KR100803577B1

KR100803577B1 - 이카린의 가수분해물을 함유하는 화장료용 조성물

Info

Publication number: KR100803577B1
Application number: KR1020050115649A
Authority: KR
Inventors: 박준성; 노호식; 김덕희; 장이섭
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2005-11-30
Filing date: 2005-11-30
Publication date: 2008-02-15
Anticipated expiration: 2025-11-30
Also published as: JP5227181B2; JP2009517461A; WO2007064085A1; KR20070056674A; CN101316573A; CN101316573B; US20090170787A1; US8394775B2

Abstract

본 발명은 이카린의 가수분해물을 함유하는 화장료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 이카린의 가수분해물인 이카리틴, 이카리시드 I 및 이카리시드 II를 함유하는 화장료에 관한 것이고, 상기 이카린(icariin)의 가수분해물은 (a) 식물로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 이카린을 함유하는 식물 추출물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득된 식물 추출물을 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료용 조성물은 항산화, 항노화, 미백 또는 주름 개선용으로 적용될 수 있다.

에피메디움, 이카리틴, 이카리시드 I, 이카리시드 II, 이카린, 항산화, 미백, 주름 개선, 항노화, 화장료

Description

이카린의 가수분해물을 함유하는 화장료용 조성물{Cosmetic composition containing hydrolysates of icariin}

에피메디움 속 식물류는 매자나무과에 속하며 중국 약전에는 E. brevicornum, E. sagittatum 및 E. koreanum의 3종이 기록되어 있다. 에피메디움 속 식물의 성분연구는 플라보노이드(flavonoid), 알칼로이드(alkaloid) 및 리그난(lignan) 등이 주성분으로 보고 되고 있다. 특히, 삼지구엽초(Epimedium koreanum Nakai)의 지상부를 말린 생약은 음양곽으로서 한방 및 민간에서 강정, 전신불수, 건망증 및 신경성 강장제의 목적으로 사용되고 있다.

체내 효소계, 환원대사, 화학약품, 공해물질 및 광화학반응 등의 각종 물리적, 화학적 및 환경적 요인 등에 의하여 생성되는 활성산소는 세포구성 성분들인 지질, 단백질, 당 및 DNA 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 파괴작용을 함으로써 세포노화 또는 암을 비롯한 각종 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한 이들 활성산소에 의한 지질과산화의 결과로 생성되는 지질과산화물을 비롯한 여러가지 체내 과산화물도 세포에 대한 산화적 파괴를 일으켜 각종 기능장애를 야기함으로써 여러 가지 질병의 원인이 되기도 한다.

따라서, 이와 같은 자유 라디칼을 소거할 수 있는 화합물(free radical scavengers) 또는 과산화물 생성 억제물질과 같은 항산화제들이 이들 산화물들에 기인하는 노화 및 각종 질환의 억제 또는 치료제로서 기대된다.

천연 항산화제의 개발을 위하여 많은 천연물 유래의 원료들이 연구되어 왔는데, 대부분의 천연물 유래의 원료들은 단순추출물의 형태로 사용되어 왔고, 그 추출물들이 보이는 효능이 정확하게 어떤 물질에 의한 것인지 밝혀지지 않고 경험과 구전에 의해 화장료 등에 사용되고 있는 것이 현실이다.

한편, 피부의 노화는 그 요인에 따라 크게 두 가지로 구분할 수 있다. 그 중 하나인 자연적인 노화(Intrinsic aging)는 피부의 구조와 생리적인 기능이 나이를 먹으면서 계속적인 감퇴를 일으키는 것이고, 다른 하나인 외적 노화(Extrinsic aging)는 태양광선 등 누적된 외부 스트레스로 인해 발생하는 것이다. 특히 태양광의 자외선(ultraviolet rays; UV)은 잘 알려진 노화 원인의 하나로 장시간 자외선에 노출된 피부는 각질층이 두꺼워지고 피부의 주요 구성요소인 콜라겐과 엘라스틴 이 변성되어 피부의 탄력성을 잃어가게 된다. 이러한 콜라겐과 엘라스틴은 여러 가지 요인에 의해서 조절되는데, 콜라게나아제(collagenase)와 엘라스타아제(elastase) 같은 기질 메탈로 프로테아제(matrix metallo protease)의 발현으로 인하여 생성된 콜라겐과 엘라스틴이 분해되어 결과적으로 피부 내의 콜라겐 함량이 줄어드는 현상이 나타나게 된다.

이러한 탄력감소의 원인이 되는 콜라겐 및 엘라스틴의 감소를 억제하려는 목적으로 여러 가지 물질들이 개발되어 사용되고 있는데, 그 중 레티놀과 레티노익산 등의 레티노이드 등이 탄력개선 효과를 나타내고(Dermatology therapy, 1998, 16, 357∼364), 레구미노사 종자(Leguminosae Seeds)에서 얻어진 단백질분획도 탄력증대 효과를 나타내는데 응용되고 있다(미국특허 제5,322,839호).

그러나, 이들 레티노이드들은 소량만을 피부에 적용하여도 자극이 나타난다는 단점을 가지며 대부분의 천연물 유래의 원료들은 단순추출물의 형태로 사용되어 왔고, 그 추출물들이 보이는 효능이 정확하게 어떤 물질에 의한 것인지 밝혀지지 않아 그 추출물의 활성을 지속적으로 유지, 제어하기가 어려운 것이 현실이다.

한편, 사람의 피부색을 결정하는 데는 여러 가지 요인들이 관여하는데, 그 중에서도 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드, 빌리루빈 등의 인체 내외의 색소 함유 유무 등의 요인들이 중요하다.

이중 특히 가장 중요한 요인은 인체 내의 멜라노사이트에서 타이로시나제 등의 여러 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌이라는 흑색 색소이다. 이 멜라닌 색소의 형성에는 유전적 요인, 호르몬 분비, 스트레스 등과 관련된 생리적 요인 및 자외선 조사 등과 같은 환경적 요인 등이 영향을 미친다.

신체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서, 태양으로부터 조사되는 자외선을 차단하여 진피 이하의 피부기관을 보호해주는 동시에 피부 생체 내에 생겨난 자유 라디칼 등을 잡아주는 등 피부 내 단백질과 유전자들을 보호해주는 유용한 역할을 담당한다.

이와 같이 피부 내, 외부의 스트레스적 자극에 의해 생겨난 멜라닌은, 스트레스가 사라져도 피부 각질화를 통해서 외부로 배출되기 전까지는 없어지지 않는 안정한 물질이다. 그러나 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미나 주근깨, 점 등과 같은 과색소 침착증을 유발하여 미용상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 된다.

또한, 레저 인구의 증가로 외부에서 활동하는 것을 즐기는 사람들이 많아지면서 자외선에 의한 멜라닌 색소 침착을 막고자 하는 요구가 늘어나게 되었다.

이와 같은 요구에 부응하여 종전부터 아스코르빈산, 코지산, 알부틴, 하이드로퀴논, 글루타치온 또는 이들의 유도체들, 또는 타이로시나제 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합하여 사용하여 왔으나, 이들의 불충분한 미백효과, 피부에 대한 안전성 문제, 화장료에 배합 시 나타나는 제형 및 안정성의 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고, 보다 우수한 항산화, 항노화, 미백제 원료를 찾고자 하는 연구의 일환으로 여러 천연물을 검색한 결과 에피메디움속 식물 추출물의 플라보노이드 성분인 이카린이 우수한 효능을 보이는 것을 발견하였고 나아가 이카린으로부터 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해하여 생성된 이카린의 가수분해물이 항산화, 항노화 및 미백제로서 효과가 더욱더 우수하다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 목적은 이카린의 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 에피메디움 속 식물 유래의 이카린으로부터 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용한 분해 반응을 통하여 상기 화장료 조성물에 유효성분으로 함유되는 이카린의 가수분해물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 이카린의 가수분해물을 함유하는 화장료용 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

상기에서, R1은 OH 또는 람노피라노오스이고, R2는 OH 또는 글루코피라노오스이다. 다만, R1과 R2는 동시에 람노피라노오스 및 글루코피라노오스가 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 항산화용, 항노화용, 미백용 또는 주름개선용인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 함유되는 이카린의 가수분해물은 (a) 식물로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 이카린을 함유하는 식물 추출물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득된 식물 추출물을 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조될 수 있다.

상기 방법에서, 상기 (a) 단계의 식물 추출물은 에피메디움속으로부터 유래된 것임을 특징으로 할 수 있고, 상기 유기용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유기용매, 또는 이들 유기용매와 물과의 혼합용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 80% 에탄올을 사용할 수 있다.

또한, 상기 (b) 단계에서, 산은 염산, 황산 및 질산으로 이루어진 군에서 선 택된 하나 이상의 산, 또는 이들 산과 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매를 사용할 수 있다. 이 때, 사용할 수 있는 산의 농도는 0.1∼2N이고, 혼합용매의 알코올 함량은 10∼50%이며, 반응온도는 50∼100℃이고, 반응시간은 0.5∼8 시간이다.

상기 (b) 단계의 상기 염기는 수산화나트륨 및 수산화칼륨으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기, 또는 이들 염기와 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매를 사용할 수 있다. 이 때, 사용할 수 있는 염기의 농도는 0.1∼2N이고, 혼합용매의 알코올 함량은 10∼50%이며, 반응온도는 50∼100℃이고, 반응시간은 0.5∼24 시간이다.

상기 (b) 단계의 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물은 당 결합을 분해하는 효소 또는 상기 당 결합을 분해하는 효소를 생산하는 미생물을 사용할 수 있으며, 상기 효소는 이카린에서 당 부분을 제거하여 이카린의 가수분해물을 분리한다.

상기 효소로는 글루코시다제(glucosidase), 아라비노시다제(arabinosidase), 람노시다제(rhamnosidase), 자일로시다제(Xylosidase), 셀룰라제(cellulase), 헤스페리디나제(hesperidinase), 나린지나제(naringinase), 글루쿠로니다제(glucuronidase), 펙티나제(pectinase), 갈락토시다제(galactosidase) 및 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

또한, 상기 효소를 생산하는 미생물은 아스퍼질러스(aspergillus)속, 바실러 스(bacillus)속, 페니실리움(penicillium)속, 리조푸스(rhizopus)속, 리조무코르(rhizomucor)속, 탈라로마이세스(talaromyces)속, 비피도박테리움(bifidobacterium)속, 모르티에렐라(mortierella)속, 크립토코커스(cryptococcus)속 및 마이크로박테리움(microbacterium)속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명에 의한 이카린 및 이카린의 가수분해물인 이카리틴, 이카리시드 I 및 II는 하기의 구조식을 가진다:

물질명	R1	R2
이카린 (icariin)	람노피라노오스 (Rhamnopyranose)	글루코피라노오스 (Glucopyranose)
이카리시드 I (icariside I)	OH	글루코피라노오스
이카리시드 II (icariside II)	람노피라노오스	OH
이카리틴 (icaritin)	OH	OH

이하, 본 발명에서 이카린의 가수분해물을 제조하는 과정을 보다 상세히 설명한다.

상기 (a) 단계에서, 식물로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 이카린을 함유 하는 식물 추출물을 수득하는 방법은 다음과 같다. 즉, 식물에 약 1 내지 6 배, 바람직하게는 약 3 배의 물 또는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유기용매, 또는 이들 유기용매와 물과의 혼합용매를 넣고, 상온에서 1 내지 5 회 교반하면서 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 식물에 약 1 내지 8 배, 바람직하게는 약 4 배의 물 또는 유기용매를 넣고, 1 내지 5회 환류 추출한 후, 10 내지 20℃에서 1 내지 3일간 침적시킨다.

상기 침적물을 여과와 원심분리를 통하여 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후 에테르 등을 이용하여 색소를 제거한 다음, 수층을 부탄올 등을 사용하여 1 내지 5회 추출한 후, 수득한 유기용매층을 감압농축하여 부탄올 등의 엑기스를 얻고, 이를 소량의 메탄올 등에 녹인 후, 대량의 에틸아세테이트 등을 추가하여 생성된 침전물을 건조시켜 이카린을 수득할 수 있다.

상기 (b) 단계에서, 상기 수득된 이카린을 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해하여 이카린의 가수분해물을 제조한다.

이 때, 산을 이용하는 경우, 식물 추출물에 0.1∼2N 농도, 바람직하게는 1N 농도의 산, 또는 산 및 알코올의 혼합용매(바람직하게는 50% 에탄올 혼합용매)를 가한 후, 50 내지 100℃, 바람직하게는 80℃ 수욕조에서 1 내지 48 시간, 바람직하게는 8 시간 동안 가열 환류시켜 가수분해하여 반응액을 수득할 수 있다.

염기를 이용하는 경우, 식물 추출물을 녹인 후, 0.1∼2N 농도, 바람직하게는 1N 농도의 염기, 또는 염기 및 알코올의 혼합용매(바람직하게는 50% 부탄올 혼합용매)를 가해 50 내지 100℃, 바람직하게는 100℃ 수욕조에서 1 내지 48 시간, 바람직하게는 8 시간 동안 가열 환류시켜 가수분해하여 반응액을 수득할 수 있다.

효소를 이용하는 경우, 식물 추출물을 5 내지 20 배, 바람직하게는 약 10 배의 산성완충용액에 용해시킨 다음, 효소를 첨가하여 약 37℃ 수욕상에서 약 40 내지 55 시간, 바람직하게는 약 48시간 동안 교반하면서, 박층크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수(80∼100℃) 중에서 5 내지 15 분 동안 가열하여 가수분해 반응을 종료시키고 반응액을 수득할 수 있다.

상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하는 경우, 식물 추출물을 5 내지 10 배, 바람직하게는 약 10 배의 이온수에 용해시킨 후 약 121℃에서 30분간 멸균하여 약 30℃로 냉각한 다음 미리 배양된 미생물을 액체량 대비 5∼10% 로 접종하여 30℃에서 2 내지 5일, 바람직하게는 5일 동안 배양시킨 후, 박층 크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 가수분해 반응을 종료시키고, 배양액을 5,000 내지 10,000rpm으로 원심분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척한 다음 원심분리하여 침전물로써 반응액을 수득할 수 있다.

상기와 같이 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해 한 후, 수득한 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 알코올을 가하여 1 내지 5회 교반시킨 후, 침전된 염들을 여과를 통하여 제거하고, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하고, 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올 = 8:1∼4:1)로 분리하여 이카린의 가수분해물을 수득할 수 있다.

본 발명에 의하여 제조된 이카린의 가수분해물은 DPPH 및 ROS 생성을 억제시킴으로써 항산화 효능이 우수하고, 콜라겐 생합성을 촉진시키고 콜라게나아제 발현을 억제시킴으로써 항노화 효능이 우수하며, 멜라닌 생성을 억제시키고 자외선에 의해 생성된 색소 침착을 개선시킴으로써 미백 효능이 우수하다.

따라서, 본 발명에서는 상기 이카린의 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 화장료용 조성물을 제공한다.

또 본 발명에서는 상기 이카린의 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항노화용 화장료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명에서는 상기 이카린의 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명에서는 상기 이카린의 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 외용제 조성물을 제공한다.

상기 화장료용 조성물들은 화장료 조성물 또는 약학 조성물로 제형화될 수 있으며, 조성물 내에서 상기 이카린 가수분해물의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.0001∼10 중량％의 양으로 하나 또는 그 이상 함유될 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 자세하게 설명한다. 그러한 이러한 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하려는 것이지, 이러한 실시예에 의하여 본 발 명의 권리범위가 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1] 이카린 제조 및 동정

< 이카린의 제조 >

삼지구엽초의 건조된 잎 2㎏에 헥산 6ℓ를 넣고, 상온에서 3회 교반 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 녹차 잎 1kg 에 80% 메탄올 4ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 후, 15℃에서 1일간 침적시켰다. 그 다음, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 1ℓ로 5회 추출하여 색소를 제거하고, 수층을 1-부탄올 500㎖로 3회 추출하였다. 이로부터 얻은 총 1-부탄올층을 감압농축하여 1-부탄올 엑기스를 얻고, 이를 소량의 메탄올에 녹인 다음, 대량의 에틸아세테이트에 추가하여, 생성된 침전물을 건조함으로써, 이카린을 함유하는 삼지구엽초 추출물 80g을 수득하였다.

< 이카린의 동정 >

상기 실시예 1에서 수득한 추출물 20g을 실리카겔 칼럼크로마토그래피(실리카겔 100g 충진)로 정제하였다. 이 때, 전개용매로는 클로로포름과 메탄올을 사용하였고, 클로로포름과 메탄올의 비를 10:1에서 2:1까지 농도구배를 높여 분획을 수득하였으며, 이들 분획으로부터 이카린 2.3g을 수득하였다. 상기 수득한 생성물들을 동정한 결과(Varian Gemini 2000 300MHz, Varian사), 하기와 같은 특성을 나타내었다.

< 이카린의 물리화학적 성상 >

성상 : 연한 미황색의 미세결정

양성(Positive) FAB-MS : 677[M+H]

¹H NMR: (DMSO-d6) δ: 0.81(3H, d, J=6 Hz, Rham-6), 1.61 & 1.69(6H, br s, Me-11), ca 3.1-3.3(m), 3.33(1H, br d-like, ca 5), ca 3.4-3.6(m), ca 3.7-3.76(1H, m), 3.86(3H, s, OMe-4'), 4.01(1H, br, H2''), 5.00(1H, d, 7.5, H1'''), 5.19(1H, br t, 7, H10), 5.30(1H, d, J=1.5 Hz, H1''), 6.64(1H, s, H6), 7.12(2H, d, 9, H3',5'), 7.89(2H, d, 9, H2',6'), 12.53(1H, s, OH-5).

¹³C-NMR: (DMSO-d6) δ: 153.0, 135.7, 178.3, 160.5, 98.2, 161.4, 108.4, 157.3, 105.6, 122.2, 130.5, 114.1, 160.5, 114.1, 130.5, 21.1, 122.3, 131.1, 25.4, 17.5, 102.0, 70.4, 70.6, 69.7, 70.1, 17.9, 100.6, 73.4, 76.7, 71.2, 76.7, 60.7, 55.5.

산 가수분해물: 이카리틴, 글루코오스(glucose), 람노오스

[실시예 2] 이카리틴, 이카리시드 I 및 II 의 제조 및 동정

< 산 가수분해 방법에 의한 이카리틴, 이카리시드 I 및 II 의 제조 >

상기 실시예 1에서 수득한 추출물 20g에 20배(v/w)의 1N HCl-50% 메탄올 용액(v/v)을 가하여, 80℃ 수욕조에서 8시간 동안 가열 환류시켜, 이카린에 결합된 당들을 가수분해시킨 후, 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 에탄올(200㎖)을 가해 교반시킨 다음(3회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 후, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득한 다음, 수득된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올 = 8:1∼4:1)로 분리하여 이카리틴 0.9g, 이카리시드 I 0.7g 및 이카리시드 II 0.5g을 각각 수득하였다.

< 염기 가수분해 방법에 의한 이카리틴, 이카리시드 I 및 II의 제조 >

상기 실시예 1에서 수득한 추출물 20g을 건조피리딘(500㎖)에 녹이고, 여기에 소디움 메톡사이드(sodium methoxide)(powder, 10g)를 가해 수욕조에서 8시간동안 가열 환류시켜, 이카린에 결합된 당들을 가수분해시킨 후, 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 에탄올(200㎖)을 가해 교반시킨 다음(3회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거하였다. 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하였으며, 수득된 얻은 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올=8:1∼4:1)로 분리하여 이카리틴 0.6g, 이카리시드 I 0.7g 및 이카리시드 II 0.8g을 각각 수득하였다.

< 효소분해 방법에 의한 이카리틴, 이카리시드 I 및 II 의 제조 >

상기 실시예 1에서 수득한 추출물 20g을 100㎖의 0.1 M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 여기에 효소 2.5g(헤스페리디나제 0.5g, 나린지나제 0.5g, 셀룰라제 0.5g, β-글루쿠로니다제 0.2g, β-갈락토시다제 0.5g, 아밀로글루코시다제 0.3g ; Sigma사 제조)을 첨가하여 37℃ 수욕상에서 48 시간동안 교반시키면서, 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여, 이카린이 완전히 소실되면 열수(80∼100℃) 중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 후, 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 에탄올(200㎖)을 가해 교반시킨 다음(3회), 침전물을 여과를 통해 제거한 후, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하였다. 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올= 8:1∼4:1)로 분리하여 이카리틴 1.1g, 이카리시드 I 1.2g 및 이카리시드 II 0.9g을 각각 수득하였다.

< 미생물을 이용한 이카리틴, 이카리시드 I 및 II의 제조 >

상기 실시예 1에서 수득한 추출물 20g을 100㎖의 이온수에 용해시키고, 121℃에서 30분간 멸균하여 30℃로 냉각한 후 미리 배양된 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) KCCM 11885를 액체량 대비 5∼10%로 접종하여 30℃에서 5일 동안 배양시킨 다음, 박층 크로마토그래피로 이카린의 소거율을 확인하여 완전히 소실되면 반응을 종료시키고, 배양액을 5,000 내지 10,000rpm으로 원심분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척한 후 원심분리하여 침전물로써 반응액을 얻은 다음, 상기 침전물에 에탄올(200㎖)을 가해 교반시킨 후(3회), 침전물을 여과를 통해 제거한 다음, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하였고, 상기 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올= 8:1∼4:1)로 분리하여 이카리틴 0.8g, 이카리시드 I 0.7g 및 이카리시드 II 0.8g을 각각 수득하였 다.

< 이카리시드 I의 동정 >

상기 효소분해법으로 수득한 추출물 20g을 실리카겔 칼럼크로마토그래피(실리카겔 100g 충진)로 정제하였다. 이 때, 전개용매로는 클로로포름과 메탄올을 사용하였고, 클로로포름과 메탄올의 비를 10:1에서 2:1까지 농도구배를 높여 분획을 수득하였으며, 이들 분획으로부터 이카리시드 I 1.8g을 수득하였다. 상기 수득한 생성물들을 동정한 결과(Varian Gemini 2000 300MHz, Varian사), 하기와 같은 특성을 나타내었다.

< 이카리시드 I (icariside I) 물리화학적 성상 >

성상 : 연한 미황색의 미세결정

양성(Positive) FAB-MS : 531[M+H]

¹H NMR: (DMSO-d6) δ:1.70, 1.83(ea. 3H, s, Me-4'',5''), 2.90(2H, H1''), 3.87(3H, s, OMe), 3.83-5.40(m, sugar protons), 6.64(1H, s, H6), 7.16(2H, d, 9, H3',5'), 8.23(2H, d, 9, H2',6').

¹³C-NMR: (DMSO-d6) δ: 146.9, 136.2, 176.5, 160.1, 97.5, 160.6, 108.1 152.7, 104.5, 123.4, 129.3, 114.1, 158.5, 114.1, 129.3, 21.5, 122.3, 131.1, 25.4, 17.9, 100.5, 73.4, 76.7, 69.7, 77.2, 60.7, 55.4.

산가수분해물: 이카리틴, 글루코오스

< 이카리시드 II의 동정 >

상기 효소분해법으로 수득한 추출물 20g을 실리카겔 칼럼크로마토그래피(실리카겔 100g 충진)로 정제하였다. 이 때, 전개용매로는 클로로포름과 메탄올을 사용하였고, 클로로포름과 메탄올의 비를 10:1에서 2:1까지 농도구배를 높여 분획을 수득하였으며, 이들 분획으로부터 이카리시드 II 1.5g을 수득하였다. 상기 수득한 생성물들을 동정한 결과(Varian Gemini 2000 300MHz, Varian사), 하기와 같은 특성을 나타내었다.

< 이카리시드 II 물리화학적 성상 >

성상 : 연한 미황색의 미세결정

양성(Positive) FAB-MS : 515[M+H]

¹H NMR: (DMSO-d6) δ:0.79(3H, d, 6, Me-5''), 1.63 & 1.68(6H, br s, Me-11), 3.03(1H, qd, 6, 9.5, H5''), 3.14(1H, dd, 9, 9.5, H4''), ca 3.4(2H-9, overlaping with the signals of H2O), 3.47(1H, br, H3''), 3.85(3H, s, OMe-4'), 3.98(1H, br, H2''), 5.15(1H, br t, 7, H10), 5.26(1H, d, 1.5, H1''), 6.31(1H, s, H6), 7.12(2H, d, 9, H3',5'), 7.86(2H, d, 9, H2',6'), 12.52(1H, s, OH-5).

¹³C-NMR: (DMSO-d6) δ: 156.2, 133.8, 177.1, 103.6, 158.1, 97.8, 160.9, 105.4, 153.8, 21.0, 121.7, 130.3, 17.6, 25.2, 121.8, 129.7, 113.5, 160.5, 55.2, 101.4, 69.7, 70.0, 70.2, 70.8, 17.3.

산가수분해물: 이카리틴, 람노오스

< 이카리틴의 동정 >

상기 효소분해법으로 수득한 추출물 20g을 실리카겔 칼럼크로마토그래피(실리카겔 100g 충진)로 정제하였다. 이 때, 전개용매로는 클로로포름과 메탄올을 사용하였고, 클로로포름과 메탄올의 비를 10:1에서 2:1까지 농도구배를 높여 분획을 수득하였으며, 이들 분획으로부터 이카리틴 2.4g을 수득하였다. 상기 수득한 생성물들을 동정한 결과(Varian Gemini 2000 300MHz, Varian사), 하기와 같은 특성을 나타내었다.

< 이카리틴 물리화학적 성상 >

성상 : 연한 미황색의 미세결정

양성(Positive) FAB-MS : 369[M+H]

¹H NMR: (DMSO-d6,300 MHz) δ:3.82(3H, s, OMe), 1.62(3H, s, Me-5''), 1.75(3H, s, Me-4''), 5.14(1H, t, 6, H2''), 3.24(2H, d, 6, H1''), 7.08(2H, d, 8.7, H3',5'), 8.10(2H, d, 8.7, H2',6'), 6.27(1H, s, H6).

[실시예 3] 이카린, 이카리틴, 이카리시드 I 및 이카리시드 II의 효능 시험

1. 항산화 효과 시험(DPPH test)

유기 라디칼인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)의 환원에 의해(항산화제는 산화됨) 발생되는 흡광도의 변화를 통해 항산화능을 평가하는 방법을 사용하였다. 하기 예들에 의해 DPPH의 산화가 억제되어 흡광도가 대조군에 비해 감소되는 정도를 측정하여, 대조군의 흡광도에 비해서 50％ 이하의 흡광도를 나타내는 농도를 유효 항산화 농도로 평가하였다.

100μM(in 에탄올) DPPH 용액 190㎕와 상기 실시예 1∼2에서 동정한 이카린, 이카리시드 I, 이카리시드 II 및 이카리틴과 대조시료를 각각 10㎕ 넣어 반응액을 만들고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조시료로는 널리 사용하고 있는 합성 항산화제 트롤록스(Trolox)를 사용하였다.

각 물질의 DPPH 분석 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

DPPH 분석 결과(억제 ％)

(IC₅₀ : 첨가한 시료에 의해 흡광도가 50％ 감소했을 때의 시료 농도)

시료	IC₅₀(uM)
이카린	49.59
이카리시드 I	7.78
이카리시드 II	7.15
이카리틴	6.75
트롤록스	8.63

표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 의한 이카리틴, 이카리시드 I 및 II 가 이카린 보다 더 좋은 활성을 보이고 트롤록스 보다도 오히려 항산화능 이 더 우수함을 알 수 있었다.

2. 형광물질을 이용한 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 생성 억제능 시험

시험에 사용한 세포주는 인간 각질형성세포 HaCaT 세포주(Human keratinocytes HaCaT cell line)로 형광측정용 96공 블랙 플레이트에 각 공당 2.0×10⁴개로 분주하고 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbeccos Modification of Eagles Medium, FBS 10％) 배지를 사용하여 37℃, 5％ CO₂조건에서 1일간 배양한 후 시험시료를 처리하였다. 하기 표 2에 나타나 있는 시료 처리에 사용된 배지로 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 무혈청 DMEM(FBS free)을 사용하고 37℃, 5％ CO₂조건에서 1일간 배양하였다.

시험시료를 넣고 24시간 배양한 후, HCSS(HEPES-buffered control salt solution)로 세척하여 남아있는 배지를 제거하고 HCSS에 20μM로 준비된 DCFH-DA(2',7'-dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, Inc)를 100㎕ 가하고 37℃, 5％ CO₂조건에서 20분간 배양하고 HCSS로 세척하였다. 이 후 시료 농도별로 처리된 HCSS를 100㎕ 가한 다음 초기에 ROS로 산화된 DCF (dichlorofluorescein)의 형광도를 형광플레이트 리더(Ex=485 nm, Em=530nm)로 형광 강도를 측정하였다. 이후 UVB(30mJ/㎠)를 조사하고 처리직후 및 처리 3시간 후의 형광도를 형광플레이트 리더(Ex=485 nm, Em=530nm)로 형광 강도를 측정하였다.

비교시료로서 트롤록스를 사용하였다.

각 시험물질의 ROS 생성억제능 실험 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2]

ROS 생성억제능 실험결과(대조군의 ％)

농도(uM)	이카린	이카리시드 I	이카리시드 II	이카리틴	트롤록스
50	86.3	43.8	46.6	43.2	58.5
25	88.6	54.8	56.6	51.7	73.3
12.5	89.7	61.4	62.0	61.5	74.6
6.25	98.1	65.6	63.2	68.2	76.9

위의 표 2에서와 같이 이카리틴, 이카리시드 I 및 II 가 이카린 보다 더 좋은 활성을 보이고 트롤록스 보다도 오히려 ROS 생성 억제능이 더 우수함을 알 수 있다.

3. 콜라겐 생합성 촉진 효과의 측정

상기 실시예 1∼2에서 동정한 이카린, 이카리시드 I, 이카리시드 II 및 이카리틴의 콜라겐 생합성 촉진 효과를 토코페롤 및 EGCG와 비교하여 측정하였다.

먼저, 인간섬유아세포(fibroblast)(PromoCell, Germany)를 24공(well)에 1 공 당 10⁵개씩 파종(seeding)하여 90% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 이를 24시간 동안 무혈청 DMEM 배지로 배양한 후 무혈청 배지에 녹여진 상기 실시예 1∼2에서 동정한 이카린, 이카리시드 I, 이카리시드 II 및 이카리틴; 토코페롤 및 EGCG를 각각 10^-4 몰농도로 처리하고 24시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 이들의 상층액을 떠내어 프로콜라겐 형(I) ELISA 키트(proc/; ollagen type(I))를 이용하여 프로 콜라겐(procollagen)의 증감여부를 보았다. 그 결과는 표 3에 나타내었으며, 여기서 합성능은 비처리군을 100으로 하여 대비한 것이다.

[표 3]

처리군	합성능 (%)
비처리군	100
토코페롤	118
EGCG	125
이카린	117
이카리시드 I	145
이카리시드 II	138
이카리틴	146

그 결과 상기 표 3에서 보여지는 것처럼, 이카리틴, 이카리시드 I 및 II가 이카린 보다 더 좋은 콜라겐 생합성 증가 효과를 보이고 양성 대조군에 비해서도 오히려 더 좋은 효능을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

4. 콜라게나아제 발현 억제 효능 측정

상기 실시예 1∼2에서 동정한 이카린, 이카리시드 I, 이카리시드 II 및 이카리틴으로부터 얻은 물질의 콜라게나아제 발현 억제 효능(생성 저해능)을 토코페롤 및 EGCG와 비교하여 하기와 같이 측정하였다.

먼저, 2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배지가 들어있는 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/공(well)이 되도록 넣고, 90% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 후 무혈청 DMEM 배지에서 24시간 배양한 다음, 시험물질로 무혈청 DMEM 배지에 녹여진 상기 실시예 1∼2에서 동정한 이카린, 이카리시드 I, 이카리시드 II 및 이카리틴; 토코페롤 및 EGCG(양성대조군)를 10^-4 몰농도로 24시간 동안 처리한 후, 세포배양액을 채취하였다.

이 후, 채취한 세포배양액을 상업적으로 이용가능한 콜라게나아제 측정기구(미국 아머샴파마샤 사)를 이용하여 콜라게나아제 생성 정도를 측정하였다.

먼저 1차 콜라게나아제 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판(96-well plate)에 채위된 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96-공 평판(96-well plate)에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1M 황산을 넣어 반응(발색)을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띄며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타났다.

노란색을 띠는 96-공 평판(96-well plate)의 흡광도를 흡광계를 이용하여 405nm에서 측정하였고, 하기 수학식 1에 의해 콜라게나아제의 발현 정도를 계산하였다. 이때 상기 시험물질을 처리하지 않은 군의 채취된 세포배양액의 반응 흡광도를 대조군의 흡광도로 하였다.

콜라게나아제 발현 정도(%)= A/B × 100

A: 상기 시험물질 처리 세포군의 흡광도

B: 대조군의 흡광도

한편, 상기 인간의 섬유아세포에서 상기 시험물질들의 콜라게나아제 발현 억제 효능을 측정한 결과를 콜라게나아제 발현 정도로 하기 표 4에 나타내었으며, 이는 비처리군의 콜라게나아제 발현 정도를 100으로 하여 대비한 것이다.

[표 4]

시험물질	콜라게나아제 발현 정도(%)
비처리군	100
토코페롤(양성대조군)	75
EGCG(양성대조군)	60
이카린	81
이카리시드 I	64
이카리시드 II	66
이카리틴	66

그 결과, 상기 표 4에 보여지는 것처럼, 이카리틴, 이카리시드 I 및 II 가 이카린 보다 콜라게나아제 발현을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다.

5. 엘라스타아제 발현 억제 효능 측정

상기 실시예 1∼2에서 동정한 이카린, 이카리시드 I, 이카리시드 II 및 이카리틴의 엘라스타아제 발현 억제 효능(생성 저해능)을 토코페롤 및 EGCG와 비교하여 하기와 같이 측정하였다.

먼저, 시험은 2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배지가 들어있는 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/공(well)이 되도록 넣고, 90% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 후 무혈청 배지로 24시간 배양하고, 시험물질로 무혈청 배지에 녹여진 상기 실시예 1∼2에서 동정한 이카린, 이카리시드 I, 이카리시드 II 및 이카리틴; 토코페롤 및 EGCG(양성 대조군)를 10^-4 몰 농도로 24시간 동안 처리한 후, 세포배양액을 채취하였다.

이 후, 채취한 세포배양액을 상업적으로 이용 가능한 엘라스타아제 측정기구(미국 아머샴파마샤 사)를 이용하여 엘라스타아제 생성 정도를 측정하였다.

먼저 1차 엘라스타아제 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판(96-well plate)에 채위된 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 엘라스틴 항체를 96-공 평판(96-well plate)에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1M 황산을 넣어 반응(발색)을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띄며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타났다.

노란색을 띠는 96-공 평판(96-well plate)의 흡광도를 흡광계를 이용하여 405nm에서 측정하고, 하기 수학식 2에 의해 엘라스타아제의 발현 정도를 계산하였다. 이때 상기 시험물질을 처리하지 않은 군의 채취된 세포배양액의 반응 흡광도를 대조군의 흡광도로 하였다.

엘라스타아제 발현 정도(%) = A/B × 100

A: 상기 시험물질 처리 세포군의 흡광도

B: 대조군의 흡광도

한편, 상기 인간의 섬유아세포에서 상기 시험물질들의 엘라스타아제 발현 억 제 효능을 측정한 결과를 하기 표 5에 나타내었고, 이는 비처리군의 발현 정도를 100으로 하여 대비한 것이다.

[표 5]

물질	엘라스타아제 발현 정도(%)
비처리군	100
토코페롤(양성 대조군)	88
EGCG(양성 대조군)	68
이카린	87
이카리시드 I	56
이카리시드 II	63
이카리틴	55

그 결과, 상기 표 5에 보여지는 것처럼, 이카리틴, 이카리시드 I 및 II가 이카린 보다 엘라스타아제 발현을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다.

6. 쥐의 색소세포를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정

상기 실시예 1∼2에서 동정한 이카린, 이카리시드 I, 이카리시드 II 및 이카리틴의 멜라닌 생성 억제효과를 알아보기 위하여 쥐의 색소세포를 이용하여 측정하였다.

먼저, C57BL/6 마우스 유래의 쥐의 색소세포(Mel-Ab cell)(Dooley, T.P. et al, Skin pharmacol, 7, pp 188-200)를 DMEM에 10% 우태반 혈청, 100nM 2-O-테트라데카노일포르빌(tetradecanoyphorbol)-13-아테이트, 1nM 콜레라 독소(cholera toxin)을 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 배양된 Mel-Ab 세포를 0.25% 트립신-EDTA로 떼어내고, 24-웰 플레이트에 10⁵ 세포/웰(cells/well)의 농도로 세포를 배양하고 이틀째부터 3일 연속으로 10ppm의 각 시험물질로 하이드로 퀴논, 상기 실시예 1∼2에서 동정한 이카린, 이카리시드 I, 이카리시드 II 및 이카리틴을 가하여 배양하였다. 이때, 상기 하이드로퀴논은 양성대조군으로 사용하였다. 그 다음 배양액을 제거하고, PBS로 세척한 후, 1N 수산화나트륨으로 세포를 녹여 400nm에서 흡광도를 측정한 다음, 하기 수학식 3에 따라 멜라닌 생성 억제율을 계산하여 그 결과를 표 6에 나타내었다(Dooley의 방법).

[표 6]

시험물질	멜라닌 생성 억제율(%)
비처리군	100.0
이카린	84.5
이카리시드 I	38.6
이카리시드 II	38.2
이카리틴	39.5
하이드로퀴논(양성대조군)	41.1

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 의해 수득한 상기 실시예 2에서 동정한 이카리틴, 이카리시드 I 및 II가 실시예 1에서 동정한 이카린 보다 좋은 멜라닌 생성 억제율을 보이는 것으로 확인되었고, 특히 이카리틴, 이카리시드 I 및 II는 하이드로퀴논과 유사한 정도의 멜라닌 생성 억제율을 보이는 것을 확인하였다.

7. 인체 피부에 대한 미백 효과 시험

상기 실시예 1∼2에서 동정한 이카린, 이카리시드 I, 이카리시드 II 및 이카 리틴의 인체 피부에 대한 미백 효과를 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 건강한 12명의 남자를 대상으로 피검자의 상박 부위에 직경 1.5㎝의 구멍이 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(Minimal Erythema Dose)의 1.5∼2배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 흑화를 유도하였다.

상기 자외선 조사 후 상기 실시예 1∼2에서 동정한 이카린, 이카리시드 I, 이카리시드 II 및 이카리틴 각 1%(용매는 1,3-부틸렌그리콜:에탄올 = 7:3), 하이드로퀴논 1%, 용매(vehicle)(음성 대조군) 1% 만을 바르고, 한곳은 아무 것도 바르지 않고 10주 동안 상태변화를 관찰하였다. 1주 단위로 피부의 색깔을 색차계 CR2002(일본, 미놀타 사)로 측정하였다.

그 다음 상기 각 시험물질의 도포 개시시점과 도포 완료시점에서의 피부색의 차이(ΔL*)를 하기 수학식 2에 따라 계산하고, 이를 하기 표 7에 나타내었다. 한편, 미백효과는 시료 도포 부위와 대조군 부위의 ΔL*의 비교로 판정하는데, ΔL*값이 2정도일 경우는 침착된 색소의 미백화가 뚜렷한 경우이고, 1.5정도 이상이면 미백효과가 있다고 판정할 수 있다.

ΔL* = 도포 완료시점에서의 L*값 - 도포 개시시점에서의 L*값

[표 7]

시험물질	피부색 밝기 정도(ΔL*)
이카린	1.10± 0.13
이카리시드 I	1.88± 0.17
이카리시드 II	1.83± 0.25
이카리틴	1.89± 0.25
하이드로퀴논(양성 대조군)	1.90± 0.11
용매(Vehicle)(음성 대조군)	0.50± 0.15

상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 의해 수득한 실시예 1∼2에서 동정한 이카린, 이카리시드 I, 이카리시드 II 및 이카리틴은 하이드로퀴논과 유사한 정도의 피부색 밝기 정도를 보임을 확인하였다. 이는 상기 물질들이 자외선에 의해 생성된 색소 침착을 개선하여 피부색을 밝게 하기 때문이다.

이하 상기 조성물의 제형화를 제제예를 통하여 설명하나, 이는 본 발명의 이를 돕기 위한 예시일 뿐 본 발명을 이에만 한정하는 것은 아니다.

[제제예 1] 비누 제조

성분	함량(중량%)
이카리시드 I 유지 수산화나트륨 염화나트륨 향료	1.00 적당량 적당량 적당량 소량

상기 성분에 정제수를 채워 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비에 의해 비누를 제조하였다.

[제제예 2] 로션 제조

성분	함량(중량%)
이카리시드 II L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염 수용성 콜라겐 (1% 수용액) 시트르산나트륨 시트르산 감초 엑기스 1,3-부틸렌글리콜	3.00 1.00 1.00 0.10 0.05 0.20 3.00

상기 성분에 정제수를 채워 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)에 의해 로션을 제조하였다.

[제제예 3] 크림 제조

성분	함량(중량%)
이카리틴 폴리에틸렌글리콜모노스테아레이트 자기유화형모노스테아르산글리세린 세틸알코올 스쿠알렌 글리세롤 스핑고당지질 1.3-부틸렌글리콜	1.00 2.00 5.00 4.00 6.00 6.00 1.00 7.00

상기 성분에 정제수를 채워 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)로 크림을 제조하였다.

[제제예 4] 팩 제조

성분	함량(중량%)
이카리시드 I 폴리비닐알코올 L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염 라우로일히드록시프롤린 수용성 콜라겐 (1% 수용액) 1,3-부틸렌글리콜 에탄올	5.00 13.00 1.00 1.00 2.00 3.00 5.00

상기 성분에 정제수를 채워 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)로 팩을 제조하였다.

[제제예 5] 미용액 제조

성분	함량(중량%)
이카리시드 II 히드록시에틸렌셀룰로오스(2% 수용액) 크산탄검(2% 수용액) 1,3-부틸렌글리콜 진한 글리세린 히알루론산나트륨 (1% 수용액)	2.00 12.00 2.00 6.00 4.00 5.00

상기 성분에 정제수를 채워 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)로 미용액을 제조하였다.

[제제예 6] 산제의 제조

성분	함량(단위:mg)
이카리틴 유당 탈크	300 100 10

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

[제제예 7] 정제의 제조

성분	함량(단위:mg)
이카리시드 I 옥수수전분 유당 스테아린산 마그네슘	50 100 100 2

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

[제제예 8] 캅셀제의 제조

성분	함량(단위:mg)
이카리시드 II 옥수수전분 유당 스테아린산 마그네슘	50 100 100 2

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

[제제예 9] 주사제의 제조

성분	함량(단위:mg)
이카리틴 주사용 멸균 증류수 pH 조절제	50 적량 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

[제제예 10] 액제의 제조

성분	함량
이카리시드 I 이성화당 만니톨 정제수	100mg 10g 5g 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 에피메디움 속 식물 추출물의 플라보노이드 성분인 이카린으로부터 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해하여 생성된 이카린의 가수분해물을 함유하는 화장료 조성물이 DPPH 및 ROS 생성 억제 효능을 갖는 항산화 효과와 함께 콜라겐 생합성 촉진 효과, 엘라스타아제 및 콜라게나아제의 발현 억제 효과를 통한 항노화 효과, 멜라닌 생성을 억제하고, 자외선(ultraviolet rays; UV)에 의해 생성된 색소 침착을 개선하는 효과에 기인한 미백효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 의한 이카린의 가수분해물은 항산화, 항노화, 미백, 주름 개선용 화장료 조성물 또는 약학 조성물로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표현되는 이카리틴, 이카리시드 Ⅰ 및 이카리시드 Ⅱ로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 함유하는 화장료용 조성물:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

이카리틴은 R1 및 R2가 OH이고,

이카리시드 Ⅰ은 R1이 OH이며, R2가 글루코피라노오스이고,

이카리시드 Ⅱ는 R1이 람노피라노오스이며, R2가 OH이다.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 활성산소를 제거하는 항산화용 조성물임을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 미백용인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 주름개선용인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 이카리틴, 이카리시드 Ⅰ 또는 이카리시드 Ⅱ는 다음의 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된 것임을 특징으로 하는 조성물:

(a) 삼지구엽초 또는 에피메디움속 식물로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 이카린을 함유하는 식물 추출물을 수득하는 단계; 및

(b) 상기 수득된 식물 추출물을 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해하는 단계.
삭제
제 6항에 있어서, 상기 (b) 단계의 산은 염산, 황산 및 질산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 산, 또는 이들 산과 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매임을 특징으로 하는 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 (b) 단계의 염기는 수산화나트륨 및 수산화칼륨으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기, 또는 이들 염기와 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매임을 특징으로 하는 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 (b) 단계의 효소는 글루코시다제(glucosidase), 아라 비노시다제(arabinosidase), 람노시다제(rhamnosidase), 자일로시다제(Xylosidase), 셀룰라제(cellulase), 헤스페리디나제(hesperidinase), 나린지나제(naringinase), 글루쿠로니다제(glucuronidase), 펙티나제(pectinase), 갈락토시다제(galactosidase) 및 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 (b) 단계의 미생물은 아스퍼질러스(aspergillus)속, 바실러스(bacillus)속, 페니실리움(penicillium)속, 리조푸스(rhizopus)속, 리조무코르(rhizomucor)속, 탈라로마이세스(talaromyces)속, 비피도박테리움(bifidobacterium)속, 모르티에렐라(mortierella)속, 크립토코커스(cryptococcus)속 및 마이크로박테리움(microbacterium)속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 조성물.