KR100818659B1 - 거대분자 약물을 함유한 히알루론산 나노젤 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 약물과 카르복시산에 유리 황화기가 도입된 히알루론산을 수용액에 용해하는 단계; 상기 수용액을 유기용매에 첨가하여 W/O 역에멀젼을 형성하는 단계; 유리황화기를 이황화결합하여 자가가교시키는 단계를 포함하는 치료용 약물을 함유한 히알루론산 나노젤의 제조방법을 제공한다.

히알루론산, 나노젤, 하이드로젤, 역에멀젼, 이황화결합

Description

거대분자 약물을 함유한 히알루론산 나노젤 및 그 제조방법{Hyaluronic acid nanogels for physical encapsulation of macromolecular drugs and Fabrication method thereof}

도 1은 본 발명에 사용된 히알루론산 (HA)(분자량: 1.79 x 10⁷)의 카르복실기에 EDC/HOBt를 이용하여 양 말단에 아민기를 가진 씨스타민을 접목시킨 후, DTT를 이용하여 씨스타민에 존재하는 이황화 결합을 환원시켜 유리 황화기를 생성하는 방법을 설명하고 있다.

도 2는 본 발명에서 사용된 유리 황화기가 도입된 히알루론산 (HA)이 워터-인-오일 에멀젼 (w/o emulsion)을 통해 자가 가교함으로써 siRNA가 물리적으로 봉입되는 과정을 설명하고 있다.

도 3은 히알루론산 나노젤 (HA nanogel)의 크기를 측정한 결과이다. (A) DLS를 통해 측정한 히알루론산 나노젤의 크기, (B) 아토믹포스마이크로스코피 (AFM)을 토해 측정한 히알루론산 나노젤의 크기.

도 4는 히알루론산 나노젤에 함유된 siRNA가 글루타치온 (GSH) 농도에 따라 다른 방출 속도를 나타낸 것을 나타낸다.

도 5는 초록 형광 단백질 siRNA가 봉입된 히알루론산 나노젤을 초록 형광 단백질을 발현하는 세포 (HCT-116)에 첨가하였을 때 얻을 수 있는 단백질 발현에 관한 것이다. (A) 첨가된 siRNA양에 따른 초록 형광 단백질의 발현 억제와 (B) 배지에 혈청이 첨가 되었을 경우와 무혈청의 경우에 나타나는 초록 형광 단백질의 발현 억제를 나타내고 있다.

본 발명은 생체적합성 천연 고분자인 히알루론산 (HA)을 재료로 하여 거대 분자 약물을 세포내로 전달할 수 있는 히알루론산 나노젤 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

기존에 발명된 거대 분자약물을 세포내로 전달할 수 있는 방법으로 생체분해 성 합성 고분자 (예로, PLGA)를 이용한 워터인오일인워터 (W/O/W) 나노스피어 (nanosphere), 거대분자 약물(siRNA, 펩타이드, 단백질)의 페길레이션 (PEGylation), 강한 양이온을 띠는 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine, PEI), 폴리엘라이신 (poly-lysine, PLL)을 이용한 치료용 유전 물질과의 폴리일렉트롤라이트 컴플렉스(polyelectrolyte complex)의 형성 등이 있다. 이러한 전달 방법은 상기 거대 분자약물의 물리화학적 안정성에 많은 문제점을 일으킨다. 예를 들어, PLGA 나노스피어의 경우 낮은 봉입율과 미비한 전달효율로서 실용성이 현저히 낮고, 펩 타이드나 유전자의 페길레이션 (PEGylation)은 뭉침(aggregation) 현상을 줄여주지만 그 전달 효율이 낮다. 또한 폴리일렉트롤라이트 콤플렉스의 경우, 양이온성 고분자들이 세포 독성을 유발하기 쉬워 아직 안전성에 문제가 있다. 특히 급성적인 세포 독성, 면역반응 등을 일으키는 것으로 알려져 있어서 생체 적합성이 떨어진다.

천연 고분자인 히알루론산 (HA)은 넌설페이티드 글라이코사미노글리칸 (nonsulfated glycosaminoglycan)으로서 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루큐로닉산으로 구성되어 있으며, 세포 밖 구조체의 주요 성분으로서 높은 생체 적합성을 가지고 있다. 또한 피하조직과 연골조직 같은 연결조직의 세포외측 기질 뿐 아니라 안구의 유리체 및 관절 동동의 활액에 존재하며, 히알루론산과 히알루론산 수용체인 CD44/RHAMM의 상호작용은 세포 이동성 및 세포증식과 특정 생리학적 과정들을 제어하는 것으로 알려져 있다.

이러한 특징으로 히알루론산은 치료적 용도를 가지며, 미국식품의약품(FDA)에서 정맥주사, 구강 투여, 피부투여 등으로 인간에게 사용하는 것을 승인 받은 천연 고분자이다 (참조:P. Bulpitt, et al., J. Biomed. Mater. Res. 47, 152(1999)). 현재로는 조직공학용 지지체와 약물전달용 하이드로젤로서 그 사용 범위가 증대되고 있다.

하이드로젤을 이용한 거대분자 약물 전달은 그 동안 많은 연구 결과와 효용성이 발표되었으며 (참조: A. Ludwi, Adv Drug Deliv Rev 57(11) (2005)), 특정 암세포 표면에 많이 발현되는 CD44와 결합 할 수 있음이 이미 알려져 있어, 암세포 를 목표로 표적지향적 약물전달이 가능하다 (참조: K. Akima et al.. J Drug Targetting 4 (1996)). 특히 나노 크기의 시스템에서의 거대분자 약물의 흡수는 상피 장벽(epithelial barrier)을 침투하는 것을 가능하게 하며, 약물을 분해로부터 방어해준다는 것 또한 증명되었다.

본 발명은 상기한 바와 같이 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로, 그 목적은 거대 분자 약물을 물리적으로 봉입하는 것이 가능하여, 약물의 세포내 전달율, 안정성 및 약물의 활성도 면에서 매우 우수한 약물 전달체의 제조방법 및 약물전달체를 제공함에 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 카르복시산에 유리 황화기가 도입된 히알루론산을 이황화결합시켜 자가가교에 의해 히알루론산 나노젤을 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 히알루론산의 카르복시산에 유리 황화기를 도입하는 단계; 상기 유리 황화기가 도입된 히알루론산을 이황화결합시켜 자가가교에 의해 히알루론산 나노젤을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 본 발명에 의하면 바람직하게는 히알루론산의 분자량은 10,000~2×10⁷ 의 범위이다.

상기 본 발명에 의하면 바람직하게는 히알루론산의 유리 황화기의 치환율은 10~90%의 범위이다.

상기 본 발명에 의하면 바람직하게는 히알루론산 나노젤은 100~900nm의 지름을 가지는 구형이다.

또한 본 발명은 치료용 약물을 함유하며, 카르복시산에 유리 황화기가 도입된 히알루론산을 이황화결합시켜 자가가교된 히알루론산 나노젤을 포함하는 치료용 약물을 함유한 히아루론산 나노젤을 제공한다.

상기 본 발명에 의하면 바람직하게는 약물은 플라즈미드 유전자, 안티센스 ODN, siRNA, RNA, 펩타이드, 단백질 및 수용성 약물로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 한다.

또한 본 발명은 약물과 카르복시산에 유리 황화기가 도입된 히알루론산을 수용액에 용해하는 단계; 상기 수용액을 유기용매에 첨가하여 W/O 역에멀젼을 형성하는 단계; 유리황화기를 이황화결합하여 자가가교시키는 단계를 포함하는 치료용 약물을 함유한 히아루론산 나노젤의 제조방법을 제공한다.

상기 본 발명에 의하면 바람직하게는 유기용매는 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 벤젠, 톨루엔, 및 헥산으로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 한다.

이하, 본 발명의 내용을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 히알루론산 나노젤은 이황화결합에 의해 자가가교된 상태의 하이드로젤로서, 내부에 원하는 목표에 전달하고자 하는 약물을 함유할 수 있고, 환원환경에서는 함유된 약물을 방출하는 것이 가능하다.

이와 같은 본 발명의 히알루론산 나노젤은 히알루론산에 존재하는 카르복실기에 유리 황화기가 소정 비율로 도입되어진 것을 기본 단위체로 하고, 이들 단위체들을 이황화 결합시켜 자가가교에 의해 구형의 나노젤로서 제조할 수 있다.

카르복실기를 다량 함유한 천연 고분자인 히알루론산 (HA)은 황화기(thiol group)의 도입이 간편하고 또한 효과적이다. 황화기가 도입된 히알루론산은 중성 pH 영역에서 이황화 결합을 형성할 수 있으며, 자가가교에 의해 하이드로젤을 형성할 수 있다.

황화기를 제공할 수 있는 물질은 구조내 카르복실기에 치환되어질 수 있는 작용기를 가지며, 유리 황화기를 가지고 있거나, 이황화 결합을 가지고 있어 환원조건하에 유리 황화기를 제공할 수 있는 어떠한 물질도 사용될 수 있으며, 예를 들어 시스타민(Cystamine), DTP (dithiobis(propanoic dihydrazide)), DTB (dithiobis(butyric dihydrazide)) 등을 들 수 있다.

본 발명에서의 유리 황화기의 치환율은 특별한 한정을 요하는 것은 아니며, 예를 들어 10~90%의 범위내에서 실시하는 것으로 족하다.

본 발명에 사용될 수 있는 히알루론산의 분자량은 특별한 한정을 요하는 것은 아니며, 예를 들어 10,000~2×10⁷의 범위내에서 실시하는 것으로 족하다. 히알루론산 천연 고분자는 이와 같이 다양한 분포의 분자량이 사용될 수 있으며, 본 발명에 의하면 히알루론산의 분자량에 따라 용해도의 차이가 다소 나타나지만, 카르복 실기의 치환율에는 큰 차이가 나타나지 않았다.

본 발명에 따라 제조되어지는 히알루로산 나노젤은 100~900nm의 지름을 가지는 구형의 나노젤이다.

본 발명에 따라 얻어지는 히알루론산 나노젤은 타겟에 전달하고자 하는 약물을 함유할 수 있으며, 이들 약물은 유리 황화기가 도입된 히알루론산과 혼합하여 수용액에 용해된 후, 이를 초음파의 존재하에 유기용매상에 분산시켜 나노미터 수준의 W/O 역에멀젼을 형성하고, 이황화 결합으로 가교시키는 과정에 의해 히알루론산 나노젤의 내부에 봉입될 수 있다.

초음파 진동을 이용한 에멀젼의 형성은 이황화 결합의 형성을 촉진시켜 신속한 이황화 결합에 의한 자가가교를 유도하고, 그 결과 내부에 봉입되어질 거대분자 약물의 구조와 활성도를 유지하는데 큰 도움이 된다.

상기 본 발명에서 W/O 역에멀젼을 형성하기 위해 사용될 수 있는 유기 용매로는 예를 들어, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 벤젠, 톨루엔, 헥산 등을 들 수 있다.

본 발명에 사용될 수 있는 약물은 바람직하게는 치료용 수용성 고분자로서, 특별히 한정되는 것은 아니며, 플라즈미드 유전자, 안티센스 ODN, siRNA, RNA, 펩타이드, 단백질 등의 약물을 들 수 있다. 특히 치료용 유전자의 경우 봉입율이 50% 이상으로서 매우 높고, 그 활성도도 매우 우수하다.

본 발명에 따른 히알루론산 나노젤은 특히, 특정 세포 예를 들어 암세포의 CD44와 RHAMM의 수용체를 특이적으로 인식할 수 있어 세포내 이입과정 등에 의해 진입이 가능하고, 세포내 환원인자인 글루타치온에 민감하게 반응하여 분해될 수 있어 암세포 표적지향형 약물전달체로서도 기능할 수 있다.

이하, 실시 예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 본 발명을 오로지 설명하기 위한 것으로 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 히알루론산에 황화기의 도입

히알루론산 (HA, MW:132K, 630K, 1.79x10⁷) 을 각각 pH 7.0 의 인산완충액 (PBS) 에 녹인 후, 0.44 um 의 나일론 필터 (Minisart)를 이용하여 필터링을 하였다. 필터링이 된 히알루론산 용액에 히알루론산에 존재하는 카복실기의 몰비(molar ratio)의 3배에 해당하는 EDC 와 HObt를 첨가한 후 2시간 동안 잘 섞어주었다. 그 후 EDC/HObt 와 동일한 몰비 (molar ratio)의 씨스타민 (cystamine dihydrochloride)을 첨가한 후 24 시간 동안 반응시켰다. 반응 물질은 남아있는 EDC/HObt 와 씨스타민을 제거하기 위해 투석막 (MWCO: 3500)을 이용하여 증류수에서 24시간동안 투석한 후, 투석된 용액에 카르복실기의 몰 비의 5배에 해당하는 디티티 (DTT)를 첨가하여 24 시간동안 반응시켰다. 이때 첨가된 DTT는 씨스타민과 반응하여 유리 황화기 (free thiol group)를 만드는데 이용된다. 황화기가 도입된 히 알루론산 용액은 다시 한번 투석막 (MWCO: 20,000)을 이용하여 증류수에서 이틀간 투석시켰다. 투석된 용액은 동결건조하였다 (도 1).

유리 황화기 (free thiol group)가 히알루론산에 도입된 양을 확인하기 위하여, 엘만 측정법 (Elman's assay)을 사용하였다. 엘만 측정법에 따라, 각 히알루론산 분자량의 유리 황화기의 도입 정도는 30~45% 로 측정되었으며, 그 결과 분자량에 따른 황화기의 도입 경향에는 큰 차이를 보이지 않았다.

<실시예 2> 치료용 거대분자 약물이 봉입된 히알루론산 나노젤의 제조

실시예 1에서 준비한 황화기가 치환된 히알루론산 (HA, MW: 1.79x10⁷) 을 pH 7.0 PBS 에 1~2 % 농도로 녹였다. 이때 치료용 거대분자 약물 (siRNA, 펩타이드, 단백질)를 함께 첨가하여 녹인 후, 0.44 um 의 나일론 필터 (Minisart)를 이용하여 여과하였다. 워터인 오일 에멀젼 (W/O emulsion)에서 사용될 유기 용매로 헥산 (anhydrous hexane)을 준비하였다 (5 ml). 헥산에 스판 65 (Span 65) 계면 활성제를 무게비로 2 % 가량 첨가한 후 초음파 진동기를 이용해 녹였다. 이렇게 계면 활성제가 녹아 있는 헥산에 위에서 준비된 약물이 첨가된 히알루론산 용액을 한 방울씩 첨가하면서 15초간 초음파 진동기를 이용해 워터인 오일 에멀젼을 만들었다. 그 후 히알루론산 간의 충분한 가교 (crosslinking)를 위해 2 시간가량 마그네틱 교반(magnetic stirrer)를 이용해 잘 섞어주었다 (도 2). 이때 생성된 나노젤은 원심분리기를 이용하여 분리한 후, 계면 활성제 제거를 위해 헥산을 이용해 두 번 닦아 내고 진공 오븐에서 말렸다.

히알루론산 나노젤의 크기는 동적광산란 장치 (DLS)를 통해 측정할 수 있다. 측정값은 200~300 나노미터 크기로 그 분포도가 균일했다 (도 3).

<실험예 1> 봉입된 치료용 고분자의 양의 정량 및 발산

실시예 2에서 제조한 히알루론산 나노젤이 치료용 거대분자 약물을 물리적으로 봉입한 정도를 측정하기 위한 실험을 수행하였다. 디티티 (DTT) 와 글루타치온을 이용하여 이황화 결합을 통해 가교되어 있는 히알루론산 나노젤을 분해시킨 후, 남아 있는 치료용 siRNA의 양을 정량 하였다. siRNA의 양을 정량 한 경우, 봉입율이 ~50 퍼센트에 이르렀다. 또한 0~10 mM 사이의 글루타치온의 농도에 따른 siRNA 의 방출 정도도 측정하였다. 참고로 세포내의 글루타치온의 농도는 1~10 mM 정도로 알려져 있다. 측정 결과 10 mM　글루타치온 농도에서 1 시간 안에, siRNA 가 모두 방출되는 것을 확인할 수 있었다 (도 4).

<실험예 2> 히알루론산 나노젤의 세포내 전달

실시예 2에서 제조한 siRNA를 함유한 히알루론산 나노젤을 세포내로 전달하는 실험을 해보았다. 초록 형광을 띠는 HCT-116 세포를 anti-GFP siRNA를 함유한 히알루론산 나노젤 (1mg/ml)을 배지에 첨가하여 배양한 후, 유전자 발현 억제정도를 측정하였다. 측정결과, 배양액에 혈청(serum)이 첨가되거나 첨가되어 있지 않은 두 경우 모두 60% 이상의 유전자 발현 억제 정도를 확인할 수 있었다 (도 5).　이 결과 히알루론산 나노젤은 기존의 다른 양이온성 고분자 담체 (예로, 폴리에틸렌이민)에 비하여 시럼이 존재하여도 유전자 발현 억제 효율이 우수하다는 것을 예시하고 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 거대 분자 약물을 히알루론산 (HA) 나노젤에 물리적으로 봉입하는 것이 가능하여, 약물의 세포내 전달율, 안정성 및 약물의 활성도 면에서 매우 우수한 약물전달체를 제공하는 것이 가능하다. 특히, 암세포의 특정 수용체에 대하여 선택성이 우수하여 암세포 표적지향성 약물전달체로서 기능 할 수 있다.

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11. 약물과 카르복시산에 유리 황화기가 도입된 히알루론산을 수용액에 용해하는 단계; 상기 수용액을 유기용매에 첨가하여 W/O 역에멀젼을 형성하는 단계; 유리황화기를 이황화결합하여 자가가교시키는 단계를 포함하는 치료용 약물을 함유한 히 아루론산 나노젤의 제조방법.
12. 제 11항에 있어서, 히알루론산의 분자량은 10,000~2×10⁷의 범위인 히알루론산 나노젤의 제조방법.
13. 제 11항에 있어서, 히알루론산의 유리 황화기의 치환율은 10~90%인 히알루론산 나노젤의 제조방법.
14. 제 11항에 있어서, 히알루론산 나노젤은 100~900nm의 지름을 가지는 구형인 히알루론산 나노젤의 제조방법.
15. 제 11항에 있어서, 유기용매는 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 벤젠, 톨루엔, 및 헥산으로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 1종인 히알루론산 나노젤의 제조방법.
16. 제 11항에 있어서, 약물은 플라즈미드 유전자, 안티센스 ODN, siRNA, RNA, 펩타이드, 단백질 및 수용성 약물로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 1종인 히알루론산 나노젤의 제조방법.

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