KR100804126B1 - 종양 괴사 인자―관련 세포사멸―유도 리간드의 수용체에특이적으로 결합하는 1가의 인간 단일클론 항체 및 그의항원결합 단편 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종양 괴사 인자-관련 세포사멸-유도 리간드의 수용체에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체 및 그의 항원결합 단편에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 조합 항체 라이브러리(combinatorial antibody library) 및 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용하여, 정상인의 말초혈액 림프구(peripheral blood lymphocyte: PBL)에서 분리한, 종양 괴사 인자-관련 세포사멸-유도 리간드(TRAIL)의 수용체인 DR5에 특이적으로 결합하는 신규 인간 단일클론 항체, 그의 항원결합 단편(antigen binding fragment; Fab) 및 이를 함유하는 종양 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 인간 단일클론 항체는 DR5와 결합하여 cross-linker없이 in vitro 에서 종양세포의 사멸을 유도하므로, 종양 치료에 유용하다.

TRAIL 수용체, DR5, 1가의 인간 단일클론 항체 Fab, cross-linker, 종양세포

Description

종양 괴사 인자―관련 세포사멸―유도 리간드의 수용체에 특이적으로 결합하는 1가의 인간 단일클론 항체 및 그의 항원결합 단편{Monovalent Human Monoclonal Antibody Specifically Binding to Receptor of Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand and Antigen-Binding Fragment Thereof}

도 1은 TRAIL 수용체에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변영역(A) 및 경쇄 가변영역(B) 부위 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체와 DR5의 결합 여부 및 DR5에 대한 결합시 TRAIL과의 관계를 나타낸 것이다 [A: 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체와 DR5 및 DR4와의 결합을 측정한 것; B 및 C: 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체가 DR5와의 결합시 TRAIL과의 관계를 나타낸 것].

도 3은 다양한 종양세포에서 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체의 세포 독성에 미치는 영향을 측정한 것이다 [A: TRAIL를 처리한 경우 세포의 생존율을 측정한 것; B: 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체 단편을 처리한 경우 세포의 생존율을 측정한 것; C: 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체 단편이 Jurkat 세포에서 가교제(cross-linker)없이 세포 사멸을 유도한다는 것을 나타낸 것].

도 4는 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체 처리시 Jurkat(A) 및 HL60(B) 종 양 세포 주에서의 카스페이즈-3/7의 활성화 정도를 측정한 것이다.

도 5는 Jurkat 및 HL60 종양 세포 주에서 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체에 의해 유도된 세포 사멸이 카스페이즈-비의존성 경로에 의한 것이라는 것을 나타낸 것이다 [A: 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체에 의해 유도된 세포 사멸에 미치는 zVAD(카스페이즈 저해제)의 영향을 세포 독성 측정 방법으로 나타낸 것; B: 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체에 의해 유도된 세포 사멸에 미치는 zVAD의 영향을 유세포 형광분석 방법으로 나타낸 것; C: 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체에 의해 유도된 세포 사멸에 미치는 zVAD의 영향을 DNA laddering 어세이로 나타낸 것].

도 6은 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체 단편이 TRAIL에 의해 유도된 종양세포 사멸에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

발명의 분야

본 발명은 종양 괴사 인자-관련 세포사멸-유도 리간드의 수용체에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체 및 그의 항원결합 단편에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 조합 항체 라이브러리(combinatorial antibody library) 및 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용하여, 정상인의 말초혈액 림프구(peripheral blood lymphocyte: PBL)에서 분리한, 종양 괴사 인자-관련 세포사멸-유도 리간드(TRAIL)의 수용체인 DR5에 특이적으로 결합하는 신규 인간 단일클론 항체, 그의 항원결합 단편(antigen binding fragment; Fab) 및 이를 함유하는 종양 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

배경기술

종양 괴사 인자-관련 세포사멸-유도 리간드(tumor necrosis factor(TNF)-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)는 막-결합 형태이거나 가용성 상태로 존재한다. 가용성 TRAIL(sTRAIL)은 종양세포에 대한 특이적 세포사멸을 유도하는 TRAIL 수용체 1(DR4) 및 TRAIL 수용체 2(DR5)와 상호작용할 수 있다 (Jang, Y.J. et al ., Cancer Lett., 194:107, 2003). 상기 DR4 및 DR5는 sTRAIL-유도 세포 사멸에 필요한 사멸 도메인을 포함하며, DR4 및/또는 DR5에 대한 sTRAIL의 결합은 수용체의 삼량화(trimerization)를 유도할 수 있고, 세포 내 신호 활성화에 의해 어댑터(adapter) 단백질과 사멸-유도 신호 복합체를 형성하여 세포 사멸을 일으킨다. 따라서, sTRAIL의 항암 치료제로서의 가능성에 대한 연구가 진행되어 왔다 (Walczak, H. et al., Nat. Med., 5:157, 1999).

최근, TRAIL 수용체에 대한 단일클론 항체(mAbs)가 암 치료에 유용할 수 있다는 보고가 있으며, DR4 또는 DR5를 활성화시키고 세포 사멸을 유도하는 몇몇 인간 mAbs 또는 마우스 mAbs가 보고되고 있다 (Griffith, T.S. et al ., J. Immunol., 162:2597, 1999; Rowinsky, E.K. et al ., J. Clin . Oncol., 23:9394, 2005; Georgakis, G.V. et al ., Brit . J. Haematol., 130:501, 2005; Motoki, K. et al ., Clin . Cancer Res., 11:3126, 2005; Mori, E. et al ., Cell Death & Diff., 11:203, 2004; Guo, Y. et al , J. Biol. Chem., 280(51):41940, 2005; Ichikawa, K. et al ., Nat . Med., 7:954, 2001; Chuntharapai, A. et al ., J. Immunol., 166:4891, 2001; Takeda, K. et al ., J. Exp . Med., 199:437, 2004; Pukac, L. et al ., Brit . J. Cancer, 92:1430, 2005). 몇몇 mAbs는 암세포의 사멸을 효과적으로 유도하기 위하여 가교제(cross-linker, 항-글로불린 항체, 단백질 A 또는 화학제)을 필요로 하나, 일부 mAbs는 in vitro상에서 가교제 없이 암세포를 죽일 수 있다. 상기 암세포 사멸 항체들은 모두 2가(bivalent) 항체이다. 아직까지 TRAIL 수용체에 특이적으로 결합하여 제2의 cross-linker 도움없이 종양 치료효과를 나타내는 1가(monovalent) 인간 항체는 개발된 바 없다. 가교제(cross-linker)를 필요로 하지 않는 mAbs는 면역 억제 항암 치료를 받는 환자 또는 FcR(Fc receptor)의 다형성을 갖는 환자에 있어서 항암제로 사용할 때 장점을 가질 것으로 기대된다.

몇몇 항-TRAIL 수용체 항체는 sTRAIL와 유사한 카스페이즈-의존성 세포사멸 기작에 의해 항암 작용을 한다. 그러나, 어떤 마우스 항-인간 DR5 단일클론 항체는 Jurkat 세포에서 카스페이즈-의존성 및 카스페이즈-비의존성 세포 사멸을 유도한다고 보고되었다. 따라서, TRAIL 수용체에 대한 각각의 단일클론 항체가 다양한 작용기작에 의해 세포 독성 작용을 나타낼 수 있다.

한편, 본 발명자들은 TRAIL 수용체에 대한 인간 항체를 개발하는 과정에서 그 중쇄 가변영역(GenBank accession number DQ344022, protein ID ABC70316)과 경 쇄 가변영역(GenBank accession number DQ344023, protein ID ABC70317)을 규명한 바 있다.

이에, 본 발명자들은 TRAIL 수용체에 특이적으로 결합하고, 종양 치료효과 나타내는 인간 항체의 가변영역에 불변영역을 첨가한 Fab 구조를 개발하고자 예의 노력한 결과, DR5에 특이적으로 결합하는 인간 1가 항체를 개발하고, 이 항체가 TRAIL과는 다른 세포사멸 유도 기작을 통하여 cross-linker없이도 종양세포의 사멸을 일으킨다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 TRAIL 수용체(DR5)에 특이적으로 결합하여 cross-linker 없이 종양세포의 사멸을 유도하는 인간 단일클론 1가 항체 또는 그의 항원결합 단편(Fab)을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 인간 단일클론 항체 또는 그의 항원결합 단편을 함유하는 종양 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7의 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변영역을 함유하는, 종양 괴사 인자-관련 세포사멸-유도 리간드(tumor necrosis factor(TNF)-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL) 수용체(death receptor5, DR5)에 특이적으로 결합하는 1가의 인간 단일클론 항체(monovalent human monoclonal antibody) 또는 그의 항원결합 단편(Fab)을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 중쇄 가변영역 및 상기 경쇄 가변영역은 각각 서열번호 4 및 서열번호 8로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 인간 단일클론 항체를 암호화하는 DNA서열을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 인간 단일클론 항체 또는 그의 항원결합 단편을 함유하는 종양 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 종양은 백혈병인 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태는 TRAIL 수용체(DR5)에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 1가 항체 또는 그의 항원결합 단편(Fab)에 관한 것이다.

본 발명자들은 DR5에 특이적으로 결합하는 1가의 인간 단일클론 항체(monovalent human monoclonal antibody)를 개발하는 과정에서, 중쇄 가변영역(GenBank accession number DQ344022, protein ID ABC70316) 및 경쇄 가변영역(GenBank accession number DQ344023, protein ID ABC70317)을 규명하고, 그 DNA 및 아미노산 서열을 GenBank에 등록한 바 있다.

본 발명에서는 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역뿐 아니라, 경쇄의 전체 불변영역 및 중쇄의 CH1 부위를 함유하는 인간 단일클론 항체 Fab 단편을 단백질로 분리?정제하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체 또는 그의 항원결합 단편을 함유하는 종양 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 인간 단일클론 항체 단편과 DR5와의 결합 여부를 ELISA로 확인한 결과, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체는 DR5와 결합하였고, DR5와의 결합시 TRAIL과는 경쟁적인 반응을 나타내지 않았다. 또한, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체 처리시 종양세포의 생존율을 MTT 어세이로 측정한 결과, 백혈병 종양 세포주에서 가교제(cross-linker)없이 세포의 사멸을 유도하였고, TRAIL과는 다른 카스페이즈-비의존성 작용기작에 의한다는 것을 확인할 수 있었으며, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체가 TRAIL에 의한 백혈병 종양세포의 사멸율을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 약학 조성물은 이미 사용되고 있는 항히스타민제, 소염진통제, 항암제 및 항생제 등의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 담 체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. DR5에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체 클론의 분리 (파아지 디스플레이)

실시예 1-1. PBL 분리

재조합 sDR5(Strathmann Biotech, GenBank accession number BAA33723)에 대한 Fab 클론을 항-DR5 항체의 농도를 비교적 높게 보유하는 정상인을 PBL의 제공자(donor)로 선정하고, 이들로부터 Histopaque-1077(Sigma)를 사용하여 헤파린을 처리한 혈액에서 PBL을 분리하였다.

실시예 1-2. Fab(항원결합 단편)의 PCR 증폭 및 라이브러리 제조

RNAsol(Gibco/BRL)을 사용하여 실시예 1-1에서 분리된 PBL에서 전체 RNA(30μg)를 분리하고, first-stranded cDNA synthesis kit(Pharmacia)를 사용하여 first-stranded cDNA를 제조하였다. 세 단계의 PCR을 수행하여 인간 Fab 분절(human Fab segment)을 준비하였다. VH, VL, CH1 및 Cκ 유전자 각각을 PCR 첫 번째 단계에서 증폭하고, 두 번째 단계인 오버래핑 PCR(overlapping PCR)에서 상기 각각의 유전자를 조합하여 Fd(VH/CH1) 및 경쇄(VL/Cκ 또는 VL/Cλ)를 제조하였다. 그리고, PCR의 세 번째 단계를 통해 오버래핑 확장(overlapping extension)을 진행시킴으로써 전체 길이를 가진 Fab 산물을 제조하였다.

상기 각각의 VH 및 VL, 유전자 패밀리에 대한 5' 프라이머 및 IgG, k 또는 λ에 대한 3' 불변영역(constant region) 프라이머는 Barbas 등의 방법으로 합성하였다 (Barbas, C.F., et al., Antibody Libraries. In Phage Display: A Laboratory Manual, 1st Ed. T. Kuhlman, D. deBruin, and P. Barker, eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001; Andris-Widhopf, J., et al., J. Immunol. Methods., 242:159, 2000). 전체 길이를 가진 Fab PCR 산물은 5'말단 및 3'말단에 비대칭성 SfiI 제한효소 자리를 가지고 있고, 이 자리를 통해 파지미드 벡터(phagemid vector)인 pComb3X(GenBank Accession No.: AF268281)로 클로닝하였다.

pComb3X는 두 개의 리보좀 결합부위(ribosome-binding site)와 신호 펩타이드(signal peptide)를 가지고 있다. 각각의 Fd 및 경쇄는 원형질막공간(periplasm)으로 이동하여 어셈블리(assembly)된 다음, 파지 입자(phage particle) 표면에 나열된다.

Fab를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합벡터 pComb3X로 E. coli(XL-1/Blue(Stratagene))를 형질전환시켰다. 재조합벡터로 연결된 Fab 라이브러리(ligated Fab library)는 7X108개의 형질전환체(transformant)를 가지고 있다. 파지미드를 가지고 있는 XL-1/Blue를 VCSM16 헬퍼 파지(Stratagene)로 감염시킨 다음, Fab를 암호화하는 DNA를 운반하는 파지를 제조하였다.

실시예 1-3. Fab 클론의 선별(패닝(panning)) 및 선별된 클론의 특성 규명

sDR5에 특이적으로 결합하는 클론의 선별은 하기 기술한 방법대로 수행하였다. 먼저, PBS(phosphate buffered saline) 버퍼로 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate, Costar)를 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 동안 방치한 다음, PBS로 한번 세척하였다. 그리고, PBS에 희석한 5% BSA(bovine serum albumin)를 4℃에서 하룻밤 동안 처리하여 코팅한 플레이트를 블러킹(blocking)한 다음, 실시예 1-2에서 제조된 파지 입자 40㎕(1× 1011), 10% BSA 5㎕ 및 10X PBS를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트의 각 웰(well)은 0.5% Tween 20이 녹아 있는 PBS(PBST)로 6번 세척하였다. 결합한 파지 입자는 0.5M HCl/glycine(pH 2.3) 50㎕를 사용하여 실온에서 5분 동안 배양함으로써 용출(elution)하였고, 상기 용출 은 두 번 수행하였다.

상기 용출액에 1M Tris/HCl(pH 8.0) 150㎕를 첨가하여 파지 입자를 중화(neutralization)시켰다. 활발하게 성장하고 있는 3㎖의 E. coli XL-1 Blue 세포에 중화시킨 파지 입자 250㎕를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양한 다음, 카베니실린(carbenicillin, 50㎍/㎖) 및 테트라사이클린(10㎍/㎖)을 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, VCSM13(Stratagene) 100㎕를 첨가하였다. 최종부피가 100㎖이 되도록 카베니실린 및 테트라사이클린을 함유하는 배양액(broth)을 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 카나마이신(kanamycin, 50㎍/㎖)을 첨가하고 37℃에서 하룻밤 동안(overnight) 배양하였다.

상기 배양액을 4℃에서 15분 동안 스핀다운(spin down)시켜 파지 입자를 모으고, 상등액(supernatant)을 다시 스핀다운시켜 수득한 상등액은 두 번째 패닝에서 사용하였다. 네 번째 패닝 후, 파지 상등액 및 파지미드 DNA(phagemid DNA)를 수득하였다.

sDR5에 대한 4번의 패닝이 완료된 다음, 파지 ELISA에서 양성반응을 나타낸 클론을 H/κ 및 H/λ라이브러리에서 분리하였다. MDA-LDL에서 나타난 ELISA 시그널(ELISA signal)은 패닝이 진행되는 동안 증가한 반면, BSA에서 나타난 시그널은 패닝동안 낮게 나타났다. 벡터에 삽입된 약 1,500bp의 DNA를 함유하는 클론은 SfiⅠ 제한효소 분석법을 수행하여 확인하였다.

실시예 1-4. 파지 ELISA

파지 상등액은 항원(antigen)에 대한 항체-결합 특이성(antibody-binding specificity)에 근거하여 선별하였다. BBS에 녹인 MDA-LDL(2㎍/㎖)을 마이크로타이터 플레이트에 넣고, 4℃에서 하룻밤 동안(overnight) 방치하여 플레이트를 미리 코팅하였다. PBS에 희석한 5% BSA로 상기 플레이트를 블러킹(blocking)한 다음, 실시예 1-3에서 수득된 파지 상등액을 각 웰에 첨가하여 실온에서 2시간 동안 배양하고, PBST로 4번 세척한 후, AP가 결합되어 있으면서 Fab 특이적인 항-인간 IgG 항체(alkaline phosphate(AP)-conjugated anti-human IgG(Fab specific) antibody, Sigma)를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBST로 플레이트를 세 번 세척한 후, AP의 기질(substrate)인 ρ-나이트로페닐 포스페이트(ρ-nitrophenyl phosphate) 50㎕를 첨가하고, 적정 시간 동안 반응시킨 다음, ELISA reader ELX 808 IU(BIO-TEK)를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 1-5. Fab V 영역을 암호화하는 유전자의 시퀀싱

자동화된 염기서열 분석기(automatic sequencer, Biocore Technology, Korea)를 사용하여, 파지 ELISA에서 양성반응을 보이고 SfiI 제한효소 분석법으로 삽입 유전자가 확인된 클론(positive clone)에서 추출한 파지미드 DNA를 분석하였다. 하기 서열번호 9 및 서열번호 10로 표시된 프라이머를 사용하여 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 시퀸싱하였다:

서열번호 9: 5'-TATTGCCTACGGCAGCCG

서열번호 10: 5'-ATTGCAGTGGCACTGGCT

시퀀싱 자료는 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 및 DNAPLOT(V BASE)를 사용하여 수집하고 분석하였다.

그 결과, 중쇄 가변영역은 서열번호 4로 표시되고, 경쇄 가변영역은 서열번호 8로 표시되는 것을 확인하고, 이를 GenBank에 등록(중쇄 가변영역:DQ344022, 경쇄 가변영역: DQ344023)하였다. 도 1에서는 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 부위의 아미노산 서열을 나타내었다.

실시예 2. DR5에 특이적으로 결합하는 가용성 인간 단일클론 항체 Fab 분리

실시예 2-1. 가용성 인간 단일클론 항체 Fab 분리

실시예 1에서 분리된 인간 단일클론 항체의 VH, VL 부위뿐 아니라, 경쇄 전체 불변영역 및 중쇄의 CH1 부위를 포함하는 Fab 형태로부터 가용성 인간 단일클론 항체를 분리하기 위하여, 우선, 실시예 1에서 제조된 재조합 파지 Fab를 함유하는 파지미드로 상기 TOP10F'세포를 형질전환(transformation)시키고, 각각의 클론을 분리하기 위하여 플레이팅(plating)하였다. 일렉트로컴피턴트 TOP10F' 세포(electrocompetent TOP10F' cell, Invitrogen)는 억제자를 생산하지 않는 계통(non-repressor strain)으로, 파지의 코트 단백질인 pⅢ가 없는 가용성 Fab 단백질을 생산할 수 있도록 종결코돈(stop codon)인 앰버코돈(amber codon)을 인지한다. 각각의 세포는 37℃에서 5시간 동안 카베니실린, 테트라사이클린 및 20mM MgCl2를 함유하는 SB 배지에서 배양하였다. Fab 단백질의 발현을 유도하기 위하여, 세포에 1mM IPTG(isopropyl thiogalactopyranoside)를 처리하고, 25~30℃에서 2~16 시간 동안 배양하였다.

상기 배양액을 원심분리하여 세포 펠렛(cell pellet)을 분리하였다. 차가운 TES 버퍼(0.2M Tris-HCl, pH 8.0, 0.5mM EDTA, 0.5M 수크로즈) 10㎖을 희석시킨 배양액 1ℓ에 분리한 펠렛을 재현탁한 다음, 희석한 차가운 TES 버퍼(증류수에 1:3의 비율로 희석)를 첨가하고 30분 동안 얼음 속에 방치하였다. 반응이 끝난 후, 상기 혼합물(mixture)을 15000g에서 10분 동안 원심분리하여 부유물(suspension)을 수득함으로써, 가용성 원형질막공간 추출물(soluble periplasm extract)을 수득하였다.

Fab을 분리(purification)하기 위하여, Fab의 발현이 유도된 세포 배양액의 상등액과 가용성 원형질막공간 추출물을 혼합하고, 울트라필트레이션 세포 유닛(ultrafiltration cell unit, Amicon, U.S.A.) 및 울트라필트레이션 멤브레인(ultrafiltration membrane, NMWL: 10,000, Millipore, U.S.A.)을 사용하여 5번 농축한 다음, 세정버퍼(washing buffer: 50mM NaH2PO4, pH 8.0, 300mM NaCl, 20mM 이미다졸(imidazole))로 세척하였다. 농축된 혼합물은 15,000g로 20분 동안 원심분리한 후, 0.22㎛ 필터(Millipore, U.S.A.)를 사용하여 여과하였다.

농축된 혼합물에서 Fab 단백질을 추출하기 위하여, 세정버퍼로 세척한 Ni-NTA 컬럼(Qiagen, Germany)을 사용하였다. 택일적으로, 농축된 혼합물을 컬럼에 넣기 전에, Ni-NTA 아가로즈에 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 섞어줄 수 있다. 단백질은 10㎖의 용출버퍼(elution buffer: 50mM NaH2PO4, pH 8.0, 300mM NaCl, 250mM 이미다졸)를 사용하여 두 부분(fraction)으로 용출하였다. 용출된 샘플은 센트리프 렙(centriprep, YM-10, Millipore)을 사용하여 최종 부피가 1.5㎖이 되도록 농축하고, PBS로 세척하여 최종적으로 인간 단일클론 항체를 수득하였다.

실시예 2-2. 분리된 가용성 Fab의 면역블러팅(immunoblotting)

단백질 레벨에서 항-DR5 단일클론 항체의 특징을 규명하기 위하여, 상기 기술한 바와 같이 가용성 Fab의 발현을 유도한 다음, 배양액의 상등액 및 원형질막공간 추출물에서 수득하였다. 수득된 Fab은 비환원성 조건(non-reducing condition)하에서 SDS-PAGE를 수행하여 분리하고, NC 멤브레인으로 이동시켰다. 상기 멤브레인을 3% BSA/PBS로 실온에서 2시간 동안 블러킹한 다음, 여기에 AP가 결합되어 있으면서 Fab에 특이적인 항-인간 IgG 항체를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 PBS/Tween-20으로 멤브레인을 세 번 세척하고, ECM 시스템(enhanced cheiluminescence system)인 WEST-zol plus(Intron, Korea)를 사용하여 단백질의 존재를 확인하였다. 정상적인 인간의 IgG를 파파인(papain)으로 처리한 후, 단백질 G 친화력 컬럼(protein G affinity column)으로 분리하여, 수득한 인간의 Fab는 면역 블러팅에서 양성대조군(positive control)으로 사용하였다. 상기 Fab은 Fab에 특이적인 항-인간 IgG 항체와 반응하였다.

실시예 3. 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체와 DR5 및 DR4와의 결합 측정

실시예 2에서 수득된 인간 단일클론 항체와 E. coli BL21(DE3)에서 발현되는 DR5 또는 DR4와의 결합 여부를 측정하기 위하여, 5㎍/㎖ DR5, DR4(Strathmann Biotech, GenBank accession number O00220) 및 PBS(phosphate-buffered saline)가 코딩된 플레이트에 상기에서 정제된 인간 단일클론 항체를 농도별로 처리한 후, 결합 여부를 바이오틴(biotin)이 결합된 항 인간 IgG(Fab 특이적) 염기성 인산 분해효소(alkaline phosphatase)를 이용하여 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 측정하였다 (도 2의 A).

그 결과, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체의 농도에 따라 DR5 또는 DR4와의 결합이 증가하였고, 특히 DR5와 더 많이 결합하였다. 이는 항-DR5인 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체가 DR4와 교차-반응성을 가지는 것을 의미한다. 인간 DR5 및 DR4는 약 50% 아미노산 서열의 상동성을 가지기 때문에, DR5 혹은 DR4에 대한 하나의 단일클론 항체가 서로 교차-반응을 할 수 있다.

DR5와의 결합에 대한 TRAIL과 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체의 관계를 측정하기 위하여, ELISA 플레이트를 5㎍/㎖ DR5로 코팅한 후, 50㎍/㎖ 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체와 다양한 농도의 sTRAIL(Koram Biotech, Korea)을 처리하거나(도 2의 B), 5㎍/㎖ TRAIL과 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체를 다양한 농도로 처리하여 ELISA로 측정하였다 (도 2의 C).

그 결과, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체와 TRAIL 간에는 DR5 결합에 대하여 경쟁적인 반응을 나타내지 않는다는 것을 알 수 있었다. 이는 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체와 TRAIL이 가용성 DR5(sDR5)의 서로 다른 에피토프와 결합한다는 것을 시사한다.

실시예 4. 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체의 세포 사멸에 미치는 영향 측정

Jurkat(인간 T-세포 백혈병 세포, ATCC TIB-152), HL60(인간 골수 백혈병 세포, ATCC CCL-240) 및 LNCa-P(인간 전립선암세포, ATCC CRL-1740) 세포는 10% FBS(fatal bovine serum), 2mM 글루타민 및 100㎍/㎖ 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. MOLT-4 세포(인간 급성 림프구성 백혈병, ATCC CRL-1582)는 20% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였고, HCT116(인간 대장선암, ATCC CCL-247) 및 HeLa(인간 목 선암종 세포, ATCC CCL-2) 세포는 Dulbecco's Modified Eagle 배지에서 배양하였다.

상기 세포들(4×104/well)에 다양한 농도의 sTRAIL를 24시간 동안 처리하거나(도3의 A), 다양한 농도의 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체를 가교제(cross-linker)없이 48시간 동안 처리한 후(도3의 B), MTT(3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-(3-diphenyl tetrazolium bromide, Sigma) 어세이를 수행하여 각 세포의 생존율을 측정하였다.

그 결과, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체는 sTRAIL와 같은 정도의 세포 사멸을 유도하기 위하여 sTRAIL 보다 높은 농도를 필요로 하였지만, Jurkat 및 HL60 백혈병 암 세포 주에서 확실히 세포 독성을 보였다. 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체 1.1ug/ml를 48시간 동안 처리한 경우, TRAIL-민감성 세포주인 Jurkat 및 HL60 세포는 각각 45% 및 50% 생존하였다. 또한, TRAIL-민감성 세포주인 HCT116 세포는 sTRAIL을 처리한 경우 민감하게 반응하여 세포 사멸이 발생하나, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체를 처리한 경우 효과적으로 사멸되지 않았다. 이는 본 발 명에 따른 인간 단일클론 항체와 TRAIL이 서로 다른 작용기작에 의해 세포 사멸을 유도한다는 것을 의미한다. TRAIL-저항성 종양 세포주(LNCa-P, Molt-4 및 HeLa)에 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체를 처리한 경우, 세포 사멸이 발생하지 않았다.

또한, Jurkat 세포에 마우스 항-인간 IgG(Fab-특이적) 항체(1:15,000, Sigma)와 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체를 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양한 후, MTT 어세이를 수행하여 세포 생존 여부를 측정하였다.

그 결과, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체는 Jurkat 세포(도 3의 C) 또는 다른 상기 5 종류의 세포(HCT116, HL60, LNCa-P, Molt-4 및 HeLa)에서 가교제(cross-linker)의 존재 여부에 상관없이 세포 사멸을 유도하였다.

실시예 5. 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체의 카스페이즈의 활성화에 미치는 영향

TRAIL 및 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체의 카스페이즈(caspase) 활성화에 미치는 영향을 비교 측정하기 위하여, Jurkat 및 HL60 세포(2×104/well)에 0.1㎍/㎖ TRAIL 또는 1㎍/㎖ 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체를 처리하여 시간별로 배양한 후, 원심분리하여 얻은 상등액의 카스페이즈-3 및 카스페이즈-7의 활성도를 Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 어세이(Promega)를 사용하여 LS55 발광 스펙트럼(luminescence spectrometer, Perkin Elmer)로 측정하였다.

그 결과, TRAIL을 처리한 경우 카스페이즈-3/7를 활성화시키는 반면, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체를 48시간 동안 처리한 경우 카스페이즈-3/7를 활성 화시키지 않았다 (도 4의 A 및 B). 이는 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체와 TRAIL이 다른 작용기작에 의해 세포 사멸을 유도한다는 것을 의미한다.

실시예 6. 팬-카스페이즈 억제제와 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체에 의해 유도된 세포 사멸과의 관계

팬-카스페이즈 억제제(pan-caspase inhibitor)인 z-VAD가 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체에 의해 유도된 세포 사멸에 미치는 영향을 측정하기 위하여, Jurkat 및 HL60 세포(4×104/well)에 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, Sigma)에 녹인 z-VAD(Santa Cruz Biotechnology)을 농도별로 처리하고, 1㎍/㎖ TRAIL을 24시간 동안 처리하거나, 1㎍/㎖ 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체를 48시간 동안 처리한 후, MTT 어세이로 세포 생존 여부를 측정하였다.

그 결과, Jurkat 및 HL60 세포에서 z-VAD는 농도 의존적으로 TRAIL에 의해 유도된 세포 사멸을 억제한 반면, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체에 의한 세포사멸은 높은 농도의 z-VAD에서도 억제되지 않았다 (도 5의 A의 윗 패널).

또한, Jurkat 및 HL60 세포(4×104/well)에 1㎍/㎖ 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체와 50μM z-VAD를 처리하여 시간별로 배양한 후, MTT 어세이로 세포 생존 여부를 측정하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체와 z-VAD를 함께 처리하여 48시간 배양한 경우 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체에 의해 유도된 세포 사멸에 영향을 미치지 않았다 (도 5의 A의 아래 패널). 이는 팬-카스페이즈 억제제가 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체에 의해 유도되는 세포 사멸을 회 복시키지 못한다는 것을 의미한다.

Jurkat 세포에 30μM z-VAD의 존재하에 1㎍/㎖ 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체를 처리하여 48시간 동안 배양하거나, 0.5㎍/㎖ TRAIL을 처리하여 3시간 동안 배양한 후, annexin-V FITC 키트(Pharmingen)를 사용하여 염색한 다음, flow cytometry(FACSVantage, BD Biosciences)를 이용하여 세포사멸 여부를 측정하였다 (도 5의 B).

그 결과, z-VAD가 TRAIL에 의해 유도된 세포사멸로부터 Jurkat 세포를 보호하는데 비하여(TRAIL 처리군:TRAIL+z-VAD 처리군=38.42%:6.31%), 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체에 의해 유도된 세포사멸에 대해서는 영향이 없었다 (본 발명에 따른 인간 단일클론 항체 처리군: 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체+z-VAD 처리군=19.44% 대 20.11%). 또한, TRAIL 처리군의 전체 세포 사멸율은 53.97%이고, TRAIL+z-VAD 처리군은 8.4%로써 z-VAD 존재 하에서 사멸율이 급격히 감소한데 비하여, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체 처리군의 전체 세포 사멸율은 72.6%이고, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체+z-VAD 처리군은 80.29%로써 z-VAD 존재 하에서도 세포 사멸율이 감소하지 않았다 (도 5의 B). 이는 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체에 의해 유도되는 세포 사멸은 sTRAIL에 의해 활성화되는 작용기작과는 다른 카스페이즈-비의존성 경로에 의한다는 것을 의미한다.

HL60(1×106/well) 세포에 30μM z-VAD의 존재 하에 1㎍/㎖ TRAIL를 6시간 동안 처리하거나, 10㎍/㎖ 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체를 52시간 동안 처리한 후, ApopLadder Ex 키트(TAKARA Bio)를 이용하여 DNA를 수득한 다음, 1% 아가로 오스 겔에 전기영동하였다.

그 결과, TRAIL 처리군 또는 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체 처리군의 경우, 일반적인 세포사멸의 현상인 DNA ladder를 나타내는데 비하여, TRAIL+z-VAD 처리군의 경우 DNA ladder를 나타내지 않았다 (도 5의 C). 그러나, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체+z-VAD 처리군의 경우, DNA ladder가 완전히 사라지지 않았다. 이는 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체는 카스페이즈-비의존성 세포사멸을 유도한다는 것을 의미한다.

실시예 7. 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체의 TRAIL 에 의해 유도된 세포 사멸에 미치는 영향

본 발명에 따른 인간 단일클론 항체가 TRAIL에 의해 유도되는 세포 사멸을 증진시킬 수 있는지 확인하기 위하여, Jurkat 세포에 1㎍/㎖ 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체, 0.1㎍/㎖ TRAIL 또는 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체+TRAIL을 처리하여 세포 생존율을 측정하였고, HL60 세포에 1㎍/㎖ 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체, 0.001㎍/㎖ TRAIL 또는 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체+TRAIL을 처리하여 MTT 어세이로 세포 생존율을 측정하였다.

그 결과, 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체+TRAIL 처리군의 경우 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체 또는 TRAIL을 단독으로 처리한 경우보다 세포 사멸율이 높았다 (도 6). 이는 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체가 TRAIL에 의해 유도되는 세포 사멸율을 증가시킨다는 것을 의미한다.

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 DR5에 특이적으로 결합하는 신규 인간 단일클론 항체, 그의 항원결합 단편(Fab) 및 이를 이용한 종양 치료용 약학 조성물을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 1가 인간 단일클론 항체는 TRAIL과는 비경쟁적으로 DR5와 결합하여 종양세포의 사멸을 유도하고, 가교제(cross-linker)를 필요로 하지 않으며, TRAIL와는 다른 카스페이즈-비의존성 작용기작에 의해 종양세포의 사멸을 유도하므로 종양 치료에 유용하다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

1. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7의 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변영역을 함유하는, 종양 괴사 인자-관련 세포사멸-유도 리간드(tumor necrosis factor(TNF)-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL) 수용체(death receptor5, DR5)에 특이적으로 결합하는 1가의 인간 단일클론 항체(monovalent human monoclonal antibody) 또는 그의 항원결합 단편(Fab).
2. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역 및 상기 경쇄 가변영역은 각각 서열번호 4 및 서열번호 8로 표시되는 것을 특징으로 하는 인간 단일클론 항체 또는 그의 항원결합 단편(Fab).
3. 제1항의 인간 단일클론 항체를 암호화하는 DNA서열.
4. 제1항 또는 제2항의 인간 단일클론 항체 또는 그의 항원결합 단편을 함유하는 종양 치료용 약학 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 종양은 백혈병인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

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