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KR100799626B1 - 암 세포 특이적 과발현 프로모터를 함유하는 재조합벡터 - Google Patents

암 세포 특이적 과발현 프로모터를 함유하는 재조합벡터 Download PDF

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KR100799626B1
KR100799626B1 KR1020060114249A KR20060114249A KR100799626B1 KR 100799626 B1 KR100799626 B1 KR 100799626B1 KR 1020060114249 A KR1020060114249 A KR 1020060114249A KR 20060114249 A KR20060114249 A KR 20060114249A KR 100799626 B1 KR100799626 B1 KR 100799626B1
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Abstract

본 발명은 암 세포 특이적 과발현 프로모터를 함유하는 재조합벡터에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 암 치료용 유전자를 유방암세포에서 특이적으로 과다 발현시키기 위하여 유방암세포에서 암 특이적으로 과다 발현하는 사이토키네시스 1의 단백질 조절자(protein regulator of cytokinesis 1, PRC1) 유전자의 프로모터 및 암 치료용 유전자를 함유하는 암세포 특이적 발현벡터, 리보뉴클레오타이드 환원효소 서브유닛 2(ribonucleotide reductase subunit 2, RRM2) 유전자의 프로모터 및 암 치료용 유전자를 함유하는 암세포 특이적 발현벡터 및 상기 발현벡터에 유방암세포에서 많이 발현되는 전사인자인 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER)가 결합하는 ER 결합 서열(estrogen response element, ERE)을 추가로 함유하는 암세포 특이적 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명에 따른 암세포 특이적 발현벡터는 유방암을 비롯한 다른 암세포에서 암 치료용 유전자를 효율적으로 과다 발현시킬 수 있어, 암 치료에 유용하다.
PRC1, RRM2, 에스트로겐 수용체 결합서열, 유전자 치료, 암

Description

암 세포 특이적 과발현 프로모터를 함유하는 재조합벡터{Recombinant Vector Containing Cancer Cell Specific, Over-Expressing Promoter}
도 1은 PRC1 및 RRM2의 발현 정도를 정상세포와 암세포에서 측정한 것이다 (A: 유방암세포(MCF)와 정상 유방세포(MCF10A)에서의 PRC1 및 RRM2 mRNA 측정; B: 정상 유방세포(MCF10A)와 유방암세포(MCF, T47D)에서 PRC1 및 RRM2의 단백질 발현 정도 측정).
도 2는 PRC1 및 RRM2 유전자의 프로모터의 암 특이적인 활성을 루시퍼레이즈 발현 벡터를 이용하여 암세포와 정상세포에서 조사한 것이다. 이때, BIRC5 프로모터(BIRC5-luc)를 양성대조군으로 사용하였다 (A: 유방암세포(MCF7)와 정상유방세포(MCF10A)에서의 PRC1 및 RRM2 유전자의 프로모터의 활성; B: 폐암세포(A549)와 정상폐세포(MRC5)에서의 PRC1 및 RRM2 유전자의 프로모터의 활성).
도 3은 에스트로겐 수용체가 결합하는 염기 서열(ERE)을 PRC1-luc 및 RRM2-luc 재조합벡터에 삽입하는 모식도이다.
도 4는 에스트로겐 수용체가 결합하는 염기 서열(ERE)을 PRC1 및 RRM2 유전자의 프로모터에 0, 2, 4개 삽입한 재조합벡터의 루시퍼레이즈 발현 여부를 유방암세포(MCF7)에서 조사한 것이다.
도 5는 PRC1 및 RRM2 유전자의 프로모터에 GFP 유전자를 연결하고 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터에 삽입한 후, 자궁경부암세포인 HeLa 세포(A)와 유방암세포인 MCF7(B)에 도입하여 GFP 형광단백질의 발현 정도를 측정한 것이다.
발명의 분야
본 발명은 암 세포 특이적 과발현 프로모터를 함유하는 재조합벡터에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 암 치료용 유전자를 유방암세포에서 특이적으로 과다 발현시키기 위하여 유방암세포에서 암 특이적으로 과다 발현하는 사이토키네시스 1의 단백질 조절자(protein regulator of cytokinesis 1, PRC1) 유전자의 프로모터 및 암 치료용 유전자를 함유하는 암세포 특이적 발현벡터, 리보뉴클레오타이드 환원효소 서브유닛 2(ribonucleotide reductase subunit 2, RRM2) 유전자의 프로모터 및 암 치료용 유전자를 함유하는 암세포 특이적 발현벡터 및 상기 발현벡터에 유방암세포에서 많이 발현되는 전사인자인 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER)가 결합하는 ER 결합 서열(estrogen response element, ERE)을 추가로 함유하는 암세포 특이적 발현벡터에 관한 것이다.
배경기술
유전자 치료는 질병의 원인을 제거할 수 있는 기능을 가진 유전자를 직접 환자의 체내에 도입하여 질병을 치료하고자 하는 기술이다. 대표적인 예로는 돌연변이로 인해 기능을 상실하여 질병을 야기하는 유전자에 야생종 유전자를 삽입하여 상실된 기능을 회복시켜 주는 방법과, 암과 같이 질병의 원인이 되는 세포를 선택적으로 죽일 수 있는 유전자를 특정 표적 세포에만 배달·발현시키는 방법 등이 있다.
후자의 경우 유전자 치료를 위한 표적 유전자를 암세포에서만 특이적으로 과발현시키는 프로모터를 개발하고자 많은 시도가 있었다. 현재까지 이 분야에서 많이 개발된 프로모터로는 BIRC5(baculoviral IAP repeat-containing 5, survivin)와 텔로머라아제 역전사효소(telomerase reverse transcriptase, TERT)가 있다. 상기 두 유전자는 암 특이적으로 발현된다는 것이 확인되었으나, TERT는 암 특이성은 강하지만 전사 활성이 약하기 때문에 이를 보완하기 위해 암세포의 특이적 환경인 무산소 상태에서 활성화되는 전사인자인 HIF-1α(Hypoxia-inducible factor 1)의 결합 염기서열을 TERT 프로모터에 삽입한 수정된 프로모터가 개발되었다 (Shin et al., Oncology Reports, 10:2063, 2003; Yin et al., J. Lab . Cli . Med., 144:302, 2004).
사이토키네시스 1의 단백질 조절자(protein regulator of cytokinesis 1, PRC1)는 포유동물 세포에서 세포질 분열에 필수적인 스핀들(spindle)에 결합하는 단백질로서, p53 단백질에 의해 그 발현이 억제되는 것으로 보고되고 있다 (Li et al., Oncogene ., 23:9336, 2004). p53이 암을 억제하고 과반수의 암세포에서 p53의 발현 이상으로 정상 기능을 상실한다는 것을 고려할 때, 이러한 보고는 PRC1이 암세포에서 과발현될 수 있다는 것을 시사한다. 실제로 이자암의 진단 마커로 PRC1의 이용이 제안되었다 (WO 2004/078205A1).
리보뉴클레오타이드 환원효소 서브유닛 2(ribonucleotide reductase subunit 2, RRM2)는 M1 및 M2의 두 서브유닛으로 구성된 DNA 합성을 조절하는 효소의 작은 서브유닛으로, 세포 증식, 발암, 암 전이 등에 관련되어 있다고 알려져 있다. 특히, RRM2는 유방암 환자의 암 조직에서 과발현되는 것으로 보고되었다 (Jenson et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA., 91:9257, 1994).
이에, 본 발명자들은 목적유전자를 유방암세포에서 특이적으로 과다 발현시키는 암세포 특이적 발현벡터를 개발하고자 예의 노력한 결과, PRC1 또는 RRM2 유전자의 프로모터를 함유하는 암세포 특이적 발현벡터가 암세포에서 유전자의 발현을 특이적으로 과발현시킨다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 사이토키네시스 1의 단백질 조절자(protein regulator of cytokinesis 1, PRC1) 유전자의 프로모터 및 암 치료용 유전자를 함유하는 암세포 특이적 발현벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 리보뉴클레오타이드 환원효소 서브유닛 2(ribonucleotide reductase subunit 2, RRM2) 유전자의 프로모터 및 암 치료용 유전자를 함유하는 암세포 특이적 발현벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 암세포 특이적 발현벡터에 에스트로겐 반응 요소(estrogene response element, ERE)를 추가로 함유하는 암세포 특이적 발현벡터를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사이토키네시스 1의 단백질 조절자(protein regulator of cytokinesis 1, PRC1) 유전자의 프로모터 및 암 치료용 유전자를 함유하는 암세포 특이적 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 암세포 특이적 발현벡터에 에스트로겐 반응 요소(estrogene response element, ERE)를 추가로 함유하는 암세포 특이적 발현벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 에스트로겐 반응 요소는 서열번호 9로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 리보뉴클레오타이드 환원효소 서브유닛 2(ribonucleotide reductase subunit 2, RRM2) 유전자의 프로모터 및 암 치료용 유전자를 함유하는 암세포 특이적 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 암세포 특이적 발현벡터에 에스트로겐 반응 요소(estrogene response element, ERE)를 추가로 함유하는 암세포 특이적 발현벡터 를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있고, 에스트로겐 반응 요소는 서열번호 9로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암 치료용 유전자는 BCL-2 계통 세포사멸 촉진(pro-apoptotic)유전자 또는 자살 수용체/리간드(death receptor/ligand) 유전자인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 BCL-2(B-cell leukemia/lymphoma 2) 계통 세포사멸 촉진(pro-apoptotic)유전자는 Bax(BCL2-associated X) 또는 Bad(BCL2-antagonist of cell death)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 자살 수용체/리간드(death receptor/ligand) 유전자는 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor-α, TNF-α) 또는 Fas 리간드(Fas ligand, FasL)인 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태는 PRC1 유전자의 프로모터 및 암 치료용 유전자를 함유하는 암세포 특이적 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 RRM2 유전자의 프로모터 및 암 치료용 유전자를 함유하는 암세포 특이적 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명에 따른 재조합벡터의 경우, pGL3-Basic 벡터의 클로닝 사이트를 변형시킨 pGL3-mBasic 재조합벡터를 제작한 후, human PRC1 또는 human RRM2 유전자의 프로모터를 증폭시킨 다음, pGL3-mBasic에 클로닝하여 PRC1 또는 RRM2 유전자의 프로모터 서열을 삽입하여 PRC1-luc 또는 RRM2-luc 재조합벡터를 제작하였다. 상기 PRC1-luc 또는 RRM2-luc 재조합벡터로 형질전환된 세포주의 루시퍼레이즈 활성을 측정한 결과, 루시퍼레이즈의 발현이 활성화된 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 발현벡터에 에스트로겐 반응 요소(ERE)를 추가로 함유하는 암세포 특이적 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명에 따른 재조합벡터의 경우, 상기 PRC1-luc 또는 RRM2-luc 재조합벡터에 ERE가 2개 추가로 함유되어 있는 재조합벡터를 제작하기 위하여, ERE를 합성하고 결합하여 PRC1-luc 또는 RRM2-luc 재조합벡터에 연결하여 PRC1-ERE2-luc 또는 dRRM2-ERE2-luc 재조합벡터를 제작하였다.
또한, PRC1-luc 또는 RRM2-luc 재조합벡터에 ERE가 4개 추가로 함유되어 있는 재조합벡터를 제작하기 위하여, ERE를 합성하고 결합하여 PRC1-ERE2-luc 또는 dRRM2-ERE2-luc 재조합벡터에 연결하여 PRC1-ERE4-luc 또는 dRRM2-ERE4-luc 재조합벡터를 제작하였다.
상기 PRC1-ERE2-luc, RRM2-ERE2-luc, PRC1-ERE4-luc 및 RRM2-ERE4-luc 재조합벡터로 형질전환된 세포주의 경우, PRC1-ERE2-luc에서 루시퍼레이즈의 활성이 증가되었다.
또한, 상기 PRC1 및 RRM2 유전자의 프로모터의 전사 활성이 바이러스성 벡터에서도 유지되었다.
본 발명에 따른 암세포 특이적 발현벡터로 형질전환된 세포주의 루시퍼레이즈 활성이 증가되었다는 것은 PRC1 및 RRNM2 유전자의 프로모터가 pGL3-Basic 플라스미드뿐만 아니라, 다른 플라스미드나 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 외에 리트로바이러스, 랜티바이러스, 아데노바이러스성 벡터에서도 유사한 기능을 할 수 있고, 이질적인 다른 치료용 유전자의 고발현을 가능하게 한다는 것을 의미한다. 결론적으로, PRC1 및 RRNM2 유전자의 프로모터는 암 치료용 유전자의 고발현을 위한 벡터에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 Sambrook, et . al ., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann, et . al ., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 유방암세포에서 PRC1 및 RRM2 의 발현
사이토키네시스 1의 단백질 조절자(protein regulator of cytokinesis 1, PRC1) 유전자 및 리보뉴클레오타이드 환원효소 서브유닛 2(ribonucleotide reductase subunit 2, RRM2) 유전자가 암세포에서 특이적으로 고발현 되는지를 조사하기 위하여, 상기 두 유전자의 발현 여부를 RNA 및 단백질 단계에서 조사하였다.
정상 유방세포인 MCF10A 세포(ATCC CRL-10317) 및 유방암세포인 MCF7 세포(ATCC HTB-22)의 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 후, PRC1 및 RRM2에 대해 특이적인 올리고머를 이용하여 PCR을 통해 PRC1 및 RRM2의 mRNA 양을 조사하였다 (도 1의 A).
또한, PRC1 및 RRM2에 대한 항체를 사용하여 정상 유방세포인 MCF10A, 유방암세포인 MCF7 및 T47D(ATCC HTB-133)에서 PRC1 및 RRM2의 발현 정도를 조사하였다 (도 1의 B). 상기 MCF10A, MCF7 및 T47D 세포 용해물(cell lysate)을 전기영동한 후, 웨스턴 블로팅(western blotting)을 통해 PRC1 항체(Biolegend Co.) 및 RRM2 항체(Abnova Co.)에 반응하는 밴드를 확인하였다. 그 결과, PRC1 유전자 및 RRM2 유전자가 유방암세포에서 정상세포에 비해 고발현된다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2. PRC1 - luc 및 RRM2 - luc 재조합벡터의 제작
human PRC1 유전자의 프로모터(GenBank AC068831, 서열번호 1) 및 humam RRM2 유전자의 프로모터(GenBank AF149206, 서열번호 2)를 클로닝하기 위하여, human PRC1 유전자의 프로모터의 경우 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를, humam RRM2 유전자의 프로모터의 경우 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머를 사용하여 PCR 법에 의해 각각 증폭하였다. 사용된 DNA 절편은 PRC1 및 RRM2의 첫 번째 아미노산인 메티오닌을 코딩하는 염기서열인 ATG가 3' 끝이 되고, 클로닝을 위해 NcoI 사이트(CCATGG)에 ATG가 포함되도록 고안하였다. 다만, humam RRM2 유전자의 프로모터(GenBank AF149206)의 서열이 역방향이므로 그에 대해 상보적인 염기 서열을 사용하였다.
서열번호 3: 5'-AAAACTGCAGTGAATGTTTGGCATGCTGCTGAC
서열번호 4: 5'-CATGCCATGGCGGACGCTCCAAGCAG
서열번호 5: 5'-AAACTGCAGAATGGCAGAGGCGGGGTC
서열번호 6: 5'-CATGCCATGGTGGAGGCGCAGCGAAGCAG
먼저 클로닝의 편의를 위하여 pGL3-Basic 벡터에서 SalI 부위를 제거하기 위하여, 제한효소 SalI으로 처리하고, 클레나우 프래그먼트로 끝 부분을 채워서 리가아제를 사용하여 상기 DNA 절편을 연결한 다음, 반응 유전체를 대장균에 도입하였다. 상기 방법으로 제작된 재조합벡터를 제한효소 KpnI 및 HindIII로 자른 후, 서 열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머를 사용하여 합성된 DNA를 결합(annealing)하여 만든 DNA를 리가아제를 사용하여 삽입하였다.
서열번호 7: 5'-CTCGAGGATCCGTCGACAGATCTACGCGTGGGCCCTGCAGAATTCA
서열번호 8: 5'-AGCTTGAATTCTGCAGGGCCCACGCGTAGATCTGTCGACGGATCCTCGAGGTAC
그 결과, 상기 pGL3-Basic 벡터의 제한효소 부위 중 SacI, MluI, NheI, SmaI, XhoI 및 BglII가 있는 부분이 XhoI, BamHI, SalI, BglII, MluI, ApaI, PstI 및 EcoRI이 있는 DNA로 대체되었다. 상기 방법으로 제작된 재조합벡터를 pGL3-mBasic으로 명명하였다.
상기 pGL3-mBasic 벡터에 PRC1 및 RRM2 유전자의 프로모터 절편을 삽입하기 위하여, PRC1 및 RRM2 유전자의 프로모터를 PCR을 이용하여 증폭하였다. PRC1의 경우, 인간 정상 폐세포인 WI38(ATCC CCL-75)의 genomic DNA를 주형으로 하고, 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머와 taq 폴리머라제를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 초기 변성(94℃에서 5분), 변성(denaturation, 94℃에서 30초), 결합(annealing, 65℃에서 30초), 연장(elongation, 72℃에서 1분) 단계를 총 35 회 수행한 후, 72℃에서 5분간 수행하였다.
RRM2의 경우, 인간 정상 폐세포인 WI38의 genomic DNA를 주형으로 하고, 서열번호 6 및 서열번호 7의 프라이머와 taq 폴리머라제를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 초기 변성(94℃에서 5분), 변성(denaturation, 94℃에서 30초), 결합(annealing, 58℃에서 30초), 연장(elongation, 72℃에서 1분) 단계를 총 40 회 수행한 후, 72℃에서 5분간 수행하였다.
상기에서 증폭된 DNA를 각각 제한효소 PstI 및 NcoI으로 처리하고, 상기와 동일한 제한효소 PstI 및 NcoI으로 절단한 pGL3-mBasic 재조합벡터에 리가아제를 사용하여 연결하였다. 상기와 같은 방법으로 제작된 재조합벡터를 각각 PRC1-luc 및 RRM2-luc로 명명하였다.
PRC1 및 RRM2 유전자의 프로모터의 활성을 비교하기 위하여, 암 특이적인 고발현을 유도한다고 알려져 있는 survivin/BIRC5(Yang et al., Gene Therapy, 11:1215, 2004)의 프로모터(GenBank U75285의 852~2813, 3' 끝은 BIRC5의 첫 아미노산을 코딩하는 ATG)를 상기와 같은 방법으로 클로닝하여 얻은 재조합벡터를 BIRC5-luc로 명명하였다.
실시예 3. PRC1-luc 및 RRM2-luc 재조합벡터의 루시퍼레이즈 활성 측정
PRC1 및 RRM2 유전자의 프로모터가 암세포에서 활성을 보이는지를 확인하기 위하여, 상기에서 제작한 PRC1-luc 및 RRM2-luc 재조합벡터를 폐와 유방의 정상세포 및 암세포에 도입하여 루시퍼레이즈(luciferase)의 활성을 측정하였다.
각 세포를 24 웰 플레이트에 지정된 개수(MCF10A(정상 유방세포): 1.5×10-5개 세포/well; MCF7(유방암세포): 2×10-5개 세포/well, 1×10-5개 세포/well; MRC5(정상 폐세포, ATCC CCL-171): 6×10-4개 세포/well; A549(폐암세포, ATCC CCL-185): 1×10-5개 세포/well, 단, MCF7세포는 48 웰 플레이트를 사용함)로 도말한 후, 상기에서 제작한 PRC1-luc, RRM2-luc, BIRC1-luc 및 pGL3-mBasic 재조합벡터 중 하나(350 ng DNA/well)와, 형질전환율을 계산하기 위한 normalization용 벡터인 pRL-CMV(100 ng DNA/well, Promega) 또는 pRL-TK(50 ng DNA/well, Promega) 벡터 중 하나를 리포펙타민(Lipofectamine, Invitrogen) 2000을 이용하여 각 폐와 유방의 정상세포 및 암세포에 도입하였다. 상기 세포를 2일간 배양한 후, Dual-luciferase assay kit(Promega)로 루시퍼레이즈의 활성을 측정하였다 (도 2).
그 결과, MCF7(유방암세포)와 A549(폐암세포)에서 모두 PRC1-luc 및 RRM2-luc 재조합벡터가 음성대조군인 pGL3-Basic에 비해서 10 배 정도, 양성대조군인 BIRC5-luc에 비해서는 50% 정도의 루시퍼레이즈의 발현을 활성화시켰다.
실시예 4. PRC1 - ERE2 - luc , RRM2 - ERE2 - luc , PRC1 - ERE4 - luc 및 RRM2 - ERE4 - luc 재조합벡터의 제작
유방암에서 발현되는 에스트로겐 수용체 전사인자가 체내의 에스트로겐과 결합하여 대상유전자의 발현을 활성화시켜 유방암이 증식하도록 하는 특성을 유전자 발현에 이용하기 위하여, 에스트로겐 수용체가 결합하는 염기서열인 에스트로겐 반응 요소(estrogene response element, ERE, 서열번호 9)를 2개 또는 4개씩 합성하여 상기 실시예 2에서 제작한 PRC1-luc 및 RRM2-luc 재조합벡터에 삽입하였다.
ERE가 2개 있는 플라스미드를 만들기 위하여, 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머를 이용하여 ERE를 합성한 후, 상기 DNA를 결합(annealing)하여 제한효소 BamHI 및 BglII를 처리한 PRC1-Luc 및 RRM2-Luc 벡터에 리가아제를 이용하여 연결 하였다 (도 3의 A). 상기 방법으로 제작된 재조합벡터를 PRC1-ERE2-luc 및 RRM2-ERE2-luc이라고 명명하였다.
서열번호 10: 5'-GATCCAGGTCACAGTGACCTGAGATCCAGGTCACAGTGACCTAGATCTA
서열번호 11: 5'-GATCTAGATCTAGGTCACTGTGACCTGGATCTCAGGTCACTGTGACCTG
ERE가 4개 있는 플라스미드를 만들기 위하여, 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머를 이용하여 ERE를 합성한 후, 상기 DNA를 결합(annealing)하여 제한효소 BamHI 및 BglII를 처리한 PRC1-ERE2-luc 및 RRM2-ERE2-luc 재조합벡터에 리가아제를 이용하여 연결하였다 (도 3의 B). 상기 방법으로 제작된 재조합벡터를 PRC1-ERE4-luc 및 RRM2-ERE4-luc이라고 명명하였다.
다만, RRM2 유전자의 프로모터의 경우 상기 클로닝 과정 중에 제거되는 RRM2 유전자의 프로모터의 BamHI DNA 절편을 분리하여, BamHI으로 처리한 dRRM2-ERE2-luc 및 dRRM2-ERE4-luc 재조합벡터에 다시 삽입하여 RRM2-ERE2-luc 및 RRM2-ERE4-luc 재조합벡터를 제작하였다.
실시예 5. PRC1 - ERE2 - luc , RRM2 - ERE2 - luc , PRC1 - ERE4 - luc 및 RRM2 - ERE4 - luc 재조합벡터의 루시퍼레이즈 활성 및 GFP 의 발현 여부 측정
상기 실시예 4에서 제작된 재조합벡터(PRC1-ERE2-luc, RRM2-ERE2-luc, PRC1-ERE4-luc 및 RRM2-ERE4-luc)를 에스트로겐 수용체가 있는 유방암세포(MCF7)에 실시예 3의 방법으로 각각 도입하여 루시퍼레이즈의 활성을 비교·조사하였다 (도 4). 양성대조군으로는 BIRC5-luc 재조합벡터 및 SV40 프로모터에 루시퍼레이즈를 연결 한 플라스미드인 pGL3-프로모터(Promega, USA)를 사용하였다.
그 결과, PRC1-ERE2-luc의 경우에는 루시퍼레이즈 활성이 양성대조군인 pGL3-프로모터보다 약간 높았다. 그러나, PRC1-ERE4-luc, RRM2-ERE2-luc 및 RRM2-ERE4-luc의 경우에는 ERE 서열 삽입으로 인하여 루시퍼레이즈 활성이 증가되는 효과를 나타내지 않았다.
실시예 6. PRC1-luc 및 RRM2-luc 재조합 바이러스벡터의 GFP 발현 활성 측정
PRC1 및 RRM2 유전자의 프로모터의 전사 활성이 바이러스성 벡터에서도 유지되는지 조사하기 위하여, 상기 두 프로모터를 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV, Stratagene Co., USA) 벡터에 삽입하였다. 이때, 대상 유전자로 루시퍼레이즈를 대신하여 녹색형광단백질인 GFP(green fluorescence protein)를 사용하였다.
즉, 암 특이적 발현을 하는 프로모터에 대한 양성 대조군으로 사이토메가로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 프로모터를 GFP에 연결한 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터(AAV-CMV-GFP)를 제작한 후, 상기 AAV-CMV-GFP 벡터를 이용하여 PRC1 및 RRM2 유전자의 프로모터 등 암 특이적 프로모터가 삽입된 AAV 벡터(AAV-PRC1-GFP 및 AAV-RRM2-GFP)를 제작하였다.
AAV의 재조합을 위한 pAAV-CMV-GFP 플라스미드 DNA를 하기의 방법으로 서브클로닝하였다. 즉, AAV 혈청형 2(AAV2) 바이러스 게놈 유래의 역위 말단 반복서열(inverted terminal repeat, ITR), CMV 프로모터, SV40 초기 mRNA 폴리아데닐레 이션 시그날 서열(SV40 early mRNA polyadenylation signal sequence)을 포함한 pAAV-FIX cis 플라스미드(미국 등록특허 제6,093,292호)를 제한효소 KpnI 및 NotI으로 처리하고, pEGFP-N1 플라스미드 DNA(Clontech. Co)를 상기와 동일한 제한효소 KpnI 및 NotI으로 처리하여 선형 벡터 및 삽입할 GFP 단편을 준비하였다. 상기 선형 벡터와 삽입 단편을 리가아제를 처리하여 연결함으로써 pAAV-CMV-GFP 플라스미드 DNA를 얻었다.
상기 pAAV-CMV-GFP 벡터의 CMV 프로모터 대신, 암 특이적 발현 프로모터인 PRC1 또는 RRM2 유전자의 프로모터로 대체하여 pAAV-PRC1-GFP 및 pAAV-RRM2-GFP 플라스미드 DNA를 하기의 방법으로 서브클로닝하였다. 즉, 상기 pAAV-CMV-GFP를 제한효소 SalI 및 NcoI으로 처리하고, 상기 실시예 2에서 제작한 PRC1-luc 또는 RRM2-luc 재조합벡터를 상기와 동일한 제한효소 SalI 및 NcoI으로 처리하여 삽입할 암 특이적 프로모터 단편을 준비한 후, 선형 벡터와 삽입할 PRC1 유전자 또는 RRM2 유전자 단편을 리가아제를 처리하여 연결함으로써 pAAV-PRC1-GFP 또는 pAAV-RRM2-GFP 플라스미드 DNA를 얻었다.
재조합 AAV 벡터(rAAV-CMV-GFP, rAAV-PRC1-GFP 및 rAAV-RRM2-GFP)를 생산하기 위하여, 상기에서 제작한 pAAV 플라스미드 DNA(pAAV-CMV-GFP 플라스미드 DNA, pAAV-PRC1-GFP 플라스미드 DNA 및 pAAV-RRM2-GFP 플라스미드 DNA), AAV 레플리케이션 부분, 캡시드를 발현시키는 AAV rep - cap 플라스미드 DNA(Stratagene Co., USA), 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드(Stratagene Co., USA)를 동시에 HEK293(human embryonic kidney 293; ATCC CRL-1573) 세포에 모두 형질전환시켜, 96시간 배양한 후, 세포를 모아서 초음파 파쇄하고, 재조합 AAV 파티클을 2번 CsCl 밀도 구배로 원심분리하여, RI(Refractive Index)가 1.37~1.41g/㎖인 부분을 모아 분리·정제하였다.
상기 정제된 재조합 AAV 벡터를 Real-time PCR 정량법을 이용하여 정량하였다. 상기 pAAV-CMV-GFP 플라스미드 DNA를 103~109 분자 수가 되도록 연속적으로 희석하여 표준곡선용 DNA를 준비하고, 정량하고자 하는 순수하게 분리된 rAAV 벡터(rAAV-CMV-GFP, rAAV-PRC1-GFP 및 rAAV-RRM2-GFP)를 희석배수 100~10-4로 연속적으로 희석하였다. 상기 희석된 표준곡선용 DNA 및 희석된 rAAV-GFP 벡터를 사용하여 각각 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머를 이용하여 real-time PCR을 수행하고, 표준곡선용 DNA 결과를 이용하여 표준곡선을 만든 후, rAAV-GFP 벡터의 입자 적정용 PCR 결과를 표준곡선에 적용하여 titer값을 얻었다.
서열번호 12: 5'-GGCCGACAAGCAGAAGAAC
서열번호 13: 5'-CGCGCTTCTCGTTGGGGTCTT
상기와 같은 방법으로 제작된 재조합 AAV 벡터를 자궁경부암세포인 HeLa 세포((ATCC CCL-2, 도 5의 A)와 유방암세포인 MCF7(도 5의 B)에 MOI 20K 비율로 감염시켜, PRC1 및 RRM2 유전자의 프로모터에 의한 발현 정도를 형광현미경 및 유세포측정기로 측정하였다. 이때, CMV40 프로모터를 GFP 형광단백질 유전자에 연결한 아데노-연관 바이러스(CMV)를 양성대조군으로, 바이러스를 처리하지 않은 군(control)과 프로모터를 제거한 아데노-연관 바이러스(promoter(-))를 음성대조 군으로 사용하였다.
그 결과, AAV-PRC1-GFP 및 AAV-RRM2-GFP 재조합벡터 모두 음성대조군에 비하여 GFP를 잘 발현시켰으며, 강력한 양성대조군인 AAV-CMV-GFP의 10~50% 정도로 발현되었다. 표 1은 각 형질전환체의 GFP 발현 정도를 유세포분리기로 측정하여 정리한 것이다.
각 형질전환체의 GFP 발현 정도
control promoter(-) BIRC5 PRC1 RRM2 CMV
HeLa 0.4 1.93 64.99 40.11 21.38 80.07
MCF7 0.72 1.44 27.1 5.78 11.47 68.02
이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 암 세포 특이적 과발현 프로모터를 함유하는 재조합벡터를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 재조합벡터는 암세포, 특히 유방암세포 또는 자궁암세포에서 높은 전사 활성을 나타내므로 암 치료용 유전자의 발현을 증가시켜 암을 치료하는데 효과적으로 사용할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정 의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는, 사이토키네시스 1의 단백질 조절자(protein regulator of cytokinesis 1, PRC1) 유전자의 프로모터 및 암 치료용 유전자를 함유하는 암세포 특이적 발현벡터.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 에스트로겐 반응 요소(estrogene response element, ERE)를 추가로 함유하는 암세포 특이적 발현벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 암 치료용 유전자는 BCL-2(B-cell leukemia/lymphoma 2) 계통 세포사멸 촉진(pro-apoptotic) 유전자 또는 자살 수용체/리간드(death receptor/ligand) 유전자인 것을 특징으로 하는 암세포 특이적 발현벡터.
  4. 제3항에 있어서, 상기 BCL-2(B-cell leukemia/lymphoma 2) 계통 세포사멸 촉진(pro-apoptotic) 유전자는 Bax(BCL2-associated X) 또는 Bad(BCL2-antagonist of cell death)인 것을 특징으로 하는 암세포 특이적 발현벡터.
  5. 제3항에 있어서, 상기 자살 수용체/리간드(death receptor/ligand) 유전자는 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor-α, TNF-α) 또는 Fas 리간드(Fas ligand, FasL)인 것을 특징으로 하는 암세포 특이적 발현벡터.
  6. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는, 사이토키네시스 1의 단백질 조절자(protein regulator of cytokinesis 1, PRC1) 유전자의 프로모터 및 암 치료용 유전자가 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 암세포 특이적 발현벡터.
  7. 삭제
  8. 서열번호 2의 염기서열로 표시되는, 리보뉴클레오타이드 환원효소 서브유닛 2(ribonucleotide reductase subunit 2, RRM2) 유전자의 프로모터 및 암 치료용 유전자를 함유하는 암세포 특이적 발현벡터.
  9. 제8항에 있어서, 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 에스트로겐 반응 요소(estrogene response element, ERE)를 추가로 함유하는 암세포 특이적 발현벡터.
  10. 제8항에 있어서, 상기 암 치료용 유전자는 BCL-2(B-cell leukemia/lymphoma 2) 계통 세포사멸 촉진(pro-apoptotic) 유전자 또는 자살 수용체/리간드(death receptor/ligand) 유전자인 것을 특징으로 하는 암세포 특이적 발현벡터.
  11. 제10항에 있어서, 상기 BCL-2(B-cell leukemia/lymphoma 2) 계통 세포사멸 촉진(pro-apoptotic) 유전자는 Bax(BCL2-associated X) 또는 Bad(BCL2-antagonist of cell death)인 것을 특징으로 하는 암세포 특이적 발현벡터.
  12. 제10항에 있어서, 상기 자살 수용체/리간드(death receptor/ligand) 유전자는 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor-α, TNF-α) 또는 Fas 리간드(Fas ligand, FasL)인 것을 특징으로 하는 암세포 특이적 발현벡터.
  13. 서열번호 2의 염기서열로 표시되는, 리보뉴클레오타이드 환원효소 서브유닛 2(ribonucleotide reductase subunit 2, RRM2) 유전자의 프로모터 및 암 치료용 유전자가 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 암세포 특이적 발현벡터.
  14. 삭제
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