KR100801437B1

KR100801437B1 - 돼지 유래 유산균으로부터 분리한 신규한 플라스미드 및이의 용도

Info

Publication number: KR100801437B1
Application number: KR1020060115567A
Authority: KR
Inventors: 유한상; 이덕용
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2006-11-22
Filing date: 2006-11-22
Publication date: 2008-02-11
Anticipated expiration: 2026-11-22

Abstract

본 발명은 돼지 유래 유산균으로부터 분리한 신규한 플라스미드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 락토바실러스 루테리 L09에서 분리한 플라스미드 pILR091 및 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따른 플라스미드 pILR091은 돼지의 장내에 쉽게 정착할 수 있는 락토바실러스로부터 분리된 것으로서, RCR 플라스미드와 세타-복제 플라스미드의 장점을 모두 가질 뿐 아니라 20계대 동안에도 복제수에 큰 변화를 나타내지 않아 안정하다는 장점이 있다. 따라서 본 발명의 플라스미드, 이를 이용하여 제조된 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체는 돼지의 경구 운반체의 제조에 사용될 수 있을 뿐 아니라 프로바이오틱스의 잠재력과 그 가능성을 획기적으로 높일 수 있다.

락토바실러스 루테리, 플라스미드, 경구 운반체, 셔틀 벡터

Description

돼지 유래 유산균으로부터 분리한 신규한 플라스미드 및 이의 용도{Novel plasmid isolated from L. reuteri from pig and use thereof}

도 1은 락토바실러스 루테리 L09로부터 본 발명의 플라스미드 pILR091을 분리하기 위한 방법을 도시한 것이다

도 2는 본 발명의 pILR091의 제한효소 부위의 그래픽 지도(A)와 효소 프로파일(B)을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 pILR091의 추정되는 ORF, 복제 원점 및 제한 효소의 구조적인 구성을 도시한 것이다. 각 ORF는 파랑색 화살표(복제 단백질)과 하늘색 화살표(추정되는 단백질)로 나타내었고, 추정되는 ORF의 잔제(ORF6)는 노란색 점선 화살표로 나타내었다. 복제 원점(ori)은 검정색 박스로 표시하였다. 회색 격자와 체크는 10bp DR과 21 또는 22bp DR을 나타낸다.

도 4는 DNasist 프로그램을 이용하여 본 발명의 pILR091과 다른 락토바실러스 속 균주 유래 플라스미드 간의 ori 서열을 비교한 결과이다. 분홍색 박스는 ori 사이트간의 보존된 부위를 나타내고 본 발명의 pILR091의 추정되는 복제 원점은 흰색 박스로 나타내었다.

도 5는 공지된 데이터베이스의 서열에 근거로 한 본 발명의 pILR091의 추정되는 각 ORF들의 일반적인 특성을 나타낸 것이다.

도 6은 DNasist 프로그램을 이용하여 락토바실러스 루테리로부터 유래한 본 발명의 pILR091과 pTE44의 복제 단백질들을 비교한 결과이다. 박스 내 빨강색 문자는 정확하게 일치하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 7은 잠적 플라스미드 DNA와 비-잠적 플라스미드 DNA 간의 G-C 함량을 비교한 결과이다.

도 8은 본 발명의 pILR091의 ORF와 다른 락토바실러스 균주 유래 게놈 DNA의 ORF 간의 G-C 함량을 비교한 결과이다.

유산균은 일반적으로 안전한 균으로 알려져 있으며, 오랫동안 식품산업 및 의학분야에서 활용 및 연구되어 왔다. 특히, 최근에는 안전성, 반복 투여, 점막내 점착성 그리고 프로바이오틱스(Probiotics)로서의 건강 증진 효과 등으로 인해 경구 운반체의 후보 물질로 각광을 받고 있다. 그러나 이런 장점에도 불구하고 균체의 집락화와 정상 세균총과의 경쟁에서 미약한 면을 보이는 것이 문제점으로 지적되고 있다.

락토바실러스 종은 유산균 종 중에서 가장 크며 표현형과 생화학 및 생리적 특성의 다양성 또한 큰 종이다(Salminen, S. et al., 2004. Lactic acid bacteria: microbiological and functional aspects. 3^rd ed. Revised and expanded. Marcel Dekker, Inc. NewYork. U.S.A. p.249-293). 락토바실러스는 자연계에 널리 분포하며 식품 산업에 두루 사용되고 있고(Daeshel, M.D. et al., 1987. FEMS Microbiol. Rev. 46, 357-367), 사람과 동물의 구강, 소화기장관 및 질내의 점막층에 주로 발견된다(Kandler, O. and Weiss, D. 1986. Regular, non-sporing gram-positive rods. In Bergey's manual of systemic bacteriology. Sneath, P.H.A., Mair, N.S., Sharpe, M.E., Holt, J.G., Eds.; Williams and Wilkins Co.: Baltimore. Vol2, 1208-1234; Sharpe, M.E. 1981. The genus Lactobacillus. In The prokaryotes. A handbook on habitant, Isolation and Identification of bacteria; Starr, M.P., Stolp, H., Tr, H.G., Balows, A., Schlegel, H.G., Eds; Springer-Verlag: Berlin, p.1653-1674).

락토바실러스 플라스미드는 L. casei에서 처음 분리되었고(Chassy, B.M., Gibson, E. and Giuffrida, A. 1976. J. Bacteriol. 127, 1576-1578.), 그 후 다양한 락토바실러스에서 분리 보고되었다. 일반적으로 락토바실러스 속 균주는 1-10개의 플라스미드를 보유하고 있으며 그 크기는 1.2-169kb에 해당된다(Mayo, B. et al., 1989. Microbiologia. 5, 105-112; Ruiz-Barba, J. L. et al., 1991. J. Appl. Bacterial. 71, 417-421). 락토바실러스 플라스미드의 기능은 크게 4가지로 나누어진다: 단백질의 가수화분해; 탄수화물, 아미노산 및 구연산(citrate)의 대사; 박테리오신(bacteriocin), 엑소폴리사카라이드(exopolysaccharides) 및 색소(pigments)의 생산; 및 항생제, 중금속 및 파지(phages)에 대한 저항성(Wang, T.T. and Lee, B.H. 1997. Crit. Rev. Biotechnol. 17, 227-272).

환형 박테리아 플라스미드(Circular bacterial plasmid)는 증식을 위해 회전환(rolling circle, RC)과 세타(theta)라는 2가지 방법을 사용한다. RC 플라스미드는 그람 양성균에서 널리 분포하고 있다. 그러나 최근엔 많은 수의 세타-복제(theta-replication) 플라스미드가 그람 양성균, 특히 유산균에서 분리, 보고되고 있다(Wang, T. T. et al., 1997. Crit. Rev. Biotechnol. 17, 227-272). RC 타입 복제는 전형적으로 유산균의 작은 플라스미드(<12kb)에서 사용되는데(Gruss, A. and Ehrlich, S. D. 1989. Microbiol. Rev. 53, 231-241.; Kiewiet, R. et al., 1993. Appl. Environ. Microbiol. 59, 358-364), 다소 불안정하다(Heng, N. C. et al., 1999. Appl. Environ. Microbiol. 65, 5378-5385).

반면, 세타-복제는 일반적으로 중간 또는 큰 크기의 플라스미드가 사용하며, 단일가닥 복제 대사물(single-stranded replication intermediate) 보다는 이중 가닥으로 증식을 하여 보다 안정적으로 증식을 한다(Alpert, C. A. et al., 2003. Appl. Environ. Microbiol. 69, 5574-5584). 그러나 숙주 영역은 상대적으로 RC 플라스미드에 비해 제한적인 편이다.

락토바실러스 복제단위(replicons)의 특성 연구에 대한 관심 증가로서 셔틀벡터를 개발할 수 있게 되었다(Pavlova, S. I. et al., 2002. Plasmid. 47, 182-192). Kullen과 Klaenhammer(2000)는 락토바실러스에 가장 많이 사용되는 플라스미드 벡터를 다음과 같은 3가지로 분류하였다(Kullen, MJ et al., 2000. Curr Issues Mol Biol, 2(2), 41-50): RCR 복제단위에 기초를 둔 플라스미드; 2개의 원점(origin)을 가지는 플라스미드(첫 번째는 대장균 유래의 복제 원점, 그리고 두 번째는 그람 양성균 유래의 복제 원점); 및 그람 음성균을 위한 대안적인 복제 원점을 가진 락토바실러스 벡터.

락토바실러스로부터 분리된 23개 플라스미드의 유전자 염기서열이 밝혀졌지만, 그 기능이 규명되고 벡터 제작, 균주 동정, 탐지 및 조정을 위해 사용되는 플라스미드는 극히 적다(Wang, T. T. et al., 1997. Crit. Rev. Biotechnol. 17, 227-272). 또한 유산균은 숙주 특이성이 높아 다른 숙주에서는 잘 정착하지 못하는 특성을 가진다.

이에 본 발명자들은 돼지의 장내에 쉽게 정착할 수 있는 유산균을 분리하여 이로부터 유산균 클로닝 및 발현 벡터의 개발을 위한 플라스미드 DNA을 분리 및 분석하여 그 특성을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 돼지의 장내에 쉽게 정착할 수 있는 유산균으로부터 분리된 신규한 플라스미드 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 플라스미드 pILR091을 제공한다.

본 발명에 있어서, 용어 “플라스미드”는 당해 분야에 통상적으로 공지된 바와 같은 의미를 가지면, 즉 세균에 존재하는 환상의 비-염색체성 요소이다. 플라스미드의 제조, 플라스미드 DNA의 전달 및 결합, 형질전환 등을 위해 당해 분야의 숙련자는 공지의 방법들을 사용할 수 있다. 상기 방법들은 문헌[예를 들면, Sambrook, J. et al., 'Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition', Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)] 등에 기술되어 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 돼지 유래 유산균에서 분리한 신규 플라스미드 pILR091 및 이의 용도를 제공한다는 점에 특징이 있다. 본 발명의 플라스미드는 돼지의 장내에 쉽게 정착할 수 있는 락토바실러스 루테리 L09(Lactobacillus reuteri L09)로부터 분리된 것이다.

본 발명자들은 돼지 장관내 집락형성이 잘 일어나며 경구 운반체로 사용 가능한 유산균을 확보하고 이로부터 신규 플라스미드를 분리하기 위하여, 먼저 돼지 분변에서 분리한 49주의 락토바실러스 속 균주를 대상으로 선발 실험을 실시하여 2~10kb 크기의 플라스미드 DNA를 가지고 있는 균주 10주를 선발하였다. 이들의 동정은 API CH50L kit와 16S rRNA 유전자 분석으로 실시하였다. 선발된 균주를 숙주로 사용하였을 때 생체 내(in vivo) 상태에서의 질병 발생 가능성을 알아보기 위해, 혈구용해검사, 인돌 형성, 암모니아 형성 그리고 페닐알라인 분해와 같은 안전성 검사를 통해 7주의 안전한 균주를 선발하였다. 이후, 내산성, 내열성, 내담즙성, 장점착능, 항균효과 및 과산화수소(hydrogen peroxide) 생성과 같은 효능 검사를 통해 최종적으로 1주의 우수한 균주를 선발하였다. 선발된 균주는 16S rRNA 분석을 이용하여 동정한 결과 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)로 확인되었다.

선발된 균주를 "락토바실러스 루테리 L09"라 명명하였으며, 이를 한국 농업미생물 자원센터에 2006년 8월 30일자로 기탁하였다(기탁번호:KACC 91266P). 이후, 상기 L. reuteri L09로부터 플라스미드 DNA를 도 1에 도시된 방법에 따라 분리한 후, 프라이머 워킹을 통해 염기서열을 결정하고 그 특성을 분석하였다.

본 발명에 따른 플라스미드 pILR091은 7,185개의 뉴틀레오티드로 구성된다(서열번호 1). 또한 상기 pILR091의 평균 G-C 함량(content)은 39%로서, 이는 L. reuteri의 게놈 DNA의 G-C 함량과 유사하다. 복제 원점(replication origin)은 복 제 단백질을 암호하고 있는 ORF1의 63bp 상부(upstream) 부분에 위치하고(도 3 참조), 이것은 pC194-RCR 패밀리와 유사한 구조의 염기서열이나, 다른 락토바실러스 속 균주들과는 염기서열의 차이를 나타내었다(TTTATATTGAT). 4,966개의 뉴클레오티드로 구성된 총 5개의 ORF가 본 발명의 pILR091에서 확인되었고, 이들은 전체 염기서열의 70.4%를 차지하였다. 본 발명의 pILR091의 복제수(copy number)는 24~25이다.

일반적으로 유산균이 보유한 플라스미드 DNA는 회전환 복제(rolling circle 복제, RCR) 또는 세타-복제(theta replication)의 기본적인 2 가지 복제 메카니즘으로 증식한다(Desmond, C. et al., 2005. 플라스미드. 54, 160-175). 본 발명의 pILR091은 2개의 RCR-복제 원점과 1개의 복제 단백질, 그리고 2개의 반복 구조를 가지고 있다. 본 발명에 따른 pILR091의 복제 원점을 다른 락토바실러스 속 유래의 플라스미드 DNA 및 pC194-RCR 패밀리의 유전자와 비교하였다.

그 결과, 여러 플라스미드에서는 일반적으로 11bp의 컨센서스 ori 서열(consensus ori sequence; 5'-CTTATCTTGAT-3')이 관찰된 반면(Desmond, C. et al., 2005. 플라스미드. 54, 160-175), 본 발명의 pILR091은 12bp의 ori 서열(5'-TTTATATTGATA-3')을 보유하고 있었으며, 이것은 다른 플라스미드와 약간의 다른 유전자형을 보였다(도 4 참조). pILR091 서열상에서는 L. curvatus LTH의 ori 서열(TACTACGA)도 관찰되었다.

크기가 큰 플라스미드는(예컨대, IncF incompatibility groups), 비록 생체 내에서 하나의 복제단위(replicon)가 작용을 할지라도, 여러 개의 복제단위를 가진다(Summers, D. K. 1996. The Biology of plasmid; plasmid replication and its control, plasmid dissemination. Blackwell Science, Ltd. London, UK. p31-64/92-110). 그러나 pLIR091에서는 L. curvatus LTH의 ori 서열이 ORF3에 존재하나, 이것은 복제 단백질과 거리가 있으므로, 상기 L. curvatus LTH ori 서열은 우연한 또는 휴면의 복제 원점일 것으로 사료된다.

반복된 구조적 형태는 세타-복제의 전형적인 특성이다(Benachour, A. et al., 1995. FEMS Microbiol. Lett. 128, 167-175; Desmond, C. et al., 2005. Plasmid. 54, 160-175). 그러나 본 발명의 pILR091에는 복제 단백질이 AT-풍부 반복 서열의 양 옆에 존재하지 않는다(Alpert, C. A. et al., ,2003. Appl. Environ. Microbiol. 69, 5574-5584; Gardner, M. N. et al., 2001. J. Bacteriol. 183, 3303-3309; Pavlova, S. I. et al ., 2002. Plasmid. 47, 182-192).

세타-복제는 일반적으로 수천에서 수백 bp의 중간 또는 큰 크기의 플라스미드에서 발견되는데(Salminen, S. et al ., 2004. Lactic acid bacteria: microbiological and functional aspects. 3^rd ed. Revised and expanded. Marcel Dekker, Inc. NewYork. U.S.A. p.249-293), 본 발명의 pILR091은 그 크기가 세타- 복제 플라스미드에 비해 작고, 잠적(crytic) 플라스미드와 같은 RCR 플라스미드와 비교해서는 큰 편이다.

또한 pILR091의 각 ORF 서열을 락토바실러스 속 유래의 다른 플라스미드 DNA와 비교한 결과, 서열 유사성이 매우 낮았다(도 5 참조). 특히 pILR091의 복제 단백질은 L. reuteri 유래의 다른 플라스미드 pTE44와 비교하여도 매우 낮은 유사성을 보였다(도 6 참조). 일반적으로 프로바이오틱스로 사용되는 유산균은 다른 환경에서 분리하였을 경우 다른 특성을 가지는 것으로 알려져 있다(Haddadin, M. S. Y. et al., 2004. J. Nutr. 3, 290-293). 특히 L. reuteri 균주는 다른 숙주에서 분리하였을 경우 생리적 및 유전적 차이는 보이지 않지만 다른 콜로니 모양을 가진다(Salminen, S. and Wright, A. V. 1998. Lactic acid bacteria: microbiological and functional aspects. 2nd ed. Revised and expanded. Marcel Dekker, Inc. NewYork. U.S.A. p.475-518).

이는 다른 숙주의 장내에 정착하기 위해 자신을 숙주 표면의 점착 부분에 맞게 적응시킨 것으로 보이며, 이를 통해 플라스미드 DNA가 각각의 다양성을 갖추는데 중요한 역할을 했을 것으로 사료된다. 이런 이유로 본 발명에서 제공되는 pILR091의 숙주인 L. reuteri L09는 다른 L. reuteri와 유사한 생리적, 유전적 특성을 가지고 있으면서 pILR091과 같은 다양성으로 보이는 플라스미드를 통해 그 균주만의 독특한 특성을 보유하고 있을 것으로 사료된다.

본 발명에 따른 pILR091의 평균 G-C 함량은 39%로서 이 수치는 L. reuteri의 게놈 DNA의 G-C 함량과 유사하였다. 일반적으로 락토바실러스 속 균주의 다양성(heterogenecity)은 각 종의 G-C 함량에 의해 반영되어 있어 32-55%의 변이가 있으며(Schleifer, K. H. and Stackebrandt, E. 1983. Annu. Rev. Microbiol. 37, 143-187.), 이는 그 종이 보유한 플라스미드 DNA에도 반영이 된다(도 7 참조).

그러나, 상대적으로 크기가 작고 RC 복제를 하는 잠적 플라스미드 DNA는 일반적으로 게놈 DNA에 비해 낮은 G-C 함량을 가지고 있다. 반면, 비-잠적 플라스미드 DNA는 일반적으로 세타-복제로 증식하며 중간 또는 큰 사이즈이고, 숙주의 생존에 중요한 유전자를 보유하고 있는 경우가 많다. 비록 본 발명의 pILR091이 RC-복제를 사용하고 상대적으로 작은 크기의 플라스미드 DNA이지만, G-C 함량면에서는 비-잠적 플라스미드 DNA를 따르고 있다.

이를 통해 본 발명의 pILR091이 비-잠적 플라스미드이면서 RC-복제의 다양한 숙주 영역과 세타-복제 플라스미드의 안정성의 두 가지 장점을 모두 가지고 있다고 할 수 있다.

본 발명의 pILR091의 복제수를 조사한 결과, 본 발명에 따른 플라스미드는 L. reuteri L09 안에 24~25개 존재한다. L. reuteri가 보유하고 있는 플라스미드들의 복제수는 아직 알려진 바 없으나, 일반적으로 유산균들은 2~15 복제수를 가진 플라스미드를 보유하고 있다(Douglas, G. A. et al., 1984. Appl. Environ. Microbiol. 47, 245249; Kiewiet, R. et al., 1993. Appl. Environ. Microbiol. 59, 358-364; Kok, J. et al., 1984. Appl. Environ. Microbiol. 48, 726-731; Nicoloff, H. et al., 2003. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6032-6040; Soryig, E. et al,. 2005. Microbiology. 151, 421-31).

그러나 일부 재조합된 플라스미드들은 30~170개의 복제수를 가지는데(Perez-Arellano et al., 2001. Plasmid. 46, 106-116), 이러한 복제수는 숙주의 상태, 플라스미드가 암호화한 인자들과 숙주의 전사(transcription) 간의 상호 작용, 그리고 복제 방식(mode), 삽입된 유전자의 크기와 특성 등에 의해 이런 차이가 생긴다(Kiewiet, R. et al., 1993. Appl. Environ. Microbiol. 59, 358-364).

따라서 20 계대 동안 본 발명의 pILR091는 그 복제수에 큰 차이가 없으므로 벡터 제작을 위한 유전자 조작에 의해서도 복제수에 큰 변화가 없을 것으로 사료된다.

본 발명의 플라스미드 pILR091은 L. reuteri의 게놈 DNA와 같은 G-C 함량을 가짐으로써 RCR 플라스미드의 단점을 보완할 수 있다. 따라서, 본 발명의 pILR091은 RCR과 세타-복제 플라스미드의 장점을 모두 가진다.

이와 같은 장점을 갖는 본 발명의 플라스미드 pILR091은 유산균을 이용한 경구 운반체(예: 경구용 백신)의 개발. 이를 위한 클로닝 및 발현 벡터의 제작 및 프 로바이오틱스의 개량 등에 유용하게 사용될 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 플라스미드 pILR091에 프로모터, MCS(multiple cloning site) 및 선별 마커가 삽입된 클로닝 벡터를 제공한다. 본 발명의 클로닝 벡터는 유산균에서의 유전자의 클로닝에 매우 유용하다. 본 발명의 클로닝 벡터에 사용되는 프로모터는 유산균에서 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있는 프로모터라면 제한없이 사용될 수 있다. 이에 제한되지는 않으나, CMV(cytomegalovirus) 프로모터, CaMV(Cauliflower Mosaic Virus) 35S 프로모터, rplL(recombinant porcine interleukin) 프로모터, ptsH(phosphotransferase system HPr(phosphocarrier protein)) 프로모터 등이 있다.

본 발명에서 "MCS(multiple cloning site)"란 다양한 제한효소 부위를 갖는 DNA 단편을 말하는 것으로서, 이는 특정 제한효소로 인지되어 절단되므로 절단된 MCS의 부위에 목적 유전자의 삽입을 가능하게 한다. 본 발명의 클로닝 벡터에 사용될 수 있는 MCS는 당업계에 공지된 MCS라면 제한없이 사용할 수 있으며, 이는 MCS를 가지고 있는 당업계에 공지된 다양한 벡터(예: pUC18, pUC19 등)에서 얻을 수 있다.

또한 본 발명에서“선별 마커(selection marker)"란 유전자의 클로닝 여부를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택 가능 표현형을 부여하는 마커 유전자가 사용될 수 있다. 바람직하게는 항생제 저항성 유전자, 발색 효소 유전자 또는 발광/형광 유 전자가 사용될 수 있다.

항생제 저항성 유전자의 예로는, 이에 제한되지는 않으나, 네오마이신 저항성 유전자, 하이그로마이신 저항성 유전자, 암피실린 저항성 유전자, 가나마이신 저항성 유전자, 에리쓰로 마이신 저항성 유전자, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자가 있다. 또한 발색 효소 유전자의 예로는 β-갈락토시다제 유전자, β-글루쿠로니다제(GUS) 유전자가 있다. 상기 발광 유전자의 예로는 루시퍼라제 유전자가 있고, 상기 형광 유전자의 예로는 BFP 유전자, CFP 유전자, GFP 유전자, YFP 유전자, RFP 유전자가 있다. 이외에도 선별 마커로 당업계에 공지된 다양한 유전자가 본 발명에 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 플라스미드 pILR091; 대장균의 복제 원점; 프로모터; MCS; 및 선별 마커를 포함하는 셔틀 벡터를 제공한다. 본 발명의 셔틀 벡터는 유산균의 복제 원점 및 대장균의 복제 원점을 모두 가지고 있으므로 유산균 및 대장균에서 상호 복제가 가능하다. 따라서 상기 셔틀 벡터는 목적 유전자를 유산균과 대장균에서 대량 복제 및 발현시킬 수 있다.

본 발명의 셔틀 벡터에 사용되는 대장균의 복제 원점은 당업계에 잘 알려진 대장균 유래 형질전환용 벡터(예컨대, pUC18, pUC19 등)로부터 얻을 수 있다. 대장균의 복제 원점의 염기서열은 당업계에 잘 공지되어 있으므로, 당해 분야의 숙련자라면 공지된 대장균의 복제 원점을 본 발명의 셔틀 벡터에 용이하게 삽입할 수 있다.

또한 본 발명의 셔틀 벡터에 사용될 수 있는 프로모터는 유산균 및 대장균에서 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있는 프로모터라면 제한없이 사용될 수 있으며, 그 예는 위에서 언급한 바와 같다. 상기 셔틀 벡터에 사용될 수 있는 선별 마커도 위에서 언급한 바와 같다.

본 발명의 셔틀 벡터는 상기 본 발명의 클로닝 벡터에 대장균의 복제 원점의 염기서열을 직접 삽입하여 제조할 수도 있다. 다른 방법으로는 본 발명의 pILR091과 대장균 유래 형질전환용 벡터를 연결하여 제조될 수 있다. 즉, 본 발명의 pILR091을 제한효소, 바람직하게는 원-컷 사이트를 가진 SalI 또는 HindⅢ로 절단하여 선형 플라스미드 DNA로 제조한 후, 이를 동일한 제한효소로 절단한 대장균 유래 형질전환용 벡터와 유전공학적 방법(예: ligation)으로 연결하여 제조할 수 있다.

락토바실러스 유래의 셔틀 벡터는 다수 공지되어 있으며, 예를 들면 미국특허 제5,688,683호는 락토바릴러스 유래의 셔틀 벡터 및 이를 이용한 형질전환 방법을 기술하고 있다. 또한 다음의 참고문헌에도 개시되어 있다: Pavlova, S. I. et al., 2002. Plasmid. 47, 182-192.

당해 분야에 공지된 임의의 유산균 및 대장균에서의 발현을 위한 셔틀 벡터의 제조 방법에 의해 목적 유전자를 유산균 및 대장균에서 발현시키기 위한 벡터의 제조를 위해 본 발명의 플라스미드가 사용될 수 있다는 것은 당해 분야의 숙련자라 면 이해할 것이다.

이와 같이 본 발명에서 제공되는 클로닝 벡터 또는 셔틀 벡터에는 목적 유전자가 삽입될 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 클로닝 벡터 또는 셔틀 벡터에 목적 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 “목적 유전자(target gene)”이라 함은 유산균에서 클로닝 하고자 하는 유전자 또는 특정 숙주세포에서 발현시키고자 하는 유전자를 말한다.

상기 목적 유전자는 본 발명의 클로닝 벡터 또는 셔틀 벡터 내에 존재하는 MCS 내에 삽입될 수 있다. 예컨대, 목적 유전자는 각 벡터의 MCS 내에 삽입될 수 있도록 제한효소 서열을 포함하는 프라이머로 PCR 증폭한 후, 제한효소로 절단하여 동일한 제한효소로 절단된 클로닝 벡터 또는 셔틀 벡터의 MCS 내에 삽입된다. 상기 목적 유전자는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. "작동가능하게 연결된다(operably linked)"는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다.

즉, 상기 목적 유전자는 벡터 내에 있는 프로모터에 의해 그 발현이 조절될 수 있도록 연결될 수 있다.

본 발명에 사용되는 목적 유전자로는 실험자가 유산균에서 클로닝하고자 하는 것이거나 및 대장균에서 발현시키고자 하는 모든 유전자를 다 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 벡터를 유산균에 형질전환시키는 경우에는 상기 유산균에 대해 프로바이오틱스로서의 활성, 기능 및/또는 유용성을 높일 수 있는 유전자를 목적 유전자로 사용할 수 있다.

특히 본 발명의 플라스미드가 대장균의 장 내에 잘 정착할 수 있는 유산균으부터 분리된 것이므로, 본 발명의 플라스미드 및 이를 이용하여 제조된 벡터들은 돼지를 위한 경구 운반체로서 유용하게 사용될 수 있다. 따라서 이 경우에는 돼지의 면역 증강, 성장 촉진, 질병 예방 등을 위한 유전자를 본 발명의 벡터의 목적 유전자로 사용할 수 있다.

본 발명의 벡터의 MCS 부위로 삽입 가능한 의학, 산업적으로 유용한 목적 유전자의 예로는 호르몬, 사이토카인, 효소, 응고인자, 수송 단백질, 수용체, 조절 단백질, 구조 단백질, 전사 인자, 항원, 항체 등을 암호화하는 유전자가 있다.

그 구체적인 예로는, 트롬보포이에틴, 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론, 인터페론 수용체, 콜로니 자극인자, 글루카곤-유사 펩타이드(GLP-1 등), G-단백질 관련 수용체(G-protein-coupled receptor), 인터루킨, 인터루킨 수용체, 효소, 인터루킨 결합 단백질, 사이토카인 결합 단백질, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당 단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, α-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ 및 XⅢ, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체, 수용체 길항물질, 세포표면항원, 바이러스 유래 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편 등을 암호화하는 유전자일 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 제공하는 모든 벡터는 pILR091의 복제수와 안정성 그리고 이들과 숙주세포와의 관계를 고려하여 제작할 수 있다. 또한 본 발명의 벡터들에는 목적 유전자의 발현을 조절하기 위하여 프로모터 이외에 발현 조절 서열이 추가로 포함될 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다.

그러한 발현 조절 서열은 전사를 개시하기 위한 프로모터(promoter) 이외에 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터(operator) 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아를 제공한다. 상기 박테리아는 대장균 또는 유산균일 수 있다. 상기 대장균은 XL1-blue, JM-109 등 일반적인 대장균이라면 제한없이 사용될 수 있다. 상기 유산균은 락토바실러스 속 균주일 수 있다.

이와 같이 형질전환된 박테리아는 목적 유전자로부터 발현되는 단백질의 대량 생산에 유용하게 이용될 수 있다. 따라서 형질전환된 박테리아를 배양하여 배양물로부터 대량 생산된 목적 단백질을 수득할 수 있다. 특히 본 발명에 의해 형질전환된 유산균은 돼지의 경구 운반체 또는 사료 첨가제로서 유용하게 사용될 수 있다.

나아가 본 발명은 상기 재조합 벡터를 박테리아에 도입하는 것을 포함하는 형질전환 방법을 제공한다. 상기 박테리아는 대장균 또는 유산균인 것이 바람직하다. 상기 방법은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 열 충격 방법(heat shock method), 칼슘 포스페이트 침전법, 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 박테리아 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio . Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio . Chem ., 263:14621-14624, 1988).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

본 발명의 플라스미드의 분리를 위한 락토바실러스 속 균주의 선발

돼지 장관내 집락형성이 잘 일어나며, 경구 운반체로 사용 가능한 유산균을 확보하기 위하여 충청북도에 있는 돈사에서 수거한 돼지 분변을 락토바실러스 속 선택 배지, LBS 및 유산균 비특이 배양 배지인 BS에서 배양하였다. 각 배지를 37℃에서 48시간 동안 혐기 상태로 배양하였다.

전형적인 락토바실러스 속 콜로니를 택하여 BL 배지에서 37℃의 조건으로 48시간 동안 혐기 상태로 배양하였다. 이후, 호기 상태에서의 배양성, 그람 염색, 카탈라제 테스트(catalase test), 콜로니 형태 및 세포 모양 관찰 등을 수행하여 락토바실러스 속 균주를 분리하였다.

이와 같이 돼지 분변에서 분리한 49주의 락토바실러스 속의 플라스미드 DNA를 추출하여 분석하여 셔틀 벡터로 개발 가능한 2~10kb 크기의 플라스미드 DNA를 가지고 있는 균주 10주를 선발하였다. 플라스미드 분석으로 선발된 락토바실러스 속을 동정하기 위하여 16S rRNA 유전자 분석(Flint, J.F. and Angert, E.R. 2005. J. Microbiol. Methods, 61: 235-243)과 API CH50L 키트를 이용한 표현형 분석을 실시하였다.

선발된 10주의 락토바실러스 속을 숙주로 사용하기 위하여 안정성 검사를 실시하였다. 용혈 반응 및 유해 대사산물 생성에 대해 조사하였다. 용혈 검사는 양 혈액 배지(sheep blood agar)에 각 균주를 배양한 후 용혈 여부를 확인하였다.

또한 유해 대사산물 생성 조사는 인돌, 암모니아 및 페닐알라닌 생성에 관하여 각각의 배지에 균을 배양하여 실시하였다(Cappuccino, J.G. and Sherman, N. 1987. Urease test. Microbiology: a laboratory manual. Pp. 157-160. Bejamin/Cummings Publishing Co. Inc., Menlo park, C.A., U.S.A; Isenberg, H.D. 1992. Indole test/Urease. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Vol.1, pp.1.19.13-1.19.15./2.6.8. American Society of Microbiology, Washington D.C., U.S.A.; Ishibashi, N. and Yamazaki, S. 2001. Probiotics and safety. Am. J. Clin. Nutr. 73, 465S-470S). 이를 통하여 생체 내(in vivo) 상태에서의 질병을 야기할 수 있는 균주를 배제한 결과, 7개 균주가 선발되었다.

이후, 선발된 7개 균주가 백신 운반체로 사용하기 위해 필요한 기능을 보유하고 있는지 알아보기 위하여 장 점착능, 항균효과, 내산성, 내담즙성, 내열성, 내 건조성 및 과산화수소(hydrogen peroxide) 생성 여부를 조사하였다. 그 결과, 가장 우수한 활성을 나타내는 하나의 균주를 선발하였다. 선발된 균주는 특히 장 점착능, 항균효과 및 내열성 면에서 가장 우수하였다.

상기 균주를 “락토바실러스 루테리 L09”라 명명하였으며, 이를 한국 농업미생물 자원센터에 2006년 8월 30일자로 기탁하였다(기탁번호:KACC 91266P).

< 실시예 2>

L. reuteri 09로부터 플라스미드의 분리

상기 실시예 1에서 선발된 L. reuteri 09 균주를 MRS 배지(Merck)에서 30°C의 조건으로 혐기상태로 정치배양하였다. 이후, 배양된 균주로부터 플라스미드 DNA를 분리하였다. 플라스미드 DNA의 분리는 O'sullivan and Klaenhammer(1993, Appl. Environ. Microbiol. 59, 2730-2733)의 방법을 기초로 하여 수행하였으며, 분리 효율을 올리기 위하여 일부 변형하였다.

구체적인 방법을 도 1에 나타내었다.

< 실시예 3>

플라스미드 DNA 의 클로닝 및 분석

<3-1> 플라스미드 DNA 의 분리

상기 실시예 2에서 분리한 전체 플라스미드 DNA를 SalI, SphI, EcoRI, PstI, XhoI, BamH, KpnI, HindⅢ, SmaI, XmaI 및 ApaI(Takara)의 제한 효소로 처리한 후 제한 효소 지도를 작성하였다.

L. reuteri L09의 전체 플라스미드 DNA를 여러 제한 효소를 이용하여 분석하였다.

그 결과, SalI 및 HindⅢ의 두 효소가 원-컷 사이트를 가지고 있었다. 이를 통해 L. reuteri L09는 10 kb이하의 플라스미드 DNA 두 개를 가지고 있음을 확인할 수 있었다(Primose, S., Twyman, R. and Old, B. 2001. Principles of Gene Manipulation, 6^th ed. Blackwell Science Ltd. London, UK. p43-63). 그 중에서 상대적으로 높은 복제(high copy)인 플라스미드(제한 효소 분석에 의해 약 7kb 크기의 플라스미드) DNA를 “pILR091”이라 명명하였다.

이후, 원-컷 사이트인 SalI을 이용하여 pILR091을 E. coli 벡터인 pQE30Xa 에 클로닝하였다. 먼저, SalI으로 pILR091을 절단하여 이를 선상 플라스미드 DNA로 생성하였다. 선상 플라스미드 pILR091를 동일한 제한 효소로 절단된 pQE30Xa 발현 벡터(QIAGEN)와 20℃에서 5시간 동안 라이게이션(ligation)시켜 본 발명의 pILR091을 pQE30Xadp 벡터에 클로닝하였으며, 이를 “pIL-01”로 명명하였다.

이후, 상기 pIL-01을 컴페턴트(competent) E. coli M15에 열충격 방법(heat shock method)을 이용하여 형질전환하였다. 형질전환체는 25㎍/ml의 카나마이신과 100㎍/ml의 암피실린이 함유된 LB 아가에 분주(plating)하여 37℃의 조건에서 16시간 배양하였다. 이후, 클로닝된 유전자는 염기서열 분석을 통해 확인하였다.

<3-2> 시퀀싱

염기서열은 ABI 377 자동화 DNA 시퀀서(Perkin-Elmer)를 이용하여 분석하였다. 하기 표 1에 나타낸 pQE-유니버설 프라이머(서열번호 2 및 서열번호 3)과 5쌍의 워킹 프라이머(서열번호 4 내지 서열번호 13)를 이용하여 pILR091의 전체 유전자 염기서열을 얻었다.

얻은 전체 유전자 염기서열은 새로 제작한 6쌍의 워킹 프라이머(서열번호 14 내지 서열번호 25)를 이용하여 PCR로 증폭하여 재확인하였다.

프라이머 워킹을 통한 시퀀싱에 사용된 프라이머의 염기서열

시퀀싱 타켓	프라이머	방향	염기서열	서열번호
pIL-01	pQE primer ^a	정방향 (Forward)	5'-CCCGAAAAGTGCCACCTG-3'	2
	pQE primer ^a	역방향 (Backward)	3'-GGTCTTACTGGAGTCTTG-5'	3
	왼쪽	Part #1	ACCATCACCATCACGGAT	4
		Part #2	TCACTTTGGCGTTTAAGTTGG	5
		Part #3	AGACAGCAAGGTCTTGTTTATGAAT	6
		Part #4	CGACCATTTTAGAAAGGAGTAGG	7
		Part #5	TATTATCAGCTTGAACTTGGCTCAT	8
	오른쪽	Part #1	AGTTCCCGCAATGGACTATG	9
		Part #2	GAATCTCAATCTTTGATGCGTTT	10
		Part #3	GACTTCCATACCATGTTTACCAG	11
		Part #4	ATTCTACTGATACCAACCAATTC	12
		Part #5	GTCGAAGCCCTAACTAGATTTGAC	13
pILR091	Portion #1	정방향	5'-TTATTGTGGTGTTGCTGTAACAG-3'	14
	Portion #1	역방향	3'-AGCTCTCTAGCGTAATTTGAACG-5'	15
	Portion #2	정방향	5'-CGCAAGTTAGGGTTATGAATATCTG-3'	16
	Portion #2	역방향	3'-TCAAAATCATATCGGAATTCTTGTT-5'	17
	Portion #3	정방향	5'-CGCATATTCACATTGTTTTGATTAC-3'	18
	Portion #3	역방향	3'-TTGATCCATTTTTGGGTAGTCTT-5'	19
	Portion #4	정방향	5'-ATCTTGATTGAGTATGGTGTTTGGT-3'	20
	Portion #4	역방향	3'-GTTATCATGTTGGCTTGAATGAA-5'	21
	Portion #5	정방향	5'-TTGATGAGTTCGATTACATTTGA-3'	22
	Portion #5	역방향	3'-CGATAATGTTGACAATTAACAAACG-5'	23
	Portion #6	정방향	5'-CATCTGAAACAAGTCAAAGAGGA-3'	24
	Portion #6	역방향	3'-TTACAGGTCCACCATAATAATCACC-5'	25

^a: pQE-유니버설 프라이머(pQE universal primers)

시퀀싱을 통해 pILR091의 전체 염기가 7,185bp임을 확인하였으며, 이의 염기서열을 서열번호 1로 기재하였다. 또한 pILR091의 전체 효소 부위를 염기서열 분석을 통해 재검증하였다(도 2 참조).

도 2의 A는 본 발명의 pILR091 내의 제한 효소의 위치를 나타낸 도면이고, B는 그 중에서 많이 사용되는 제한효소을 정리하여 이의 인식부위 및 pILR091의 염기서열 상에서의 효소위치를 나타낸 것이다.

도 2의 B에서 보는 바와 같이, SalI과 HindⅢ 이외에 EcoRV와 XbaI의 제한효소도 본 발명의 pILR091에서 원-컷 사이트를 가지는 것으로 확인되었다.

<3-3> pILR091 염기서열의 분석

상기 실시예 <3-2>로부터 얻어진 염기서열은 NCBI에서 제공하는 블라스트 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 이용하여 염기서열간 유사성을 분석하였으며, ORF 파인더(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)를 이용하여 각 ORF를 찾아내었다.

또한 DNasist(v1.02)를 이용하여 염기서열간의 유사성과 염기서열의 화학적 및 물리적 특성을 조사하였다.

a. G-C 함량 분석 결과

pILR091의 전체 G-C 함량은 39%이었으며, 이는 L. reuteri의 게놈 DNA의 G-C 함량과 유사하였다. 구체적으로 G 함량은 1,505 nucleotides(20.9%), T는 2,063 nucleotides(28.7%), A는 2,319 nucleotides(32.3%) 그리고 C는 1,298 nucleotides(18.1%)이었다.

본 발명에 따른 pILR091의 각 ORF와 락토바실러스 균주 유래 게놈 DNA의 ORF 간의 G-C 함량 비교 결과를 도 8에 도시하였다.

b. 추정되는 단백질 부위( putative replication region )의 확인 및 상대적인 비교 결과

타 연구를 통하여 알려진 RCR-플라스미드의 컨센서스 닉-사이트 서열(consensus nick-site sequence)을 본 발명의 pILR091에 적용한 결과, 본 발명의 pILR091의 서열상에 pC194-RCR 패밀리 서열(TCTTATATCTTGATAC)(Desmond, C., Ross, R.P., Fitzgerald, G. and Stanton, C. 2005. Plasmid. 54, 160-175)과 L. curvatus LTH 유래 플라스미드의 ori 사이트(TACTACGA)(Le Bourgeois, P., Lautier, M., Mata, M. and Ritzenthaler, P. 1992. J. Bacteriol. 174, 6752-6762)가 존재함을 알 수 있었다(도 3 참조).

pC194-RCR의 서열은 복제 단백질 서열인 ORF1의 63bp 상부(upstream)에 위치하고 이것은 다른 락토바실러스의 ori 사이트와 높은 유사성이 나타내었다(도 4 참조).

한편, L. curvatus의 ori 사이트(Klein, J.R., Ulrich, C. and Plapp, R. 1993. Plasmid. 30, 14-29)는 ORF3 서열에 위치하였나, 복제 단백질로 밝혀진 ORF 서열은 찾을 수가 없었다(도 3 참조). 결과적으로 본 발명에 따른 pILR091의 추정되는 복제 원점(TTTATATTGAT)은 pC194-RCR 패밀리에 속하기는 하나 염기서열에서 다소 차이점이 있는 것으로 나타났다.

또한 2가지 타입의 반복된 염기서열이 본 발명의 pILR091의 ORF3 상에서 발견되었다(도 3 참조).

첫 번째 염기서열은 10-bp 직접 반복 서열(NTGA(T/C)(T/G)T(T/A)NN)로 4회 반복되며, 두 번째 염기서열은 20 또는 21bp 추정되는 인테론(putative iteron)(ANNNAAAANNNN(3or4)ANNNNANAA)으로 4.5회 반복되었다.

c. 추정되는 ORFs 의 일반적인 특성 조사 결과

본 발명의 pILR091에서는 총 5개의 ORF가 확인되었다(도 3 참조). 코딩 서열은 모두 4,966 nucleotides이고 이는 플라스미드 크기의 70.4%를 차지하고 있다. 또한 pILR091에는 1개의 ORF의 잔제(orf6)로 예상되는 구조도 있다(도 3 및 도 5 참조).

c-1. 추정되는 복제 단백질

본 발명에 따른 pILR091의 ORF1은 플라스미드 DNA의 복제를 담당하는 것으로 밝혀졌으며, L. reuteri 뿐만 아니라 오에토코커스 오에니(Oenococcus oeni)(Genebank Access. No. BAD91409.1, E-value 4e-09, 24% identity No. NP_254271.1, E-value 9e-09, 22% identity)와 같은 다른 그람 양성 세균의 복제 단백질과도 상동성을 보였다.

비록 낮은 E-value를 보였지만 스타필로로커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(No. YP_492679., E-value, 0.18, 21% identity; No., AAM94141.1, E-value 0.14, 22% identity; No. CAD55143.1, E-value 0.31, 21% identity)의 복제 단백질과도 상동성을 보였다. 그러나 ORF1의 경우 다른 락토바실러스 속의 복제 단백질 서열상의 유사성은 낮았는데, 특히 같은 L. reuteri에서 분리된 플라스미드인 pTE44조차와도 낮은 유사성을 보였다(도 6 참조).

c-2. 추정되는 ORFs

본 발명의 pILR091의 ORF2는 푸소박테리움 뉴클레툼. 빈센티(Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii) ATCC 49256의 헤모라이신(hemolysin)과 유사성을 보였다(도 5 참조).

비록 낮은 E-value지만 Knob-associated histidine-rich protein precursors와도 유사성을 보였다. 그러나, ORF3과 ORF4는 다른 물질과의 유사성이 없는 것으로 나타났다.

반면, ORF5는 높은 아미노산 동일성(100%)과 E-value(7e-20)를 보였으나, 그 기능은 아직 명확히 밝혀지지 않았다. 한편, ORF6은 101개의 아미노산의 긴 가상 단백질(101aa long hypothetical protein), 2-옥소글루타레이트 디히드로게나제 E1 구성요소(2-oxoglutarate dehydrogenase E1 component), 열 충격 단백질(heat shock protein) 16.9 등과 높은 아미노산 염기서열의 유사성을 보였으나 종결 유전 코드(termination genetic code)인 TAA, TGA 그리고 TAG가 관찰되지 않는 것으로 보아 ORF의 잔제로 사료되었다(도 5 참조).

이와 같이 본 발명에 따른 pILRO91의 각 ORF의 정체성과 특성을 단백질 데이터를 바탕으로 블라스트 프로그램을 조사하였으나, 정체성과 기능 그리고 E-value 등이 L. reuteri 유래의 데이터를 제외하면 전반적으로 낮은 수치를 보였다.

<3-4> 플라스미드 복제수의 산출 및 안정성 조사

a. 복제수 산출

플라스미드 DNA의 복제수를 계산하기 위하여 정량(quantitative)-PCR을 실시하였다.

절대수치를 구하기 위하여 pILR091의 일부가 클로닝된 5.6kb의 pIL-01의 농도를 구한 후 이를 기준으로 절대치를 구하였다(Giulietti, A., Overbergh, L., Valckx, D., Decallonne, B., Bouillon, R. and Mathieu, C. 2001. Methods. 25, 386-401).

십진 계단 희석한 pIL-01을 표준 샘플로 하여 각각 PCR을 실시하였다. 총 DNA 와 표준 샘플의 농도를 구한 후 각 샘플을 주형으로 하여 PCR을 실시하였다.

PCR 프라이머(서열번호 26 내지 서열번호 27)는 복제 부위가 포함될 수 있도록 제작하였다(하기 표 2 참조). PCR은 총 25 사이클 반응시켰으며 다음과 같은 조건으로 실험을 진행하였다: 변성 94℃에서 30초; 어닐링 55℃에서 30초; 및 신장 72℃에서 30초. PCR 산물은 아가로스 겔 상에서 분석하였다.

플라스미드 복제수 산출에 사용된 프라이머의 염기서열

타켓	프라이머 명	방향	염기서열	서열번호
pILR091	ori frag.^b	정방향	5'-ACCCTCTGATTCGGTGTTTG-3'	26
pILR091	ori frag.^b	역방향	3'-AGTTCCCGCAATGGACTATG-5'	27

^b: frag. meant the fragment of pILR091

아가로스 겔 상의 DNA 밀도(density)를 Quantity-Oneprogram(Bio-Rad, Hercules, CA., U.S.A)을 이용하여 구한 후, 이를 통해 얻어진 표준식을 이용하여 플라스미드 DNA의 양과 복제수를 산출하였다.

게놈 DNA의 양은 총 DNA에서 플라스미드 DNA의 양을 뺀 부분이며, 산출식(Giulietti, A., Overbergh, L., Valckx, D., Decallonne, B., Bouillon, R. and Mathieu, C. 2001. Methods. 25, 386-401)을 통해 얻어낸 플라스미드 DNA와 게놈 DNA의 양을 비교하여 복제수를 산출하였다.

게놈 DNA의 크기는 락토바실러스 속 균주들의 일반적인 게놈 DNA 크기인 1.84-2.36Mb의 평균치인 2Mb로 하였다(Abs El-Osta, Y.G., Hillier, A.J., Davidson, B.E. and Dobos, M. 2002. Electrophoresis. 23, 3321-3331; El-Osta, Y.G., Hillier, A.J. and Dobos, M. 2005. Microbiology. 151, 875-892; Le Bourgeois, P., Lautier, M., Mata, M. and Ritzenthaler, P. 1992. J. Bacteriol. 174, 6752-6762; Lortal, S., Rouault, A., Guezenec, S. and Gautier, M. 1997. Curr. Microbiol. 34, 180-185).

그 결과, DNA의 밀도는 1ng 의 pIL-1(9.1kb)와 10ng의 게놈 DNA(2Mb)에서 동일하게 나왔다. 따라서, 전체 DNA인 10 ng에서 플라스미드 DNA의 질량인 1ng을 뺀 9ng이 게놈 DNA의 양이다.

이를 바탕으로 the equation of Giulietti A(Giulietti, A., Overbergh, L., Valckx, D., Decallonne, B., Bouillon, R. and Mathieu, C. 2001. Methods. 25, 386-401)을 적용하면 1ng의 pIL-01은 1 x 10⁸ molecules이 되며 9ng의 게놈 DNA는 4.095 x 10⁶ molecules을 보유하고 있게 된다.

게놈 DNA와 플라스미드의 분자수를 비례로 나타내면 약 1:24.5가 되며, 이로부터 pILR091의 복제수가 24~25임을 확인할 수 있었다.

b. 안정성 조사

또한 pILR091의 안정성을 알아보기 위하여 L. reuteri L09를 항생제가 들어있지 않는 MRS 10ml에 배양하였다. 10㎕ 의 배양액을 10^-3배 희석이 되도록 신선한 MRS 10ml에 24시간 간격으로 재접종하여 20계대를 한 후 상기 실시예 <3-4>의 a.에 기재한 방법으로 플라스미드의 복제수를 구하였다.

그 결과, 20 계대후에도 본 발명의 pILR091의 복제수(24~25)는 지속되었으며, 이를 통해 본 발명의 pILR091이 숙주인 락토바실러스에서 안정적으로 증식됨을 확인할 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 플라스미드 pILR091은 돼지의 장내에 쉽게 정착할 수 있는 균주인 L. reuteri L09로부터 분리된 것으로서, RCR 플라스미드와 세타-복제 플라스미드의 장점을 모두 가질 뿐 아니라 20계대 동안에도 복제수에 큰 변화를 나타내지 않아 안정하다는 장점이 있다.

따라서 본 발명의 플라스미드, 이를 이용하여 제조된 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체는 경구 운반체의 제조에 사용될 수 있을 뿐 아니라 프로바이오틱스의 잠재력과 그 가능성을 획기적으로 높일 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 플라스미드 pILR091.
제1항에 있어서, 락토바실러스 루테리 L09(Lactobacillus reuteri L09)(기탁번호:KACC 91266P)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 플라스미드 pILR091.
제1항의 플라스미드 pILR091에 프로모터, MCS(multiple cloning site) 및 선별 마커가 삽입된 클로닝 벡터.
제1항의 플라스미드 pILR091; 대장균의 복제 원점; 프로모터; MCS(multiple cloning site); 및 선별 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 셔틀 벡터 .
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 프로모터는 CMV(cytomegalovirus) 프로모터, CaMV(Cauliflower Mosaic Virus) 35S 프로모터, rplL(recombinant porcine interleukin) 프로모터 및 ptsH(phosphotransferase system HPr(phosphocarrier protein)) 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 셔틀 벡터.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 선별 마커는 항생제 저항성 유전자, 발색 효소 유전자, 발광 유전자 및 형광 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 셔틀 벡터.
제4항에 있어서, 상기 벡터는 제1항의 플라스미드 pILR091과 대장균 유래 형질전환용 벡터를 연결하여 제조되는 것을 특징으로 하는 셔틀 벡터.
제3항 또는 제4항의 벡터의 MCS 내에 목적 유전자가 삽입된 재조합 벡터.
제8항의 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아.
제8항의 재조합 벡터를 박테리아에 도입하는 것을 포함하는 형질전환 방법.