-2)를 ADP-리보실레이션(ribosylation)에 의해서 비활성화시키는 것이다. 영역 Ia(아미노산 1 -252)는 세포 결합을 매개한다. 영역 II(아미노산 253 -364)는 시토졸내로의 이송을 담당하며, 영역 III(아미노산 400-613)은 연장 인자 2 의 ADP-리보실레이션을 담당한다. 비록 그것의 큰 부위인, 아미노산 365- 380 이 세포독성의 손실없이 결실될수 있더라도, 영역 Ib 의 기능(아미노산 365 - 399)은 정의되지 않았다.

용어 "Pseudomonas 외독소"는 자연 서열, 자연 서열의 세포독성 단편, 및 보존적으로 변형된 자연 PE의 변이체 및 그것의 세포독성 단편이다. 바람직한 실시예에서, PE 분자는 영역 Ia를 결실시키기 위해서 변형되어, 독소의 비-특이적 결합을 제거 또는 감소시킨다. PE의 세포독성 단편은 표적세포에서 후속적인 단백질 가수분해 또는 다른 처리를 가지거나 혹은 가지지 않는 세폭독성인 것을 포함한다 (예를 들면, 단백질 혹은 프리-단백질). PE의 세포독성 단편은 PE40, PE38 및 PE35를 포함한다. PE40은 본 분야에서 앞서 언급된 바와 같이 절단형 PE 유도체이다. Pai 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:3358-62(1991); Kondo 등, J. Biol. Chem. 263:9407-9475(1988). PE35는 위치 280에서 met와 후속하는 자연 PE의 아미노산 281-364 및 381-613으로 이루어진 PE의 35kD 카르복실-말단 단편이다. PE38은 PE의 아미노산 253-364 및 381-613으로 이루어진 절단형 PE 프로-단백질이다. PE38은 세포내에서 가공시 세포독성 형태로 활성화된다 (참고으로 여기서 도입된 US 5,608,039를 참조).

특히 바람직한 실시예에서, PE38 은 본 발명의 면역독소의 독소 부분이다. 세포독성 단편 PE35 및 PE40 은 그러나 또한 사용될 수 있다; 이들 단편들은 US 5,602,095 및 4,892,827 에 공개되어 있고, 그 각각은 여기서 참고문헌으로 도입되었다. MR1-계 면역독소로 수행된 작업을 기초로, KDEL 은 C- 말단서열의 바람직한 변형이다( Lorimer et al., Proc Natl Acad Sci USA 93:14815-14820 at 14818(1996) 을 참조하라).

A. PE 의 보존적으로 변형된 변이체.

PE 의 보존적으로 변형된 변이체 또는 그 세포독성 단편은 적어도 80 % 의 서열 유사성, 바람직하게는 적어도 85 % 서열 유사성, 보다 바람직하게는 적어도 90 % 의 서열 유사성, 가장 바람직하게는 적어도 95 % 의 서열 유사성을 아미노산 수준에서 관심있는 PE, 예를 들면 PE38 에 대해 가진다.

" 보존적으로 변형된 변이체" 라는 용어는 아미노산과 핵산 서열 양자에 적용된다. 특별한 핵산 서열에 관해서, 보존적으로 변형된 변이체는 동일한 또는 필수적으로 동일한 아미노산 서열을 엔코드하는 핵산 서열을 언급하거나, 혹은 핵산이 아미노산 서열을 엔코드하지 않는다면, 필수적으로 동일한 핵산 서열을 언급한다. 유전적 코드의 축퇴 때문에, 많은 수의 기능적으로 동일한 핵산이 어떤 주어진 폴리펩티드를 엔코드한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU 전부는 아미노산 알라닌을 엔코드한다. 그래서, 알라닌이 코돈에 의해서 특정된 모든 위치에서, 코돈은 엔코드된 폴리펩티드를 변경시키는 것이 없이 기술된 어떤 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 그러한 핵산 변화는 " 침묵변화" 이며, 이것은 보존적으로 변형된 변화의 한 종류이다. 폴리펩티드를 엔코드하는 모든 핵산 서열은 여기서 또한 핵산 서열의 모든 가능한 침묵 변화를 기술한다. 당업자는 핵산(AUG , 이것은 통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈이며, UGG, 이것은 트립토판에 대한 유일한 코돈이며, 제외)에서 각 코돈이 기능적으로 동일한 분자를 생산하기 위해서 변형될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 엔코드하는 각각의 핵산의 침묵 변화는 각 기술된 서열에서 내재적이다.

아미노산 서열에 관해서, 당업자는 엔코드된 서열에서 한 아미노산 혹은 적은 퍼센트의 아미노산을 변형, 추가 또는 결실한 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환, 결실, 또는 추가는 변형이 화학적으로 유사한 아미노산으로 아미노산의 치환의 결과에 이르는 "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 인식할 것이다.

B. PE 의 세포독성의 측정

발명에 이용된 Pseudomonas 외독소는 당업자에게 공지된 측정에 의해서 원하는 수준의 세포독성에 대해서 측정될 수 있다. 예를 들면, 세포독성은 종종 대리 측정으로서 단백질 합성의 Pseudomonas 외독소에 의한 억제를 이용하여 측정된다. Loriemr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14815 - 14820(1996) at 14818 을 참조하라. 편의적으로, 이것은 정상적으로 EGFRvIII 을 발현하지는 않으나, EGFRvIII cDNA 로 감염된 세포에 의한 방사선 표지된 아미노산의 흡수를 측정하는 것에 의해서 이루어진다.(Prior et al., Cell 64: 1017-1023(1991) 에 가르켜진것 처럼). 하기의 실시예에서, 삼중수소화 루신의 흡수는 NR6M 세포로 측정된다(마우스 EGFR 의 발현의 결핍을 위해 선택되고 인간 EGFRvIII c DNA 로 감염된 Swiss 3T3 cells). 그래서, PE 의 세포독성 단편 및 보존적으로 변형된 그러한 단편들의 변이체들이 쉽게 세포독성에 대해서 측정될 수 있다.

많은 수의 후보 PE 분자가 동시에 세포독성을 당해분야에서 공지된 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 후보 분자들의 소그룹은 세포독성에 대해 측정될 수 있다. 후보 분자의 양성적으로 반응하는 소그룹은 지속적으로 나뉘어서 원하는 세포독성 단편(들)이 확인될 때 까지 재측정된다. 그러한 방법은 많은 수의 세포독성 단편 또는 PE 의 보존적인 변이체의 빠른 체질을 가능하게 한다.

C. 다른 치료적인 부분

본 발명의 항체는 그들의 표면에 EGFRvⅢ을 발현하는 세포에 대해 몇몇 다른 진단 또는 치료 화합물을 표적화하기 위해서 또한 사용될 수 있다. 그래서 본 발명의 항체는 예를 들면, 항-EGFRvⅢ scFv, 직접적으로 부착되거나 혹은 연결제를 통해서 직접적으로 EGFRvⅢ을 지니는 세포에 전달되는 약물에 부착될 수 있다. 치료제는 핵산, 단백질, 펩티드, 아미노산, 또는 유도체, 글리코단백질, 방사선 동위원소, 지질, 탄수화물, 또는 재조합 바이러스와 같은 화합물을 포함한다. 핵산 치료 및 진단 부분은 안티센스 핵산, 단일 혹은 이중 DNA와 공유적 가교를 위해 유도된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드를 형성하는 삼중체를 포함한다.

선택적으로, 항-EGFRvⅢ 항체에 연결된 분자는 약물 같은 치료 조성물, 핵산(예컨대, 안티센스 핵산), 또는 순환 시스템에 직접 노출되는 것으로부터 바람직하게 차단되는 다른 치료 모이어티를 함유하는 미셀이나 리포솜 같은 캡슐화 시스템일 수 있다. 항체에 부착된 리포좀을 제조하는 수단은 당업자에게 공개되어 있다. 예를 들어 US 4,957,735; 및 Connor 등, Pharm. Ther. 28:341-365(1985)를 참조하라.

D. 검출가능한 표지

본 발명의 항체들은 임의적으로 공유적으로 혹은 비공유적으로 검출가능한 표지에 연결될 수 있다. 그러한 이용에 적합한 검출가능한 표지는 분광, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해서 검출가능한 어떤 조성물을 포함한다. 본 발명에서 유용한 표지는 마그네틱 비드(예를 들면, DYNABEADS), 형광 염료(예를 들면, 플로로세인 이소시오시아네이트, 텍사스 레드, 로다민, 녹색 형광 단백질 등등), 방사선표지(예를 들면, ³ H, 125I, ³⁵S, ¹⁴C, 또는 ³²P), 효소(예를 들면, 호스 라디쉬 퍼옥시다제, 알카린 포스포타제, 루시페라제, 및 ELISA 에서 통상적으로 사용되는 다른 것들), 콜로이드 금 또는 착색 유리 또 는 플라스틱(예를 들면,폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등등)비드와 같은 비색표지를 포함한다.

그러한 표지를 검출하는 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그래서, 예를 들면, 방사선 표지는 사진 필름, 또는 신틸레이션 계수기을 이용하여 검출될 수 있으며, 형광 표지는 방사된 광을 검출하는 광검출기를 이용하여 검출될 수 있다. 효소 표지는 전형적으로 효소에 기질을 공급하고, 기질상에서 표소의 활동에 의해서 생성된 반응 생성물을 검출하는 것에 의해서 검출될 수 있으며, 비색표지는 단순한 착색된 표지를 관찰하는 것에 의해서 검출될 수 있다.

E.항체의 접합.

본 발명의 비-재조합 실시예에서, 효과기 분자, 예를 들면, 치료, 진단 또는 검출 부분은 본 발명의 항-EGFRvIII 항체에 다수의 당해 분야에서 공개된 방법을 이용하여 연결될 수 있다. 공유 및 비공유적 부착 수단은 본 발명의 항-EGFRvIII 항체와 함께 이용될 수 있다.

효과기 분자를 항체에 부착시키는 절차는 EM 의 화학적 구조에 따라서 변화할 것이다. 전형적으로 폴리펩티드는 다양한 관능기; 예를 들면,카르복실기(COOH), 자유 아민(-NH2) 또는 설프하이드릴(-SH)기를 함유하며, 이것은 효과기 분자의 결합의 결과에 이르는 항체상의 적절한 관능기와 반응에 이용할 수 있다.

선택적으로, 항체는 노출시키거나 혹은 부가적인 반응 관능기를 부착시키기도록 유도된다. 유도는 어떤 일련의 Pierce Chemical Company, Rockford Illinois 로부터 이용할 수 있는 것과 같은 연결체 분자의 부착을 포함할 수 있다.

여기서 사용될 때 "연결제" 는 항체를 효과기 분자에 연결하기 위해서 사용되는 분자이다. 연결제는 항체와 효과기 분자에 공유결합을 형성할 수 있다. 적절한 연결제는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 직쇄 혹은 가지쇄 탄소 연결제, 헤테로사이클 탄소 연결제, 또는 펩티드 연결제를 포함하지만 이것에 한정되지는 않는다. 항체와 효과기 분자가 폴리펩티드인 경우 연결제는 이들의 곁그룹을 통해서 구성 아미노산에 결합될 수 있다(예를 들면, 시스테인에 이황화 연결을 통해). 그러나, 바람직한 실시예에서, 연결제는 말단 아미노산의 알파 탄소 아미노 및 카르복실기에 연결될 것이다.

어떤 환경에서, 면역접합체가 그것의 표적부위(target site)에 도달될 때, 항체로부터 효과기 분자가 없도록 하는 것이 바람직하다. 그러므로, 이러한 경우, 면역접합체는 표적부위 근방에서 쪼개질 수 있는 연결을 포함할 것이다. 효과기 분자를 항체로부터 방출하기 위한 연결제의 쪼개짐은 효소적 활성, 혹은 면역접합체가 표적세포 내로 혹은 표적부위 근방으로 보내지는 조건에 의해서 자극될 수 있다. 표적부위가 종양일 때는 종양 부위에서 존재하는 조건에서 쪼개질 수 있는 연결제가 사용될 수 있다 (예를들면, 종양관련 효소 또는 산성 pH 에 노출될 때).

다양한 방사선진단 화합물, 방사선치료 화합물, 약물, 독소, 및 다른 제제를 항체에 부착시키는 것에 대한 많은 수의 방법에서, 당업자는 항체 또는 폴리펩티드에 주어진 제제를 부착시키는 적절한 방법을 결정할 수 있을 것이다.

VII. 약리학적 조성물 및 투여

본 발명의 항체 및/또는 면역접합체 조성물(즉 MR1 보다 적어도 1 nM 낮은 EGFRvIII의 에피토프에 대한 Kd 를 가지는 항체에 연결된 PE), 은 뇌에 투여하기에 유용하다. 뇌종양 치료를 위한 면역독소의 이용은 최근 Oldfield, E., and Youle,R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 234:97 - 114(1998) 에서 검토되었다. 적은 폴리펩티드가 혈액 뇌 장벽을 지난다. 혈액 뇌 장벽을 지나지 못하는 더 긴 폴리펩티드에 대해서, 뇌에 단백질을 투여하는 방법이 공개되어 있다. 예를 들면, 단백질, 폴리펩티드, 다른 화합물 및 세포들이 포유류 뇌에 인트라세레브로벤트리큘라(ICV) 주입 또는 캐뉼러를 통해서 전달될 수 있다.( 예를 들면 Motta & Martini, Proc. Soc, Exp. Biol. Med. 168:62- 64(1981); Perterson et al.,Biochem. Pharamacol. 31:2807 - 2810(1982); Raepczynski et al., Metab. Brain Dis. 3:211 - 216(1988); Leibowitz et al., Brain Res. Bull. 21:905 - 912(1988); Sramka et al.,Stereotact. Funct. Neurosurg. 58: 79 - 83(1992); Peng et al.,Brain Res. 632:57-67(1993); Chem et al., Exp. Neurol. 125:72 - 81(1994); Nikkhah et al., Neuroscience 63: 57 - 72(1994): Anderson et al., J. Comp. Neurol. 357: 296 - 317(1995); and Brecknell & Fawcett, Exp. Neurol. 138:338 - 344(1996) 를 참조).

그래서, 예를 들면, 글리오블라스토마는 캐뉼러 혹은 주사기에 의해서 종양으로 둘러쌓인 조직, 보다 일반적으로는 ICV 에 의한 중앙 신경 시스템 구획으로의 국지 전달에 의해 처리될 수 있다. 추가적으로, 예를 들면, 환자의 글리오블라스토마가 상피세포에 손상을 가해, 혈액-두뇌 장벽의 파괴를 충분히 허용하게, 면역 접합체는 체계적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 항체 혹은 면역접합체는 또한 국지적으로 혹은 체계적으로 유방, 난소, 및 폐 암종을 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들면, 이들 유해성들은 외과적으로 제거될 수 없는 종양으로의 직접적인 주사에 의해서 치료될 수 있다. 이들 암종들은 또한 예를 들어 자리를 잡고 그리고 방사선 또는 외과적으로 치료될 수 있거나 또는 사실 쉽게 발견될 수 있는 충분한 크기의 종양으로 아직 발견되지 않은 어떤 전이성 세포를 죽이는 면역접합체의 비경구적 투여에 의해서 치료될 수 있다.

투여용 조성물들은 약학적 허용 운반체, 바람직하게는 수용성 운반체에 용해된 항체 및/또는 면역접합체의 용액을 일반적으로 포함한다. 다양한 수용성 운반체 예컨대, 완충된 살린 등이 사용될 수 있다. 이들 용액들은 무균성이고 일반적으로 바람직하지 않은 물질이 없다. 이들 조성물들은 통상적인, 잘 알려진 무균화 기법에 의해서 무균화된다. 조성물들은 약학적 허용 pH 조절 및 완충제, 독성 조절제 예컨대, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소듐 락테이트 등 같은, 생리적 조건에 근접하게 하는데 요구되는 보조 물질들을 함유할 수 있다. 이러한 제형들에 있어서 융합 단백질의 농도는 매우 광범위하게 변할 수 있고, 선택된 특별한 형태의 투여 및 환자의 요구에 따라서 유체 부피, 점도, 체중 등에 1차적으로 기초하여 선택될 것이다.

그래서, 뇌에 투여하기 위한 본 발명의 전형적인 약리학적 면역독소 조성물 은 매일 약 1.2 에서 1200 ㎍ 정도이다. 유방, 난소, 또는 폐 암종을 치료하기 위한 정맥 주상용의 전형적인 조성물은 환자에게 매일 약 0.1 에서 10 mg 정도 이다. 특히 만일 약물이 격리된 부위에 투여되고, 순환계 혹은 림프계가 투여되지 않는다면, 예를 들어 기관의 루멘(lumen) 또는 신체의 공동(cavity)에 투여시 매일 환자당 0.1 에서 약 100 mg 까지의 복용량이 이용될 수 있다. 투여할 수 있는 조성물 제조의 실제 방법은 당업자에게 명백하고 공지되어 있으며, 보다 상세하게는 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 19 TH ED., Mark Publishing Company, Easton, Pennsylvania(1995)에 기술되어 있다.

본 발명의 조성물은 치료용 처치를 위해서 투여될 수 있다. 치료적 적용에서, 조성물들은 질병, 예를 들면 글리보블라스토마, 유방 암종, 난소암종, 또는 폐암종으로부터 고통받는 환자에게, 질병 또는 그것의 합병증을 적어도 늦추거나 혹은 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이것을 성취하기에 적절한 양은 "치료적으로 효과적인 양" 으로 정의된다. 이러한 이용에 효과적인 양은 질병의 심각성 및 환자 건강의 일반적인 상태에 좌우된다. 조성물의 효과적인 양은 환자에게 증상의 완화 혹은 임상의사 혹은 다른 자격을 갖춘 관찰자에 의해서 인지되는 객관적으로 확인할 수 있는 개선을 제공하는 그것이다.

조성물의 단수 혹은 복수의 투여는 환자에 의해서 인내되고, 요구되는 복용량 및 주기에 따라서 투여된다. 어떤 경우에든, 조성물은 환자를 효과적으로 치료하기 위해서 본 발명의 단백질의 충분한 양을 제공한다. 바람직하게는, 복용략은 한번에 투여되며, 그러나 치료적 결과가 성취될 때까지 또는 부작용이 치료의 불연 속성을 보증할 때까지, 주기적으로 적용될 수 있다. 일반적으로, 복용은 수용할 수 없는 독성을 환자에게 발생시킴이 없이 질병의 증상 또는 신호를 치료하거나 또는 호전시키기에 충분하다.

본 발명의 면역접합체 조성물의 조절 방출 비경구 포뮬레이션은 임플란트, 유질 주사 또는 특별한 시스템으로서 만들어질 수 있다. 단백질 전달 시스템의 폭넓은 검토를 위해서는 여기서 참고문헌으로 도입된 Banga, A.J., THHRAPEUTIC PEPTIDE AND PROTEINS: FORMULATION, PROCESSING, AND DELIVERY SYSTEM, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA,(1995) 를 참조하라. 미립자 시스템은 마이크로스피어, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 나노캡슐, 나노스피어, 및 나노입자를 포함한다. 마이크로캡슐은 중앙코어로서 치료 단백질을 함유한다. 마이크로스피에서, 치료제는 입자에 분산된다. 1 ㎛ 보다 작은 입자, 마이크로스피러, 및 마이크로캡슐은 나노입자, 나노스피어, 나노캡슐로 각각 언급된다. 모세혈관은 약 5㎛ 의 직경을 가지며, 그래서 단지 나노입자만이 정맥주사로 투여될 수 있다. 마이크로입자는 직경이 약 100 ㎛ 이므로 피하 또는 근육내적으로 투여될 수있다. Kreuter. J,. COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, J.,Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, pp. 219 - 342(1994); and Tice & Tabibi , TREATISE ON CONTROLLED DRUG DELIVERY, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp 315-339,(1992) 를 참조하고, 둘다 참고 문헌으로 도입되었다.

폴리머는 본발명의 면역 접합체 조성물의 이온-조절 방출용으로 사용된다. 다양한 분해가능 및 비분해가능한 폴리머 매트릭스가 조절 약물 방출의 이용용으로 당해 분야에서 공지되어 있다(Langer, R., Accounts Chem. Res. 26:537- 542(1993)). 예를 들어, 블럭공중합체, polaxamer 407 은 저온에서 점성의 유동성 유체로 아직 존재하나, 그러나 체온에서는 반고체의 겔을 형성한다. 포뮬레이션 및 재조합 인터루킨-2 및 우레아의 지연전달에 효과적인 운송수단이 알려져있다(Johnston et al., Pharm. Res. 9:425 - 434(1992); and Pec et al.,J. Parent. Sci.Tech. 44(2):58 -65(1990). 선택적으로, 하이드록시아파티트가 단백질의 조절 방출용 마이크로운반체로서 사용되었다(Ijntema et al.,Int. J. Pharm. 112: 215 -224(1994)). 다른 측면에서, 리포좀은 지질-캡슐화된 약물의 약물 목표화 뿐만아니라 조절방출에 사용된다(Betageri et al., LIPOSOME DRUG DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA(1993)). 많은 치료 단백질의 조절방출용 추가적인 시스템이 알려져 있다. US 5,055,303, 5,188,387, 4,235,871, 4,501,728, 4,387,028, 4,957,735 및 5,019,369, 5,055,303; 5,413,797; 5,268,164; 5,004, 697; 4,902,505; 5,506,206, 5,271,961; 5,254,342 및 5,534,496 을 참조하라 각각은 참고문헌으로 도입되었다.

본 발명의 면역독소의 다양한 이용가운데 면역접합체의 독성활성에 의해서 제거될 수 있는 EGFRvIII 을 발현하는 특이적 인간 세포에 의해서 야기되는 질병조건이 포함된다. 본 발명의 면역독소의 한 바람직한 실시는 EGFRvIII을 발현하는 유해한 세포의 치료이다. 전형적인 유해한 세포는 글리오블라스토마, 유방암종, 난소암종, 및 폐암종을 포함한다.

VIII. 진단키트와 in vitro 이용

다른 실시예에서, 본 발명은 생물학적 시료에서 EGFRvIII 의 검출용 키트를 제공한다. 여기서 사용되는 "생물학적 시료"란 생물학적 조직의 시료 또는 EGFRvIII 를 함유하는 유체를 의미한다. 그러한 시료들은 생체검사, 타액, 양수, 혈액, 및 혈액세포(예를 들면, 백혈구)로부터의 조직을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 유체시료는 어느정도 흥미롭지만 그러나 EGFRvIII의 검출가능한 농도가 그러한 시료들에서는 거의 발견되지 않기 때문에 일반적으로는 바람직하지 않다. 생물학적 시료는 또한 조직의 부위를 포함하는데, 예를 들면, 조직학적 목적을 위해서 채취된 냉동 부위이다. 생물학적 시료는 전형적으로 다세포 진핵 생물, 바람직하게는 쥐, 마우스, 소, 개, 기니 돼지, 또는 토끼, 보다 더 바람직하게는 마카스, 침팬치와 같은 영장류로부터 얻어진다. 가장 바람직하게는, 생물학적 시료는 인간으로부터이다.

키트는 전형적으로 본 발명의 항-EGFRvIII scFv 를 포함할 것이며, 이것은 MR1 scFv보다 더 EGFRvIII에 대해 더 높은 친화성을 가진다.

더구나, 키트는 전형적으로 본 발명의 항체의 이용 수단을 공개하는 지시용 재료를 포함한다( 예를 들면, 시료에서 EGFRvIII-함유 세포의 검출). 키트는 또한 키트가 적용되기 위해서 설계된 특별한 응용을 용이하게 하는 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 그래서, 예를 들면, 키트는 추가적으로 표식을 검출하는 수단을 포함한다(예를 들면, 효소 표지에 적절한 효소 기질, 형광 표지를 검출하는 필터세트, 양 항-마우스-HRP 등등과 같은 적절한 2 차 표지). 키트는 추가적으로 특별한 방법의 실시를 위해서 통상적으로 사용되는 완충제와 다른 시약을 포함한다.

본 발명이 다른 실시예에서, 진단키트는 면역측정을 포함한다. 상기와 같이, 본 발명의 면역측정의 상세한 부분이 사용되는 특정한 형식에 따라서 변하다 하더라도 생물학적 시료에서, EGFRvIII를 검출하는 방법은 면역학적으로 반응조건하에서, MR1 scFv 보다 더 높은 EGFRvIII 에 대한 친화성을 가지고, 특이적으로 EGFRvIII 에 대해 반응하는 생물학적 시료를 접촉시키는 단계를 포함한다. 항체는 면역학적으로 반응 조건하에서 EGFRvIII 에 결합하는 것이 허용되며, 고정항체의 존재는 직접 또는 간접적으로 검출된다.

여기서 교사되는 방법에 의해서 개발된 항체 및 MR1-1으로 명명된 scFv의 증가된 친화성 때문에, 특히, 여기서 제공된 항체는 생물학적 시료에서 EGFRvⅢ의 존재를 검출하는 in vitro 측정에서 진단제로서 유용할 것이다. 예를 들어, MR1-1 및 여기서 교사되는 방법에 의해서 만들어진 다른 항체들은 시료가 EGFRvⅢ를 발현시키는 세포를 함유하는지를 결정하는 면역조직화학적 분석법에서 면역접합체의 표적화 모이어티로서 사용될 수 있다. EGFRvⅢ를 정상적으로 발현하지 않는 환자의 조직으로부터 채취된 시료라면, EGFRvⅢ의 검출은 환자가 EGFRvⅢ-발현 세포의 존재에 의해서 특징화되는 암을 가지거나 혹은 그러한 암의 치료가 아직 암의 뿌리를 뽑는데 있어서 성공적이지 않다는 것을 가르킨다. 당업자는 본 발명의 항-EGFRvⅢ 항체가, 적절한 수준과 짝을 이루어, EGFRvⅢ 발현 세포의 존재를 in vivo 검출하는데 사용되고, 그에 의해서, 환자가 EGFRvⅢ-발현 세포의 존재에 의해서 특징화되는 암을 가지거나 혹은 그러한 암의 치료가 암의 뿌리를 뽑는데 있어서 성공적이지 않다는 것을 의미한다.

실시예 1

MR1 보다 더 좋은 결합을 가지는 항체 개발의 전략

MR1보다 더 잘 EGFRvⅢ에 결합하는 항체들을 발견하기 위해서, 파지 디스플레이 라이브러리가 MR1 scFv로 만들어졌다. 랜덤 돌연변이들이 중쇄 상보성 결정부위 3(V_HCDR3), 항원 결합에서 주요 역할을 하는 영역에 도입되었다(MacCallum 등, J.Mol. Biol. 263:732-745 (1996)). EGFRvⅢ을 발현시키는 세포들 상에서 패닝은 몇몇 돌연변이체들을 발생시키고, 이것은 면역독소들을 구성하기 위해서 사용될 때 친화력, 세포독성 및 수율을 향상시킨다. 이러한 변이체들의 분석은 이것들 전부가 과돌연변이(hypermutation)를 위한 핫스팟으로서 적임인 V_HCDR3의 부위에 위치한 돌연변이들을 가진다는 것을 나타냈다 (Neuberger 등, Curr Opin. Immunol. 7:248-254 (1995); Jolly, C.J., Semin. Immunol. 8:159-168 (1996); Neuberger 등, Immunological Rev. 62:107-116 (1998)). 핫스팟들은 공통서열들 G/A-G-T/C-A/T 또는 A-G-C/T에 의해 규정된다. 후자는 항체의 가변영역 유전자들에서 발견되는 세린 코돈들을 함유한다 (Goyenechea 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13979-13984 (1996)). 핫스팟들은 항체들의 성숙 동안 높은 빈도로 돌연변이되는 부위들이다. V_HCDR3 라이브러리를 패닝하는 것은 핫스팟들 외부에서 돌연변이들을 함유하는 어떤 클론들도 생산하지 않았다. 이 결과는 핫스팟들을 랜덤화하는 것이 향상된 친화력을 갖는 돌연변이들을 생산하는데 더욱 유망하다는 최근 발견을 확인시킨다 (Chowdhury 등, Nature Biotechnol. 17:568-572(1999)). V_HCDR3 라이브러리 팬닝으로부터 얻어지는 가장 좋은 바인더는 경쇄 CDR3에서 핫스팟을 램덤화한 파지 디스플레이 라이브러리를 만드는데 사용되었다. 이 라이브러리를 패닝하는 것은 훨씬 더 바람직한 특성을 갖는 돌연변이 클론들을 좀더 생산하였다.

실시예 2

V_H 돌연변이 라이브러리의 구성. MR1의 V_HCDR3은 11 아미노산들로 이루어진다. 도입부에서 밝힌 것과 같이, 이들 아미노산들 중 둘은 항원 결합에 참여하지 않을 것으로 고려되었다. V_H에서 다른 9 아미노산들은 그 위치에서 정규로 발생하는 아미노산 잔기 대신에 다음과 같은 다른 천연 아미노산들 모두로 치환함으로써 돌연변이되었다. DNA 올리고머는 세 개의 라이브러리를 발생시키도록 설계되었고, 각각은 9 뉴클레오티드들을 랜덤화한다 (3 연속 아미노산들). MR1 파지미드는 3개의 개별적인 2단계 폴리머라제 쇄 반응(PCR)(도 1)에서, CDR3 중쇄에서 3 아미노산 랜덤화들을 도입하는 주형으로 사용되었다. 다음 올리고들(oligos)이 사용되었다:

1 차 PCR 에서, 파지미드 pCANTAB 5 E-MR1 의 50 pg 이 20 pmol DNA 올리고머 S1 을 20 pmol DNA 올리고머 CDR3Hb, CDR3Hd 또는 CDR3Hf 와 함께 이용하여 세 별도 반응에서 주형으로 사용되었다. 주형 및 올리고는 2 레디-투-고 PCR Bead(Pharmacia)와 50 ㎕ 부피에서 혼합되어 이후 하기 프로파일을 이용하여 반복되었다: 95 ℃ 에서 5 분간 1 사이클 후, 1 분동안 94 ℃, 1 분동안 55 ℃, 1 분동안 72 ℃의 30 사이클. 이들 반응들은 돌연변이를 함유한 407 bp 생성물을 발생시킨다. 제 1 단계에서 발생된 생성물은 다음 MR1 파지미드를 주형으로 이용하면서 프라이머 AMBN 과 3 별도의 반응에서 프라이머로 사용되었다. 이러한 반응에서, 첫 번째 반응으로부터의 1 ㎕ 의 생성물은 주형으로서 50 pG 파지미드 pCANTAB 5 E-MR1 을 가지는 20 pmol 의 DNA 올리고머 AMBN과 함께 사용되었다. 프라이머와 주형은 2 PCR 비드와 함께 50 ㎕ 부피로 혼합되고, 상기 프로파일을 이용하여 반복되었다. 각 반응은 876 bp 라이브러리를 생성하였다. PCR 생성물은 제한 효소 Sfi I 및 Not I 로 소화되고, 정제되었다. 150 ng 의 정제된 PCR 생성물들은 250 ng 의 파지 디스플레이 벡터 DNA pCANTAB5E(Pharmacia 에 의해서 공급된 선-소화된(pre-digested)와 결찰되었다. 결찰 혼합물은 탈염되고, 각 결찰의 40 ng 이 E.coli TG1 을 형질전환시키기 위해서 이용되었다. 각 형질전환은 대략 1.5 x 10⁶ 클론이 된다. 파지 라이브러리는 이후 형질 전환된 박테리아로부터 탈출되었다. 각 형질전화으로부터의 세포들은 2 % 글루코스를 함유하는 10 ml 2 xYT(16 g 박토-트립토판, 10 g 박토-곰팡이 추출물, 물 1 리터당 5 g NaCl)을 250 RPM 으로 흔들면서 배양되었다. 한시간 후 앰피실린(100 ㎍/ml 최종 농도) 및 1x10¹⁰ 플레이크 형성 단위(pfu)의 M13KO7 헬퍼 파지가 투입되었다. 배지는 1 시간동안 배양되고, 펠렛화되고, 이후 10 ml 2xYT 플러스 앰피실린(100 ㎍/ml) 및 카나미신(50 ㎍/ml)에 재현탁되고, 250 RPM 에서 흔들면서, 37 ℃ 에서 16 시간 동안 배양되었다. 박테리아는 Sorval SS34 로터에서 8000 RPM에서 20 분동안 원심분리기에 의해서 펠렛화되었다. 파지-함유하는 부유물들은 0.45 마이크론 시린지 필터 기구를 이용하여 여과되었다. 파지는 2 ml PEG, NaCl(2.5 M NaCl w/v 에서 20 % PEG 8000)을 투입하는 것에 의해서 침전되고, 30 분동안 얼음상에서 배양되었다. 침전된 파지는 20 분간 10 K RPM 으로 Sorvall SS34 로터에서 원심분리에 의해서 펠렛화되었고, 그리고 1 ml NTE 에서 재현탁되었다(100 mM NaCl, 10 mM TRIS pH 7.5, 1 mM EDTA). 탈출된 파지 라이브러리는 적정되고, 4 ℃ 에서 저장되었다.

V_HCDR3 라이브러리 패닝. 10% 송아지 혈청 플러스 750㎍/㎖ G418을 함유하는 DMEM에서 성장된 NR6M 세포들이 0.02% EDTA(Sigma # E-8008)를 사용하여 수확되었다. 2x 0⁷ 세포들이 펠렛화되고, 10㎖ 차가운 차단 완충제(DPBS에서 2% BSA, 0.02% NaN₃)에서 재현탁되고, 4℃에서 1시간 동안 서서히 회전되었다. 세포들은 펠렛화되고, 5㎖ 차가운 차단 완충액에서 재현탁되었다. 각각의 중쇄 CDR3 라이브러리로부터 1x10⁹ 파지가 세포 부유물에 첨가되었고, 혼합물이 2시간 동안 4℃에서 서서히 회전되었다. 세포들은 10㎖ 차가운 차단 완충제로 두 번 세척되었고, 5㎖ 차가운 차단 완충제에서 재현탁되었다. MR1dsFvPE38은 경합저해제로서 (2μM 최종 농도) 첨가되었고, 현탁액은 2시간 동안 4℃에서 서서히 회전되었다. 세포들은 10㎖ 차가운 차단 완충제로 3회 세척되었다. 결합된 파지가 세척된 세포들을 1.5㎖ 아이스 콜드 50mM HCl에서 재현탁함으로써 용출되었고, 얼음에서 10분간 배양되었다. NR6M 세포들은 펠렛화되었고, 용출된 파지는 200㎕ 1M Tris pH 8.0을 함유하는 새로운 튜브로 옮겨졌다. 그 후 0.5㎖의 용출된 파지가 다음 단계의 패닝에서의 사용을 위해서 E. coli TG1을 재감염시키는 것에 의해서 증폭되었다.

V_L 돌연변이 라이브러리의 구성. 중쇄 CDR3 돌연변이체(S98P-T99Y)가 2단계 PCR에서 주형으로 사용되었고, 이것은 경쇄 CDR3에 위치한 핫스팟에서 랜덤화를 도입하였다. 제1반응에서, 중쇄 돌연변이(S98P-T99Y)를 함유하는 50pg의 파지미드가 20p㏖의 DNA 올리고머들 VLMUT(5'-GATTACTACTGTTTGCAANNSNNSAACGTGSSTS TTACA-3') 및 AMBN과 50㎕ 부피에서 혼합되었다. 혼합물은 중쇄 CDR3 라이브러리를 발생시키기 위해서 사용된 동일한 프로파일을 이용하여 반복되었다. 반응은 경쇄 CDR3에서 "핫스팟"의 랜덤화를 함유하는 150 염기쌍 생성물들을 발생시켰다. 정제 후, 처음 PCR에서 발생된 1㎕의 반응생성물이 주형으로서 중쇄 돌연변이체(S98P-T99Y)을 함유한 파지미드 DNA와 함께 두 번째 PCR에서 20p㏖ DNA 올리고머 S1와 사용되었다. 주형 및 프라이머는 2 PCR Bead들과 50㎕ 부피로 혼합되었고, 상기 프로파일을 이용하여 반복되었다. 반응은 V_HCDR3 돌연변이(S98P-T99Y)와 CDR3L에서 핫스팟의 랜덤화를 함유하는 876 염기쌍 라이브러리를 발생시켰다. PCR 생성물들은 제한효소 Sfi I 및 Not I로 소화되었고, 정제 후 중쇄 CDR3 라이브러리와 같이 pCANTAB5E 벡터로 연결되었다. 연결물(ligation)은 탈염되고, 반응의 10분의 1(40ng)이 E.coli TG1을 형질전환하는데 사용되었다. 3x10⁵ 클론들을 함유하는 파지 라이브러리가 중쇄 CDR3 구성에서 기술된 것과 같이 구해졌다. 그것의 4분의 1이 증폭되었고 첫 번째 패닝을 위해 사용되었다.

V_LCDR3 라이브러리 패닝. NR6M 세포가 V_HCDR3 패닝 절차에서와 같이 수확되었다. 모든 단계 및 세척은 기록된 경우를 제외하고는 차가운 차단 완충제에서 행해졌다. 5x10⁶ 세포들이 1㎖ 차단 완충제에서 재현탁되었고 1시간 동안 회전되었다. 세포들은 펠렛화되었고, 재현탁되었고, 구해진 파지 라이브러리가 첨가되었고, 현탁액은 2시간 동안 4℃에서 서서히 회전되었다. 세포들은 3회 세척되었고, 2pM MR1 중쇄 돌연변이체(S98P-T99Y) scFv-PE38을 함유하는 차단 완충제에 재현탁되었고 4℃에서 2시간 동안 서서히 회전되었다. 세포들은 3회 세척되었고 결합된 파지가 용출되었고, 중쇄 CDR3 라이브러리 같이 중화되었다. 용출된 파지는 적정되었고 다음 회 패닝을 위해서 구해졌다.

파지 탈출. 각 회의 팬닝후 잡혀진 파지는 다음 회의 팬닝을 위해서 증폭되었다. 탈출을 위해서, E.coli TG1 이 2% 글루코스를 함유한 10 ml 2xYT 에서 37 ℃, 250 RPM 으로 배양되면서 성장되었다. OD₆₀₀ 에 도달하였을 때, 포집된 파지 0.3, 0.5 ml가 배양기에 투입되고, 배양이 지속되었다. 한 시간 후 앰피실린(100 ㎍/ ml 최종) 및 1 x 10¹⁰ pfu 의 M13KO7 헬퍼 파지가 투입되고, 한시간 동안 배양이 계속되었다. 배양체는 이후 원심분리되고, 펠렛화된 박테리아는 앰피실린(100 ㎍/ ml 최종) 및 카나미신(50 ㎍/ ml 최종) 을 함유한 10 ml 새 2xYT 매개에서 재현탁되고, 37 ℃, 250 RPM 으로 16 시간 동안 배양되었다. 부유물을 함유한 파지는 0.45 마이크로 실린지 필터 기구를 이용하여 여과되었다. 파지는 이후 2 ml PEG/NaCl(2.5 M NaCl w/v 에서 20 % PEG8000) 을 투입하는 것에 의해서 침전되고, 얼음상에서 30 분간 배양되었다. 침전된 파지는 Sorvall SS34 로터에서 10 K RPM 으로 20 분간 원심분리에 의해 펠렛화되고, 이후 1 ml NTE 에서( 100 mM NaCl, 10 mM TRIS, 1 mM EDTA pH 7.4)에 재현탁되었다. 탈출된 파지 라이브러리는 적정되고 4 ℃ 에서 저장되었다.

양성 클론들의 검출. 3회 패닝 후, 중쇄 CDR3 라이브러리로부터 48 클론들이 ELISA를 사용하여 EGFRvⅢ 펩티드(LEEKKGNYVVTDHSGGK-바이오틴)에 대한 결합에 대해서 분석되었다. 가장 강한 신호를 주는 22 클론들이 DNA 서열화를 거치고 더 분석되었다. 네 번째 패닝 후, 48 클론들이 ELISA에 의해 분석되었고, 가장 강한 ELISA 신호를 가ㅉ는 10 클론들의 DNA 서열이 결정되었다. 경쇄 라이브러리에 대해서, 2회 패닝 후, 48 클론들이 ELISA에 의해서 분석되었고, 가장 강한 ELISA 신호를 갖는 17 클론들이 서열화되었다. 3회 패닝 후 20 클론들이 분석되었고, 가장 강한 ELISA 신호를 갖는 10 클론들이 DNA 서열화를 거쳤다. 각각의 클론으로부터 파지를 구하기 위해서, 단일 콜로니들이 최종 패닝 적정판으로부터 골라졌고 96 웰 배양접시에서 2% 글루코스를 가진 150㎕ 2xYT 및 100㎍/㎖ 앰피실린으로 접종되었다. 접시는 37℃,150RPM에서 배양되었다. 3시간 후, 20㎕의 배양체가 2% 글루코스를 가진 100㎕ 2xYT 및 100㎍/㎖ 앰피실린 플러스 1x10⁸ M13KO7 헬퍼 파지를 함유하는 두 번째 접시로 옮겨졌고 2시간 동안 배양되었다. 배양체는 펠렛화되었고, 새로운 2xYT 플러스 앰피실린 및 카나미신에서 재현탁되었고, 16시간 동안 성장되었다. 세포들은 펠렛화되었고, 50에서 100㎕의 파지-함유 부유물이 ELISA에서 분석되었다. 파지 ELISA는 100㎕ 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘(BM blue, Boehringer Mannheim)이 검출을 위한 물질로 사용된 것을 제외하고는 기술된 대로 행해졌다 (Loimer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14815-14820 (1996)). 청색/녹색 색상이 나타난 후, 100㎕ 2M H₂S0₄가 색상 전개를 중단시키기 위해 첨가되었다. 흡수는 450nM에서 측정되었다.

DNA 서열화. DNA 서열화는 PE Applied Biosystems(Forster City, CA) Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Kit를 사용하여 수행되었다. 시료들은 PE Aplied Biostystems Model 310 자동화 서열화기에서 실시되고 분석되었다.

ScFv 면역독소 플라스미드 구성, 발현, 및 정제. 선택된 파지미드 클론으로부터 scFv 가 Ndel 및 HindIII 제한부위를 도입한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭되었다. 생성물은 이후 소화되고, scFv 가 농녹균 외독소 A 의 절단형에 융화되는 T7 계 발현벡터로 복제되었다. 플라스미드는 발현 숙주 BL21(λDE3)으로 형질전환되었다. MR1 돌연변이 면역독소는 발현되고, 앞서 기술된 것과 같이 제조되었다(Buchner et al., Anal.Biochem. 205:263 -270(1992)).

표면 플라스몬 공명. 결합 속도론이 BIAcore 2000 Biosensor(Biacore, Inc., Piscataway, NJ) 를 이용하여 측정되었다. 스텝타비딘이 BIAcore 에 의해서 제공된 아민커플링제를 이용하여 CMS 리서치 등급 센서 칩에 고정되었다. 비오틴화된 EGFRvIII 펩티드가 칩상에 펩티드의 10 nM 용액 10㎕ 를 주입하는 것에 의해서 스트렙타디비딘에 고정되었다. 면역독소는 히피 완충된 살린(hepes buffered saline)(HBS) 에서 25 ㎍/ml 까지 희석되었다. 온 앤 오프율은 50 ㎕ 의 면역독소를 칩표면에 10 ㎕/분으로 주입한후 고정된 물질이 5 분이상 분해되도록 하는 것에 의해서 측정되었다. 잔존하는 고정된 물질은 100 mM 인산을 주입하는 것에 의해서 EGFRvIII 펩티드로부터 제거되었다. 결합 속도론은 BIAevaluation 2.1 소프트웨어를 이용하여 분석되었다.

세포 배양 및 세폭독성 측정. NR6M 세포들이 750 ㎍/ml G418 로 보충된 DMEM 플러스 10 % 송아지 혈청에서 배양되었다. 세포독성 측정은 상기에서 기술한 것과 같이 [3H]-루신 도입의 억제를 측정하였다.(Prior et al., Cell 64: 1017-1023, 1991).

박테이라 및 세포주 E.coli TG1; K12Δ(lac-pro),supE, thi, hsdΔ5/F'[traD36, ProAB,lacI^q, laczΔM15]. E.coli BL21(λDE3);F^- ompT[lon]hsdS_B(r_B ^-m_B ^-;an E.coli B strain) with DE3, T7 RNA 폴리머라제 유전자를 운반하는 λ 프로파지. NR6 는 검출가능한 EGFR 가 없는 Swiss 3T3 마우스 섬유아세포 변이체 세포주이다. NR6M 은 β-액틴 프롭모터의 조절하에서, 돌연변이 EGFRvIII 수용체를 위한 cDNA로 감염된 NR6 세포주이다. NR6 및 NR6M 의 원천은 앞 서 기술되었다.(Lorimer et al., Ciln. Cancer Res. 1:859 -864(1995)).

실시예 3

V_H CDR3 라이브러리의 구성. MR1(Fv) 의 친화성과 상응하는 면역독소 MR1(FV)-PE38 의 활성을 증가시키기 위해서, V_HCDR3 와 V_HCDR3 를 돌연변이시켰으며, 이는 항체의 이들부분이 항원과 중요한 접촉을 만들기 때문이다(MacCallum et al., J. Mol. Biol.262:732 - 745(1996)). V_HCDR3 의 11 아미노산의 처음 9 는 표 5 에 나타나있다.(마지막 2, D101 및 Y102 는 항원 결합에 참여하지 않는 경향이 있는 것으로 고려되어 배제되었다). 9 아미노산 잔기가 무작위화된 완전한 라이브러리는 5 x 10¹¹ 이상의 개개의 클론을 요구하므로, 대신 실시예 1 에서와 같이 잔기 95- 97, 98 - 100 및 101A-101C 를 포함하는 세개의 상이한 라이브러리를 제조하였다. 라이브러리 H-CDR3 95 - 97 은 1.6 x 10⁶ 클론을 포함하며, 라이브러리 H-CDR3 98 - 100 은 4 x 10⁵ 클론을 포함하며, 라이브러리 H-CDR3 101A-101C 은 1 x 10⁶ 클론을 포함한다. 라이브러리가 적절하게 만들어졌다는 것을 확인하기 위해서, 각 라이브러리로부터 5 클론이 서열화되었다. 3 아미노산을 무작위화한 완전히 다른 라이브러리는 단지 8 x 10³ 의 독립 클론을 요구하므로, 라이브러리의 크기는 모든 가능한 DNA 서열이 잘 표현될 수 있다는 것을 확증한다.

V_HCDR3 라이브러리 팬닝 및 선택된 클론의 분석. 향상된 MR1 돌연변이를 위한 최종의 목적된 용도는 독소를 EGFRvIII-양성 암세포에 목표화하는 것이기 때문에, 팬닝에서 EGFRvIII 양성 NR6M 세포를 사용하였다. 팬닝은 면역독소 MR1(Fv)-PE38의 존재하에서 행해졌으므로, 이것은 라이브러리에서 야생형 MR1 Fv의 선택에 대해서 경쟁체로서 활동할 것이 기대되었다. 각 라이브러리로부터 파지가 탈출되고, 동량의 파지(1x109)가 각 라이브러리로부터 1 회 팬닝을 시작하기 위해서 모여졌다. 용출된 파지는 적정되었고, 다음회의 팬닝을 위해서 탈출되었다. 계속적인 팬닝은 팬닝이 실시된 후 탈출된 파지의 적정을 결정함이 없이 시행되었다. 이것은 시간을 절약하기 위한 것이며, 탈출된 파지를 적정하는데 요구되는 24 시간동안 불안정한 바인더가 손실될 수 있는 가능성을 줄이기 위한 것이다. 전형적으로 탈출물들은 1 x 10¹² cfu/ml 를 생산하였다. 표 3 의 각각의 4 회 팬닝중에 포집된 파지의수를 요약하고 있다. 3 회에서 농축이 최고가 되고, 4 회에서는 감소하는 경향이 있다.

초기에 4 회 팬닝후 선택된 파지를 시험하였다. 84 클론이 파지 ELSIA에 결합에 대해 분석되었고, 가장 강한 신호를 가지는 10 클론의 DNA 서열이 결정되었다. 표 6 에서 보여지는 것과 같이, 회수된 유일한 돌연변이는 위치 98 및 99 였다. DNA 서열 분석은 클론이 5 개의 상이한 그룹에 속한다는 것을 보여주었다: 양친 S98-T99; 및 돌연변이 P98-N99; P98-Y99; P98-F99 및 P98-W99. 양호한 바인더가 3 회와 4 회사이에서 손실되었는지를 보기위해서 3 회 후 선택된 파지를 또한 시험하였다. 우리는 개개의 48 클론을 EGFRvIII 펩티드에 대한 결합을 ELISA 에 의해 분석하고, 이들 중 가장 강한 신호를 주는 22가 DNA 서열화를 거쳤다. 다시, 회수된 유일한 돌연변이는 위치 98 및 99에 존재하였다(표 6). 다양한 아미노산이 이 위치에서 회수되었다. 가장 빈번한 것은 S98-T99(야생형)이고 이후 P98-S99;P98-Y99;P98-N99 및 A98-D99 이다. 4 회 팬닝은 야생형(S98-T99)을 넘어서 클론 P98-N99 및 P98-Y99 의 농축, 몇몇 클론의 손실의 결과에 이르며, P98-F99 를 함유한 새로운 클론을 또한 생산한다.

세포독성 및 V_HCDR3 돌연변이의 친화성. MR1 V_HCDR3 라이브러리를 팬닝하여 얻어진 각각의 12 돌연변이는 면역독소를 만들기 위해서 사용되었다. 각 면역독소는 파지 디스플레이 벡터로부터 Fvs 를 PCR 증폭하고 이들을 면역독소 발현 벡터내로 부차클론닝하는 것에 의해서 구성되었다. 모든 면역독소(A98-D99 돌연변이를 V_HCDR3에 함유하는 것을 제외)는 90 - 95 % 이상의 균질성까지 정제될 수 있었다. 정제된 면역독소는 NR6M 세포상에서 그들의 세포독성을 결정하기 위해서 사용되었다. 결합친화성은 칩상에 고정화된 펩티드(또는 칩에 부착된 EGFR의 세포외 영역의 돌연변이형)를 이용한 Biacore 방법에 의해서 측정되었다. 한 세트 실험의 결과는 표 6 에 보여진다; 8.0 ng/ml 의 IC₅₀을 가지는 양친 클론(S98-T99)과 비교시, 보다 세포독성인 것은 6 클론이 존재하였다. 3.5 ng/ml 의 IC₅₀ 을 가지는 P98-Y99 존재 하고, 이어서 4.5 ng/ml 의 IC₅₀ 을 가지는 P98-N99, P98-W99, P98-I99, 6 ng/ml 의 IC₅₀ 을 가지는 P98-S99, 및 6.5 ng/ml 의 IC₅₀ 을 가지는 P98-V99 이다. 4 클론, P98-S99, W98-F99, S98-W99 및 P98-T99 는 양친 항체와 동일한 IC₅₀ 를 갖는다.

V_L CDR3 라이브러리의 구성. V_HCDR3 라이브러리를 팬닝한 수 얻어진 모든 돌연변이는 위치 98 및 99 에 위치되었다. 이들 두 잔기의 DNA 서열은 항체의 in vivo 친화성 성숙 중 돌연변이를 겪는 부위인 핫스팟을 구성한다. V_H라이브러리로부터 가장 높은 세폭독성 활성을 가지는 돌연변이가 사용되고, V_LCDR3 에서 단지 핫스팟을 목표화하는 돌연변이 발생을 겪는다. V_LCDR3 의 서열은 표 3 에 나타나있다. 라이브러리는 잔기 91 및 92 를 코드화하는 핫스팟에 무작위화를 도입하였다. V_LCDR3 파지 라이브러리는 실시예 1에서 기술된 것과 같이 구성되었고, 3 X10⁵ 클론을 함유하였다. 돌연변이를 위해서 선택된 두개의 위치에서 가능한 모든 아미노산 조합을 성취하기 위해서 단지 400 클론의 라이브러리가 요구되기 때문에, 모든 가능한 DNA 서열은 이 라이브러리에 많이 있다는 것이 가정될 수 있다.

V_LCDR3 라이브러리 팬닝 및 선택된 클론의 분석. 3 회 팬닝이 수행되고, 각 단계에서 포집된 파지가 표 3에 나타나 있다. 이러한 라이브러리에 대해서, 3 회 보다 2 회의 팬닝에서 더 농축물을 얻었다. 2 회 팬닝후 48 개개 클론이 탈출되었고, ELISA 에 의해서 측정된 펩티드에 대한 결합 및 가장 강한 신호를 보내는 17 클론의 DNA 서열이 결정되었다. 표 7 에서 나타난 것과 같이, 다섯개의 상이한 돌연변이들이 얻어졌다. 모두다 야생형 세린 잔기를 위치 91 에 보존하였고, 잔기 92 에 돌연변이를 가졌다. 가장 빈번한 것은 F92W(17 중 6), 이어서 E92R(17 중 3), F92S(17 중 2), F92L(17 중1 ) 및 F92M( 17 중1)이다. 분석된 17 중 4 는 양친형이라는 사실이 발견되었다.

3 회 팬닝 후 분리된 클론의 특성은 또한 (표 7) 분석되었다. 20 클로니가 무작위로 뽑혀서, 파지는 탈출되고, ELISA 에 의해서 펩티등에 대한 결합이 체크되었다. 가장 강한 신호를 보내는 10 클로니가 DNA 서열 분석을 위해서 골라졌다. DNA 서열은 3 개의 상이한 타입의 클로니가 존재하며, 전부가 3 회에서 표본이 되었다. 한 양친 클로니 이외에도 이 클론들은 F92S( 10 중 7), F92W(10 중 1), ALC F92R(10 중1) 이 존재하였다. 발견된 새로운 돌연변이는 없었으며, 돌연변이 F92L, F92M 은 발견되지 않았다.

세포독성 및 V_LCDR3 돌연변이의 결합 특성. 얻어진 상이한 Fvs 가 면역독소를 만들기 위해서 사용되고, 그들의 세포독성 활성 및 결합 친화성이 정제된 재조합 단백질을 이용하여 측정되었다. 단지 한 돌연변이, F92W 만이 양친보다 더 활성인 면역독성을 나타내었다. 그 양친의 3.5 ng/ml 에 비해서 그것의 IC50 은 1.3 ng/ml 였다.(표7) 다른 돌연변이들은 낮은 활성을 가졌다. 표 7 에서의 자료는 또한 F92W 가 양친 클로니 F92(Kd 6 nM)에 비해서 보다 높은 친화성(Kd 3 nM)을 가지는 것을 보여주었다. 한 다른 돌연변이, F92L, 은 약간 증가된 친화성(Kd 4 nM)을 가졌다. 그러나 세포독성은 증가하지 않았다. 도 2 는 V_HCDR3 라이브러리 (V_HS98P-T99Y)로부터 얻어진 Fv 및 V_LCDR3 라이브러리 (V_HS98P-T99Y-V_L F92W)로부터 얻어진 가장 활성적인 클로니로부터 만들어진 가장 활성적인 면역독소를, 이것은 이제 MR1-1 으로 명명되며, 양친 클로니의 결합특성과 비교한 면역독성 BIACore 센서그람을 보여준다. 도는 두 돌연변이가 양친 Fv 보다 늦은 분해 속도를 가지는 것을 보여준다. V_H 및 V_L 양자의 돌연변이를 가지는 면역독소 (MR1-1-(Fv)-PE38)의 분석은 그것이 Koff 에서의 감소, 및 Kon 에서의 약간 증가를 가지며, 3 nM의 Kd 의 결과에 이르는 것을 보여준다.

표 4 는 MR1(Fv)-PE38 의 세포독성 활성이 두 개선된 변이체:MR1(Fv) (V_HS98P-T99Y)-PE38 및 MR1-1(Fv)-PE38 과 비교된 두 실험을 보여준다. 양 실험에서, MR1(Fv)-PE38은 가장 적게 활성이었으며, MR1-1(Fv)-PE38 은 가장 활성적이었다.

실시예 4

면역독소 수율. 인식할 수 있는 증가가 상이한 돌연변이 면역독소의 수율에서 정제 공정중에 관측되었다. 되접힘 후, 단백질은 투석되고, 크로마토그래피에 의해서 정제되었다(Buchner et al., Anal. Biochem. 205 : 263 - 270(1992)). 단백질은 큰 단백질 집합, 핵산 및 다른 오염물들을 제거하는 Q-Sepharose 음이온 교환 수지상에서 1 차 회분식-정제되었다. 다음 용출된 단백질이 MonoQ 컬럼상에 적재되고, 단백질이 0 - 0.3 M NaCl 연속 구배로 용출되었다. 이단계는 작은 집합을 제거한다. 적절하게 접힌 단위체 면역독소는 280 mM 의 특징직인 NaCl 농도에서 MonoQ로부터 용출되었다. 모집된 MonoQ 프렉션의 순도는 TSK G300SW 크기별 배제 컬럼으로부터 단일 단위체 피크를 관측하는 것과 SDS-PAGE 에 의해서 확증되었다. 각 돌연변이 면역독소 MR1(Fv)-PE38 의 수율은 피크 MonoQ 프렉션으로부터 모집된 단백질의 양 및 크기별 배제 크로마토그래피(TSK 3000)상에서 단일 피크의 존재를 기준으로 계산되었다. 표 6 및 표 7 은 100 mg 의 내포체 단백질이 정제되었을 때의 수율을 보여준다. 면역독소의 수율은 CDR 에서의 돌연변이에 의해서 영향을 크게 받으며, 양친 MR1(Fv)-PE38 로 2 % 에서부터 많은 돌연변이로 10 - 17.5 % 까지 많게 증가되었다.

실시예 5

EGFRvIII 두개내종양은 10⁵ U87MG.ΔEGFRvIII 세포(U87MG 세포를 EGFRvIII으로 감염시켜서 만들어진 인간 글리오블라스토마 세포주, Nishikawa et al., Proc Natl Acad Sci(USA)91:7727-7730(1994)) 의 브레그마 뒤 4 mm 및 전 1 mm 에 놓여진 카테더를 통한 주입에 의해서 무흉선마우스(athymic rat) 에서 개시되었다. 종 양은 종양내로 직접적으로 카테터를 통한 살린 제어 또는 MR1-1-PE38 면역 독소의 주입에 의해서 처리되었다. 면역독소는 0.2 % 인간 혈청 알부민(HSA) 를 가지는 200 ㎕ 의 포스파이트 버퍼드 살린(PBS)에서 2 또는 6 ㎍ 의 복용량으로 7 일간 투여되었으며, Alzet^R 2 Ml 삼투 펌프를 이용하였으며, 대조 동물은 200 ㎕ 의 PBS-HSA 용액이 투여되었다. 처리는 종양 접종 3 일후 개시되었다. 도 3 에서 보여진 것과 같이, 살린 대조를 받은 모든 동물은 20 일에 사망하였다. 6 ㎍ 복용을 받은 동물의 10 % 는 160 까지 살아있었다. 2 ㎍ 복용으로 처리된 모든 동물의 30 퍼센트가 넘게 여전히 160 까지 살아 있었다. 2 ㎍ 과 6 ㎍ 복용량사이의 생존에서의 차이는 두개내 장착에 있어서, 6 ㎍ 복용량에서 면역독소의 농도는 2 ㎍ 복용량에서는 존재하지 않거나 혹은 감소되는 일부 비-특이적 독성을 뇌 조직에 야기시키기에 충분할 정도로 높을 수 있다. 그러나 양측 복용량에서 면역독소는 생존을 증가시켰다.

실시예 6

EGFRvIII 두개내종양은 10⁵ U87MG.ΔEGFRvIII 세포의 브레그마 뒤 4 mm 및 전 1 mm 에 놓여진 카테더를 통한 주입에 의해서 무흉선마우스(athymic rat) 에서 개시되었다. 종양은 종양내로 직접적으로 카테터를 통한 살린 제어 또는 MR1-1-PE38 면역 독소의 주입에 의해서 처리되었다. 면역독소(0.2, 0.6 및 2.0 ㎍)이 HSA 를 가지는 200 ㎕ PBS 에서 7 일간 Alzet^R 2 Ml 삼투 펌프를 이용하여 앞의 실시 예처럼 전달되었다. 처리는 종양 접종 3 일후 개시되었다.

도 4 에서 보여진 것과 같이, 0.2 ㎍ 또는 0.6 ㎍ 복용량의 면역독소를 받은 동물의 단지 10 % 만이 25 일부 생존하였으며, 반면 살린 대조구를 받은 동물의 약 22% 가 생존하였다. 반대로, 2 ㎍ 복용량을 받은 동물은, 살린 대조구를 받은 동물의 생존 퍼센트의 두배가 넘는 약 55 % 가 생존하였다. 결과는 0.2 및 0.6 ㎍ 복용량은 생존에 영향을 미치기에는 너무 낮고, 반면 2.0 ㎍ 복용량의 면역독소는 충분히 생존을 증가시켰다.

실시예 7

EGFRvIII 종양성 뇌막염은 10⁶ U87MG.ΔEGFRvIII 를 40 ㎕ PBS-HSA 용액에서 수막강내 카테터를 통해 주입하는 것에 의해서 무흉선마우스(athymic rat) 에서 개시되었다. 모든 종양을 가지는 동물의 처리는 종양 접종 3 일 후에 시작되었다. MR1-1-PE38 면역 독소가 40 ㎕의 PBS-HSA 에서 종양 개시 후 3, 5 및 7 일에 주어졌다. 대조구 동물들은 40 ㎕ PBS-HSA 를 동일한 날에 주입하였다.

도 5 에서 보는 것과 같이, 살린 대조구를 받은 모든 동물들은 10 까지 죽었다. 반면, 면역독소를 받은 모든 동물들은 적어도 14 일까지 연장된 생존을 가졌고, 1 ㎍ 복용량을 가지는 동물의 30 % 및 2 ㎍ 복용량을 가지는 동물의 50 % 가 60 일동안 생존하였다.

실시예 8

처리 시작전 7 일에 50 ㎕ 의 U87MG.ΔEGFRvIII 종양 세포 쇄균액의 주입에 의해서 종양이 무흉선마우스(athymic rat) 에서 개시되었다(처리의 시작일은 이 연구에서 "0" 으로 명명되었다). 종양은 20 ㎕ 의 MR1-1-PE38 면역 독소의 1, 2 또는 3 ㎍ 의 20 ㎕ 종양내 볼러스 주입 또는 살린 대조구(상기 실시예에서 기술된 PBS-HSA 용액) 가 0, 2, 4 일에 주입되었다. 종양은 처리시작 0 일에서 600 mm³ 의 평균 부피를 가졌다.

도 6 에서 보는 것과 같이, 어떤 면역독소 복용량으로 처리된 동물의 종양 크기는 대략 처음 처리후 2 일에 측정된 것과 동일하고, 효과적으로 종양의 성장을 정지시켰다. 대조적으로, 단지 살린 대조구로 처리된 동물들은 종양량의 급격한 증가를 보였으며, 종양의 부피가 7 일에는 7500 mm³ 까지 증가하였다.

여기서 명세서에서 언급된 모든 문헌과 특허들은 참고문헌으로 도입된 것으로서 각각 개개의 문헌 또는 특허들이 상세하게 또는 개별적으로 참고문헌으로 여기서 도입된 것으로 가르켜지는 것과 동일한 정도로 도입되었다.

MR1(FV)-PE38 의 세포독성 활성의 EGFRvIII 에 대한 증가된 친화성을 가지는 두 돌연변이외의 비교. IC₅₀ 은 다른 양의 면역독소를 이용한 측정으로부터 계산된다. MR1(Fv)-PE38 을 MR1-1(Fv)-PE38과 비교할 때, MR1(Fv)(VHS98P-T99Y)-PE38 을 MR1-1(Fv)-PE38과 실시예 1에서 비교할 때, MR1(Fv)-PE38 을 MR1(Fv)(VHS98P-T99Y)-PE38, 및 MR1(Fv)(VHS98P-T99Y)-PE38 를 MR1-1(Fv)-PE38과 실시예 2에서 비교할 때, 수치들은 평균 ± S.D.P이며 <.01 이다.

Claims (40)

1. 변이된 항체 중쇄 가변부위(V_H) 및 변이된 항체 경쇄 가변부위(V_L)를 포함하는 폴리펩티드에 있어서,

   각 부위는 3개의 상보성 결정 부위들(CDR들)을 포함하고, 각 부위의 CDR들은 아미노 말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1에서 CDR3로 번호 매겨지고, 상기 폴리펩티드는 Pseudomonas 외독소 A(PE) 또는 PE의 세포독성 단편을 지닌 면역독소로 재조합적으로 만들어질 때 3% 이상의 수율을 가지며, 여기서 상기 변이된 V_H는 하기 치환에 의해 모체 항체 MR1(EGFRvⅢ에 특이적으로 결합하는 scFv, GenBank 수납번호 U76382) V_H와 다른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:

   (a) 항체 MR1의 중쇄 가변부위의 위치 98에서 CDR3의 세린을 프롤린으로 아미노산 치환; 및

   (b) 항체 MR1의 중쇄 가변부위의 위치 99에서 CDR3의 트레오닌을 티로신, 아스파라긴, 트립토판, 이소루신, 페닐알라닌 및 발린으로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 항체 MR1의 경쇄 가변부위의 위치 92에서 CDR3의 페닐알라닌을 트립토판으로 치환을 더 포함하는 폴리펩티드.
4. 제1항에 있어서, 경쇄 가변부위의 CDR1 또는 CDR2에서 치환을 더 포함하는 폴리펩티드.
5. 제1항에 있어서, 중쇄 가변부위의 CDR1 또는 CDR2에서 치환을 더 포함하는 폴리펩티드.
6. 삭제
7. 삭제
8. 제1항에 있어서, 상기 치환들이 P98-Y99, P98-N99, P98-W99, P98-I99, P98-F99 및 P98-V99로 이루어진 그룹에서 선택되는 폴리펩티드.
9. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 scFv인 폴리펩티드.
10. 삭제
11. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 dsFv, Fab 또는 F(ab')₂인 폴리펩티드.
12. 제1항에 있어서, 상기 중쇄에서 치환들이 S98P-T99Y이고, 상기 경쇄는 치환 F92W을 갖는 폴리펩티드.
13. 제1항에 있어서, 효과기 분자, 치료 모이어티 또는 검출가능한 표지를 더 포함하는 폴리펩티드.
14. 제13항에 있어서, 상기 치료 모이어티가 독성 모이어티인 폴리펩티드.
15. 제14항에 있어서, 상기 독성 모이어티가 Pseudomonas 외독소 또는 그것의 세포독성 단편인 폴리펩티드.
16. 제14항에 있어서, 상기 독성 모이어티가 PE38인 세포독성 단편인 폴리펩티드.
17. 제15항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 7ng/㎖ 이하의 단백질 합성에 대한 IC₅₀을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
18. 제15항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 5ng/㎖ 이하의 단백질 합성에 대한 IC₅₀을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
19. 제15항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 3.5ng/㎖의 단백질 합성에 대한 IC₅₀을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
20. 삭제
21. 제15항에 있어서, 상기 폴리펩티드는, 영역 I(아미노산 1-252 및 365-380)이 결실된 Pseudomanas 외독소 A의 38kD 세포독성 단편을 지닌 융합 단백질로 발현시, 3% 이상의 수율을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
22. 제15항에 있어서, 상기 폴리펩티드는, 영역 I(아미노산 1-252 및 365-380)이 결실된 Pseudomanas 외독소 A의 38kD 세포독성 단편을 지닌 융합 단백질로 발현시, 7%의 수율을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
23. 제14항에 있어서, 상기 독성 모이어티는 디프테이아 독소 또는 그것의 세포독성 단편, 사포린 또는 그것의 세포독성 단편, 포키위드 항바이러스 독소 또는 그것의 세포독성 단편, 리신 또는 그것의 세포독성 단편, 및 브리오딘 1 또는 그것의 세포독성 단편으로 이루어진 그룹에서 선택되는 폴리펩티드.
24. 제15항에 있어서, 상기 중쇄에서 치환들이 S98P-T99Y이고, 상기 경쇄는 치환 F92W을 갖는 폴리펩티드.
25. 제1항에 있어서, 박테리오파지 M13 유전자 3 단백질로 융합되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
26. 변이된 항체 중쇄 가변부위 또는 변이된 항체 경쇄 가변부위를 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 있어서,

    각 부위는 3개의 상보성 결정 부위들(CDR들)을 포함하고, 각 부위의 CDR들은 아미노 말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1에서 CDR3로 번호 매겨지고, 상기 폴리펩티드는 Pseudomonas 외독소 A(PE) 또는 PE의 세포독성 단편을 지닌 면역독소로 재조합적으로 만들어질 때 3% 이상의 수율을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 하기 치환에 의해 모체 항체 MR1(EGFRvⅢ에 특이적으로 결합하는 scFv, GenBank 수납번호 U76382)과 다른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 분자:

    (a) 항체 MR1의 중쇄 가변부위의 위치 98에서 CDR3의 세린을 프롤린으로 아미노산 치환; 및

    (b) 항체 MR1의 중쇄 가변부위의 위치 99에서 CDR3의 트레오닌을 티로신, 아스파라긴, 트립토판, 이소루신, 페닐알라닌 및 발린으로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환.
27. 제26항에 있어서, 상기 중쇄 가변부위의 CDR1 또는 CDR2에서 하나 이상의 아미노산의 치환을 더 포함하며, 상기 아미노산은 R이 아데닌(A) 또는 구아닌(G), Y가 시토신(C) 또는 티민(T), W가 A 또는 T인 AGY 또는 RGYW로부터 선택된 핫스팟 모티프에 속하는 뉴클레오티드를 포함하는 코돈에 의해 엔코딩되는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
28. 제26항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 경쇄 가변부위의 CDR3에서 F92의 치환을 더 갖는 핵산 분자.
29. 제28항에 있어서, 상기 중쇄 가변부위에서 치환들이 S98P-T99Y, S98P-T99W, S98P-T99I 및 S98P-T99V로부터 선택되는 핵산 분자.
30. 제28항에 있어서, 상기 중쇄 가변부위에서 치환들이 S98P-T99Y이고, 상기 경쇄에서 F92W의 치환을 더 포함하는 핵산 분자.
31. 제26항에 있어서, 프로모터에 작동적으로(operably) 연결된 핵산 분자.
32. 제27항에 있어서, 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산 분자.
33. 제28항에 있어서, 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산 분자.
34. 제29항에 있어서, 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산 분자.
35. 제30항에 있어서, 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산 분자.
36. 항원을 지닌 세포를 사멸시키기 위한 약제를 조제하는데 사용되는, 독성 모이어티 및 표적화 모이어티를 포함하는 면역독소에 있어서,

    상기 표적화 모이어티는 변이된 항체 중쇄 가변부위 및 변이된 항체 경쇄 가변부위를 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, 각 부위는 3개의 상보성 결정 부위들(CDR들)을 포함하고, 각 부위의 CDR들은 아미노 말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1에서 CDR3로 번호 매겨지고, 상기 폴리펩티드는 Pseudomonas 외독소 A(PE) 또는 PE의 세포독성 단편을 지닌 면역독소로 재조합적으로 만들어질 때 3% 이상의 수율을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 하기 치환에 의해 모체 항체 MR1(EGFRvⅢ에 특이적으로 결합하는 scFv, GenBank 수납번호 U76382)과 다른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 면역독소:

    (a) 항체 MR1의 중쇄 가변부위의 위치 98에서 CDR3의 세린을 프롤린으로 아미노산 치환; 및

    (b) 항체 MR1의 중쇄 가변부위의 위치 99에서 CDR3의 트레오닌을 티로신, 아스파라긴, 트립토판, 이소루신, 페닐알라닌 및 발린으로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환.
37. 제36항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 중쇄 가변부위의 CDR1 또는 CDR2에서 하나 이상의 아미노산 치환을 더 포함하며, 상기 아미노산은 R이 아데닌(A) 또는 구아닌(G), Y가 시토신(C) 또는 티민(T), W가 A 또는 T인 AGY 또는 RGYW로부터 선택된 핫스팟 모티프에 속하는 뉴클레오티드를 포함하는 코돈에 의해 엔코딩되는 것을 특징으로 하는 면역독소.
38. 제36항에 있어서, 변이된 중쇄 가변부위의 CDR3이 P98-Y99, P98-N99, P98-W99, P98-I99, P98-F99 및 P98-V99로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 치환을 포함하는 면역독소.
39. 제36항에 있어서, 경쇄 가변부위의 위치 92에서 CDR3의 페닐알라닌을 트립토판으로 치환을 더 포함하는 면역독소.
40. 제36항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 상기 경쇄에서 치환 F92W을 포함하는 면역독소.

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