KR100758611B1 - 핵산증폭 및 분석을 위한 멀티-챔버 반응기 - Google Patents

Abstract

본 발명은 10㎕이하의 미량 시료들의 핵산 증폭 및 핵산 분석반응을 위한 멀티 챔버 반응 장치에 관한 것으로, 구체적으로는 생물학적 시료용액을 담기 위한 분리되어 있는 다수의 반응챔버와 상기 반응챔버 사이에 형성된 격리홈으로 이루어진 반응블록, 상기 반응블록상의 반응챔버를 실링하기 위한 투명한 실링커버 및 반응챔버내의 밑면에 부착되어 있는 건조된 핵산증폭시약 및 건조된 핵산분석시약을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료용액의 핵산증폭 및 핵산 분석반응을 위한 멀티 챔버 반응 장치에 관한 것이다. 본 발명의 반응기는 미량의 시료를 반응시키기에 적합하며, 반응기의 두께가 매우 얇아 열 용량이 작기 때문에 반응기의 가열 및 냉각속도가 매우 빠르며, 투명 소재의 실링커버를 사용함으로써 미량의 반응시료로부터 발생되는 광을 용이하게 측정할 수 있다.

반응기, 반응챔버, PCR, 실링커버, 핵산증폭

Description

핵산증폭 및 분석을 위한 멀티-챔버 반응기{Multi-Chamber Reaction Device for Nucleic acid Amplification and Assay}

도 1은 본 발명의 전체 사시도.

도 2는 본 발명의 반응블록의 평면도 및 A와 A'선으로 절단한 단면도.

도 3은 본 발명의 실링커버의 평면도 및 우측면도.

도 4는 본 발명에 의한 중합효소연쇄반응 결과를 나타내는 도.

도 5는 본 발명에 의한 중합효소연쇄반응 결과를 나타내는 도이다.

<도면의 주요부분에 대한 간단한 설명>

10: 반응블록 11: 반응챔버

12: 격리홈 13: 테두리

21: 실링커버 30: 건조된 핵산증폭시약 및 핵산분석시약

본 발명은 미량의 생물학적 시료용액의 핵산 증폭 및 핵산 분석 반응을 수행하는데 사용하기 위한 멀티 챔버 반응기에 관한 것이다.

근래 중합효소연쇄반응을 수행하면서 실시간으로 모니터링할 수 있는 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 방법이 개발되었다. 이 방법은 젤 상에서의 전기영동이 필요 없고, 반응사이클 도중에 증폭산물을 확인할 수 있으며, 정량적인 결과를 얻을 수 있는 이점이 있는 방법이다. 이러한 실시간 PCR을 위해 사용되는 장치는 PCR 반응을 위한 온도순환장치(thermal cycler)와 반응물의 실시간 검출을 위한 형광분석기(fluorometer)를 합체한 기기이다. 통상 실시간 PCR의 모니터링은 형광시약을 이용한 형광검출이 사용되고 있다. 이는 PCR을 수행하면서 PCR 산물로부터 발생되는 형광을 동시에 측정함으로써 생성물을 정량적으로 분석할 수 있다. 근래 real-time PCR 수행시 반응시료의 양은 대체로 10 내지 50㎕로 사용하게 된다. 만약 반응시료를 미량으로 사용할 수 있다면 반응에 필요한 여러 시약의 필요량이 적어지므로 경제적으로 큰 이득이 된다. 이러한 미량의 시료를 PCR 반응시키면서 동시에 발생되는 형광을 검출하기 위해서는 반응용기가 시료량에 맞게 작아져야 한다. 이러한 미량시료를 반응시키기 위해서 미국특허 제 5948673호에는 '필름 반응기' 또는 'DNA 카드'라 하는 반응기가 제시되었는데, 이는 3층의 매우 얇은 필름으로 되어 있다. 하층 필름은 반응기의 밑면을 형성하고, 중층 필름은 반응기의 측면을 형성하며, 상층필름은 시료주입구를 형성한다. 그러나 이러한 DNA 카드 반응기에 파이펫을 통하여 미량 시료용액을 주입한 후에 반응을 위해서는 반응주입구를 완전하게 밀봉하여야 한다. 그렇지 않을경우 PCR 반응시 반응용액이 모두 증발되게 된다. 그러나 상기 필름 반응기의 반응주입구를 실링하기는 매우 어렵다. 접착 테이프를 부칠경우 필름의 성질과, 접착시 누르는 힘때문에 반응용액이 밖으로 흘러나오게 되어 접착 테이프가 반응기에 부착되지 않게 되어 완전한 실링이 어렵게 된 다. 이 경우 기포가 들어가게 되면 광산란에 의해 형광측정이 어려워진다. 또한 얇은 필름의 성질로 인해 시료용액은 다른 챔버내의 용액과 섞이기 쉽고, 고온에서 반응시 액체로 인해 커버가 반응기로부터 떨어지게 된다. 따라서 PCR 반응시 반응기의 실링이 용이하며 실링효과가 좋은 실링커버가 요구되고 있다. 또한 편평한 블록상에 오목하게 반응챔버를 다수 형성한 반응기가 제시되어 있는데, 이러한 반응기는 PCR 반응시 고온에서 버블이 발생되어 실제 형광 측정시 빛이 산란되어 측정이 어렵게 되며, 버블로 인해 용액이 넘쳐나 다른 반응 챔버로 넘어가 오염의 결과를 초래하게 된다. 따라서 반응챔버 사이가 오염되지 않도록 격리되어 있어야 하며, 실링효과가 좋고 반응물로부터 생성되는 광을 실시간으로 측정할 수 있는 투명한 반응 용기가 요구되고 있다.

따라서 상기 실시간 PCR 장치에서와 같이 반응과 분석을 동시에 수행하며, 미량 또는 극미량의 시료를 사용하며, 반응시 생성되는 광을 실시간으로 측정하는데 적합하고, 실링이 용이하며, 오염의 위험이 거의 없는 미량시료용 반응 장치가 요구되고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 10㎕ 이하의 미량 시료를 반응시키는데 적합한 미량 시료용 멀티 챔버 반응기를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 냉각 및 가열을 매우 빠르게 수행할 수 있는 열 용량이 적고 열 전달률이 좋은 멀티 챔버 반응기를 제공하는 것이다.

또 다른 목적은 형광측정시 기포에 의한 광의 산란, 교란을 없애기 위하여 반응중 또는 반응종료 후 반응챔버의 실링이 완벽하여 반응산물로부터 발생되는 형광을 정확하게 측정할 수 있는 실링커버를 구비한 멀티 챔버 반응기를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 각종 생물학적 반응, 즉 핵산증폭반응, LCR(ligase chain reaction), 혼성화(hybridization) 반응, 각종 혼성화 프로브(hybridization probe) 반응에 적합하게 사용될 수 있는 멀티 챔버 반응기를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해서 본 발명은 반응시료용액를 담기 위한, 분리되어 있는 다수의 반응챔버와 다수의 반응챔버사이에 형성되어 있는 격리홈으로 이루어진 반응블록과, 상기 반응블록상의 반응챔버를 실링하기 위한 투명한 실링커버로 이루어지는 생물학적 시료용액의 핵산증폭 및 핵산분석을 수행하기 위한 멀티 챔버 반응기를 제공한다.

본 발명은 반응챔버내의 밑면에 부착되어 있는 건조된 핵산증폭시약 및 건조된 핵산분석시약을 더 포함하여 구성된다.

본 발명에서 상기 반응챔버는 1 내지 20㎕의 시료를 반응시키기에 적합하다.

본 발명에서 실링커버는 투명하며, 100℃ 이상의 내열성을 갖는 탄력성과 신축성이 있는 재질로 되어있다.

또한, 본 발명의 반응블록은 1 내지 8mm 두께의 플라스틱 또는 폴리머로 피복된 알루미늄으로 되어 있다.

본 발명의 반응블록은 시료용액이 밖으로 누출되는 것을 방지하기 위해 일정 높이의 테두리가 형성되어 있다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면을 참조로 하여 구체적으로 설명한다.

도 1은 본 발명의 전체 사시도를 나타낸 것으로, 본 발명의 반응기는 반응블록(10)과 실링커버(21)로 이루어져 있다. 얇은 두께의 블록(10)에는 다수의 반응챔버(11)가 형성되어 있다. 반응챔버(11)는 일정한 배열로 형성되어 있다. 반응챔버는 원통형, 사각형 또는 원뿔형상 일 수 있다. 본 발명에서 반응챔버의 외경은 약 2 내지 4mm, 바람직하게는 2 내지 2.5mm정도 되고, 챔버밑면으로부터 챔버 윗면까지의 높이는 0.5 내지 5mm, 바람직하게는 1 내지 3mm 정도 된다(도 2 및 3 참조). 따라서, 본 발명의 반응챔버는 미량시료를 반응시키는데 적합하다. 본 발명에서는 반응블록 상에 24개의 반응챔버를 구비하고 있다. 반응챔버의 수는 조절될 수 있다.

각각의 반응챔버(11) 사이에는 격리홈(12)이 형성되어 있다. 챔버와 챔버사이에 오목하게 격리홈을 형성함으로써 챔버와 챔버는 서로 분리되게 된다. 본 발명에서는 챔버사이에 격리홈이 형성되어 있기 때문에 반응시 시료가 넘치게 되어도 다른 반응챔버로 시료가 들어가지 않아 오염의 위험이 전혀 없게 된다.

본 발명의 반응블록(10) 가장자리에는 테두리(13)가 형성되어 있다. 테두리의 높이는 반응블록 윗면으로부터 1 내지 5mm, 바람직하게는 2 내지 2.5mm가 되도록 하였다. 블록 가장자리에 테두리가 형성되어 있어, 반응챔버로부터 시료가 넘쳐날 경우 반응블록 밖으로 시료용액이 흘러나가지 않게 된다. 본 발명의 반응기를 PCR 장치와 같은 장치에 장착하여 사용하는 경우에도 반응기 밖으로 시료용액의 누출 위험이 없어 PCR 장치에 손상을 줄 위험은 없게 된다.

본 발명의 반응블록 가장자리에는 위치를 표시하기 위한 어떠한 표시수단이 형성될 수 있다. 본 발명에서는 대각선 모서리에 구멍(14)을 형성하여 블록의 방향을 알 수 있게 하였다.

도 3에 제시된 바와 같이 본 발명은 상기 반응블록상에 형성된 반응챔버를 실링하기 위한 실링커버(21)를 포함한다. 실링커버는 투명한 재질을 사용한다. 투명한 재질을 사용할 경우, 주입된 반응시료를 눈으로 확인할 수 있으며, 반응시 실링커버가 덮혀 있는 반응챔버로부터 발생되는 광을 실시간으로 측정할 수 있다. 실시간 PCR 장치에 본 발명의 반응기를 장착하여 PCR 반응을 수행할 경우, 반응중에 발생되는 형광은 실링커버를 통하여 PCR 장치의 형광검출기로 쉽게 검출될 수 있다. 상기 실링커버의 재질은 바람직하게 반응챔버의 실링을 용이하게 하기 위해서 투명 실리콘, 투명, 우레탄, 투명 PVC 또는 이들의 혼합재료 등으로써 신축성 및 탄력성이 있으며 100℃ 이상의 내열온도를 갖는 가벼운 재질을 사용하는 것이 좋다. 또한 실링커버와 반응챔버가 접촉되는 부분은 실링효과를 높이기 위해서 반응챔버에 맞게 돌기(22)를 형성할 수 있다. 돌기가 형성된 실링커버로 반응챔버를 실링할 경우 돌기가 반응챔버내로 끼워 들어가게 되어 완전한 실링이 된다. 본 발명의 실링커버는 반응챔버를 밀폐시켜 반응시 버블이나, 시료용액이 밖으로 새는 경우가 없어지게 된다. 본 발명의 반응기를 PCR 장치에 장착할 경우, 통상의 PCR 장치는 반응기를 장착한 후 상부에서 눌러주는 수단이 구비되어 있다. 따라서, 본 발명의 반응기는 PCR 장치에 사용할 경우 실링커버로 인해 우수한 실링효과를 갖게 된다. 실링커버의 크기는 반응블록(10)의 테두리(13) 안으로 끼워 맞쳐 지는 것이 좋다. 실시예에서 실링커버의 두께는 0.5 내지 2mm, 바람직하게는 1 내지 1.5mm 정도로 하였으며, 돌기의 두께는 커버 면으로부터 0.4 내지 0.6mm 정도가 되게 하였다.

본 발명의 반응블록(10)의 재질은 알루미늄, 플라스틱 등이 사용될 수 있으며, 알루미늄의 경우 이들을 아노다이징하거나, 폴리머와 같은 얇은 막으로 피복하여 사용할 수 있다. 피복하기 위해서 사용되는 폴리머로는 테프론, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리에스테르수지 및 이들의 변성수지 등이 사용될 수 있다. 반응블록(10)은 반응시 광의 난반사를 방지할 수 있는 색상으로 된 것이 바람직한데 검은색 계통과 같이 불투명한 색상으로 되어 있는 것이 좋다. 본 발명에서는 바람직하게 알루미늄으로 된 블록에 반응챔버(11), 격리홈(12) 및 테두리(13)를 형성한 다음, 이를 아노다이징 처리한 후, 검은색 계통의 테프론 막으로 피복하여 반응블록으로 사용하였다. 이렇게 할 경우 반응시료로부터 발생되는 광 또는 형광은 반응챔버 윗부분으로만 반사되고 반응챔버의 다른 곳으로는 투과되지 않게 된다.

본 발명의 반응기는 반응챔버 내에 원하는 분석에 필요한 반응시약들을 더 포함할 수 있는데, 건조된 형태의 핵산증폭 및 핵산분석시약이 이에 포함된다. 본 발명에서 바람직하게 사용되는 핵산증폭시약 및 핵산분석시약(30)은 각종 PCR(polymerase chain reaction), LCR(ligase chain reaction), 올리고뉴클레오티드 라이게이션 분석반응(oligonucleotide ligation assay), 혼성화 분석반응(hybridization assay), 각종 프로브 분석반응(probe assay)에 통상적으로 사용되는 반응시약을 의미할 수 있다. 구체적으로 핵산증폭시약으로서는 핵산 증폭에 필요한 시약으로서, 완충액, 4종류의 dNTP, 핵산중합효소로 이루어진 용액이고, 핵산분석시약으로서는 핵산증폭 반응시에 반응과정을 모티터링 할 수 있는 시약으로서, 통상 광학적으로 검출할 수 있는 광을 생성하는 시약으로서 형광시약이 사용되고 있다. 형광시약을 사용할 경우 반응중에 발생되는 형광을 통하여 반응상태를 관찰할 수 있게 된다. 핵산분석시약으로서는 예를들면 이중나선 DNA에 끼워들어 가는 SybrGreen(10X, Molecular probe, USA Oregon)을 들 수 있다. SybrGreen은 핵산증폭중에 증폭되는 이중나선 DNA에 끼워 들어가 특정 파장의 형광을 나타내는 시약이다. 이들 핵산증폭시약과 핵산분석시약용액을 반응챔버내에 넣은 다음 건조시켜서, 반응시까지 보관한다. 반응시에는 건조된 반응시약이 들어있는 반응챔버내로 파이펫 등을 사용하여 분석하고자 하는 시료용액을 넣은 후 실링커버로 실링을 한 다음, 반응을 수행하면 된다.

본 발명의 전체 반응블록의 크기는 가로가 약 68mm, 세로가 약 34mm로 하였으며, 블록 밑면으로부터 반응챔버 윗면까지의 높이는 1 내지 8mm, 바람직하게는 2 내지 4 mm가 되도록 하였다. 본 발명의 반응블록의 크기, 두께, 반응 챔버의 수, 챔버의 형상 및 용량, 실링커버의 두께는 사용자의 의도에 따라 조절가능하다.

본 발명의 멀티 챔버 반응기는 미량의 시료를 반응시키는데 적합하며, 반응 중 시료로부터 발생되는 형광을 실시간으로 검출하기 위한 멀티-챔버 반응기로서 적합하며, 실시간(real-time) PCR 장치에 장착하여 사용되기에 편리하다.

<실험예> 본 발명을 이용한 PCR 반응

본 발명의 반응기를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응 및 검출은 다음과 같이 수행되었다.

본 실험에 사용한 중합효소는 Thermus aquaticus (strain YT1) 중합효소 유전자에서 발현된 Taq DNA 중합효소로서 ㈜바이오니아 제품을 사용하였다. 이때 사용된 Taq DNA 중합효소의 1unit는 72 ℃에서 30분동안 10 nmole의 dNTP들을 산 용액에 녹지 않는 형태로 전환시키는데 필요로 하는 효소량이다. 부수적으로 사용된 시약은 형광분석시약인 SybrGreen(10X, Molecular probe, USA Oregon), 반응 완충액[(10X), (100 mM Tris-HCl, 400 mM KCl, 15 mM MgCl₂, pH 9.0)], 희석 완충액[20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 % Tween 20, 0.5 % IGEPAL CA-630 (pH 8.0)], dNTPs (각각 2.5 mM)이며 저장 완충액 [20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 % Tween 20, 0.5 % IGEPAL CA-630 (pH 8.0)]에 5000 units/mL가 들어있는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다. 또한 실시간 PCR 실험에 사용된 DNA는 E. coli 게놈 DNA (unknown concentration), E.coli 게놈 특이적 전방향 프라이머 (10 pmoles/uL), E.coli 게놈 특이적 후방향 프라이머(10 pmoles/uL)를 사용하였다. 이때 시약 보관 온도는 모두 -20 ℃로 일정하게 유지 하였다.

이상과 같이 언급된 시약을 사용하여 10x 반응 완충액 2uL, 10mM dNTP (2.5mM/각각) 2 uL, Taq DNA 중합효소 1unit (5unit/uL) 0.2 uL, 형광시약인 SybrGreen (10X) 1 uL를 반응챔버에 넣은 다음 동결건조시켰다. 동결건조시킨 후, 반응전까지 상온 또는 -4℃에서 보관하였다. 반응시에는 상기 동결건조된 조성물에 게놈 DNA (unknown concentration) 10 uL, 전방향 프라이머(10 pmoles/uL) 2 uL, 후방향 프라이머 (10 pmoles/uL) 2 uL, 및 증류수를 가하여 총 용량이 20 uL가 되게 하여 혼합하였다.

실시간 PCR에 사용된 PCR 순환 조건은 초기 변성조건(predenaturation) 94 ℃ 30초를 진행하였고, 변성(denaturation), 어닐링(annealing), 확장(extension)은 94 ℃, 57 ℃, 72 ℃를 각각 10초씩 총 35 cycles을 진행하였다. 모든 cycle이 완료된 후 72 ℃에서 30초간 방치함으로서 모든 PCR 반응을 완료하였다.

㈜바이오니아의 실시간 PCR 장치에 본 발명의 반응기 (6 x 4 웰, 24 웰)에 준비된 PCR 반응물을 8 uL 로 하여 실링커버를 덮어 언급된 PCR cycling 조건으로 반응을 진행하였다. 이때 대조군으로 E.coli 게놈 DNA 10 uL 대신 증류수 10 uL을 가하여 반응을 진행하였다.

그림 4와 5에서 보는 바와 같이 E. coli 특이적 프라이머를 사용하여 증폭된 PCR 반응산물의 양이 cycle 횟수의 증가에 따라 늘어남을 볼 수 있으며, 반면 대조군의 PCR 반응산물의 양은 뒤늦게 신호가 발생하여 증가함을 볼 수 있다. 도 4와 5에서 갈색 및 보라색은 E. coli 게놈 DNA를 사용하여 PCR로 증폭된 증폭산물을 나타내고, 연두 및 하늘 색은 대조군으로서 E. coli 게놈 DNA 대신 증류수(D.W.)를 사용하여 동일하게 반응을 수행한 결과를 나타낸다.

본 발명의 멀티 챔버 반응기는 두께가 얇고 미량 시료를 사용하기 때문에 열 용량이 적어 반응기의 냉각 및 가열을 빠르게 수행할 수 있으며, 미세용량을 사용하기 때문에 용매 및 시약의 사용량을 대폭 줄일 수 있고, 제조비용이 저가이어서 대량생산이 가능하여 일회용으로 사용하기에 적합하다. 또한 반응 중에 발생되는 광을 실시간으로 측정하기에 적합한 반응기로 되어 있어, 실시간 PCR 장치에 장착되어 사용하기에 적합하다.

Claims (8)

1. 생물학적 시료용액을 담기 위한 다수의 분리되어 있는 반응챔버와 반응챔버들간에 시료용액이 혼입되는 것을 방지하기 위해 반응챔버들 사이에 구비된 격리홈으로 이루어지며, 플라스틱 또는 폴리머로 피복된 알루미늄으로 이루어진 반응블록과;

   상기 반응블록상의 반응챔버들을 실링하기 위한 투명한 실링커버를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료용액의 핵산증폭 및 핵산분석을 수행하기 위한 멀티 챔버 반응기.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 반응 챔버는 1㎕ 내지 20㎕의 용량을 가지는 것을 특징으로 하는 멀티 챔버 반응기.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 실링커버는 100℃ 이상의 내열온도를 갖는 탄성재질로 되어 있는 것을 특징으로 하는 멀티 챔버 반응기.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 반응블록 가장자리에는 일정 높이의 테두리가 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 멀티 챔버 반응기.
5. 삭제
6. 제 1 항에 있어서, 상기 반응블록은 1 내지 8mm의 두께를 갖는 것임을 특징으로 하는 멀티 챔버 반응기.
7. 제 1 항에 있어서, 반응챔버내의 밑면에 부착되어 있는 건조 핵산증폭시약 및 건조 핵산분석시약을 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 멀티 챔버 반응기.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 핵산분석시약은 핵산 분석을 위한 형광분석시약인 것을 특징으로 하는 반응기.

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