KR100684932B1

KR100684932B1 - 중간엽 줄기세포와 초음파 자극을 이용하여 연골조직을재생하는 방법

Info

Publication number: KR100684932B1
Application number: KR1020050030837A
Authority: KR
Inventors: 민병현; 박소라; 최기호
Original assignee: (주)필미아젠; 박소라
Priority date: 2005-04-13
Filing date: 2005-04-13
Publication date: 2007-02-20
Anticipated expiration: 2025-04-13
Also published as: KR20060108451A

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포로부터의 연골세포 분화방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 중간엽 줄기세포를 생분해성 고분자 포함배지에서 배양하여 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 제조하고, 이를 동물에 주입한 다음, 저주파의 초음파로 처리하는 것을 특징으로 하는 연골세포 분화방법 및 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 함유하는 연골질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, in vivo상에서 골수유래 중간엽 줄기세포로부터 연골세포의 분화속도 및 분화율을 효율적으로 향상시킬 수 있고, 연골조직 생성의 효율을 증가시키고 연골조직의 강도를 증가시킬 수 있다.

초음파, 연골세포 분화, 중간엽 줄기세포, 연골조직재생, 삼차원 지지체

Description

중간엽 줄기세포와 초음파 자극을 이용하여 연골조직을 재생하는 방법{Method For Cartilage Regeneration Using Mesenchymal Stem Cells and Ultrasound Stimulation}

도 1은 본 발명에 따른 PGA/MSCs 구조물(삼차원 지지체)이 주입된 누드마우스의 등부위를 초음파로 처리하는 것을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 PGA/MSCs 구조물이 주입된 누드마우스에서 회수한 PGA/MSCs 구조물의 사진이다.

도 3은 본 발명에 따른 PGA/MSCs 구조물이 주입된 누드마우스에서 회수한 PGA/MSCs 구조물의 총 단백질함량(B)을 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 PGA/MSCs 구조물이 주입된 누드마우스에서 회수한 PGA/MSCs 구조물의 총 GAG 함량(B) 및 콜라겐 함량(C)을 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명에 따른 PGA/MSCs 구조물이 주입된 누드마우스에서 회수한 PGA/MSCs 구조물을 사프라닌-0/패스트 그린(safranin 0/fast green)으로 염색한 사진이다.

도 6은 본 발명에 따른 PGA/MSCs 구조물이 주입된 누드마우스에서 회수한 PGA/MSCs 구조물의 타입 Ⅱ 콜라겐을 현미경으로 관찰한 사진이다.

도 7은 본 발명에 따른 PGA/MSCs 구조물이 주입된 누드마우스에서 회수한 PGA/MSCs 구조물의 압축력을 나타낸 것이다.

줄기세포(stem cell)란 조직을 구성하는 각 세포로 분화되기 전단계의 세포로서, 미분화 상태에서 무한 증식이 가능하고 특정 분화 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재적 가능성을 가진 세포를 말한다.

줄기세포는 분화 가능성에 따라 크게 배아 줄기세포(embryonic stem cell; ES cell)와 조직 특이적 줄기세포(tissue-specific stem cell)로 나뉜다. 배아 줄기세포는 수정란이 형성된 후 자궁내막에 착상하기 전의 초기 단계인 포배기(blastocyst) 배아중 태아로 발생할 세포괴(inner cell mass; ICM)로부터 분리된 줄기세포로서, 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 가지고 있는 세포이 다.

반면, 조직 특이적 줄기세포는 배아 발생 과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계에 나타나는 각 장기에 특이적인 줄기세포로서, 그 분화능이 일반적으로 그 조직을 구성하는 세포로만 한정(multipotent)된다. 대표적인 조직 특이적 줄기세포는 골수(bone-marrow)에 존재하는 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell)와 혈구 세포 이외의 결합조직(connective tissue) 세포로 분화되는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)가 있다. 조혈 줄기세포는 적혈구, 백혈구등 각종 혈구 세포로 분화되고, 중간엽 줄기세포는 골아세포(osteoblast), 연골아세포(chondroblast), 지방세포(adipocyte) 및 근아세포(myoblast) 등으로 분화된다.

근래에 들어 인간으로부터 배아 줄기세포 분리가 성공한 이후, 그 임상적 적용에 관심이 고조되고 있다. 줄기세포의 적용 분야로서 가장 주목받고 있는 것은 세포 대체요법을 위한 세포 공급원으로서의 이용이다.

줄기세포에서 연골세포로의 분화에는, 사이토카인과 기계적 자극을 포함하는 여러 성장인자들이 관여하고 있다. 정확한 메카니즘은 밝혀지지 않고 있으나, 연골세포로의 분화에 있어서 TGF-β(transforming growth factor beta), IGF(insulin-like growth factor), BMP(bone morphogenic protein), FGF(fibroblast growth factor) 등이 중요한 역할을 담당한다고 알려져 있다(Roberts A.B., Cytokine and Growth Factor Rev., 13:3, 2002). 그러나 이러한 TGF-β와 같은 성장인자들은 그 자체가 매우 고가일뿐만 아니라, 세포의 노화를 오히려 촉진하여 세포 생존률의 감소를 동반하여 임상적 이용에 제한이 있을 수 있다.

한편, 연골세포에 전단류 응력을 가하면 연골생성이 촉진된다는 보고 (WO 98/22573A1)와 중간엽 줄기세포에 생물기계적인 자극을 가하면 연골형성이 효율적으로 이루어진다는 보고가 있는바, 손상된 무릎관절에 기계적 자극을 주면 손상된 조직이 효과적으로 수복되고, 주기적인 압박을 주면 내인성 TGF-β가 유도되어 골수유래 중간엽 줄기세포의 연골형성이 촉진된다는 보고(Angle P. et al., J. Orthop. Res., 21:451, 2003)이다. 그러나 위 보고의 경우 환자의 사용편의성을 고려하기 곤란하여 임상적 이용에 제한이 있을 수 있다.

이러한 물리적 자극들 중에 초음파는 조직 내의 세포를 기계적으로 자극시킬 수 있는 수단으로 뼈의 성장, 골절, 근육 조직의 치유 등 손상된 조직의 수복에 효과적인 것으로 알려져 있다. 저강도 초음파가 연골세포에 의해서 aggrecan mRNA 발현과 proteoglycan 합성을 촉진시키고 연골내 골화 (endochondral ossification)를 촉진시켜 골절유합을 촉진한다 (J. Orthop. Res. 17:488, 1999). 또한 골절의 수복에 있어서 연골세포의 증식을 촉진하여 골융합을 촉진시키는 것 또한 알려져 있다. 그러나 이와 같은 연구결과들에서도 초음파의 연골조직생성효과가 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로의 분화를 촉진할 가능성에 대해서는 검토하지 않았다.

중간엽 줄기세포에 초음파를 처리한 예로는 인간 중간엽 줄기세포의 펠렛 배양시 TGF-β에 의해 분화가 유도된 연골세포에 초음파를 처리하여 연골세포의 분화를 촉진시킨 것(Ebisawa K. et al., Tissue Engineering, 10:921, 2004), 성장인자인 TGF-β를 사용하지 않고 단독으로 초음파를 처리하여 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법(대한민국 특허출원 2004-0090207) 등이 있다. 그러나 상 기 특허출원에서는 실제 in vivo조건에서 탐색되지 않아 in vitro 분화 후 체내로 삽입하는 외과적인 수술인 반면, in vivo조건에서 분화속도와 분화율을 탐색함으로서 체외의 조작을 최소로하고 세포를 체내에 삽입하여 체내분화를 증진시킴으로서 기대할 수 있는 세포를 체내에 삽입하여 체내분화를 증진시킴으로서 기대할 수 있는 세포의 최소조작(minimum manipulation)효과와 자가치료의 효과를 기대하기 어렵다.

이에, 본 발명자들은 중간엽 줄기세포를 in vivo상에서 분화시키는 과정에 서, 분화속도 및 분화율을 향상시킬 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 in vivo상에서 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 과정에서, 분화속도 및 분화율을 향상시킬 수 있는 연골세포의 분화방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 함유하는 연골질환 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 중간엽 줄기세포를 단층 배양한 다음, 상기 단층배양된 중간엽 줄기세포를 원심분리하여 세포펠렛을 수득하는 단계; (b) 상기 중간엽 줄기세포의 세포펠렛을 생분해성 고분자 입자를 함유하는 배지에서 배양하여 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 제조하는 단계; (c) 상기 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 인간을 제외한 동물에 주입하는 단계 및 (d) 상기 동물의 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체 주입부위를 초음파로 처리하여 연골세포로의 분화를 촉진시키는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 중간엽 줄기세포를 단층 배양한 다음, 상기 단층배양된 중간엽 줄기세포를 원심분리하여 세포펠렛을 수득하는 단계; (b) 상기 중간엽 줄기세포의 세포펠렛을 생분해성 고분자 입자를 함유하는 배지에서 배양하여 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 제조하는 단계를 거쳐 제조되는, 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 함유하는 연골 질환 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 또한, (a) 중간엽 줄기세포를 단층 배양한 다음, 상기 단층배양된 중간엽 줄기세포를 원심분리하여 세포펠렛을 수득하는 단계; (b) 상기 중간엽 줄기세포의 세포펠렛을 생분해성 고분자 입자를 함유하는 배지에서 배양하여 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 제조하는 단계; (c) 상기 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 인간을 제외한 동물에 주입하는 단계 및 (d) 상기 동물의 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체 주입부위를 초음파로 처리하여 뼈세포로의 분화를 촉진시키는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 뼈세포를 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 분화된 연골세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 인공관절의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 포어(pore)를 가진 삼차원 합성고분자 또는 포어(pore)를 가진 삼차원 천연고분자인 것을 특징으로 할 수 있고, PGA(polyglycolic acid), PLA(polylatic acid), PCL(polycaprolactone), polylatic acid/polyglycolic acid, 히알유론산(hyaluronic acid), 콜라겐, 알지네이트 및 이들의 공중합체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 중간엽 줄기세포는 배아, 성체조직, 또는 골수 유래인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 연골질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 초음파는 파장 10kHz~100MHz, 출력강도 10~5000 mW/cm² 인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 초음파 처리는 6~24시간 간격으로 1~30분간, 3~50일 동안 연속하여 실시하는 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 본 발명에 따라 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

먼저, 중간엽 줄기세포를 이용하여 연골세포를 분화시키기 위해서, 단층배양된 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 제조하여 동물에 주입하고, 연골세 포로의 분화를 유도하기 위한 물리적 자극 중 저강도 초음파를 처리한다. 이 과정에서 연골세포 분화의 특이적인 기질인 타입 Ⅱ 콜라겐이 발현하고, 단백질 함량 및 GAG(glycosaminoglycan) 함량이 증가하게 된다.

본 발명에 바람직하게 사용되는 PGA는 생체내에서 분해되어 생체에 저절로 흡수되는 성질을 가지고 있다. 중간엽 줄기세포가 고정된 생분해성 고분자입자를 생체내에 이식함으로서, 생분해성 고분자가 생체내에서 지지체 역할을 수행하여 연골세포로의 분화를 촉진하게 된다.

본 발명의 초음파 처리는 시중에서 판매되고 있는 초음파 치료기에 의해 수행될 수 있으며, 연골세포로의 분화하고자 하는 배양환경을 제공하여 연골화 분화를 촉진하는 작용을 한다.

중간엽 줄기세포는 연골세포 이외에 뼈조직을 생산하는 조골세포를 거쳐 뼈세포로 분화하는 세포이다. 골절 후 뼈조직이 재생되는 과정 중에 가장 먼저 생성되는 것이 연골세포이다. 이후, 뼈조직의 재생이 진행된다. 현재 미국에서 상품화된 초음파치료기가 골절 치료제로 시판되고 있으며, 초음파가 연골세포 외에 뼈세포로의 분화도 촉진할 것으로 사료된다. 그러므로, 본 발명의 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법은 중간엽 줄기세포를 뼈세포로 분화시키는 데도 이용될 수 있다.

본 발명에 의해 중간엽 줄기세포를 관절형태의 삼차원 지지체 상에서 연골세포로 분화시키면 인공관절을 제조할 수 있다.

본 발명의 방법으로 생산된 중간엽 줄기세포가 고정된 생분해성 고분자를 이용하여 치료할 수 있는 연골 질환으로는 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합, 외상에 의한 관절손상 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 사용하였으나, 배아 유래 줄기세포, 근육, 지방, 신경조직 등 성체조직에서 유래되는 줄기세포 등의 다른 중간엽 줄기세포를 사용할 수 있는 것은 당해분야 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)의 분리 및 배양

중간엽 줄기세포는 2주령의 암컷으로 뉴질랜드산 흰토끼(중앙실험동물세터, 한국)에서 분리하였다. 경골과 대퇴골로부터 분리한 골수천자액은 5%아세트산에 현탁시킨 다음, 1,500rpm에서 5분동안 원심분리하여 적혈구를 제거하고, 중간엽 줄기세포를 수득하였다.

상기 중간엽 줄기세포를 항생제 및 10% NCS(new-born calf serum)가 포함된 α-MEM(Minimum essential medium eagle alpha modification; Sigma, USA)에 현탁 시키고, 1.5×10⁷ 농도로 조직배양 평판에 분주한 후, 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 2주동안 배양하였다.

배양 14일 후, 일차 배양된 세포를 0.05% 트립신-EDTA(Gibco-BRL Life Technologies, USA)로 처리한 후, 1,500 rpm에서 5분간 원심분리하여 펠렛을 형성시켰다. 세포 펠렛은 플레이트당 1.5×10⁶ 세포농도로 평판배양하고 일주일에 세 번씩 배지를 교환하였다. 두 번째 계대 배양된 세포들을 PGA mesh에 주입하였다.

실시예 2. PGA/MSCs 구조물의 제조방법

중간엽 줄기세포는 그 분화를 용이하게 하기 위하여, 하기의 방법으로 PGA(non-woven mesh)를 이용하여 3차원 배양을 수행하였다.

PGA(mesh)를 6mm×6mm×3mm의 형태로 세절한 다음, 멸균하기 위해서 4℃에서 70% 알콜에 10시간 담궈두었다. 상기의 과정을 거친 PGA를 항생제를 함유한 PBS로 3번 세척한 다음, DMEM(Dulbecco's modifided eagle medium, Gibco, New York)에 넣고 37℃ 항온기에서 12시간 두었다.

실시예 1에서 계대배양한 중간엽 줄기세포를 PGA 골격당 5×10⁶ 세포농도로 분주한 다음, 배양배지(chondrogenic-defined medium, DMEM supplemented with ITS, 50ug/ml ascorbate 2-phosphate, 100nM dexamethasone, 40mg/ml proline, 1.25mg/ml BSA, 및 10% NCS)에서 일주일 동안 배양하여 중간엽 줄기세포(MSCs)가 고정된 PGA(PGA/MSCs 구조물)(삼차원 지지체)를 수득하였다.

실시예 3. PGA/MSCs 구조물 주입과 초음파 자극

실시예 2에서 수득된 PGA/MSCs 구조물을 주입하기 위하여, 5주령된 수컷 누드마우스는 케타민과 하이드로클로라이드로 마취시킨 후, 등피부의 피하조직을 절개하였다. 누드마우스 한 마리당 4번 주입하였으며, 두 번은 등의 왼쪽부위에 세로로, 다른 두 번은 오른쪽 부위에 주입하였다. 다음으로, 초음파로 먼저 10분간 왼쪽을 자극한 다음, 10분간 오른쪽을 자극하였다(도 1). 도 1에서 삼각형 표시는 PGA/MSCs 구조물의 주입 부위를 나타내며, 초음파가 잘 전달될 수 있도록 초음파용 젤을 사용하였다.

그 결과, 누드마우스에 주입된 PGA/MSCs 구조물은 초음파를 처리한 군과 처리하지 않은 군에서 시간이 지남에 따라 크기와 모양이 변했으며, 전체적인 크기는 점차적으로 줄어들고 모양은 둥글게 변했다. 이는 PGA(mesh)의 분해, 새로운 물질의 합성 및 연골 ECM(Extra cellular matrix)의 축적때문으로 사료된다. 또한, 상기 PGA/MSCs 구조물은 1주차 및 2주차에서는 초음파를 처리한 군(US)과 처리하지 않은 군(Control)에서 특별한 변화를 보이지 않은 반면, 4주차에서는 초음파를 처리한 군(US)에서 연골관절의 조직이 형성되었다(도 2).

본 실시예에서 사용한 초음파 처리기기는 콘트롤박스에 강도와 시간을 조절하는 조절기와 세 개의 트랜스듀서를 가지고, 한 개의 직경 5cm의 트래스듀서를 포 함하는 초음파 처리기인 Noblelife^TM(듀플로젠, 한국)을 사용하였다. 중간엽 줄기세포에 대한 초음파 처리는 0.8MHz의 주파수 및 200mW/cm²의 출력강도로 매일 4주동안 연속하여 실시하였다.

실시예 4. 총 단백질 함량 측정

실시예 3에 따라 누드마우스에 주입된 PGA/MSCs 구조물을 초음파 자극 마지막 주인 4주차에 다시 회수하여 함수 중량을 측정하였으며, 생화학적 성질을 측정하기 전에 액체질소를 이용하여 즉시 동결시켰다. 동결된 PGA/MSCs 구조물은 소디움 포스페이트 버퍼용액(5mM EDTA, 5mM L-cysteine-HCl 및 125g/ml of papain)을 포함한 파파인 소화 용액(papain digestion solution)에서 60℃, 24시간 동안 완전히 효소분해시켰다.

총 단백질 함량은 BCA(bicinchoninic acid) 프로테인 어세이 방법을 통해 측정하였다(Shihabi, Z.K. and Dyer, R.D., Ann. Clin. Lab. Sci., 18:235, 1988). 효소 분해된 PGA/MSCs 구조물을 BCA 시약으로 30분동안 실온에서 처리하고, 562 nm에서 흡광도값을 측정하였다. BSA(bovine serum albumin)의 검량곡선은 0~1.6 mg/mL 범위에서 사용하였다.

그 결과, 총 단백질 함량은 초음파 처리군과 비처리군 모두에서 점차적으로 증가하였고, 특히 4주차에는 초음파를 처리한 군(US) 과 처리하지 않은 군(Control)에서 유의적인 차이를 나타냈다(도 3). 이는 타입 Ⅱ 콜라겐을 포함한 변 조단백질 발현에 있어서, 저주파의 초음파가 관여한 것에 기인한 것으로 사료된다.

실시예 5. 총 콜라겐과 GAG(Glycosaminoglycan) 함량 측정

실시예 4에 따라 효소분해된 PGA/MSCs 구조물의 총 콜라겐 함량은 Heide tullberg-reinert 방법으로 측정하였다(Heide, T.R. and Gernot, J., Histochem. Cell Biol., 112:271, 1999). 상기 효소분해된 PGA/MSCs 구조물을 시리우수 래드 다이 용액(Sirius red dye solution)과 같이 96웰 플레이트에서 건조한 후, 염색용액으로 1시간동안 반응시켰다. 염색된 PGA/MSCs 구조물의 흡광도는 550 nm에서 측정하였다. 총 콜라겐 함량은 0~100 ㎍/mL 범위에서 소혈청 알부민의 표준직선으로 나타냈다.

또한, 효소분해된 PGA/MSCs 구조물의 총 GAG 함량은 DMB(1,9-dimethylmethylene blue) 컬러메트릭 방법으로 측정하였다(Farndale, R.W. et al., Biochim. Biophys. Acta., 883:173, 1986). 상기 효소분해된 PGA/MSCs 구조물을 DMB 용액과 혼합한 다음, 525 nm에서 흡광도값을 측정하였다. 총 GAG 함량은 상어 콘드로이친 설페이트(Shark chondroitin sulfate)의 표준도표를 사용하였다.

그 결과, 총 GAG 함량(mg/mg)은 초음파를 처리한 군(US)에서 시간이 지날수록 뚜렷하게 증가했으며, 특히 2주차와 4주차에서 비처리군과 유의적인 차이를 나타냈다(도 4A) . 총 GAG 함량은 2주차 및 4주차에서 초음파를 처리하지 않은 군(Control)은 각각 8.2±0.5 및 13.5±1.5를 나타낸 반면, 초음파를 처리한 군(US)은 각각 20.1±2.8 및 25.8±2.9를 나타냈다. 또한, 4주차의 총 콜라겐 함량은 처 리군와 비처리군에서 각각 34.8±2.7 및 29.8±2.3으로 유의적인 차이를 나타내지 않았다(도 4B).

실시예 6. 조직학적 및 면역조직세포학적 측정

실시예 3에 따라 누드마우스에 주입된 PGA/MSCs 구조물을 4% 포름알데하이드에서 48시간동안 고정시켰다. 고정된 시료를 탈수시킨 후, 파라핀 왁스에 담갔다. 시료가 포함된 파라핀을 5㎛ 두께로 절단하여 절편을 만들었으며, 그 중 일부 절편은 조직학적 분석을 위하여 사프라닌-0/패스트 그린(safranin-0/fast green)으로 염색하였다.

다른 절편들은 연골세포 분화표식 인자인 타입 Ⅱ 콜라겐의 발현을 확인하기 위한 면역조직화학적 분석에 사용하였다. 절편은 PBS로 세척한 다음, 3% 과산화수소로 처리하였다. 그 후, 조직의 투과성을 높이기 위해 0.15% 트리톤 X-100과 반응시켰다.

면역과산화효소 염색은 1% BSA(bovine serum albumin)으로 30분간 반응시켜 비특이적 결합을 블로킹시킨 후, 절편 슬라이드는 마우스 항-인간 타입 Ⅱ 콜라겐 모노 클로날 항체(Chemicon, CA)와 1:500으로 희석시켜서 1시간 배양하였다. 상기 일차 항체로 처리된 절편을 200배 희석된 biotinylated 2차 항체(DAKO LSAB System, CA)와 실온에서 1시간 배양하였다.

상기 이차항체로 처리된 절편은 PBS로 세척한 다음, 스트렙타비딘(Streptavidin) 용액과 접합한 펄옥시다아제(peroxidase)와 실온에서 30분간 반응 하였다. 반응한 절단면은 Mayer's hematoxylin(Sigma, USA)으로 대조염색하여, 현미경(Nikon E600, Japan)으로 관찰하였다.

PGA/MSCs 구조물로부터 연골 ECM(Extra cellular matrix)의 합성이 진행되는 것을 확인하기 위해 사프라닌-0/패스트 그린으로 염색하였다. 초음파를 처리하지 않은 군에서는 4주차까지 특징적인 래드 염색이 나타나지 않은 반면에, 초음파를 처리한 군에서는 2주차에 래드 염색이 나타났으며, 4주차에는 래드 염색이 짙어지고 고르게 분포하였다.

타입 Ⅱ 콜라겐을 확인하기 위한 면역조직화학 방법으로서 단백질 발현을 통해 타입 Ⅱ 콜라겐을 확인하였으며, 초음파 처리군과 비처리군 모두 점진적으로 타입 Ⅱ 콜라겐이 증가하였다. 초음파를 처리한 군에서는 2주차에 타입 Ⅱ 콜라겐이 국소적 범위에서 양성적 반응을 보였으며, 4주차에는 타입 Ⅱ 콜라겐이 더욱 넓게 분포하였다(도 6).

실시예 7. 기계적 강도측정

누드마우스로부터 회수된 PGA/MSCs 구조물에 대하여 Universal Testing Machine(Model H5K-T, U.K)을 통해 제한되지 않은 압축으로 실험을 행하였다. 기계의 바닥에 상기 PGA/MSCs 구조물을 내려놓은 다음, 분당 1mm의 속력으로 압축을 가했다. 기계는 최고와 최저압축으로 프로그램시킨 다음 자동으로 멈추도록 하였다. 최고 세기는 하중량에 따른 곡선으로 계산하였고, 이에 따라 개별 압축력을 계산하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 회수된 PGA/MSCs 구조물은 초음파 처리군(US)과 비처리군(Control)에서 압축력이 모두 증가하는 경향을 보였으나, 초음파 처리군에서 압축력 증가 폭이 더욱 크게 나타났다. 즉, 초음파를 처리하지 않은 군은 2주차와 4주차에서 압축력이 각각 1.06±0.1 및 1.69±0.16인 반면, 초음파 처리군은 각각 1.85±0.07 및 2.25±0.13을 나타냈다.

상기 모든 실험의 통계 처리 분석은 ANOVA(one-way analysis of variance), Student-Newman-Keuls test 및 t test를 통해 통계처리를 하였다. 통계적 유의도는 5% 미난이며 개별적인 수치로는 1% 미만의 유의도를 나타내었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화하는 과정에서, 기존에 사용하였던 고가의 성장인자를 사용하지 않고도 in vivo상에서 분화속도 및 분화율을 효과적으로 향상시킬 수 있는 연골세포의 분화방법을 제공하는 효과가 있다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법:

(a) 중간엽 줄기세포를 단층 배양한 다음, 상기 단층배양된 중간엽 줄기세포를 원심분리하여 세포펠렛을 수득하는 단계;

(b) 상기 중간엽 줄기세포의 세포펠렛을 포어(pore)를 가진 삼차원 생분해성 합성고분자 또는 포어(pore)를 가진 삼차원 천연고분자를 함유하는 배지에서 배양하여 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 제조하는 단계;

(c) 상기 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 인간을 제외한 동물에 주입하는 단계; 및

(d) 상기 동물의 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체 주입부위를 초음파로 처리하여 연골세포로의 분화를 촉진시키는 단계.
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제1항에 있어서, 고분자는 PGA(polyglycolic acid), PLA(polylatic acid), PCL(polycaprolactone), polylatic acid/polyglycolic acid, 히알유론산(hyaluronic acid), 콜라겐, 알지네이트 및 이들의 공중합체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 초음파는 파장 10kHz~100MHz, 출력강도 10~5000mW/cm²인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 배아, 성체조직, 또는 골수(bone-marrow) 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 초음파 처리는 6~24시간 간격으로 1~30분간, 3~50일 동안 연속하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 중간엽 줄기세포를 단층 배양한 다음, 상기 단층배양된 중간엽 줄기세포를 원심분리하여 세포펠렛을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 중간엽 줄기세포의 세포펠렛을 포어(pore)를 가진 삼차원 생분해성 합성고분자 또는 포어(pore)를 가진 삼차원 천연고분자를 함유하는 배지에서 배양하여 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 제조하는 단계를 거쳐 제조된, 중간엽 줄기세포가 고정된 삼차원 지지체를 함유하는 연골질환 치료용 조성물.
삭제
제7항에 있어서, 상기 고분자는 PGA(polyglycolic acid), PLA(polylatic acid), PCL(polycaprolactone), polylatic acid/polyglycolic acid, 히알유론산(hyaluronic acid), 콜라겐, 알지네이트 및 이들의 공중합체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서, 상기 연골질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제1항의 방법으로 분화된 연골세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 인공관절의 제조방법.