KR100673565B1 - 인터페론-감마의 항암작용 개선제 및 상기 항암작용 개선제와 인터페론-감마를 유효성분으로 함유하는 항암제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인터페론-감마의 항암작용 개선제 및 상기 항암작용 개선제와 인터페론-감마를 유효성분으로 함유하는 항암제용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 강낭콩에서 유래한 렉틴인 파이토헤마글루티닌과 인터페론-감마를 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 파이토헤마글루티닌은 암 치료 등에 많이 사용되는 인터페론-감마 제제에 함유되어 부작용이 없이 낮은 용량으로도 효과적으로 인터페론-감마에 의한 항암 효과를 상승시키는데, 인터페론-감마 단독 투여량의 1/30인 소량의 인터페론-감마에 소량의 파이토헤마글루티닌을 첨가한 복합제제는 인터페론-감마 단독 투여보다 항암 효과가 더 크므로 과량의 인터페론-감마 투여로 인한 많은 부작용도 완화시킬 수 있으며, 인터페론-감마에 의한 암의 치료 효과를 개선하고, 소량의 인터페론-감마 투여로 인해 환자의 의료 부담을 크게 덜어줄 수 있다.

강낭콩 유래의 렉틴, 파이토헤마글루티닌, 인터페론-감마, 인터페론-감마에 유효한 항암 보조제, 항암제용 약학적 조성물

Description

인터페론-감마의 항암작용 개선제 및 상기 항암작용 개선제와 인터페론-감마를 유효성분으로 함유하는 항암제용 조성물 {Medicament improving the anti-tumour action of interferon-gamma, and anti-cancer composition comprising interferon-gamma and the medicament}

도 1은 대식세포로부터 종양살해를 매개하는 유도성 질소산화물 합성효소 (inducible nitric oxide synthase; iNOS)의 생산에 파이토헤마글루티닌이 미치는 농도 의존성 (a 및 b) 및 시간 의존성(c 및 d) 효과를 나타낸 것이다.

a 및 c: 면역 블럿팅의 결과;

b 및 d: 상기 데이타의 광 농도 측정 분석

도 2는 대식세포로부터 유도성 질소산화물 합성효소 (iNOS)의 생산에 미치는 인터페론-감마의 농도 의존성 (a 및 b) 및 시간 의존성 (c 및 d) 효과를 나타낸 것이다.

a 및 c: 면역 블럿팅의 결과;

b 및 d: 상기 데이타의 광 농도 측정 분석

도 3은 대식세포로부터 종양살해물질인 질소산화물 (nitric oxide; NO)의 생 산 및 분비에 파이토헤마글루티닌이 미치는 농도 의존성 (a) 및 시간 의존성(b) 효과를 나타낸 것이다.

도 4는 대식세포로부터 질소산화물 (NO)의 생산 및 분비 유도에 미치는 인터페론-감마의 농도 의존성 (a) 및 시간 의존성 (b) 효과를 나타낸 것이다.

도 5는 인터페론-감마에 의한 대식세포로부터 유도성 질소산화물 합성효소 (iNOS) 유전자의 mRNA 발현 유도에 파이토헤마글루티닌이 미치는 증강 효과를 나타낸 것이다.

a: 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)의 결과;

b: 상기 데이타의 광 농도 측정 분석 결과

도 6은 인터페론-감마에 의한 대식세포로부터 유도성 질소산화물 합성효소 (iNOS)의 생산 유도에 파이토헤마글루티닌이 미치는 증강 효과를 나타낸 것이다.

a: 면역 블럿팅의 결과;

b: 상기 데이타의 광 농도 측정 분석 결과

도 7은 인터페론-감마에 의한 대식세포로부터 질소산화물 (NO)의 생산 유도에 파이토헤마글루티닌이 미치는 증강 효과를 나타낸 것이다.

도 8은 인터페론-감마에 의한 대식세포로부터 질소산화물 (NO)의 생산 유도에 파이토헤마글루티닌이 미치는 증강 효과 및 높은 농도의 인터페론-감마의 효과를 비교하여 나타낸 것이다.

도 9는 인터페론-감마에 의한 대식세포로부터 육종암 사코마-180 (Sarcoma-180)의 살해에 파이토헤마글루티닌이 미치는 증강 효과를 나타낸 것이다.

도 10은 파이토헤마글루티닌이 실험 동물의 비장세포에 미치는 독성을 농도에 따른 생존율 그래프로 나타낸 것이다.

도 11은 파이토헤마글루티닌이 실험 동물의 간 조직에 미치는 독성(GOT, GPT)을 그래프로 나타낸 것이다.

도 12는 파이토헤마글루티닌이 실험 동물의 신장 조직에 미치는 독성(CRE, BUN)을 그래프로 나타낸 것이다.

도 13은 파이토헤마글루티닌이 미성숙 실험 동물의 성장에 미치는 영향을 체중 변화로 나타낸 것이다.

도 14는 파이토헤마글루티닌이 성숙 실험동물의 성장에 미치는 영향을 체중 변화로 나타낸 것이다.

본 발명은 인터페론-감마의 항암작용 개선제 및 상기 항암작용 개선제와 인터페론-감마를 유효성분으로 함유하는 항암제용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 강낭콩에서 유래한 파이토헤마글루티닌 (phytohemagglutinin; 이하 "PHA"라고 약칭함)과 인터페론-감마를 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

인터페론-감마 (interferon-γ)는 면역조절물질인 사이토카인 (cytokines)의 한 종류로서, 임상적으로 림프구들과 기타 면역세포들의 활성을 강화하거나 (Wu L. et al., Science, 309(5735): 774 ~ 7, 2000년 7월 29일), B형 및 C형 만성 간염 등의 급성 염증을 억제하거나, 다발성 골수종 등을 포함한 각종 암 및 박테리아나 진균성 질환을 치료하는 데 널리 이용되고 있다. 그러나 아직 인터페론-감마의 치료 효과는 별로 높지 않는 것으로 보고되어 있다. 예를 들어, C형 만성 간염에 있어서는 치료 효율이 29% 그리고 다발성 골수종에 있어서는 그 효율이 약 20% 에 지나지 않는다고 알려졌다 (일본의약정보센터편, 2003년판 일본의약품집, 야쿠교지호사 2002년).

특히 인터페론-감마는 약효를 나타내는 반감기 (half life)가 짧기 때문에 고용량으로 자주 그리고 오랜 기간 동안 경구 투여하거나 혈관 주사를 해야 하기 때문에 열, 설사, 혼수상태 등의 수많은 부작용을 초래한다. 이러한 인터페론-감마의 문제점을 감안하여 상기 부작용을 완화하여 인터페론의 치료 효과를 증진시키는 보조제에 대한 연구가 많이 수행되고 있긴 하지만 아직까지 별다른 성과를 거두지 못하고 개발 단계에 있는 실정이다.

면역 증강제는 그 개념이 로만 (Roman)에 의해 처음 제시된 바 있고 (Roman G., Bull. Soc. Centr. Med. Vet., 101, 277, 1925년), 항원에 대한 세포성 및 체액성 면역능을 상승시킬 수 있는 모든 물질을 일컫는다 (Rajesh K. Gupta et. al., Vaccine, 11: 293, 1993년). 이와 같이 항원에 대하여 생체 내에서 일어나는 여러 가지 면역 작용을 상승시키는 면역 증강제의 작용 기전으로는, 대표적으로 항원 제공 세포 (예로 대식세포 등)의 활성화와 림프구에 대한 특이적인 활성 효과 등을 들 수 있다 (Waksman B. H., Springer Semin, Immunopathol., 2: 5, 1979년; Bomford, R., Clin. Exp. Immunol., 39: 435, 1980년).

한편, 파이토헤마글루티닌 (phytohemagglutinin, PHA)은 강낭콩에서 유래된 렉틴으로서 T 림프구의 증식인자 (mitogen)로서 알려져 있고, 다른 면역 반응에도 관여하고 있으며, 면역 증강 작용이 있다고 보고되었다 (Gerlag D. M. et al., J. Immunol., 165(3): 1652 ~ 8, 2000년 8월 1일; Linderoth A. et al., J. Pediatr. Gastroenterol Nutr., 41(2): 195 ~ 203, 2005년 8월).

이에 본 발명자들은 기존의 면역 활성제의 효능을 증진시키는 면역 증강제를 개발하기 위하여 노력을 계속한 결과, 항암제로도 사용되는 인터페론-감마를 강낭콩에서 유래한 혈구응집물질인 렉틴의 일종인 파이토헤마글루티닌을 함께 사용하면 부작용이 없이 단독으로 사용할 때보다 1/30의 낮은 농도로도 항종양 물질의 생산이 증가하고 항암 효과가 크게 상승되는 점을 확인하고, 파이토헤마글루티닌의 유효 성분을 포함하는 항암 보조제 및 이와 함께 인터페론-감마를 함유하는 항암제용 약학적 조성물을 제공함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다.

본 발명은 파이토헤마글루티닌 (phytohemagglutinin, PHA)의 유효 성분을 포함하는 항암 보조제 및 이와 함께 인터페론-감마를 함유하는 항암제용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 파이토헤마글루티닌 및 인터페론-감마를 유효 성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 파이토헤마글루티닌에는 강낭콩에서 유래한 혈구응질물질인 파이토헤마글루티닌 및/또는 그의 유도체 등이 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용한 인터페론-감마는 천연 인터페론-감마, 유전자 재조합으로 생산된 인터페론-감마 및/또는 인터페론-감마의 활성을 가지는 인터페론-감마 유도체 등을 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 파이토헤마글루티닌 및 인터페론-감마를 유효 성분으로 함유 하는 종양살해물질의 생산을 상승시키는 항암제용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 육종암을 포함한 종양의 치료에 사용하는 용도를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 파이토헤마글루티닌 (phytohemagglutinin; PHA)의 유효 성분을 함유하는 면역 활성제의 작용을 상승시키는 항암 보조제를 제공한다.

본 발명에서 사용한 파이토헤마글루티닌은 강낭콩에서 유래한 렉틴인 혈구응집물질 파이토헤마글루티닌 및/또는 면역 증강의 활성을 가지는 파이토헤마글루티닌 유도체 등을 포함한다.

바람직하게, 본 발명은 강낭콩에서 유래한 파이토헤마글루티닌을 유효 성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공한다. 이 때 상기 파이토헤마글루티닌은 시그마사 (미국) 제품을 구입하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 파이토헤마글루티닌의 유효 성분을 함유하여 항암제 및 항종양제의 효과를 증진시키는 인터페론-감마에 유효한 항암 보조제를 제공한다.

본 발명에서 항암제 등으로 사용한 인터페론-감마는 천연 인터페론-감마, 유전자 재조합으로 생산된 인터페론-감마 및/또는 인터페론-감마의 활성을 가지는 인터페론-감마 유도체 등을 포함한다.

구체적으로, 본 발명에서는 강낭콩에서 유래한 렉틴의 일종인 파이토헤마글루티닌이 인터페론-감마가 대식세포에 작용하여 질소산화물 (nitric acid; 이하 "NO"라고 약칭함)을 포함한 종양살해물질의 생산을 증가시키고 약제의 안정성을 부여하여 항암 효과를 상승시키는 것을 확인한다 (도 1 ~ 도 9 참조). 또한, 상기 파이토헤마글루티닌이 세포 독성, 간 독성 및 신장 독성 등을 나타내지 않을 뿐만 아니라 미성숙 및 성숙한 실험 동물에서도 그 성장에 어떠한 저해 활성도 나타내지 않은 것을 검증하였다 (도 10 ~ 도 14 참조). 따라서, 본 발명의 항암 보조제는 인체에 안전하고 부작용이 없으며 동시에 인터페론-감마의 항암 활성을 효과적으로 상승시키는 항암제용 조성물에 유효 성분으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항암 보조제 및 항암제의 유효 성분을 함유하고 이에 약학적으로 허용 가능한 담체, 안정제 및 완충제 등을 추가로 포함하는 항암제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 항암 보조제로는 강낭콩에서 유래한 렉틴인 파이토헤마글루티닌 및/또는 면역 증강의 활성을 가지는 파이토헤마글루티닌 유도체 등이 사용될 수 있고, 바람직하게는 강낭콩에서 유래한 혈구응집물질인 파이토헤마글루티닌이 사용된다.

본 발명에서 상기 항암제로는 인터페론-감마 등이 사용되고, 이 때 인터페론-감마는 천연 인터페론-감마, 유전자 재조합으로 생산된 인터페론-감마 및/또는 인터페론-감마의 활성을 가지는 인터페론-감마 유도체를 포함한다.

바람직하게, 본 발명의 항암제용 약학적 조성물은 상기 항암 보조제 및 항암제 또는 항종양제를 1,000 : 1 내지 100,000: 1 의 무게비율로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항암제용 약학적 조성물을 항종양제 등으로 사용하는 용도를 제공한다.

본 발명의 항암제용 약학적 조성물은 경구 투여할 수 있는 정제, 캡슐제 또는 수액제 등의 제제로서 제공될 수 있다.

또한, 본 발명의 항암제용 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있는 정맥 주사 또는 피하 주사용 액제 또는 현탁액 등의 제제로서 제공될 수 있다.

또한, 본 발명의 항암제용 약학적 조성물은 비강내 투여할 수 있는 액체 액적 (droplet) 흡입용 스프레이 또는 흡입용 분말 형태 등의 제제로서 제공될 수 있다.

또한, 본 발명은 파이토헤마글루티닌을 포함한 기타 항암 또는 항종양 보조제를 검색하는 방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 항암제를 검색하는 방법을 제공할 수 있다. 바람직하게는, 파이토헤마글루티닌 또는 이와 유사한 물질 그리고 인터페론-감마 또는 이와 유사한 항암 활성 물질을 함유하는 항암제 또는 항종양제 등를 검색하는 방법을 제공할 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 인터페론-감마가 대식세포에서 종양살해물질을 생산 유도하는 데 있어서 파이토헤마글루티닌이 항암 상승 효과 (synergistic effect)가 있음을 보여주기 위하여, 다음과 같은 효능 검사들을 수행한다: (1) 일차면역 반응세포인 대식세포에서 파이토헤마글루티닌과 인터페론-감마가 유도성 질소산화물 합성효소 (inducible nitric oxide synthase; 이하 "iNOS"라고 약칭함) 의 생산에 미치는 효과; (2) 대식세포에서 파이토헤마글루티닌과 인터페론-감마가 종양살해물질 인 질소 산화물 (nitric oxide; 이하 "NO"라고 약창함)의 생산 유도에 미치는 효과; (3) 파이토헤마글루티닌이 인터페론-감마에 의한 iNOS 유전자의 발현 유도에 미치는 상승 효과; (4) 파이토헤마글루티닌이 인터페론-감마에 의한 iNOS 생산 유도에 미치는 상승 효과; (5) 파이토헤마글루티닌이 인터페론-감마에 의한 NO 생산 유도에 미치는 상승 효과; (6) 파이토헤마글루티닌이 인터페론-감마에 의한 항종양 작용에 미치는 상승 효과; (7) 파이토헤마글루티닌의 세포 독성 유무 검사; (8) 파이토헤마글루티닌이 독성에 민감한 장기인 간과 신장에 미치는 효과를 조사하는 조직 독성 검사; 및 (9) 파이토헤마글루티닌이 미성숙 또는 성숙한 실험 동물의 체중 증감 변화에 미치는 효과를 조사하는 안전성 검사.

본 발명의 항암 보조제 및 항암제용 조성물은 해당 용도에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 함께 독립적으로 또는 약품 첨가제로 사용되거나, 사람에게 투여하기 적합한 기타 모든 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 항암 보조제 및 항암제용 조성물에 함유될 수 있는 담체로는 증량제, 고섬유 첨가제, 캡슐화제 및 지질 등이 포함될 수 있으며, 이러한 담체들의 예는 당업계에 충분히 공지되어 있다.

본 발명의 항암 보조제 및 항암제용 약학적 조성물은 질환의 진행 정도, 나이, 성별, 신체 상태, 투여 기간, 투여 방법, 환자의 체중, 식사, 배출 속도 등에 따라 용량을 달리하여 투여될 수 있다.

바람직하게는, 상기 항암제용 약학적 조성물 중 파이토헤마글루티닌은 체중 1 kg 당 0.01 내지 10 ㎍ 범위로, 그리고 인터페론-감마는 체중 1 kg 당 1 내지 10,000 IU 범위로 비경구 또는 경구 투여될 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 실시예에서는 주요 실험 시약인 파이토헤마글루티닌 (미국, 시그마사 제품) 및 인터페론-감마 (미국, R & D 시스템사 제품)에 대해 세균의 내독소인 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide; 이하 "LPS"라고 약칭함)의 잔류량으로 오염 유무를 검사하였다. 그 결과, 리포폴리사카라이드의 잔류량은 20 엔도톡신 유닛 (endotoxin units; EU)/㎖ 인 것으로 조사되었다. 참고로 유럽 국가에 있어서 상기 실험 시약에 대한 LPS 잔류량의 기준 허용 범위는 350 EU/㎖ 이므로 (Scheer, Arzenimittelforschung, 43(7): 975 ~ 800, 1993년 7월), 본 발명에서 사용한 파이토헤마글루티닌 및 인터페론-감마는 기준 허용 범위와 비교하여 내독소 LPS 잔류량이 잔유량 허용범위의 1/18 이하인 것으로 확인되었다.

본 발명의 실시예에서는 파이토헤마글루티닌 및 인터페론-감마의 항암 상승 효과를 조사하기 위하여, 일차 면역반응 세포이면서 대표적인 항원 제공 세포인 대식세포를 사용하였고, 파이토헤마글루티닌이 비장세포, 간, 신장 및 성장에 미치는 독성을 검사하기 위하여 실험동물인 Balb/c 마우스 (한국. 대전 화학연구소 제공) 를 사용하였다.

실시예 1: 대식세포에서 종양살해 매개물질인 iNOS 생산 유도에 미치는 파이토헤마글루티닌 및 인터페론-감마의 효능 조사

본 발명은 PHA 및 인터페론-감마가 면역계의 일차적인 면역반응에 주요한 세포인 대식세포로부터 종양살해 매개물질 중 하나인 iNOS 생산능에 미치는 효과를 조사하기 위하여, 아래에 기술한 바와 같이 (1) 마우스 복강으로부터 대식세포의 분리 (2) 대식세포 자극 (3) 면역 블럿팅을 수행하여 iNOS 생산 유도를 분석하였다.

(1) 마우스 복강으로부터 대식세포의 분리

대식세포를 추출하기 위하여 사육된 실험 동물로는 6_∼10주령의 Balb/c 마우스를 사용하고, 2개월 이상 배양된 티오글리콜레이트 배지 (thioglycollate medium; 미국 Gibco사 제품)을 마우스에 투여한지 4일 후 마우스를 경추 탈골시켜 희생시켰다. 희생시킨 마우스의 복강에 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 불완전 RPMI-1640 배지 (미국 Gibco사 제품)을 주입하여 복강 내에 있던 대식세포를 추출하고 원심분리한 후, 24 웰 플레이트에 1×10⁶ 세포/웰 농도로 분주하였다.

이것을 약 1시간 가량 CO₂ 항온기에서 배양한 후, 플레이트에 부착하지 않은 세포와 다른 부유물들을 불완전 RPMI-1640 배지를 사용하여 2번 씻어내었다. 그 후 1.5㎖/웰 양의 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신과 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum)이 첨가된 완전 RPMI-1640 배지를 주입하고 3일간 CO₂ 항온기 (100% 습도, 37℃, 5% CO₂)에서 배양하였다.

대식세포의 순수도 측정은 부착된 세포들을 분리한 후, Cytospin-Ⅲ(500rpm, 5분)을 이용해 슬라이드 글라스 (slide glass)에 부착시켜 라이트 김자 (Wright and Giemsa) 염색법으로 염색하여 측정하였으며, 이 때 순수도는 95% 이상이었다.

(2) 대식세포 자극

위에 기술한 마우스 대식세포 분리과정에서 얻은 대식세포를 6 웰 플레이트 (미국 Falcon사 제품)에 3 x 10⁶ 세포/웰로 도말하고 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신과 10% 우태아 혈청이 첨가된 완전 RPMI-1640 배지 (미국 Gibco사 제품)를 사용해 3일간 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양 배지를 제거하고 새로운 불완전 RPMI-1640 배지 조건하에서 대식세포들을 PHA 및 인터페론-감마를 첨가하여 농도별 및 시간별로 자극시켰다. 이때 양성대조군으로는 기존에 잘 알려진 리포폴리사카라이드 (10㎍/㎖; 미국 Sigma사 제품)를 사용하였다.

자극을 위한 배양이 끝난 즉시 세포를 차가운 PBS 완충용액으로 3회 씻은 후 각종 프로테아제 억제제 (protease inhibitor)가 함유된 용출 완충용액 (lysis buffer)를 사용해 세포를 용해시켰다. 세포 용해 후 용해 시료를 다음과 같이 면역 블럿팅 기법을 사용해 세포 내에 존재하는 iNOS 량을 조사하였다.

(3) 면역 블럿팅을 이용한 iNOS 분석

면역 블럿팅 과정을 간단히 설명하면 다음과 같다. 0.1% SDS 폴리아크릴아미드 전기영동 상의 분리 겔과 상단 겔은 각각 16% 및 3%를 사용하였고, 전기영동 시 전류는 55mA (Powersupply; 스웨덴 Pharmacia사 제품), 온도는 쿨링 시스템 (cooling system; 스웨덴 LKB사 제품)을 사용하여 4℃를 유지하면서 약 4 _∼5 시간 동안 러닝 (running)하였다. 여기에 사용된 전기영동 시스템은 Hoefer SE 600 (미국 Hoefer-Pharmacia사 제품)을 사용하였다. 각각의 시료는 동일한 총 단백질 량을 겔에 로딩 (loading)하여 전기 영동하였다.

상기 전기영동이 끝난 겔은 트랜스퍼 완충용액 (transfer buffer; 39 mM 글리신, 2.9g, 48 mM 트리스-염기, 5.8g, 0.037% SDS, 20% 메탄올; pH 8.3)에 미리 적신 니트로셀룰로스 멤브레인 (nitrocellulose membrane, NC)을 올려놓은 후 파이버 패드 (fiber pad)에 넣고 조립하였다. 그리고 나서 면역 블럿팅 트랜스퍼 카세트 (immunoblotting transfer cassette)를 NC 멤브레인이 양극 (positive charge) 방향으로, 겔이 음극 (negative charge) 방향으로 오도록 맞추어 트랜스퍼 체임버에 넣어 두었다. 전류는 1 A로 공급하고, 온도는 쿨링 시스템을 사용하여 4℃를 유지하면서 1시간 30분간 트랜스퍼시켰다.

상기 NC 페이퍼는 블로킹 완충용액 (blocking buffer; 5% 비지방 분유 (nonfat dry milk)를 녹인 TBS-T 완충용액 (20 mM 트리스-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈-20) 약 200㎖에 1시간 동안 Red-Rocker (미국 Hoefer사 제품)로 로킹하여 항체 (antibody)의 비 특이적 결합(non-specific binding)을 블로킹한 다음, 다시 TBS-T 완충용액으로 15분간 1회, 10분간 2회 세척하였다. 그 후, 3㎖ TBS-T 완충용액을 실리콘 용기 (siliconized bottle)에 분주하고 여기에 토끼 항-생쥐 iNOS 다클론 일차 항체 (rabbit anti-murine iNOS polyclonal primary antibody; 500㎍/1.5㎖ 농도로 PBS 완충용액에 녹임) 30㎕ (1 : 300 의석)를 첨가한 후, NC 페이퍼를 실리콘 용기에 넣어 4℃ 하이브리디제이션 항온기 (hybridization incubator; 미국 Robbins사 제품)에서 10 rpm 으로 12시간 동안 반응시켰다.

배양한 후, 70㎖ TBS-T 완충용액으로 20분간 각각 3번 하이브리디제이션 항온기 (hybridization incubator)에서 12 rpm 속도로 씻어낸 후, 이차 항체(secondary antibody), 즉 염소 항-토끼 IgG 호스래디쉬 퍼옥시다제 결합을 이용하여 친화 분리된 항체 (goat anti-rabbit IgG horseradish peroxidase conjugated affinity purified antibody; PBS 완충용액에 0.02 mg/4㎖ 농도로 녹인 스톡 용액)를 3㎖ TBS-T 완충용액에 30㎕ (1 : 20,000 희석)을 첨가하여 4℃, 하이브리디제이션 항온기에서 3시간 동안 배양하였고, 70㎖ TBS-T 완충용액으로 20분간 각각 4번 씻어내었다. 씻은 후, NC 페이퍼를 얇고 투명한 비닐에 넣고 ECL (peroxidase substrate) 반응액 1 및 2 를 50%씩 혼합한 3㎖ 을 NC 페이퍼에 분주한 다음 5분간 배양하였다. 그 후, 암실 (10 W safety lamp; 미국 Kodak사 제품)에서 NC 가 들어 있는 카세트에 X-ray 필름을 넣고 5분 또는 10분 이상 감광 시킨 후 X-ray 필름을 현상용 박스 내의 현상 용액 (develop solution)에 넣어 약 3분간 반응시켰다.

상기 과정이 끝난 후, 이 X-ray 필름을 다시 물에서 2분간 세척한 후, 고정 용액 (fixing solution)에서 3분간 반응시키고 다시 2분간 물로 세척하여 나타나는 밴드 (band)를 분석하였다.

그 결과, PHA 의 경우 0㎍/㎖ 농도에서 iNOS 단백질의 생산을 보이기 시작하다가 300㎍/㎖ 농도에서 최고의 iNOS 생산을 보였으며 (도 1 a 및 b 참조), 자극 후 3시간에서 iNOS 의 생산을 보이기 시작하다가 자극 후 8시간에서 최고의 iNOS 의 생산을 보였으며 이후로는 생산이 감소하였다 (도 1 c 및 d 참조).

도 1은 대식세포로부터 iNOS(inducible nitric oxide synthase) 생산에 있어서 파이토헤마글루티닌의 농도 의존성(a, b) 및 시간 의존성(c, d) 효과를 나타낸 것으로, 패널 a 및 c 는 면역 블럿팅의 결과이고, 패널 b 및 d 는 상기 데이타의 광 농도 측정 분석 결과이다. 이때 농도 의존성 효과 검사에서는 자극시간을 8시간으로 했으며, 시간 의존성 효과 검사에서는 파이토헤마글루티닌 300㎍/㎖ 사용하였다. 여기서 사용한 내독소 LPS(1㎍/㎖)는 양성대조군으로 사용되었다.

인터페론-감마의 경우 1 ng/㎖ 농도에서 iNOS 생산을 보이기 시작하다가 10 ng/㎖ 농도에서 최고의 iNOS 생산을 보였으며 (도 2 a 및 b 참조), 자극 후 2시간에서 iNOS 생산을 보이기 시작하다가 자극 후 8시간에서 최고의 iNOS 생산을 보였으며 이후로는 감소하였다 (도 2 c 및 d 참조).

도 2는 대식세포로부터 iNOS(inducible nitric oxide synthase) 생산에 있 어서 인터페론-감마의 농도 의존성(a, b) 및 시간 의존성(c, d) 효과를 나타낸 것으로, 패널 a 및 c 는 면역 블럿팅의 결과이고, 패널 b 및 d 는 상기 데이타의 광 농도 측정 분석 결과이다. 이때 농도 의존성 효과 검사에서는 자극시간을 8시간으로 했으며, 시간 의존성 효과 검사에서는 인터페론-감마 10ng/㎖ 사용하였다. 여기서 사용한 LPS(1㎍/㎖)는 양성대조군으로 사용되었다.

따라서 도 1 및 2에 나타난 바와 같이, PHA 및 인터페론-감마는 대식세포로부터 iNOS 를 많이 생산하게 작용하는 것을 알 수 있었고, 이 결과는 iNOS 생산에 있어서 PHA 및 인터페론-감마가 농도 의존적 그리고 자극시간 의존적 효과가 있음을 나타내는 것이다.

실시예 2: 대식세포에서 종양살해물질인 NO 생산 유도에 미치는 파이토헤마글루티닌 및 인터페론-감마의 효능 조사

본 발명은 PHA 과 인터페론-감마가 면역계의 일차적인 면역반응에 주요한 세포인 대식세포로부터 항종양 매개물질 중의 하나인 iNOS 를 많이 생산하게 하는 것을 확인하고, 이러한 현상이 항종양물질인 NO 생산으로 이어지는 지 여부를 알기 위하여 다음에 기술한 바와 같이 (1) 대식세포 자극 (2) 질소 산화물 (NO) 측정을 수행하여 NO 생산을 분석하였다.

(1) 대식세포 자극

상기에서 기술한 마우스 대식세포의 분리 과정으로 얻은 대식세포를 6 웰 플 레이트 (미국 Falcon사 제품)에 3 x 10⁶ 세포/웰 농도로 도말하여 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신과 10% 우태아 혈청이 첨가된 완전 RPMI-1640 배지(미국 Gibco사 제품)를 사용하여 3일간 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양 배지를 제거하고 새로운 불완전 RPMI-1640 배지 조건하에서 상기 대식세포들을 각각 PHA 과 인터페론-감마를 농도별 및 시간별로 자극시켰다. 이 때 양성대조군으로는 기존에 잘 알려진 리포폴리사카라이드 (미국 Sigma 사 제품)를 10 ㎍/㎖ 농도로 사용하였다.

자극을 위한 배양이 끝난 즉시 각 세포 배양액을 채취한 후 원심분리(1000g, 4℃, 5분)하여 배양 상등액을 수거하고 다음과 같이 생산된 NO 량을 측정하였다.

(2) NO 의 정량 분석

활성화된 대식세포로부터 생산된 NO 는 곧바로 산소와 반응해 나이트라이트 (nitrite)로 변환되므로, 배양액에 있는 나이트라이트를 측정하여 NO 생산을 검사하였다. 나이트라이트는 그리스 반응액 (Griess reagent; Green LC 등, 1982, Anal Biochem., 126(1): 131~138)을 사용하여 측정하며 간단히 설명하면 다음과 같다. 반응은 100㎕ 배양 상등액과 100㎕ 그리스 반응액을 함께 혼합한 후 10분 동안 항온에서 배양하고, 배양이 끝난 후 엘리자 판독기 (ELISA reader)를 이용하여 540 nm 에서 흡광도를 측정하였으며, 이 때 표준곡선을 위한 시약은 소듐 나이트라이트 (sodium nitrite(미국 Sigma사 제품)을 사용하였다.

그 결과, PHA 의 경우 0 ~ 1000 ㎍/㎖ 농도 범위 및 0 ~ 16 시간 범위에서는 어디에서도 대식세포로부터 NO 생산을 보이지 않았다 (도 3a 및 도 3b 참조).

도 3은 대식세포로부터 nitric oxide(NO) 생산 분비에 있어서 파이토헤마글루티닌의 농도 의존성(a) 및 시간 의존성(b) 효과를 나타낸 것이다. 농도 의존성 효과 검사에서는 자극시간을 8시간으로 했으며, 시간 의존성 효과 검사에서는 파이토헤마글루티닌 300㎍/㎖ 사용하였다. 여기서 내독소 LPS 는 1 ㎍/㎖ 농도로 양성대조군으로 사용되었다.

인터페론-감마의 경우 1 ng/㎖ 농도에서 NO 생산을 보이기 시작하다가 10 ng/㎖ 농도에서는 최고의 NO 생산을 보였으며 (도 4a 참조), 자극 후 3시간에서 NO의 생산을 보이기 시작하다가 자극 후 8시간에서 최고의 NO 생산을 보였으며 이후로는 감소하였다 (도 4b 참조).

도 4는 대식세포로부터 NO 생산 분비에 있어서 인터페론-감마의 농도 의존성(a) 및 시간 의존성(b) 효과를 나타낸 것이다. 농도 의존성 효과 검사에서는 자극시간을 8시간으로 했으며, 시간 의존성 효과 검사에서는 인터페론-감마 농도10 ng/㎖ 를 사용하였다. 여기서 내독소 LPS 는 1 ㎍/㎖ 농도로 양성대조군으로 사용되었다.

그 결과, NO 생산에 있어서 PHA 은 아무런 영향을 미치지 않았는데 반해 인터페론-감마는 대식세포로부터 NO 생산을 농도 의존적 그리고 자극시간 의존적 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 3: 인터페론-감마에 의한 iNOS mRNA 유전자 발현에 미치는 파이토헤 마글루티닌의 상승 효과 조사

본 발명은 PHA 및 인터페론-감마가 면역계의 일차적인 면역반응에 주요한 세포인 대식세포로부터 항종양 매개물질 중의 하나인 iNOS 및 항종양물질인 NO 를 많이 생산하게 작용하는 것을 확인하고, 이러한 현상들이 iNOS 유전자의 mRNA 발현에 의한 것인지 여부를 조사하기 위하여 다음에 기술한 바와 같이 (1) 대식세포 자극 및 전체 RNA 의 분리 (2) 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR) 를 수행하여 분석하였다.

(1) 대식세포 자극 및 전체 RNA 의 분리

실험 과정을 간단히 기술하면 다음과 같다. 상기에서 기술한 마우스 대식세포 분리 과정에 따라 얻은 대식세포를 6 웰 플레이트 (미국 Falcon사 제품)에 3 x 10⁶ 세포/웰 농도로 도말하고 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신과 10% 우태아 혈청을 첨가한 완전 RPMI-1640 배지(미국 Gibco사 제품)를 사용하여 3일간 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양배지를 제거하고 새로운 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 불완전 RPMI-1640 배지(미국 Gibco사 제품)로 적당한 배지조건하에서 대식세포들을 PHA 과 인터페론-감마로 자극시켰다.

자극이 끝난 후, 차가운 PBS 완충용액으로 2회 씻고 PBS 완충용액을 제거한 후 각 웰에 1 ㎖의 트리졸 (Trisol)을 주입하고 5분간 항온에서 배양하였다. 배양이 끝난 후, 트리졸에 녹인 세포 용액을 3회 피펫팅 (pipetting)한 후 E-투브에 넣 은 다음 0.2 ㎖ 클로로포름 (chloroform)을 첨가하고 10초 정도 볼텍싱 (vortex)하여 잘 섞은 후 원심분리 하였다 (12,000 rpm/60분, 4℃). 전체 RNA 층인 상층액만을 떠내 E-튜브에 옮기고, 차가운 100% 이소프로판올을 넣은 후 적어도 하루동안 침전시켰다. 그리고 다시 같은 조건에서 20분 정도 원심분리를 한 다음 상층액 (supernatant)을 버리고, 순수한 전체 RNA 를 분리하기 위해 이 과정을 반복하였다. 그러고 나서 75% 에탄올을 넣고 손으로 흔들어 잘 혼합한 다음원심분리하고, 원심분리가 끝나면 다시 상층액을 따라 버리고 0.1% DEPC-H₂O 를 넣어 65℃에서 10분간 가열한 다음 -20℃에서 사용할 때까지 저장하였다.

(2) 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)

역전사-중합효소 연쇄반응을 수행하기 위하여, 하기에 기술한 모든 프라이머는 주식회사 바이오니아 (청원, 충북)에 의뢰하여 주문 합성하였다. 구체적으로, iNOS 의 정방향 프라이머 (iNOS forward primer; 5'-TGCCCCTTCAATGGTTGGTA-3') 및 역방향 프라이머 (iNOS reverse primer; 5'-ACTGGAGGGACCAGCCAAAT-3') 그리고 베타-액틴의 정방향 프라이머 (β-actin forward primer; 5'-CAAAGAAAATGGACGCCGCCGAACTTGG-3') 및 역방향 프라이머 (β-actin reverse primer; 5'-CCTGCTTGCTTGCTGATCCACATCTGCTGG-3')를 사용하였다.

중합효소 연쇄반응으로 cDNA 를 합성하기 위하여, 5× 역전사효소 완충용액 (reverse transcriptase buffer), 2.5 mM dNTP, 500 ng 프라이머/㎕, 200 U/㎕ MMLV 역전사효소 (MMLV resverse trancriptiase; 일본 Takara사 제품), 전체 RNA, 0.1% DEPC 가 처리된 이차증류수를 사용하여 반응 혼합액 (reaction mixture)를 준비하였다. 이 때 사용한 프라이머는 역방향 프라이머였다. 그러고 나서 42℃에서 30분간 배양, 75℃에서 30분간 배양을 실시하여 cDNA 를 얻었다. 역전사 (Reverse transcription) 반응 과정에서 생성된 cDNA 가 있는 RT 혼합액, 10x Taq 폴리머라제 완충용액, 2.5 mM dNTP, 정방향 프라이머(25 pmol/㎕), 역방향 프라이머 (25 pmol/㎕), Taq 폴리머라제 (2.5 units/㎕; 일본 Takara사 제품), 이차 증류수를 잘 섞은 후 반응 조건 95℃에서 30초 55℃에서 1분 72℃에서 30초를 30 회 반복하여 cDNA 를 증폭하였다. 그리고 난 뒤 cDNA 를 전기영동하여 iNOS 유전자의 mRNA 발현 상의 차이를 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 것과 같이, 인터페론-감마에 의한 iNOS 유전자의 발현능에 있어서 PHA 의 상승 효과가 있음을 알 수 있었다. 인터페론-감마를 최고 농도 30 ng/㎖의 1/30인 저 농도 1 ng/㎖ 로 하고, PHA 는 저 농도 10 ㎍/㎖(최고 농도의 1/30)로 하여 함께 자극했을 때가 인터페론-감마의 최고 농도인 30 ng/㎖보다 더 강하거나 거의 동일한 정도로 대식세포의 항종양매개물질 중의 하나인 iNOS 유전자의 mRNA 발현 효과를 증대하는 것을 확인하였다 (도 5a 및 도 5b 참조).

도 5는 인터페론-감마에 의한 대식세포로부터 iNOS 유전자의 mRNA 발현 유도에 있어서 파이토헤마글루티닌의 증강 효과를 나타낸 것으로, 패널 a는 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)의 결과이고, 패널 b는 상기 데이타의 광 농도 측정 분석 결과이다. 이 때 인터페론-감마(IFN)의 농도는 1 ng/㎖ 이고 자극시간은 4시간, 파이토헤마글루티닌 (PHA)의 농도는 10 ㎍/㎖이고 자극시간은 4시간, IFN + PHA 는 IFN 1 ng/㎖ 및 PHA 10㎍/㎖를 함께 투여한 것이며 자극시간은 4시간으로 하였다. MA (medimu alone)는 파이토헤마글루티닌 대신 식염수로 자극한 것이며 음성 대조군으로 사용되었고, 내독소 LPS 는 1 ㎍/㎖ 농도로 양성대조군으로 사용되었다.

따라서 인터페론-감마와 PHA 를 함께 투여하면 인터페론-감마 저 농도로도 인터페론-감마 고농도 단독 투여시와 똑같은 높은 효능을 보여준다는 것을 입증하였다. 이러한 PHA의 상승 효과는 인터페론-감마를 고농도로 투여하여 생기는 부작용을 줄일 수 있음을 보여주는 것이다.

실시예 4: 인터페론-감마에 의한 iNOS 생산 유도능에 미치는 파이토헤마글루티닌의 상승 효과 조사

상기 실시예 3에서 살펴본 바와 같이, 인터페론-감마에 의한 iNOS 유전자발현능에 있어 PHA의 상승 효과가 확실히 있지만, 이러한 iNOS 유전자 발현능에 있어 PHA의 상승 효과가 iNOS 생산능으로 이어지는 지 여부를 조사하기 위하여 아래에 기술한 바와 같이 (1) 대식세포 자극 (2) 면역 블럿팅을 이용한 iNOS 분석을 수행하였다.

(1) 대식세포 자극

상기 실시예 1 에서 기술한 바와 같은 과정으로 대식세포를 마우스에서 추출 분리하여 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양 배지를 제거하고 새로운 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 불완전 RPMI-1640 배지 (미국 Gibco사 제품)로 적당한 배지조건 하에서 대식세포들을 인터페론-감마 (1ng/㎖), PHA (10㎍/㎖), 인터페론-감마(1 ng/㎖) + PHA (10 ㎍/㎖)로 최적의 자극시간인 8시간으로 자극하였다.

자극을 위한 배양이 끝난 즉시 세포를 차가운 PBS 완충용액으로 3회 씻은 후 각종 프로테아제 억제제 (protease inhibitor)가 함유된 용출 완충용액 (lysis buffer)를 사용해 세포를 용해하였다. 용해 후 용해 시료를 다음과 같이 면역 블럿팅 기법을 사용해 세포 내에 존재하는 iNOS 량을 측정하였다.

(2) 면역 블럿팅을 이용한 iNOS 의 분석

상기 실시예 1 에서 기술한 바와 같은 과정으로, 면역 블럿팅 기법을 이용한 iNOS 분석을 수행하여 인터페론-감마에 의한 iNOS 생산능에 있어 PHA 의 상승 효과가 있는지를 조사하였다.

그 결과 도 6에 나타난 것과 같이, 인터페론-감마에 의한 iNOS 생산능에 있어 PHA 의 상승효과가 있음을 확실하게 입증하였다. 인터페론-감마를 최고 농도 (30ng/㎖)의 1/30인 저농도 1 ng/㎖로 하여 PHA 의 저농도 10㎍/㎖ (최고 농도의 1/30)와 함께 자극했을 때가 인터페론-감마 최고 농도인 30 ng/㎖보다 더 강하거나 동일한 정도로 대식세포의 iNOS 생산을 상승시키는 효과를 확인하였다(도 6a 및 6b 참조).

도 6은 인터페론-감마에 의한 대식세포로부터 iNOS 생산 유도에 있어서 파이토헤마글루티닌의 증강효과를 나타낸 것인데, 패널 a는 면역 블럿팅의 결과이고, 패널 b는 상기 데이타의 광 농도 측정 분석 결과이다. 인터페론-감마(IFN)의 농도는 1 ng/㎖이고 자극시간은 8시간, PHA의 농도는 10 ㎍/㎖이고 자극시간은 8시간, IFN + PHA는 IFN 1 ng/㎖과 PHA 10 ㎍/㎖ 를 함께 투여한 것이며 자극시간은 8시간으로 하였다. MA (medimu alone)는 파이토헤마글루티닌 대신 식염수로 자극한 것이며 음성 대조군으로 사용되었으며, 내독소 LPS 는 1 ㎍/㎖ 농도로 양성대조군으로 사용되었다.

따라서 도 5에서 나타난 iNOS 유전자의 발현 효과와 같이, 인터페론-감마와 PHA 을 함께 투여하면 인터페론-감마의 저농도로도 인터페론-감마를 고농도로 단독 투여한 때와 동일한 정도로 높은 iNOS 생산 효능을 보임을 확인하였다. 이러한 PHA 의 항종양매개물질 중의 하나인 iNOS 생산의 상승 효과는 인터페론-감마의 고농도 투여로 인한 부작용을 줄일 수 있음을 입증하는 것이다.

실시예 5: 인터페론-감마에 의한 NO 생산 유도에 미치는 파이토헤마글루티닌의 상승 효과 조사

상기 실시예 3 및 4에서 기술한 바와 같이, 인터페론-감마에 의한 iNOS 유전자의 발현능과 생산능에 있어서 PHA의 상승 효과가 확인되었지만, 이러한 iNOS 유전자의 발현능과 생산능에 있어 PHA 의 상승 효과가 NO 생산능으로 이어지는 지 여부를 조사하기 위하여 하기에 기술한 바와 같이 (1) 대식세포 자극 (2) NO 분석을 수행하였다.

(1) 대식세포 자극

상기 실시예 1에서 기술한 바와 같은 과정으로 대식세포를 마우스에서 추출 분리해서 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양배지를 제거하고 새로운 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 불완전 RPMI-1640 배지 (미국 Gibco사 제품)로 적당한 배지 조건하에서 대식세포들을 인터페론-감마 (1 ng/㎖), PHA (10 ㎍/㎖), 인터페론-감마(1 ng/㎖) + PHA (10 ㎍/㎖)로 최적의 자극시간인 8시간으로 자극하였다. 상기 실시예 2 에서 기술한 바와 같이 자극 반응을 위한 배양이 끝난 즉시 각 배양액을 채취한 후 원심분리 (1000 g, 4℃, 5분)하여 배양 상등액을 모아 다음과 같이 NO 량을 측정하였다.

(2) NO 의 정량적 분석

상기 실시예 2 에서 기술한 동인한 과정으로 분석을 수행하였다. 즉 100㎕ 배양상등액과 100㎕ 그리스 반응액 (Griess reagent)을 함께 혼합한 후 10분 동안 항온에서 배양하고, 배양이 끝난 후 엘리자 판독기 (ELISA reader)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 표준곡선을 위한 시약으로는 소듐 나이트라이트 (sodium nitrite; 미국 Sigma사 제품)을 사용하였다.

그 결과 도 7 및 도 8에 나타난 것과 같이, 인터페론-감마에 의한 NO 생산능에 있어 PHA 의 상승효과가 있음을 확인하였다. 인터페론-감마를 최고 농도(30 ng/㎖)의 1/30인 저농도 1 ng/㎖로 하고, PHA는 저농도 10㎍/㎖ (최고 농도의 1/30)로 하여 함께 자극했을 때가 인터페론-감마 최고 농도인 3 ~ 30 ng/㎖으로 단독 투여할 때보다 더 강한 대식세포의 NO 생산 증대 효과를 보여 주었다(도 7 및 도 8 참조).

도 7은 인터페론-감마에 의한 대식세포로부터 NO 분비에 있어서 파이토헤마글루티닌의 증강 효과를 나타낸 것이다. 인터페론-감마(IFN)의 농도는 1 ng/㎖이고 자극시간은 8시간, PHA 농도는 10 ㎍/㎖이고 자극시간은 8시간, IFN + PHA 는 IFN 1 ng/㎖과 PHA 10 ㎍/㎖를 함께 투여한 것이며 자극시간은 8시간으로 하였다. MA (medimu alone)는 파이토헤마글루티닌 대신 식염수로 자극한 것이며 음성 대조군으로 사용되었으며, 내독소 LPS 는 1 ㎍/㎖ 농도로 양성대조군으로 사용되었다.

도 8은 인터페론-감마에 의한 대식세포로부터 NO 분비에 있어서 파이토헤마글루티닌의 증강효과와 높은 농도 인터페론-감마의 효과를 비교해서 나타낸 것이다. 인터페론-감마(IFN)의 농도는 1 ~ 30 ng/㎖이고 자극시간은 8시간, 파이토헤마글루티닌(PHA)의 농도는 10 ㎍/㎖이고 자극시간은 8시간, IFN + PHA는 IFN 1 ~ 30 ng/㎖과 PHA 10 ㎍/㎖를 함께 투여한 것이며 자극시간은 8시간으로 하였다.

따라서 도 5 및 6에서 나타난 iNOS 유전자의 발현 및 생산 상승 효과와 같이, 본 결과는 인터페론-감마와 PHA 을 함께 투여하면 인터페론-감마의 저농도로도 인터페론-감마의 고농도 단독 투여 시와 동일한 높은 NO 생산 효능을 보임을 입증하였다. 이러한 PHA 의 항종양물질 중의 하나인 NO 생산을 위한 상승효과는 인터페론-감마 고농도 투여로 인한 부작용을 줄일 수 있음을 입증하는 것이다.

실시예 6: 인터페론-감마에 의한 항종양 작용에 미치는 파이토헤마글루티닌의 상승 효과 조사

상기 실시예 3, 실시예 4 및 실시예 5 에서 보여준 바와 같이 인터페론-감마에 의한 iNOS 유전자의 발현능과 생산능 그리고 NO 생산능에 있어서 PHA 의 상승 효과가 확인되지만, 이러한 항종양물질인 NO의 생산능에 있어 PHA의 상승효과가 항종양작용으로도 이어지는지 여부를 조사하기 위하여, 하기에 기술한 바와 같이 (1) ⁵¹Cr 표지된 Sarcoma-180 종양세포와 대식세포의 동시 배양 및 자극, (2) ⁵¹Cr 분비 측정을 수행하여 분석하였다.

(1) ⁵¹Cr 표지된 Sarcoma-180 종양세포와 대식세포의 동시 배양 및 자극

상기 실시예 1에서 기술한 바와 같은 과정으로 대식세포를 마우스에서 추출 분리하여 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양배지를 제거하고 새로운 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 불완전 RPMI-1640 배지 (미국 Gibco사 제품)로 적당한 배지 조건하에서 대식세포들을 2시간 동안 실험 전 배양하였다. 동시에 Sarcoma-180 종양세포에 ⁵¹Cr (미국 Amersham사 제품)을 500 μCi/5×10⁶ 세포 농도 로 첨가한 후 1시간 배양하여 3번 PBS 완충용액으로 씻었다. 대식세포에 ⁵¹Cr가 표지된 Sarcoma-180 세포를 100 ㎕씩을 넣고 인터페론-감마(1 ng/㎖), PHA (10 ㎍/㎖), 인터페론-감마(1 ng/㎖) + PHA(10 ㎍/㎖)를 각각 첨가하여 최적의 자극시간인 8시간으로 자극하였다.

자극을 위한 배양이 끝난 즉시 각 배양액을 채취한 후 원심분리(1000 g, 4℃, 5분)하여 배양 상등액을 수거하여 하기와 같이 분비된 ⁵¹Cr 량을 측정하였다.

(2) ⁵¹Cr 분비 측정

각각의 배양상등액을 500㎕씩 채취하여 감마 스펙트로포토미터 (gamma spectrophotometer; 미국 Pharmacia사 제품)으로 cpm 을 측정한 다음 다음과 같은 공식에 따라 % 독성(cytotoxicity)을 측정하였다. 독성 (Cytotoxicity; %) = 100 x (실험 cpm - 자연적인 cpm)/(전체 cpm - 자연적인 cpm). 이 때 전체 cpm은 ⁵¹Cr 표지된 Sarcoma-180 세포를 100㎕ DMSO 로 용해한 후 얻은 동위원소 량이다.

그 결과 도 9에서 보는 바와 같이, 인터페론-감마에 의한 육종암세포 Sarcoma-180 살해능에 있어 PHA 의 상승효과가 있음을 확인하였다. 인터페론-감마를 최고 농도(30 ng/㎖)의 1/30인 저 농도 1 ng/㎖로 하여 PHA 의 저농도 10㎍/㎖ (최고 농도의 1/30)로 함께 자극했을 때가 인터페론-감마 최고 농도인 30 ng/㎖보 다 더 강하거나 동일한 정도로 항육종암 효과를 보여주었다(도 9 참조).

도 9는 인터페론-감마에 의한 대식세포로부터 육종암 Sarcoma-180 살해에 있어서 파이토헤마글루티닌의 증강 효과를 나타낸 것이다. 인터페론-감마(IFN)의 농도는 1 ng/㎖이고 자극시간은 8시간, 파이토헤마글루티닌(PHA)의 농도는 10 ㎍/㎖이고 자극시간은 8시간, IFN + PHA는 IFN 1 ng/㎖과 PHA 10㎍/㎖ 를 함께 투여한 것이며 자극시간은 8시간으로 하였다. MA (medimu alone)는 파이토헤마글루티닌 대신 식염수로 자극한 것이며 음성 대조군으로 사용되었으며, NMMA는 NO 생산 억제제이다.

따라서 인터페론-감마와 PHA을 함께 투여하면 인터페론-감마의 저농도로도 인터페론-감마의 고농도 단독 투여 시와 동일한 육종암세포 Sarcoma-180 살해능을 보여줌을 입증하였다. 이러한 PHA의 항종양을 위한 상승효과는 인터페론-감마의 고농도 투여로 인한 부작용을 줄일 수 있음을 다시 확인해주는 것이다. 끝으로 이러한 종양살해효과가 NO 생산 억제제인 NMMA 로 감소하는 것으로 보아 NO가 종양살해와 밀접한 관련이 있는 것을 보여주므로 본 발명의 상승 효과는 더욱 유효한 것이 된다.

실시예 7: 실시예 5. 파이토헤마글루티닌의 세포 독성 유무 검사

본 발명은 면역 활성제인 인터페론-감마의 증강 보조제인 파이토헤마글루티닌이 면역 활성에 탁월하더라도 생체 내에 독성이 있으면 약제학적으로 사용할 수 없기 때문에 다음과 같이 (1) 비장세포 추출 및 배양; 및 (2) 화학적 세포독성분석을 위한 MTT 시험으로 나누어 세포 독성에 대한 안전성을 조사하였다.

(1) 비장세포 추출 및 배양

본 발명의 파이토헤마글루티닌이 정상 세포에 미치는 세포 독성 유무를 조사하기 위하여 마우스의 비장세포를 이용하여 연구하였다. 구체적으로 7 주령의 Balb/c 마우스 (한국, 대전 화학연구소)를 경추 탈골해서 희생시키고 비장을 무균 상태에서 회수한 다음 100 U/㎖의 페니실린-스트렙토마이신만이 첨가된 차가운 불완전 RPMI-1640 배지(미국 Gibco사 제품)로 2회 씻고 다시 차가운 불완전 RPMI-1640 배지를 주입하여 Daunce 세포균질기(미국 Wheaton사 제품)를 사용하여 각각 하나의 세포를 만들고 얼음물에 10분 동안 배양하였다.

배양이 끝난 다음 세포 상층액만을 수집하여 원심분리 (1000 g, 5분, 4℃)하고 다시 상층액을 따라버리고 세포를 얻었다. 비장세포는 96-웰 플레이트에 1.5×10⁵ 세포/웰 농도로 분주하여 100 U/㎖ 의 페니실린-스트렙토마이신과 10% 우태아 혈청이 첨가된 완전 RPMI-1640 배지(미국 Gibco사 제품)로 배양하였다. 그 다음 각 웰에 파이토헤마글루티닌을 농도별로 첨가하고 2일 동안 배양하여 MTT 분석을 수행하였다.

(2) 화학적 세포독성 검사를 위한 MTT 분석

본 발명에서는 비장세포에 대한 파이토헤마글루티닌의 세포 독성 유무를 MTT 방법을 사용하여 검증하였다. MTT 분석은 프랑소아와 리타 (Francois D and Lita L., J. Immunological methods, 89, 271-277, 1986년)의 방법에 준하여 다음과 같이 실시하였다. 비장세포의 배양이 완료되면 MTT 반응액 (HBSS 완충용액에서 농도 1 mg/㎖)을 각 웰 당 50 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 다시 배양하였다. 이후 배양 상등액은 모두 제거하고 침전된 불용성 포르마잔 (formazan)을 녹이기 위하여 디메틸설포옥사이드 (dimethylsulfoxide; DMSO)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하여 15분 동안 저어주고 (stirring) 엘리자 판독기 (ELISA reader; 미국 Pharmacia사 제품)를 사용하여 540 nm 파장에서의 흡광도(O. D.)를 측정하여 다음과 같은 공식에 따라 % 세포 독성(cytotoxicity)을 측정하였다.

×100

그 결과 도 10 에서 보는 바와 같이, 본 발명의 파이토헤마글루티닌은 높은 농도인 300 ㎍/㎖ 에서도 비장세포에 독성 효과를 미치지 않으며 오히려 대조군과 비교하여 더 높은 생존율을 보여주었다(도 10).

도 10은 본 발명의 파이토헤마글루티닌이 실험 동물의 비장세포에 미치는 독성을 생존율 그래프로 나타낸 것으로서, 이 때 파이토헤마글루티닌의 농도는 10 ~ 300 ㎍/㎖ 범위이고 자극시간은 2일이며, MA (medimu alone)는 PHA 대신 식염수로 자극하였으며 음성 대조군으로, 내독소 LPS 는 1 ㎍/㎖ 농도로 양성 대조군으로 사용되었다.

이러한 결과로 미루어 파이토헤마글루티닌은 세포 독성이 없으며 인터페론-감마에 유효한 면역 증강 보조제로서 안전성이 있는 것을 확인하였다.

실시예 8. 파이토헤마글루티닌의 장기 독성 검사

본 발명은 실시예 7 에서 기술한 파이토헤마글루티닌의 세포 독성 검사만으로는 안전성에 안심할 수 없기 때문에 다음과 같이 파이토헤마글루티닌이 생체의 신진대사와 독성에 민감한 주요 장기인 간과 신장에 미치는 효과를 검사하였다. 신장 기능은 혈액 크레아틴 (blood creatin, CRE)과 혈액 우레아 질소 (blood urea nitrogen, BUN)의 혈중 농도를 측정하여 검사하고, 간 기능은 간세포가 함유하는 GOT (glutamic-oxalacetate transaminase)와 GPT (glutamic pyruvic transaminase)의 두 효소의 혈중 농도를 측정하여 검사하였다.

7주령의 마우스 (Balb/c; 한국, 대전 화학연구소)를 사용하여 실험군에는 파이토헤마글루티닌 10 ㎍ 및 300㎍ 을 0.01M PBS 완충용액 2 ㎖ 에 용해시켜 정맥에 매일 1회 2 ㎖씩 투여하고, 정상군에는 PBS 완충용액 2 ㎖만을 매일 1회 투여하여 동일한 과정으로 실험하였다. 정맥 주사 후 1, 2, 5 및 10일이 경과하면 마우스의 눈으로부터 채혈하여 얻은 혈청 10㎕ 를 다층 필름 (multilayer film)상에 놓고 후지 드라이 켐 시스템 (Fugi Dry Chem System; 일본 Fugi Photo Film 사 제품)을 이용하여 각각 CRE, BUN, GOT 및 GPT 값을 측정하였다.

그 결과 도 11 및 도 12 에서 보는 바와 같이, 파이토헤마글루티닌 10㎍ 투 여한 실험군에서는 GOT, GPT, CRE 및 BUN 의 혈중 농도가 정상군과 거의 동일하고 파이토헤마글루티닌 300 ㎍ 투여한 실험군에서는 정상군보다는 조금 높지만 유의한 차이는 없었다(도 11 및 도 12). 따라서 파이토헤마글루티닌이 간 및 신장 모두에서 유해한 독성을 미치지 않는 것을 확인할 수 있다.

도 11은 파이토헤마글루티닌의 간 독성 영향을 나타낸 그래프이다. 사용된 파이토헤마글루티닌 10㎍과 300㎍을 각각 마우스에 매일 투여했으며 1일 5일 10일에 채혈해서 간 조직에 미치는 독성을 검사(GOT, GPT) 하였으며, 대조군(Con)은 파이토헤마글루티닌 대신 식염수로 자극하였다.

도 12는 파이토헤마글루티닌의 신장 독성 영향을 나타낸 그래프이다. 사용된 파이토헤마글루티닌 10㎍과 300㎍을 각각 마우스에 매일 투여했으며 1일 5일 10일에 채혈해서 신장 조직에 미치는 독성을 검사(CRE, BUN) 하였으며, 대조군(Con)은 파이토헤마글루티닌 대신 식염수로 자극하였다.

실시예 9. 파이토헤마글루티닌에 의한 실험 동물의 체중 변화 검사

본 발명의 파이토헤마글루티닌의 안전성을 확인하기 위하여, 미성숙 또는 성숙한 쥐의 신체 발육에 미치는 영향을 체중 증감 변화로 조사하였다. 파이토헤마글루티닌을 10 ㎍/㎖ 및 300 ㎍/㎖ 농도가 되도록 0.01M PBS 완충용액에 녹이고 생후 1일째의 미성숙 마우스에는 매일 피하 주사하고, 생후 7주령된 성숙 마우스에는 매일 복강 내 주사하였으며, 대조군에는 0.01 M PBS 완충용액을 피하주사하거나 복강 내 주사하였다.

그 결과 도 13 (미성숙 쥐의 경우)과 도 14(성숙 쥐의 경우)에서 보는 바와 같이, 미성숙 마우스와 성숙 마우스 모두에서 파이토헤마글루티닌의 10 ㎍/㎖ 및 300㎍/㎖ 농도가 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 13 및 도 14). 이와 같이 파이토헤마글루티닌은 실험 동물에 있어서 신체 발육에 유해한 독성을 미치지 않고 안전한 것을 알 수 있었다.

도 13 및 도 14는 본 발명의 파이토헤마글루티닌이 각 미성숙 및 성숙한 마우스에 미치는 영향을 체중 변화로 나타낸 것으로서, 이 때 PHA 10 ㎍ 과 300 ㎍ 을 각각 마우스에 매일 투여한 다음 0, 2, 4, 6, 8, 10일에 마우스의 체중을 측정한다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 파이토헤마글루티닌 단독으로는 항종양 매개물질 중 하나인 iNOS 유전자의 발현 및 생산 그리고 항종양물질인 질소 산화물 (NO) 생산에 미치는 효과가 명확하지 않았다. 그러나 파이토헤마글루티닌과 인터페론-감마를 함께 투여하는 경우 인터페론-감마의 iNOS 유전자 발현 및 생산능, 항종양물질인 NO 생산능, 육종암세포인 Sarcoma-180 살해능이 PHA 에 의해 상승되는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같이 파이토헤마글루티닌은 인터페론-감마가 저 농도로 투여되어도 고농도로 단독 투여되는 것과 동일한 육종암 살해 효능을 나타내므로, 이러한 파이토헤마글루티닌의 상승 효과가 인터페론-감마의 고농도 투여에 의한 부작용을 줄일 수 있음을 입증하였다. 또한, 쥐를 사용한 동물 실험에서는 파이토헤마글루티닌이 세포, 조직 및 신체 발육에 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 파이토헤마글루티닌 (PHA)과 인터페론-감마를 유효 성분으로 포함하는 항암제용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 파이토헤마글루티닌은 암 치료 등에 사용되는 인터페론-감마에 포함되어 부작용이 없이 낮은 농도로도 효과적으로 항암 효과를 증진시킬 수 있다. 실제로 적은 농도의 파이토헤마글루티닌을 인터페론-감마와 같이 사용하면 인터페론-감마 단독으로 사용할 때보다 1/30의 인터페론-감마 농도로도 항암 활성이 크게 상승되므로 인터페론-감마 등을 고농도로 투여하여 생기는 기존의 부작용을 제거하면서 아주 적은 양의 인터페론-감마로도 많은 양의 인터페론-감마와 동일한 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 파이토헤마글루티닌이 인터페론-감마에 유효한 항암 증강제로서 새로운 항암제, 항종양제 등에 이용되어 암 및 종양의 치료 효과를 크게 개선함과 동시에, 기존의 인터페론-감마 다량투여 대신 소량투여로 인해 환자의 의료 부담을 많이 덜어줄 수 있다.

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1. 파이토헤마글루티닌과 인터페론-감마를 유효 성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물.
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