KR100771171B1

KR100771171B1 - 모낭 줄기세포의 분리, 증식 및 분화 방법 및 대머리치료용 조성물

Info

Publication number: KR100771171B1
Application number: KR1020060062807A
Authority: KR
Inventors: 강경선; 이성훈; 손용진; 정미경
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단; (주)모디셀
Priority date: 2006-07-05
Filing date: 2006-07-05
Publication date: 2007-10-29
Anticipated expiration: 2026-07-05
Also published as: DE112007000030T5; DE112007000030B4; JP5508715B2; JP2009509526A; WO2008004819A1; US20080286243A1

Abstract

본 발명은 모낭 줄기세포를 분리, 증식하여, 모낭 세포로 분화시키는 방법 및 대머리 치료용 조성물에 관한 것으로, 모낭을 포함하는 두피조직을 잘게 절개한 다음 절개된 조직을 디엔에이즈 효소가 포함된 단백질 분해효소 복합체와 디스페이즈가 함유된 배지에서 1차 화학적 분해를 행하는 단계; 콜라게나아제가 함유된 배지에서 2차 화학적 분해를 행하는 단계; 화학적 분해된 조직을 회수하여 두피세포를 혈청 1-30%가 포함된 배지에서 배양한 다음, 세포부착후 무혈청 배지에 배양하는 단계; 배양증식된 두피세포를 회수한 다음 이로부터 CD34양성(+) 세포를 분리하여 모낭 줄기세포를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 모낭 줄기세포를 두피조직에 피하주사로 투여하여 모낭 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 모낭 줄기세포의 분리·증식 및 모낭 세포로의 분화 방법 및 이로부터 분리된 모낭 줄기세포를 유효성분으로 하는 대머리 치료용 조성물이 제공된다.

본 발명에 따라 얻어진 모낭 줄기세포는 성체의 모낭세포로 분화하는 능력을 가지며 머리털을 자라게 하는 능력을 가져 탈모의 새로운 세포 치료제로써 매우 유용하다.

모낭 줄기세포, 모낭 세포, 분화, 대머리, 탈모, 두피

Description

모낭 줄기세포의 분리, 증식 및 분화 방법 및 대머리 치료용 조성물{Method for isolation, expansion and differentiation of a hair follicle stem cell, and a composition for hair reproduction}

도 1은 모낭을 포함하는 두피를 적출한 후 세포배양용디쉬에 처음 붙기 시작한 세포의 형태를 나타내는 사진이다. 두 사진은 같은 플라스크의 다른 부분을 찍은 사진이다(×100).

도 2는 상기 디쉬에 처음 붙기 시작한 세포의 첫번째 계대후 세포 형태를 나타내는 사진이다. 두 사진은 같은 플라스크의 다른 부분을 찍은 사진이다(×100).

도 3은 모낭을 포함하는 두피를 적출한 후 처음에 디쉬에 붙지 않다가 옮겨준후 디쉬에 붙은 세포의 형태를 나타내는 사진이다. 두 사진은 같은 플라스크의 다른 부분을 찍은 사진이다(×100).

도 4는 초기배양 3일 후 세포들을 수거하여 계대배양 한 지 1~8일 동안 매일 세포수를 계산 후 각 날짜별로 평균과 표준편차값을 구하여 모낭 세포의 성장곡선을 나타내는 것이다.

도 5는 MACS(Magnetic Cell Sorting)를 이용한 CD34+ 세포 분리 방법을 도식적으로 나타낸 것이다.

도 6은 CD34+ 세포 분리에 사용된 MACS 기기를 나타낸다.

도 7은 모낭줄기세포의 면역학적 특성으로 FACS(fluorescence activated cell sorting)의 기법을 이용한 결과이다.

도 8은 모낭 줄기세포의 비투여 대조군(A)과 투여군(B)의 마우스 사진이다.

도 9는 모낭 줄기세포의 비투여 대조군(A)과 투여군(B)의 마우스의 두피 조직의 HE 염색 결과사진이다.

도 10은 모낭 줄기세포 투여군(A,B)와 비투여 대조군(C,D)의 사람 특이 프로브를 이용한 원위치 하이브리드화(in situ hybridization) 결과를 보여준다.

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23. 미국 특허 공보 제 6,399,057호(2002.6.4)

본 발명은 모낭 줄기세포를 분리하여 고 순도로 배양하는 방법 및 대머리 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 두피 조직으로부터 두피 세포를 배양하고 그 세포로부터 모낭 줄기세포를 분리하고 시험관내에서 고순도로 모낭줄기세포를 증식배양하고, 이를 모낭 세포로 분화시키는 방법 및 그 모낭 줄기세포를 이용한 대머리 치료용 조성물에 관한 것이다.

최근 미용에 관한 관심이 높아지면서 탈모증의 치료에 대한 관심 또한 높아지고 있다. 탈모증이란 정상적으로 모발이 있어야 할 곳에 모발이 없는 상태를 말한다. 모발은 생명에 직접 관계되는 중요한 생리적 기능은 없지만 미용적인 관점에서 역할이 매우 크며 이외에도 자외선 차단, 머리 보호 등의 기능이 있다. 탈모가 심한 경우 사회생활을 하는데 문제가 있을 수 있으며 심리적으로도 심각한 영향을 미칠 수 있어서 삶의 질 측면에서 중요하다(1,2).

탈모는 임상적으로 상처가 동반되는 반흔성 탈모와 모발만 빠지는 비반흔성 탈모로 나뉠 수 있다. 반흔성 탈모의 경우 모낭이 파괴되므로 모발이 다시 나지 않는다. 모발은 모낭이라고 하는 곳에서 만들어지며 각 모낭은 주기적으로 활동과 정지의 단계를 거치게 된다(2). 이러한 모발 주기의 시간적 간격은 신체 부위에 따라 다양한 데 머리털의 경우에는 2∼6년 정도의 성장기(생장기)와 2∼4주간의 퇴행기를 거쳐서 3∼4개월 정도의 휴식기(휴지기)에 들어가게 된다. 각 모낭은 일생 동안 10∼20회의 모낭 성장 주기(hair follicle growth cycle)를 갖게 된다(3).

정상인의 경우 머리털의 수는 약 10만개 정도이며, 하루에 자라는 길이는 평균 0.37mm 정도 된다(한 달에 약 1cm 정도 성장). 보통의 경우 머리털의 85∼90%는 성장기에 있고 나이를 먹음에 따라 성장기 모낭의 수가 감소한다. 따라서 10∼15%의 모낭이 퇴행기나 휴지기에 있으며, 하루 평균 50∼60여 개 정도의 머리털이 정상적으로 빠지며 하루 100개 이상 빠지면 탈모증을 의심해야 한다.

탈모의 원인에는 첫 번째로 남성호르몬의 일종인 DHT (다이하이드로테스토스테론)이 모낭에 영향을 주어 단백질 합성 저하와 모낭에 직접 손상을 주어 탈모가 발생한다는 설과 남성호르몬(Testosterone)이 세포내에 있는 수용체인 5α-리덕타아제(환원효소)와 결합하여 활동하는데 그 산물인 DHT (다이하이드로테스토스테론)이 DNA전사 과정에서 모낭에 영향, 즉 단백질 합성저해, 모낭의 손상등으로 탈모가 발생한다는 남성호르몬 영향설이 있다. 두 번째로는 탈모 유전자를 받아 남성호르몬의 영향에 의해 발생한다는 것과 탈모증 자체는 유전이 아니고, 탈모가 되기쉬운 체질을 조상으로부터 유전 받는다는 유전적 탈모설이 있으며 세 번째로는 스트레스로 인한 탈모설 네 번째로는 두피는 20세 전후까지 두개골은 30세전후까지 발달하는데, 이로인해 두피가 얇아지고, 혈류장애가 원인이 되어 탈모가 된다는 두개골 발달로 인한 탈모설, 마지막으로 노화에 의해 탈모가 발생한다는 설등 여러 가지 원인이 있는 것으로 보고되고 있다(4).

탈모의 치료법으로 여러 가지 방법들이 소개되어 있으나 현재 가장 많이 쓰이고 있는 수술 방법은 자기 자신의 머리털을 이용하여 이식하는 자가모발이식(자기모발이식)이다. 이는 1930년대에 최초로 등장하여 1950년대 미국에 소개된 이후로 꾸준한 발전을 거듭하였다. 또한 과거 15년 사이에 북미와 특히 불란서를 중심으로 한 유럽에서 대머리 치료를 위한 다양한 모발이식, 두피 피판술 및 탈모부의 두피 축소술 등이 널리 시행되고 있다 (5).

그리고 약물치료로는 현재 먹는 약 프로페시아와 바르는 약 미녹시딜 두 가지만 미국 식품안전청(FDA)에서 인정받았다. 탈모 예방 및 치료 효과는 미녹시딜의 경우 20-30%정도에서, 프로페시아의 경우 60-70% 정도 에서 효과를 나타낸다고 보고되어 있다. 프로페시아는 1997년 하반기에 남성형 탈모 치료용으로 승인을 받았 다. 이 프로페시아는 피나스테라이드라는 물질이 1mg이 함유되어 있으며 이는 제 2형 5α-리덕타아제(환원효소)를 억제하는 물질이다. 이 효소는 테스토스테론(남성호르몬)과 만나면 탈모를 유발하는 DHT (다이하이드로테스토스테론)으로 변한다. 따라서 이 효소를 억제하면 탈모 인자인 DHT호르몬으로 인한 것을 억제할 수 있다. 임상사진평가에서 복용한 남성의 66%가 모발의 뚜렷한 재성장이 일어난 것으로 확인되었다. 하지만 이러한 치료효과는 투여할 당시에는 그 약효가 유효하지만 약의 복용이 중단되면 몇 달 후 약을 먹기 이전의 상태처럼 탈모가 다시 진행된다 (6,7). 그리고 미녹시딜은 1997년 하반기에 남성형 탈모 치료용으로 최초 승인을 받은 바르는 약물이다. 남녀 모두에서 사용이 가능한 탈모 치료제로써 처음에는 고혈압 환자의 치료제로 사용되었지만 그 부작용으로 머리가 나는 것이 밝혀져 탈모 치료제로 사용되었다. 사용 후 2-3개월 이후부터 효과가 나타나며 초기에는 머리카락이 더 빠지는 경우도 있지만 시간이 지나면서 개선된다(6,8). 하지만 이러한 약물치료는 성기능 장애등 많은 부작용이 있는 것으로 보고되고 있다(8).

최근에 기대되고 있는 치료방법으로 유전자를 이용한 치료방법을 들 수 있다. 1998년 1월 미국 콜롬비아대학의 안젤라 크리스티아노 (Angela Christiano) 박사는 전신적으로 탈모가 일어나는 질환에 관여하는 유전인자를 발견하여 발표함(9)으로써 탈모의 유전자 치료의 새로운 장을 열었다. 이러한 유전자 구조를 이용하여 모낭에 직접 원하는 DNA코드를 전달하는 방법이나 유전자 발현을 차단하는 치료법이 개발되고 있다. 그러나 이러한 치료의 효능성, 치료비용, 안정성, 후대에 미칠 영향 등에 대해 아직 밝혀지지 않은 점이 너무 많고 그러므로 탈모에 관여하는 유 전인자를 밝혀낸다고 하더라도, 그걸 이용한 치료방법이 안전하게 현실화되기까지는 상당한 기간이 걸릴 것 같다.

한편, 성장기에 있는 모발의 구근 특성이 모발에 붙어있는채로 적출한 다음, 그 모낭세포를 배양하고 이를 다시 적출한 부위에 이식하는 모발 재생방법이 개시된 바 있으나(23), 그 효과는 그다지 효율적이지 않은 것으로 간주된다.

마지막으로 줄기세포를 이용한 탈모 치료방법이 개발되고 있는데, 줄기세포는 크게 네가지의 방법으로 얻을 수 있다. 그 첫째는 배아의 발생과정중 배반포기에 내부세포괴를 추출하여 카우는 방법, 둘째는 태아의 생식세포를 이용하는 방법이고, 세 번째는 돌리와 같이 체세포의 핵을 핵을 제거한 난자에 집어넣어 배반포기를 만들어 내부세포괴를 얻는 방법으로, 이들 방법은 초기의 배나 태아 및 난자를 이용하는 방법이다. 네 번째 방법으로는 성인의 몸에서 줄기세포를 얻는 방법이다. 즉, 고전적인 방법인 골수세포를 추출하는 것과 같이 뇌를 포함한 자기재생능력이 있는 성인 장기의 일부조직으로부터 줄기세포를 추출하는 방법이고, 이러한 성체줄기세포에는 제대혈 까지도 성체줄기세포로 규정지을 수 있다. 즉 성체줄기세포는 “성체로부터 얻어질 수 있는 자기재생가능(self-renewal)하고 자기유지기능(self-maintenance) 및 다분화능을 보이는 성체의 모든 장기로부터의 세포”로 정의된다. 지금까지 넓은 범위의 임상에서 성체줄기세포의 성격과 조작이 응용되어지고 있다. 예를 들면 안구안쪽에 각막 상피 줄기세포의 동정은 각막이식의 새로운 기술의 발전을 낳았고(10,11) 조혈모세포의 특징으로 자가조직의 부분적인 줄기세포 이식과 유전자 치료의 결과를 가져왔다(12). 탈모나 화상과 같은 다른 피부 질 병도 이와 마찬가지로 모낭 줄기세포의 동정과 유전자 분석과 같은 방법으로 치료의 발전을 기대할 수 있다. 표피에서의 줄기세포 개념은 30년 전부터 이미 논의되어 왔다(13). 최근 세포 배양 연구를 기초로 한 시험관내 연구(14,15)들과 마우스에서의 생체내 연구의 결과들은 표피층의 소낭안 특정부위(at specific locations in the interfollicular epidermis)와 모낭의 외부 모근초의 윗부분(in the upper regions of the outer root sheath of the hair follicle), 즉 돌출부분(bulge region)이라고 불리는 곳과, 성장기 모낭의 배아기질에 포함된 유사 줄기세포들과 함께 피부 줄기세포의 다소 더 복잡한 분포와 유기적 구조를 제안해 왔다 (16,17,18,19,20,21).

이 분할된 세 부분 피부 줄기세포들 사이의 상호연관성에 대해서는 모낭 돌출부분(bulge region)이 궁극적인 줄기세포의 가장 핵심적인 부분이라고 생각되어지고 있다. 또한 이 모낭 돌출부분(bulge region)에서의 모낭 줄기세포는 줄기세포는 쥐에서는 CD34 세포표면 단백질을 발현 하는 것으로 일관되게 보고되고 있다(22). 그러나, 사람에서의 모낭돌출부분의 세포는 CD34를 발현하지 않는다고 보고되고 있다. 그러나 이러한 CD34음성세포가 모낭내에서 머리털을 자라게 하는지에 대하여는 아직 확인되지 않고 있다. 또한 이러한 모낭 줄기세포의 명확한 배양법이 확립되지 않았고, 줄기세포의 그 표식인자가 불분명하였다. 또한, 일부 모낭내에 모낭 줄기세포가 존재한다는 것이 알려져 있을 지라도, 실제 사람의 대머리 치료를 위해 많은 양의 줄기세포가 필요하였으나, 아직까지 분리된 줄기세포를 임상에 적용할 수 있을 정도의 양으로 증식 시키는 기술이 미미하였다. 줄기세포의 표지 단 백질도 아직까지 정확하게 확립되지 않아 줄기세포를 이용한 탈모치료방법은 여전히 미흡한 상태이다.

이에 본 발명은 두피조직에서의 모낭 세포를 배양하고 모낭 줄기세포를 분리한 후, 이를 임상에 적용 가능할 정도로 증식시키는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 얻어진 모낭 줄기세포를 유효성분으로 하는 대머리 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 일견지에 의하면,

모낭을 포함하는 두피조직을 잘게 절개한 다음 절개된 조직을 디엔에이즈 효소가 포함된 단백질 분해효소 복합체와 디스페이즈가 함유된 배지에서 1차 화학적 분해를 행하는 단계; 콜라게나아제가 함유된 배지에서 2차 화학적 분해를 행하는 단계;

화학적 분해된 조직을 회수하여 두피세포를 혈청 1-30%가 포함된 배지에서 배양한 다음, 세포부착후 무혈청 배지에 배양하는 단계;

배양증식된 두피세포를 회수한 다음 이로부터 CD34양성 세포를 분리하여 모낭 줄기세포를 분리하는 단계; 및

상기 분리된 모낭 줄기세포를 두피조직에 피하주사로 투여하여 모낭 세포로 분화시키는 단계

를 포함하는 모낭 줄기세포의 분리·증식 및 모낭 세포로의 분화 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 견지에 의하면,

배양증식된 두피세포를 회수한 다음 이로부터 CD34양성 세포를 분리하여 모낭 줄기세포를 분리하는 단계

에 의해 분리된 모낭 줄기세포를 유효성분으로 하는 대머리 치료용 조성물이 제공된다.

이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명에서 모낭 줄기세포는 인간을 포함하는 모든 포유류의 두피조직으로부터 분리하여 사용될 수 있다. 이때 두피조직은 모낭을 포함하여야 한다.

두피조직으로부터 모낭 줄기세포를 분리하기위하여 우선 두피조직을 잘게 절 개한다. 그 다음, 절개된 조직을 디스페이즈와 아큐맥스가 포함된 배지에서 1차 화학적 분해를 행한다. 이때 상기 배지는 이에 한정하는 것은 아니나, 우태아혈청 1-30%, 노르모신 10-200ug/ml, 페니실린-스트렙토마이신 1-10%가 포함된 DMEM배지에 디스페이즈 0.1-2mg/ml 및 아큐맥스 1-10%가 첨가된 배지가 바람직하다. 여기서 상기 디엔에이즈 효소가 포함된 단백질 분해효소 복합체는 상업적으로 입수가능하며, 이에 한정하는 것은 아니나 아큐맥스(accumax; Chemicon cat# SCR006)가 사용될 수 있다.

그 다음, 콜라게나아제가 함유된 배지에서 2차 화학적 분해를 행한다. 이때 상기 콜라게나아제가 함유된 배지는 우태아혈청, 노르모신, 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에 콜라게나아제 타입ⅠA이 첨가된 것이 바람직하다. 상기 DMEM 배지는 이에 한정하는 것은 아니나, 우태아혈청 1%-30%, 노르모신 10-200ug/ml, 페니실린-스트렙토마이신 1-10% 이 함유된 것이 바람직하며, 상기 콜라게나아제 타입ⅠA는 0.1-10mg/ml로 첨가된 것이 바람직하다. 또한 이때 절개된 조직의 화학적 분해(1차 및 2차)는 50-200m/min, 30-40℃에서 0.5-24시간 동안 중력대류배양기에서 행하는 것이 바람직하다.

그 다음, 화학적 분해된 조직(두피세포)을 회수하여 혈청, 바람직하게는 우태아혈청 1-30%가 포함된 배지에서 배양한다. 이때 사용되는 배지는 M199/F12이 바람직하다. 그 다음, 절개된 조직들이 플라스크에 부착되면 혈청이 없는 배지로 갈 아준다. 일반적으로 3일에서 1개월이 지나면 노르모신이 없는 무혈청배지로 갈아준다.

상기 두피세포 배양시 처음에 사용되는 M199/F12 배지는 이에 한정하는 것은 아니나, M199와 F12를 1:1로 섞은후 인슐린 0.1-1.0ug/ml, 트랜스페린 0.1-1.0ug/ml, 페니실린-스트렙토마이신 1-10%, rEGF 1-100ng/ml, bFGF 1-100ng/ml, 노르모신 10-200ug/ml, 우태아혈청 1-30%, N-아세틸-L-씨스테인 0.1-10mM 을 첨가한 배지가 바람직하며, 세포부착후 사용되는 배지는 상용되고 있는 무혈청 케라티노사이트용 배지에 아스코르빈산 0.1-10mM을 함유한 것이 바람직하다. 여기서 상기 무혈청 케라티노사이트용 배지는 상업적으로 입수가능하며, 이에 한정하는 것은 아니나 디파인드 케라티노사이트 무혈청배지(Gibco cat# 10785-012)가 사용될 수 있다.

배지를 갈아준 이틀정도 후(도 1)에 세포들이 디쉬에 붙기 시작하면 떠있는 조직과 세포들을 보다 큰 사이즈의 플라스크로 옮겨준다. 처음 부착하기 시작한 세포를 트립신 처치 후 계대를 하여 5~15일 정도 지나면 플라스크에 70-90%정도 자라게 된다. 이때부터 세포는 2~3일에 한번씩 인산완충식염수로 2번 헹궈준 후 같은 배지로 갈아준다.

그 다음, 배양된 두피세포를 회수하여 이중에서 CD34양성 세포를 분리하여 모낭 줄기세포를 분리해낸다. 이때 상기 배양된 두피세포로부터 CD34양성 세포를 분리하는 방법은 통상적으로 알려진 MACS(Magnetic Cell sorting)를 이용하여 수행 될 수 있다. MACS 기기는 예를 들어, Miltenyi Biotec Inc. 부터 상업적으로 입수가능하다.

MACS를 이용한 CD34양성 세포를 분리하는 방법을 도식적으로 도 5에 나타내었다.

일단 수거된 두피세포를 먼저 대략적으로 싱글화 해 놓고 MACS 버퍼와 블로킹 리전트, 마이크로비드를 순서대로 넣어준다. 각 시약의 양은 마이크로비드: 150-1000㎕, 블로킹 리전트: 50-500㎕, 마이크로비드: 50-500㎕이고, 배양 시간은 30분-4시간이다. 이때 블로킹 리전트와 마이크로비드를 다루는 모든 과정에서는 형광등을 끄도록 한다. 혼합액이 담긴 튜브는 알루미늄 호일로 싸고, 4℃에서 30분-4시간 배양한다. 그 후에 알루미늄 호일을 벗기고 혼합액의 약 10배 볼륨의 MACS 버퍼를 튜브에 추가하고 피펫으로 잘 섞어준 후 1200rpm, 5-6분간 원심 분리하고, 상층액은 제거한다. MACS 버퍼를 세포의 수에 맞게 넣어주어 피펫으로 펠렛을 녹여준다. 이때의 MACS 버퍼의 양은 500㎕ 이다. MACS 버퍼와 혼합된 세포가 담긴 튜브는 얼음에 넣어두고, MACS 기기를 셋팅(도 5의 (A)) 하고 MACS 컬럼과 자석(도 5의 (B))을 셋팅한다. 셋팅의 대략적인 순서는 다음과 같다. 'CD+'와 'CD-'로 표지된 코니칼튜브를 각각 1개씩 준비한다. 검은색 받침(강철)을 편한 곳에 놓고, 녹색 자석을 적당한 높이에 붙인다. 컬럼이 오염되지 않도록 조심해서 컬럼만 꺼내 자석의 홈에 끼운다.

준비된 튜브 중 'CD34-'로 표지된 튜브를 컬럼에서 떨어지는 세포들을 받을 수 있도록 위치시킨다. 준비가 되었으면 MACS 버퍼 150~1000㎕ 먼저 컬럼에 흘려보낸다. MACS 버퍼가 거의 다 흘러 내려갔을 때 얼음에 꽂아두었던 세포 혼합액 500㎕(세포 2x108 당)를 컬럼에 넣는다. 세포 혼합액은 천천히 컬럼을 따라 흘러 내려질 것이고, 컬럼의 아래쪽으로 떨어지는 세포는 CD34- 세포이다. CD34양성 세포는 MACS 컬럼의 중간의 검은 부분에 걸려있다. 컬럼의 수용능력 만큼의 세포가 담긴 혼합액을 흘려보냈으면 끝으로 MACS 버퍼 500㎕정도를 넣어주어서 컬럼 내에 잔류해있는 CD34- 세포를 마저 흘려 보낸다. MACS 컬럼을 자석에서 꺼내어 컬럼과 함께 들어있었던 스틱을 컬럼의 윗부분에 끼우고 밀어서 'CD34+'로 표지된 튜브에 담는다. 배지를 컬럼에 부어주고 스틱으로 다시 밀어주어 컬럼을 통과하여 나오는 배지를 받아 그 안에 포함된 CD34+ 세포를 획득하게 된다.

본 발명의 방법에 따라 분리되는 모낭 줄기세포의 면역표현형 항원은 CD34 양성을 나타내며, 또한 CD44 양성, CD45 양성, CD133 양성, 중에서 어느 하나 또는 복수의 면역학적 특성을 나타낸다.

이와 같이 분리된 CD34+ 세포인 모낭 줄기세포를 두피조직에 피하주사로 투여하면 모낭 세포로 분화가 일어난다. 더욱이, 이렇게 분화된 모낭 세포는 계속해서 머리털을 자라게 하는 능력을 갖는다. 따라서, 상기 분리된 모낭 줄기세포는 대머리 치료용으로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 방법으로 분리된 모낭 줄기세포를 유효성분으로 하는 대머리 치료용 조성물을 제공한다. 이때 상기 조성물내 포함되는 활성 성분인 상기 모낭 줄기세포의 투여량은 이에 한정하는 것은 아니나, 1×10³이상, 바람직하게 1×10³-1×10⁹, 보다 바람직하게 1×10³-1×10¹²세포의 양으로 한다. 투여방식은 피하주사 방식이 바람직하며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 실제 투여량은 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 대머리 치료용 조성물은 상기 분리된 모낭 줄기세포를 담체, 부형제 및 희석제와 함께 혼합하여 제조될 수 있다. 예를들어, 상기 모낭 줄기세포는 배지 또는 멸균생리식염수와 함께 혼합될 수 있다.

또한, 이때 상기 모낭 줄기세포가 투여되는 두피조직은 본래 적출된 대상자의 두피조직일 수 있으며 또한 다른 대상자의 두피조직일 수 있다. 바람직하게는 본래 적출된 대상자의 두피조직이다. 또한, 상기 두피조직은 포유류의 것이 바람직하다. 본 발명에 사용될 수 있는 포유류는 사람, 쥐, 돼지, 소, 말, 개, 고양이 등을 포함한다. 바람직하게 상기 포유류는 사람이다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

<실시예>

(1) 모낭 줄기세포의 생체로부터 분리

1) 생체로부터 1차 두피세포의 배양

세포치료를 필요로 하는 환자의 뒷머리 두피를 피하조직을 포함하여 잘라낸 후，봉합하였다. 취득한 모낭을 포함한 두피를 10%우태아혈청, 노르모신(100ug/ml), 페니실린 100unit, 스트렙토마이신(0.1mg/ml), 네오마이신 (0.25ug/ml)이 함유된 DMEM배지에 넣었다. 상기 적출된 두피를 멸균된 포셉으로 꺼내어 페트리디쉬위에 올려놓고 블레이드를 스카펠에 끼워 두피조직을 잘게 잘랐다. 절개후에는 아큐맥스(accumax; Chemicon cat# SCR006)와 디스페이즈가 함유된 DMEM배지(10%우태아혈청, 페니실린 100unit, 스트렙토마이신(0.1mg/ml), 네오마이신(0.25ug/ml), 노르모신(100ug/ml)에 아큐맥스(accumax; Chemicon cat# SCR006) 2%와 디스페이즈 0.4mg/ml가 함유된 배지)로 페트리 디쉬에 있는 절개된 조직을 담아서 플라스크로 옮겼다. 조직이 담긴 플라스크를 130m/min, 37℃에 30분동안 중력대류배양기에서 1차 화학적 분해작업을 행하였다.

그 다음 화학적 분해된 조직들을 원심분리로 수거해서 인산완충식염수로 3번 헹궈 주었다. 헹군 조직은 콜라게나아제가 함유된 배지(10%우태아혈청, 페니실린 100unit, 스트렙토마이신 (0.1mg/ml), 네오마이신(0.25ug/ml), 노르모신(100ug/ml)이 함유된 DMEM배지에 2mg/ml 콜라게나아제 타입ⅠA를 첨가한 배지)로 130m/min, 37℃에 30분동안 중력대류배양기에서 2차 화학적 분해작업을 행하였다. 화학적 분해된 조직들을 원심분리로 수거해서 다시 인산완충식염수로 3번 헹궈주었다. 이 과 정들을 거치고 수거된 조직을 M199/F12 혈청배지 (M199와 F12를 1:1로 섞은후 인슐린(0.62ug/ml), 트랜스페린(0.62ug/ml 페니실린 100unit, 스트렙토마이신(0.1mg/ml), 네오마이신(0.25ug/ml), rEGF(10ng/ml), bFGF(10ng/ml), 노르모신(100ug/ml), 10% 우태아혈청, N-아세틸-L-씨스테인(1mM) 을 첨가한 배지)가 들어간 25플라스크에서 배양하였다. 조직들이 디쉬에 부착하기 시작하면(약 3일경과) 우태아혈청이 없는 M199/F12 무혈청 배지(상기 M199/F12 혈청배지에서 우태아혈청만을 제외한 배지)로 갈아주었다.

일주일이 지난후 노르모신이 없는 디파인드 케라티노사이트 무혈청 배지(아스코르빈산 0.2mM을 첨가한 Defined keratinocytes 무혈청 액상배지(Gibco cat# 10785-012))로 갈아주고 이틀이 지난 후 디쉬에 처음 부착하기 시작한 세포의 형태를 나타내는 사진을 도 1에 나타내었다. 도 1의 두 사진은 같은 플라스크의 다른 부분을 찍은 사진이다(×100).

배지를 갈아준 이틀정도 후(도 1)에 세포들이 디쉬에 붙기 시작하면 떠있는 조직과 세포들을 75플라스크로 옮겨주었다.

처음 붙기 시작한 세포를 트립신 처치 후 계대를 하여 5~7일 정도 지난 후 플라스크에 70-90%정도 자라게 된다. 첫번째 계대후 세포 형태를 나타내는 사진을 도 2에 나타내었다. 도 2의 두 사진은 같은 플라스크의 다른 부분을 찍은 사진이다(×100). 이때부터 모든 플라스크 배지는 2~3일에 한번씩 인산완충식염수로 2번 헹궈준 후 같은 배지로 갈아주었다. 75플라스크로 옮겨준지 7일정도 후에 25플라스크의 부착된 세포들을 트립신 처치 후 75플라스크로 계대(1번세포)하고 처음에 옮 겨 주었던 75플라스크의 부착되지 않은 세포들을 다시 옮겨준다(디쉬에 붙어있는 세포-2번세포, 떠있는 세포-3번세포). 1번세포(도 2)과 2번세포(도 3)의 플라스크에 세포가 90%정도 자랐을때 모든세포를 수거하였다.

처음에 25플라스크에서 배양할 때 떠있는 세포를 75플라스크로 옮겨주었다. 그 75플라스크에서 부착하기 시작하여 배양한지 2주후에 90% 정도 자라게 된다. 처음에 디쉬에 부착하지 않다가 옮겨준후 디쉬에 부착된 세포의 형태를 나타내는 사진을 도 3에 나타내었다. 두 사진은 같은 플라스크의 다른 부분을 찍은 사진이다(×100).

2) 모낭세포의 성장곡선

초기배양 후 3일이 지난 세포를 트립신 처치후 세포를 수거하여 4개의 6-웰 플레이트에 각 웰당 1×10⁴개의 세포를 시딩하였다. 그런 다음 이 세포들을 배양한 지 1,2,3,4,5,6,7,8일 후에 각각 3개의 웰의 세포수를 각각 계산 후 각 날짜별로 평균과 표준편차값을 구하여 성장곡선을 도 4에 나타내었다.

3) 두피세포로부터 줄기세포 분리

상용화 되어있는 MACS(Magnetic Cell Sorting) (Miltenyi Biotec Inc.)를 이용하여 CD34양성 세포를 분리해 내었다. MACS를 이용한 CD34+ 세포를 분리하는 방법을 도식적으로 도 5에 나타내었다.

앞에서 언급한 방법으로 배양 된 두피세포를 트립신으로 수거하여 이 세포를 원심분리(약 1200rpm, 5min)하여 펠렛을 남기고 배지를 제거하였다. 적당양(약 10ml)의 배지를 세포가 담긴 튜브에 넣고 피펫으로 펠렛을 재부유하였다.

다시 원심분리를 하여 펠렛을 남기고 배지는 제거하였다. 피펫팅하기 전에 손으로 튜브를 탁탁 털어서 먼저 대충 싱글화 해 놓고 피펫으로 피펫팅하는게 바람직하다. MACS 버퍼와 블로킹 리전트, 마이크로비드를 순서대로 넣어주었다. 각 시약의 양은 마이크로비드: 150-300㎕, 블로킹 리전트: 50-100㎕, 마이크로비드: 50-100㎕이고, 배양 시간은 30분-4시간으로 한다. 이때 블로킹 리전트와 마이크로비드를 다루는 모든 과정에서는 형광등을 끄도록 한다. 혼합액이 담긴 튜브는 알루미늄 호일로 싸고, 4℃에서 30분-4시간 배양하였다. 그 후에 알루미늄 호일을 벗기고 혼합액의 약 10배 볼륨의 MACS 버퍼를 튜브에 추가하고 피펫으로 잘 섞어준 후 1200rpm, 5-6분간 원심 분리하고, 상층액은 제거하였다. MACS 버퍼를 세포의 수에 맞게 넣어주어 피펫으로 펠렛을 녹여주었다. 이때의 MACS 버퍼의 양은 500㎕ 이었다. MACS 버퍼와 혼합된 세포가 담긴 튜브는 얼음에 넣어두고, 컬럼과 MACS 키트를 세팅하였다. 삼각형의 초록색 자석은 검은색 받침대의 어느 곳에 붙여도 가능하며 개인의 편리에 따라 셋팅한다.

도 5에 MACS 기기를 나타내었다. CD34의 마이크로비드로 표지된 세포가 준비되면 MACS 기기를 셋팅(도 6의 (A))하고 MACS 컬럼과 자석(도 6의 (B))을 실험자의 편의에 따라 셋팅한다.

셋팅의 대략적인 순서는 다음과 같다. 'CD+'와 'CD-'로 표지된 50ml 튜브를 각각 1개씩 준비한다. 검은색 받침(강철)을 편한 곳에 놓고, 녹색 자석을 적당한 높이에 붙인다. 컬럼을 오염되지 않도록 조심해서 컬럼만 꺼내 자석의 홈에 끼운다.

준비된 튜브 중 'CD34-'로 표지된 튜브를 컬럼에서 떨어지는 세포들을 받을 수 있도록 위치시킨다. 준비가 되었으면 MACS 버퍼 200~500㎕ 먼저 컬럼에 흘려보네준다. MACS 버퍼가 거의 다 흘러 내려갔을 때 얼음에 꽂아두었던 세포 혼합액 500㎕(세포 2x10⁸ 당)를 컬럼에 넣는다. 세포 혼합액은 천천히 컬럼을 따라 흘러 내려질 것이고, 컬럼의 아래쪽으로 떨어지는 세포는 CD34- 세포이다. CD34+ 세포는 MACS 컬럼의 중간의 검은 부분에 걸려있다. 컬럼의 수용능력 만큼의 세포가 담긴 혼합액을 흘려보냈으면 끝으로 MACS 버퍼 500㎕정도를 넣어주어서 컬럼 내에 잔류해있는 CD34- 세포를 마저 흘려 보낸다. MACS 컬럼을 자석에서 꺼내어 컬럼과 함께 들어있었던 스틱을 컬럼의 윗부분에 끼우고 밀어서 'CD34+'로 표지된 튜브에 담는다. (마치 주사기를 사용하듯이) 배지(목적으로 하는 세포에 해당하는 배지)를 컬럼에 약 200-300㎕ 정도 부어주고 스틱으로 다시 밀어주어 컬럼을 통과하여 나오는 배지를 'CD34+'에 받는다. 배지 10ml을 CD34+ 세포가 담긴 튜브에 넣어준다. 배지를 넣어줄 때 튜브의 벽에 골고루 뿌려주어 스틱으로 컬럼을 밀어줄 때 튀었던 세포들을 모두 씻어 내려서 수거하도록 한 후 CD34+세포를 획득하였다. 이때 수거된 CD34+ 세포의 세포수는 대략 1-2x10⁷정도이고 이 세포들을 1500rpm, 5-6분 원심분리하고, 상층액을 제거한다. 튜브에 담긴 CD34+ 세포들은 멸균생리식염수 100㎕로 재부유해서 500㎕ 주사기로 옮겨 담는다.

4) 모낭줄기세포의 면역학적 특성(fluorescence activated cell sorting)

상기 실시예 3)에서 실시한 MACS를 이용하여 수거된 CD34+ 세포의 수득률을 본 실시예에서 다음과 같은 방법으로 계산하였다.

CD34+ 세포수

수득률(%) = --------------------------- × 100

MACS 통과전 총 세포수

그 결과를 표 1에 나타내었다.

[표 1]

실험번호	MACS전 총 세포수	MACS후 CD34+ 세포수	CD34+ 세포 수득율(%)
1	3.00 x 10⁷	1.28 x 10⁷	42.6666667
2	4.57 x 10⁷	1.19 x 10⁷	26.0393873
3	6.80 x 10⁷	1.43 x 10⁷	21.0294118
4	7.66 x 10⁷	1.81 x 10⁷	23.6292428
5	6.10 x 10⁷	2.88 x 10⁷	47.2131148
6	4.77 x 10⁷	1.14 x 10⁷	23.8993711
7	3.77 x 10⁷	1.64 x 10⁷	43.5013263
8	3.55 x 10⁷	2.04 x 10⁷	57.4647887
9	3.30 x 10⁷	1.15 x 10⁷	34.8484848
10	5.80 x 10⁷	1.79 x 10⁷	30.862069

5) 모낭줄기세포의 면역학적 특성(fluorescence activated cell sorting)

상기의 줄기세포 분리방법으로 획득한 CD34+ 세포의 면역학적 특성을 알아보기 위하여 FACS(fluorescence activated cell sorting) 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. 본 실시예에서 면역표현형 확인대상이 된 항원은 CD 34 양성(B), CD 44 양성(C), CD 45 양성(D), CD133 양성(E), CD29 양성(F) 중에서 어느 하나 또는 복수의 면역학적 특성을 나타낸다. 상기 실시예 3)에서 동정한 세포를 1×10⁵개가 되도록 준비하여 2% FBS를 함유하는 PBS 용액으로 세척하고, 각 항원에 해당하는 항체와 실온에서 반응시켰다. 항원의 발현여부는 유세포분석기(flow cytometer)를 이용하여 확인하였다.

그 결과 도 7에서 보는 바와 같이, 본 발명의 사람유래 모낭 줄기세포는 중간엽 줄기세포의 대표적인 항체인 CD34(B)에 대해서는 90%이상, CD44(C)에 대해서는 80%이상, CD45(D)에 대해서는 60%이상, CD133(E)에 대해서는 70%이상, CD29(F)에 대해서는 90%이상의 양성반응을 나타내었다. 대조군(A)은 항체와 반응시키지 않는 경우이다.

(2) 모낭 줄기세포의 투여 후 영향

1) 모낭 줄기세포 투여 및 마우스 관찰

1×10⁵ 개의 CD34+세포를 옮겨 담은 주사기를 얼음에 담아놓은 다음 누드마우스에 피하주사로 투여한다. 투여하기 전 대조군으로 사진을 찍어 시간이 지난 후의 마우스의 상태변화와 비교하였다. 시험에 사용한 동물은 다음과 같다.

① 동물 종(계통) : BALB/cAnNCrjBgi-nu 마우스

② 성별 및 입수시 주령 : 암컷 6주령

③ 공급원 : (주)오리엔트

④ 입수동물수 : 암컷 25마리

⑤ 검역 및 순화기간 : 실험실에 순화시키는 기간을 약 1주일 두었으며,

그 기간 중 일반증상을 관찰하여 건강한 동물만을 시험에 제공하였다.

⑥ 사용동물수 : 암컷 20마리

⑦ 시험시 주령 : 암컷 7주령

⑧ 군 분리법: 무작위법

⑨ 사육조건

- 환경조건 : 본 시험은 온도 22 ± 3 ℃, 상대습도 50 ± 10 %, 환기 회수 10 - 12회/hr, 조명시간 12시간 (07:00 - 19:00), 조도 150 - 200 lux로 설정된 서울대학교 수의과대학 실험실 (85동 727호)내 HEPA 필터가 장착된 MI rack에서 실시하였다.

- 사육상자, 사육밀도 및 사육상자의 식별

순화기간 및 시험기간 중에 폴리카보네이트 MI 케이지 (26×42×18 cm, 명진기계 제작)에서 5마리/사육상자로 사육하였다. 사육상자에는 시험번호, 동물번호 및 투여량을 기입한 태그(tag)를 붙였다.

- 사료 및 음수의 급여

순화기간 동안 사료는 고압증기멸균된 실험동물용 고형사료 ((주) 퓨리나))를 자유 섭취시키며, 음수는 고압증기멸균된 상수도를 자유 섭취시켰다.

[표 2] 시험군 구성

군	성별	동물수	동물번호
모낭줄기세포 비투여 대조군	암컷	10	CF1 -10
모낭줄기세포 투여군	암컷	10	HSCF1 -10

상기와 같이 무작위로 군 분리한 누드마우스에 본 발명의 모낭 줄기세포를 투여한 후 15일 동안 실험동물의 피부를 관찰하였는바, 털이 나타난 일자난 일자를 구분하여 기록하였고, 시험 시작전과 종료시점에서 시험동물의 체중을 측정하고 투여일을 0일로 하였을 때 시험이 종료된 16일째 부검하였다. 시험 중 측정된 시험동물의 체중 등에 관한 자료의 통계학적 분석을 위하여 원-웨이 ANOVA를 실시하여 군간 유의성을 검정하였고, 유의성이 인정되면 Dunnett's t-test를 실행하여 대조군과 시험군간의 통계학적 유의성을 검정하였다(p<0.05).

상기 실험 수행의 결과, 모낭 줄기세포 비 투여 대조군(이하 대조군)과 모낭줄기세포 투여군(이하 투여군)의 마우스 사진을 도 8에 나타내었다. 대조군의 누드 마우스에는 털이 보이지 않았지만(A) 투여군의 누드마우스(B)에서는 투여군 모두 9일에서 12일째 되는 날 머리부분에 집중적인 털을 확인할 수가 있었다.

2) 마우스 두피 절편의 HE 염색

각 군의 누드마우스의 두피부분을 절개하여 그 절편을 10% 포르말린 용액에 고정한 다음 파라핀에 포매하여 0.2um로 절편화 한다음 슬라이드상에서 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)의 염색법을 이용하여 조직표본을 만들어 비교해 보았다.

대조군과 실험군 마우스의 두피 조직의 HE 염색 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9로부터 알 수 있는 바와 같이, 대조군 누드 마우스에는 모근이 보이지 않았지만(A) 투여군(B)에서는 두피조직에서 털이 자라나오는 모근을 확인할 수가 있었다.

3) 마우스 두피 절편의 원위치 하이브리드화(in situ hybridization)

상기 HE 염색법과 마찬가지로 각 군의 누드마우스의 두피부분을 절개하여 4% 파라포름알데히드 포스페이트 용액에 1.5% 수크로즈 용액을 섞은 고정액으로 각 개체들의 두피조직들을 고정하였다. 30% 수크로즈 포스페이트 용액에 두피조직들이 가라앉을 때까지 4℃에서 방치한 다음 각 조직들을 파라핀으로 포매하여 조직절편기를 이용해 5um 두께로 두피 절편을 제작한 다음 미리 준비한 프리하이브리드화 용액 (50% 포름아미드, 4X SSC, 50mM DDT, 4X Denhart`s soln, `X TED, 100ug/ml denatured salmon sperm DNA, 250ug/ml yeast RNA)으로 42℃에서 1시간 동안 반응 시켰다. DIG 라벨드 DNA(100ng/ml)를 넣어주고 프리하이브리드 용액을 24시간 동안 반응시켜 DIG 라벨드 사람 특이 DNA 프로브가 누드마우스 두피세포 mRNA에 결합하도록 하였다. 대퇴부조직을 2X, 1X, 0.5X SSC용액으로 각각 10분간 2번씩 세척 후 슬라이드 글래스에 고정시키고 실온에서 2시간 동안 건조시켰다.

상기실험 수행의 결과, 도 10에서 보는 바와 같이 대조군 (C,D)에서는 사람 특이 프로브에 의해 표지되지 않았으나, 투여군의 개체에서는 외부 모근초 주위 (A)와 모낭주위 (B)에서 표지가 된 것을 확인할 수 있었다.

<결과 요약>

현재 대머리 치료로 많이 통용되고 있는 일반적인 머리털 이식은 남아있는 머리털로 벗겨진 부분을 덮도록 하며 그 결과 종종 누덕누덕 기운 것처럼 된다. 또, 프로페시아 또는 미녹시딜과 같은 약물치료는 남성 호르몬에 영향을 미쳐 일부 사람들에게는 탈모 진행이 느려지게 할 수 있으나 약물처치는 무기한 지속되어야 하고 성기능 장애등 여러 가지 부작용도 있다.

자기재생가능(self-renewal)하고 자기유지기능(self-maintenance) 및 다분화능을 보이는 성체 줄기세포는 많은 질병의 세포치료제로써 각광을 받고 있다. 최근에는 마우스의 머리털 소낭(hair follicle)에서 분리한 줄기세포를 배양하여 대머리 마우스의 등에 이식하여 피부와 소낭, 머리털의 형태로 자라게 한 보고가 있었다(21). 만일 인간이 마우스와 같다면, 그 줄기 세포를 추출하기 위해 유사한 방법을 사용할 것이며, 이 줄기세포는 대머리 표피나 상처 부위에 재이식되어 새로운 피부와 모발로 자라게 될 것이고 이러한 치료법은 현재 통용되는 탈모 치료보다 훨씬 더 좋은 결과를 줄 것이다.

본 발명자들은 모낭의 외부 모근초의 윗부분(in the upper regions of the outer root sheath of the hair follicle), 즉 돌출부분(bulge region)이라고 불리는 곳에서 CD34 세포표면 단백질을 발현하는 줄기세포가 존재한다는 연구결과를 근거(22)로 인간 생체로부터 직접 두피조직을 추출하여 CD34 세포표면 단백질을 발현하는 모낭 줄기세포를 동정하였다. 또 이 모낭 줄기세포의 생체내(in vivo)적인 효과를 알아보기 위하여 이 세포를 마우스에 피하주사로 투여하였고 투여한지 10일후 마우스의 두부에서 털이 자라는 걸 확인하였다. 또한 털이 자라는 조직을 HE 염색법을 이용하여 대조군의 조직과의 차이점을 확인할 수 있었다.

모낭 줄기세포에 관한 연구가 많이 진행되어 지고 있지만 아직 표준화된 세포 배양법과 줄기세포의 분리법이 부재하다. 본 발명은 인간 두피 조직에서의 두피 세포의 배양법과 그 세포로부터 모낭 줄기세포를 동정하는 방법을 제시하였고 그 배양법으로 모낭세포의 증식과 모낭세포로부터 모낭 줄기세포의 수득률이 20~50% 가량 된다는 점에서 종전의 기술에 비해 훨씬 효율적인 방법이라고 말할 수 있으며 마우스에서의 모낭 줄기세포의 발모효과를 확인하였다.

즉, 본 발명의 모낭유래 줄기세포는 성인의 자가성 성체줄기세포로 분류되고，자기 복제능과 성체의 모낭세포로 분화하는 능력을 가지면서 머리털을 자라게 하는 능력을 갖으며 탈모의 새로운 세포 치료제로써 이용할 수 있을 것으로 사료되고, 본 발명이 제시한 모낭세포 배양법과 모낭줄기세포의 동정법은 세포치료제로써 응용하는데 있어 가장 중요한 방법이 될것으로 사료된다.

본 발명에 따라 얻어진 모낭 줄기세포는 성체의 모낭세포로 분화하는 능력을 가지며 머리털을 자라게 하는 능력을 가져 탈모의 새로운 세포 치료제로써 매우 유용한 것으로 기대된다.

Claims

모낭을 포함하는 두피조직을 잘게 절개한 다음 절개된 조직을 단백질 가수분해 효소, 교원분해(collagenolytic) 효소 및 DNAse 효소로 이루어진 효소 복합체와 디스페이즈가 함유된 배지에서 1차 화학적 분해를 행하는 단계; 콜라게나아제가 함유된 배지에서 2차 화학적 분해를 행하는 단계;

화학적 분해된 조직을 회수하여 두피세포를 혈청 1-30%가 포함된 배지에서 배양한 다음, 세포부착후 무혈청 배지에 배양하는 단계;

배양증식된 두피세포를 회수한 다음 이로부터 CD34+ 세포를 분리하여 모낭 줄기세포를 분리하는 단계; 및

상기 분리된 모낭 줄기세포를 두피조직에 피하주사로 투여하여 모낭 세포로 분화시키는 단계

를 포함하는, 인체를 제외한 포유류에서 모낭 줄기세포의 분리 및 모낭 세포로의 분화 방법.
제 1항에 있어서, 1차 화학적 분해에 사용되는 상기 효소 복합체와 디스페이즈가 함유된 배지는 우태아혈청 1-30%, 노르모신 10-200ug/ml, 페니실린-스트렙토마이신 1-10%가 포함된 DMEM배지에 디스페이즈 0.1-2mg/ml 및 단백질 가수분해 효소, 교원분해(collagenolytic) 효소 및 DNAse 효소로 이루어진 효소 복합체 1-10%가 첨가된 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1항에 있어서, 2차 화학적 분해에 사용되는 콜라게나아제가 함유된 배지는 우태아혈청 1-30%, 노르모신 10-200ug/ml, 페니실린-스트렙토마이신 1-10%가 포함된 DMEM배지에 콜라게나아제 타입ⅠA를 0.1-10mg/ml 첨가한 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 화학적 분해는 50-200m/min, 30-40℃에서 0.5-24시간 동안 중력대류배양기에서 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 회수된 두피세포의 배양은 우태아혈청 1-30%가 포함된 M199/F12배지에서 배양한 다음, 세포부착후 우태아혈청이 없는 M199/F12배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 처음에 사용되는 M199/F12배지는 M199와 F12를 1:1로 섞은후 인슐린 0.1-1.0ug/ml, 트랜스페린 0.1-1.0ug/ml, 페니실린-스트렙토마이신 1-10%, rEGF(receptor for human epidermal growth factor) 1-100ng/ml, bFGF(basic fibroblast growth factor) 1-100ng/ml, 노르모신 10-200ug/ml, 우태아혈청 1-30%, N-아세틸-L-씨스테인 0.1-10mM 을 첨가한 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 나아가 우태아 혈청이 없는 M199/F12배지로 배양 일주일후 노르모신이 없고 아스코르빈산 0.1-10mM이 포함된 무혈청 케라티노사이트용 배지에서 배양증식하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1항에 있어서, 분리된 모낭 줄기세포의 면역표현형 항원은 CD34 양성을 나타내며, 또한 CD44 양성, CD45 양성, CD133 양성, CD29 양성 중에서 어느 하나 또는 복수의 면역학적 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법
제 1항에 있어서, 상기 두피조직은 포유류로부터 얻어진 것을 특징으로 하는 방법.
모낭을 포함하는 두피조직을 잘게 절개한 다음 절개된 조직을 단백질 가수분해 효소, 교원분해(collagenolytic) 효소 및 DNAse 효소로 이루어진 효소 복합체와 디스페이즈가 함유된 배지에서 1차 화학적 분해를 행하는 단계; 콜라게나아제가 함유된 배지에서 2차 화학적 분해를 행하는 단계;

화학적 분해된 조직을 회수하여 두피세포를 혈청 1-30%가 포함된 배지에서 배양한 다음, 세포부착후 무혈청 배지에 배양하는 단계; 및

배양증식된 두피세포를 회수한 다음 이로부터 CD34+ 세포를 분리하여 모낭 줄기세포를 분리하는 단계

에 의해 분리된 모낭 줄기세포를 유효성분으로 하는 발모촉진용 조성물.
제 12항에 있어서, 1차 화학적 분해에 사용되는 상기 효소 복합체와 디스페이즈가 함유된 배지는 우태아혈청 1-30%, 노르모신 10-200ug/ml, 페니실린-스트렙토마이신 1-10%가 포함된 DMEM배지에 디스페이즈 0.1-2mg/ml, 단백질 가수분해 효소, 교원분해(collagenolytic) 효소 및 DNAse 효소로 이루어진 효소 복합체 1-10% 첨가한 배지인 것을 특징으로 하는 발모촉진용 조성물.
제 12항에 있어서, 2차 화학적 분해에 사용된 콜라게나아제가 함유된 배지는 우태아혈청 1-30%, 노르모신 10-200ug/ml, 페니실린-스트렙토마이신 1-10%가 포함된 DMEM배지에 콜라게나아제 타입ⅠA를 0.1-10mg/ml 첨가한 배지인 것을 특징으로 하는 발모촉진용 조성물.
제 12항에 있어서, 화학적 분해는 50-200m/min, 30-40℃에서 0.5-24 시간동안 중력대류배양기에서 행하는 것을 특징으로 하는 발모촉진용 조성물.
제 12항에 있어서, 상기 모낭 줄기세포는 1×10³-1×10¹² 세포의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 발모촉진용 조성물.
제 12항에 있어서, 회수된 두피세포의 배양은 우태아혈청이 포함된 M199/F12배지에서 배양한 다음, 세포부착후 우태아혈청이 없는 M199/F12배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 발모촉진용 조성물.
제 17항에 있어서, 나아가 우태아 혈청이 없는 M199/F12배지로 배양 일주일후 노르모신이 없고 아스코르빈산 0.1-10mM이 포함된 무혈청 케라티노사이트용 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 발모촉진용 조성물.
제 12항에 있어서, 유효성분이 되는 모낭 줄기세포의 면역표현형 항원은 CD34 양성을 나타내며, 또한 CD44 양성, CD45 양성, CD133 양성, CD29 양성 중에서 어느 하나 또는 복수의 면역학적 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 발모촉진용 조성물.
제 19항에 있어서, 복수의 면역학적 특성을 나타내는 경우 CD44 양성, CD45 양성, CD133 양성, CD29 양성에 대해서 양성을 공통적으로 나타내는 것을 특징으로 하는 발모촉진용 조성물.