KR100666055B1

KR100666055B1 - 수용성 베타글루칸의 제조방법

Info

Publication number: KR100666055B1
Application number: KR1020050005133A
Authority: KR
Inventors: 김희철
Original assignee: 한국효소 주식회사
Priority date: 2005-01-19
Filing date: 2005-01-19
Publication date: 2007-01-09
Anticipated expiration: 2025-01-19
Also published as: KR20060084310A

Abstract

본 발명은 아우레오바시디움 플루란스 종균을 배지에 접종시켜 수용성 베타글루칸을 제조하는 방법에 있어서, 아우레오바시디움 플루란스 균주를 밀기울을 기본으로 하는 곡물부산물 액체배지에서 25~35℃에서 20~72시간 배양하여 증균시키고, 상기 증균된 아우레오바시디움 플루란스균주를 밀기울을 기본으로 하는 고체배지에 접종하여 20~40℃에서 20~72시간 고체배지를 발효시켜 곡물부산물 고체배지에서 고농도의 수용성 베타글루칸을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 저가의 배지를 이용하는 고상배양법으로 고농도의 수용성 베타글루칸을 얻을 수 있는 효과를 갖는다.

고상발효, 수용성 베타글루칸, 곡물부산물 배지, 고체배지, 발효

Description

수용성 베타글루칸의 제조방법{Producing process for water soluble beta-glucan}

본 발명은 밀기울을 기본으로 하는 곡류부산물 배지에서 아우레오바시디움 플루란스 공시균주(Aureobasidium pullulans, ATCC No.42023)를 배양, 발효시켜 수용성 베타글루칸을 고농도로 제조하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로는 밀기울, 말분, 미강 등의 곡류부산물로 된 액체배지에서 아우레오바시디움 플루란스 균주를 대량으로 증균되도록 배양하고 여기에서 얻어진 증식된 종균을 곡물부산물로 이루어진 고체배지에 접종, 발효시켜 고농도의 수용성 베타글루칸을 제조하는 방법에 관한 것이다.

자연계의 많은 기능성 다당류가 존재하는 것으로 알려져 있다. 자연계에 존재하는 다당류의 일종인 글루칸(glucan)은 효모의 세포벽, 버섯류, 곡류에 존재하며, 분자구조의 연결 형태에 따라 α형 혹은 β형으로 구분된다. 베타글루칸은 당이 결합된 모양에 따라 베타(1-3)글루칸, 베타(1-4)글루칸, 베타(1-6)글루칸 등으로 나눠진다. 베타글루칸 중에서 베타(1-3)글루칸이 면역력을 강화하는 작용을 갖고 있으며, 이중에서도 베타(1-3)의 주사슬에 베타(1-6)결함을 겹사슬로 가진 구조의 것이 수용성을 띤다. 수용성 베타글루칸은 아가리쿠스 버섯, 영지, 운지버섯 등에 함유되어 있으며 항종양활성과 같은 약리작용을 갖는 물질로 알려져 있다. 버섯의 균사체나 아우레바시디움속 미생물 발효에 의해서도 생산된다.
베타글루칸은 결합구조에 따라 수용성과 수불용성으로 구분된다. 베타(1-3)이나, 베타(1-4)의 단일구조일 경우 불용성이나 베타(1-3)결합에 베타(1-6)결합이 혼합되어 있는 것은 수용성을 띠며, 121℃, 30분의 가열조건에서도 안정하다. 또한 생체 내에서의 흡수도가 달라서 면역관련 효과는 수용성 베타글루칸이 불용성 베타글루칸보다 월등하게 우수하다. 그중에서도 버섯류에서 생산되는 수용성 베타글루칸은 면역증강효과가 항종양활성, 항세균활성이 우수한 것으로 알려져 있고(Seljelid, et al: Association of macrophage Activation with Anti-tumor Activity by Synthetic and Biologic Agents. Cancer Res; 1989, 37:3338-3343) 혈당강하작용, 혈압강하작용 등의 다양한 약리적 효능이 있는 것으로 알려지면서 의약품, 화장품, 건강보조식품 및 사료첨가제 등으로 주목을 받고 있다.
종래 베타글루칸은 버섯의 균체나 효모중에 함유되어있는 것을 추출하거나 귀리, 보리, 호밀 등의 곡류나 이들의 껍질과 같은 곡물부산물에서 추출하고 있다.
버섯에서 추출하는 방법은, 버섯종균을 1-6개월간 배양하여 베타글루칸을 추출 후 정제하는 방법이고, 효모를 이용한 베타글루칸의 생산방법은 효모를 액체상태로 배양하여 효모세포벽내의 베타글루칸을 분리·정제하는 방법이며, 곡류부산물을 이용하여 베타글루칸을 생산하는 방법은 곡류부산물을 분세하여 베타글루칸을 추출·정제하게 된다. 본 기술을 아우레오바시디움 플루란스를 곡류부산물로 구성된 배지를 이용한 고상발효를 통하여 베타글루칸을 생산한다.
버섯으로부터 베타글루칸 생산하는 방법은 생산성이 높고(20-30%함량) 수용성이어서 면역증강효과가 높다는 장점이 있으나 종균의 배양기간이 1개월 내지는 6개월 정도이어서 생산비용이 높으며, 효모를 이용한 액체배양법은 소요기일이 3~4일 정도로 짧으나 이용성이 낮으며, 베타글루칸의 수용도가 낮으며, 곡류부산물에서 분리·정제된 베타글루칸은 기능성이 낮다는 단점이 있으며 활발하게 이용되지 못하고 있다.

아우레오바시디움 플루란균주는 종래 식품첨가물로 사용되고 있는 플루란(pullulan)을 생산하는데 사용되고 있는 균주이며 미국 식품의약청(FDA)으로부터 식품제조용으로 사용승인(GRAS규격 Title 21, vol 3) 받은 균주이다.

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그러나 아우레오바시디움 플루란스균주를 곡물부산물로 구성된 액상배지에서 접종하여 액상배지를 발효시켜서 베타글루칸을 얻는 방법은 수용성 베타글루칸의 함량이 배지조성물중 2중량% 이상을 생산되지않아 함량이 낮다는 단점이 있다.

따라서, 이 분야에서는 베타글루칸을 산업적으로 활용하기 위해서 저비용이면서 고효율로 베타글루칸을 생산할 수 있는 방법의 개발이 필요한 실정에 있다.

본 발명의 목적은 저비용이면서 높은 효율로 수용성 베타글루칸을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명자들은 세포 밖으로 베타글루칸을 분비하는 특성을 갖는 아우레시오바시디움플루란스 공시균주(ATCC No.42023)를 이용하고, 밀기울, 말분, 미강, 옥피 등 저가의 곡물부산물로 조성된 액상배지에서 아우레시오바시디움 플루란스균주를 증균시키고 여기서 얻어진 배양물을 고체배지에 접종하여 발효시켜주면 수용성 베타글루칸 함량 2중량% 이상인 배양물을 얻을 수 있고 이를 건조하여 저비용이면서 높은 효율로 수용성 베타글루칸을 얻을 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 밀기울을 기본으로 하는 곡물분산물로 조성된 액체배지에서 아우레오바시디움 플루란스균체를 증식시키고, 증식된 아우레오바시디움 플루란스균체를 밀기울을 기본으로 하는 곡물부산물로 조성된 고체배지에서 발효시켜 고농도의 수용성 베타글루칸을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 세포외로 수용성 베타글루칸을 분비하는 공시균주인 아우레오바시디움 플루란스를 고체배지에 접종하여 베타글루칸을 생산하는 특징을 갖는다.

본 발명은 아우레오바시디움 플루란스 균주를 이용하여 수용성 베타글루칸을 제품화하기 위하여 액체배양 및 고체배양의 단계로 구성되는 고상발효법을 이용한다는 특징을 갖는다.
본 발명자들은 액체배양방법으로는 베타글루칸의 함량을 높여주는데 한계가 있다는 것을 확인하고 고체배지에서의 배양방법을 고려하게 되었다. 그러나 곡물부산물로 조성되는 고상배지는 포자, 곡물의 껍질 등 다양한 물질이 혼재되게 되어 완전한 멸균처리가 어렵고, 따라서 종균을 활착, 증식시키는 것이 용이하지 않다는 문제가 있다. 이러한 이유로 종래에는 고체배지에서 베타글루칸을 배양하는 방법은 이용된 바가 없다.
본 발명자들은 종래 아우레오바시디움 균주를 이용하는 액상배양방법에서 베타글루칸이 생산되는 것과 병행하여 아우레오바시디움 균주의 증식도 가능할 것이라는 점에 착안하여 본발명에서는 균주증식에 액상배지를 이용하고 액상배지에서 특정한 개체수 이상으로 증식된 아우레오바시디움 균주를 고체배지에 접종, 발효시켜주면 고농도의 수용성 베타글루칸을 생산할 수 있다는 것을 확인하게 되었다.

본 발명에서 액체배양 단계는 비교적 저가의 액체배지에서 아우레오바시디움 플루란스의 균체수를 증식시키는 단계이고, 고체배양의 단계는 아우레오바시디움 플루란스가 수용성 베타글루칸을 생산하기에 적합한 영양소를 갖추고 있으며, 원료단가가 높지 않고, 식품, 화장품, 의약품, 사료에 첨가가 가능한 고체배지 조성물이 제공된다.

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이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 수용성 베타글루칸을 세포외로 분비하는 아우레오바시디움 플루란스 공시균주를 사용하여, 생산단가가 낮고, 고농도 이며, 산업화가 어려운 고체배양조건의 확립으로 면역증강효과, 항종양활성, 항세균활성, 피부재생효과, 혈당강하작용, 혈압강하작용등의 다양한 약리적 효능을 가진 베타글루칸 제품을 의약품, 화장품, 건강보조식품 및 사료첨가제 원료로서 사용하기 위함이다.

본 발명가들은 상기의 조건을 만족시키는 배양 환경을 조성하기 위하여 노력한 결과 배양 단계를 액체배양, 고체배양, 건조의 단계로 나누어 각 단계별 목표에 따라 아우레오바시디움 플루란스의 증식, 수용성 베타글루칸의 생산, 제품화로 설정함으로써 곡물부산물로 조성된 고상배지에서 2% 중량 이상의 수용성 베타글루칸을 생산하게 되어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 액체배양배지는 아우레오바시디움 플루란스가 증식할 수 있도록 영양분을 함유하고 있으며, 단가가 높지 않고, 식품·화장품·의약품·사료에 직접 사용될 수 있는 배지원료를 밀기울·말분·미강 등의 곡류 부산물로 선정하여 단일 혹은 혼합의 상태에서 액체배지의 총량 5% 내지 30%로 지하수와 함께 혼합하고, 혼합된 액체배지를 배양조에서 121℃, 30분 내지 60분간 고온멸균한다. 이 영양배지에 무균상태로 종균을 접종하고 25℃ 내지 35℃에서 20시간 내지 72시간 배양하여 아우레오바시디움 플루란스의 균체수가 상업용으로 판매되는 배지와 같은 정도의 균체 증식량을 보이고 있다.

본 발명의 고체배양은 상기 액상배양에서 증식된 균주를 영양분 함유·저가·식용가능의 조건을 가진 밀기울·말분·미강·옥피의 단일 혹은 혼합된 것을 50% 내지 70%의 산(HCl, 10ppm)이 함유된 수분을 공급하여 100℃ 내지 110℃에서 1시간 내지 2시간 증자한 배지에 30% 내지 60% 접종하여 20℃ 내지 40℃, 20시간 내지 72시간 배양하게 된다. 이후 배양과정을 거치면서 충분한 시간동안 아우레오바시디움 플루란스가 수용성 베타글루칸을 생산할 수 있는 조건을 유지한다.

본 발명의 건조공정은 배양이 종료된 아우레오바시디움 플루란스를 함유한 고체배지를 건조가 용이하도록 30mesh크기의 분쇄과정을 거쳐 60℃ 내지 80℃의 열풍으로 12시간 내지 20시간 건조하여 제품을 완성하도록 하는 공정이다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것 일뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실험예 1
<아우레오바시디움 플루란균주의 증균시험>
미생물을 배양하는데 있어서 일반적으로 멸균처리된 액상배지가 주로 이용된다.
본 발명자들은 곡물부산물로된 액체배지에서 아우레오바시디움 균주가 고상배지에서 활착가능한 농도로 증식될 수 있는 지를 확인하기 위하여 본 증균시험을 실시하였다. 고상배지에서 활착가능한 아우레오바시디움 균주의 개체수는 적어도 ㎖당 10⁸이상은 되어야 한다.
실험용 배지로는 와이엠브로스(YM broth), 엔비브로스(NB broth), 자펙크브로스(Czapeck broth), 포테이토브로스(potato broth) 등의 상품명으로 거래되고 있는 것들이 주로 사용되고 있다.
와이엠브로스는 물 10ℓ당 효모추출물 0.3wt%, 맥아추출물 0.3wt%, 펩톤 0.5wt%, 텍스트로스 1wt%로 조성된 것이고, 엔비브로스는 물 1ℓ당 소고기추출물 0.3wt%, 펩톤 0.5wt%,로 조성된 것이고, 자펙크브로스는 물 1ℓ당 NaNO₃2.5wt%, K₂HPO₄0.1wt%, KCl 0.05wt%, MgSO₄ 0.05wt%, FeSO₄0.0001wt%, 펩톤 0.5wt%, 글루코스 3wt%로 조성된 것이고, 포테이토브로스는 물 1ℓ당 전분 0.4wt%, 덱스트로스 2wt%로 조성된 것이며, 이를 각각 121℃에서 15분간 멸균하여 액상배지로 사용한다.
곡물부산물로 된 액체배지에서 아우레오바시디움 플루란스의 배양성능을 비교해보기 위해서 밀기울 50중량%, 말분 25중량%, 미강 25중량%로 조성된 혼합물 100g에 물 900g을 혼합하여 곡물부산물로 조성된 액체배지를 만들고 이들의 배양성능을 와이엠브로스, 엔비브로스, 자펙크브로스, 포테이토브로스와 비교하고 그 결과를 다음 [표 1]에 나타냈다.
다음 표1에서 와이엠브로스는 효모추출물 0.3wt%, 맥아추출물 0.3wt%, 펩톤 0.5wt%, 덱스트로스 1wt%와 나머지는 물로 조성된 액상배지이고, 엔비브로스는 소기기추출물 0.3wt% 펩톤 0.5wt%와 나머지는 물로 조성된 액상배지이고, 라펙크브로스는 NaNO₃ 2.5wt%, K₂HPO₄ 0.1wt%, KCl 0.65wt%, MgSO₄ 0.05wt%, FeSO₄ 0.001wt%, 펩톤 0.5wt%, 글루코스 3.0wt%와 나머지는 물로 조성된 액상배지이고, 피디에이브로스는 전분 0.4wt%, 덱스트로스 2wt%와 나머지는 물로 조성된 액상배지이다.
와이엠브로스 등 인공배지인 경우 121℃에서 15분간, 곡류부산물배지는 121℃에서 30분간 고온멸균을 실시한 후 아우레오바시디움 플루란스 종균을 접종하고 48시간 배양한 후 아우레오바시디움 플루란스 종균의 개체수를 조사하여 다음 [표 1]에 나타냈다.
표 1에 나타낸 바와 같이 곡물부산물 배지에서 아우레오바시디움 플루란스 균주의 개체수가 가장 많게 나타났다.
이는 고가로 시판되고 있는 배지를 사용하지 않고 저가의 곡물부산물 배지에서도 아우레오바시디움 플루란스의 효율적인 배양이 가능하다는 것을 알 수 있었다.

액체배지의 성분을 와이엠 브로스(yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%, peptone 0.5%, dextrose 1%), 엔비 브로스(beef extract 0.3%, peptone 0.5%), 자펙크 브로스(NaNO₃ 2.5%, K₂HPO₄ 0.1%, KCl 0.05%, MgSO₄ 0.05%, FeSO₄0.0001%, peptone 0.5%, Glucose 3%), 포테이토 브로스(potato starch 0.4%, dextrose 2%)의 상업용 혼합배지와 밀기울, 말분, 미강이 혼합된 곡류 부산물배지의 조성을 달리하여, 5L 발효조에서 인공배지의 경우 121℃, 15분간, 곡류 부산물배지는 121℃, 30분 내지 60분간 고온고압멸균을 실시하여, 아우레오바시디움 플루란스를 접종하고, 12시간 내지 72시간동안 액체배양을 하였다.
<증식균주 개체수확인 시험>
와이엠 -아가배지(YM agar,yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%, peptone 0.5%, dextrose 1%, agar 2%, YM broth에 agar를 첨가한 것), 엔비-아가배지(beef extract 0.3%, peptone 0.5%, agar 2%), 자펙크-아가배지(NaNO₃ 2.5%, K₂HPO₄ 0.1%, KCl 0.05%, MgSO₄0.05%, FeSO₄ 0.0001%, peptone 0.5%, Glucose 3%, agar 2%), 포테이토-아가배지(potato starch 0.4%, dextrose 2%, agar 2%), 곡류부산물(밀기울을 50%로 한 곡류부산물, agar 2%)로 만든 평판배지에 상기 실험예에서 얻어진 배양액 0.1ml를 도말(platting) 하여, 48시간 후 종균의 개체수 증식을 확인한 결과 밀기울, 말분, 미강이 혼합된 곡류부산물 배지가 인공배지보다 아우레오바시디움 플루란스의 개체수가 거의 같거나 높게 나타났다.

배지조성	YM	NB	Czapeck	포테이토	밀기울,말분,미강
아우레오바시디움 플루란스의 개체수 {A. pullulans cfu/ml}	2.1×10⁸	1.8×10⁸	2.4×10⁸	2.0×10⁸	2.5×10⁸

실험결과 밀기울, 말분, 미강으로 구성된 곡물부산물 액체배지에서도 고체배지에서 발효가 가능한 농도의 아우레바시디움 플루란 균주를 배양할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예
<액체배지의 제조>

121℃, 30분 내지 60분간 고온고압멸균을 실시한 곡류 부산물 액체배지에서 아우레오바시디움 플루란스의 배양시간을 12시간 내지 72시간으로 달리하여 곡류부산물(밀기울을 50%로 한 곡류부산물, agar 2%)배지에 도말하여 48시간 후 종균의 개체수 증식을 확인한 결과 20시간에서 72시간까지 최대 균체량을 보였다.

배양시간(시간)	12	20	36	48	72	86
A. pullulans cfu/ml	1.3×10⁸	2.0×10⁸	1.9×10⁸	2.0×10⁸	2.1×10⁸	1.8×10⁸

배양시간(시간)	12	24	36	48	72	86
A. pullulans cfu/ml	1.3×108	2.0×108	1.9×108	2.0×108	2.1×108	1.8×108

<액체배양의 온도>

121℃, 30분 내지 60분간 고온고압멸균을 실시한 곡류 부산물 액체배지에서 아우레오바시디움 플루란스의 배양온도를 20℃ 내지 40℃로 달리하고, 20시간 내지 72시간 배양한 후 곡류부산물(밀기울을 50%로 한 곡류부산물, agar 2%)배지에 도발하여 48시간 후 종균의 개체수 증식을 확인한 결과 25℃ 내지 35℃까지의 온도에서 최대 균체량을 보였다.

배양온도(℃)	20	25	30	35	40
A. pullulans cfu/ml	1.3×10⁸	2.2×10⁸	2.1×10⁸	2.1×10⁸	1.1×10⁸

배양온도(℃)	20	25	30	35	40
A. pullulans cfu/ml	1.3×108	2.2×108	2.1×108	2.1×108	1.1×108

<고체배지의 조성>

고체배지의 조성은 50%중량의 밀기울을 기본으로 하고 말분·미강·옥피의 조성을 달리하여 수분량을 10% 내지 80%로 하고, 100℃ 내지 110℃에서 1시간 내지 2시간 증자한 배지에, 30분 내지 60분간 고온고압멸균을 실시한 곡류부산물 액체배지에서 25℃ 내지 35℃, 20시간 내지 72시간 배양한 10% 내지 70%로 종균을 접종하여 15℃ 내지 50℃, 12시간 내지 84시간 발효한 결과 밀기울·말분·미강·옥피를 혼합배양한 배지에서의 수용성 베타글루칸 생산량이 가장 높았다.·

배지조성	1	2	3	4	5	6	7
베타글루칸함량(%)	1.8	1.8	1.7	2.0	1.9	2.0	2.2

※ 배지조성 1 : 밀기울 100wt%
배지조성 2 : 밀기울 50wt%, 말분 50wt%
배지조성 3 : 밀기울 50wt%, 미강 50wt%
배지조성 4 : 밀기울 50wt%, 옥피 50wt%
배지조성 5 : 밀기울 50wt%, 말분 25wt%, 미강 25wt%
배지조성 6 : 밀기울 50wt%, 말분 25wt%, 옥피 25wt%
배지조성 7 : 밀기울 50wt%, 말분 16.7wt%, 미강 16.7wt%, 옥피 16.6wt%

성분	밀기울	밀기울 말분	밀기울 미강	밀기울 옥피	밀기울 말분 미강	밀기울 말분 옥피	밀기울 말분 미강 옥피
베타글루칸함량(%)	1.8	1.8	1.7	2.0	1.9	2.0	2.2

<고체배지의 수분량>

고체배지의 수분량을 10% 내지 80%로 달리하여 100℃ 내지 110℃에서 1시간 내지 2시간 증자한 배지에, 30분 내지 60분간 고온고압멸균을 실시한 곡류부산물 액체배지에서 25℃ 내지 35℃, 20시간 내지 72시간 배양한 종균을 10% 내지 70% 접종하여 15℃ 내지 50℃로 12시간 내지 84시간 발효한 결과 50% 내지 70%의 수분을 함유한 고체배지의 수용성 베타글루칸의 생산능력이 높게 나타났다.

수분량(%)	10	20	30	40	50	60	70	80
베타글루칸함량(%)	0.6	2.1	2.0	2.0	2.5	2.5	2.3	1.7

<고체배지의 발효온도>

고체배지의 발효온도를 15℃ 내지 55℃로 달리하여 수분량을 50 내지 70%로 하여 100℃ 내지 110℃에서 1시간 내지 2시간 증자한 배지에, 30분 내지 60분간 고온고압멸균을 실시한 곡류부산물 액체배지에서 25℃ 내지 35℃, 20시간 내지 72시간 동안 배양한 종균을 10% 내지 70% 접종하여 12시간 내지 84시간 배양한 결과 20℃ 내지 40℃의 온도조건에서 배양된 베타글루칸 생산능력이 가장 높음을 확인하였다.

배양온도(℃)	15	20	35	40	55
베타글루칸함량(%)	0.5	2.4	2.1	1.2	0.8

배양온도(℃)	15	25	35	45	55
베타글루칸함량(%)	0.5	2.4	2.1	1.2	0.8

<고체배지의 종균접종 농도>

고체배지에 액체배지를 접종하는 농도를 10% 내지 70%로 달리하여 수분량을 50 내지 70%, 100℃ 내지 110℃에서 1시간 내지 2시간 증자한 배지에, 30분 내지 60분간 고온고압멸균을 실시한 곡류부산물 액체배지에서 25℃ 내지 35℃, 20시간 내지 72시간 동안 배양한 종균을 10% 내지 70% 접종하여, 20℃ 내지 40℃, 12시간 내지 84시간 동안 배양하여 확인한 결과는 수용성 베타글루칸 생산능력이 30% 내지 60%의 종균 접종량일 때가 가장 높았다.

액체배지공급량(%)	10	20	30	40	50	60	70
베타글루칸함량(%)	2.0	2.0	2.6	2.5	2.4	2.2	2.1

<고체배지의 발효>

고체발효시간을 12시간 내지 84시간으로 달리하여 수분량을 50 내지 70%, 100℃ 내지 110℃에서 1시간 내지 2시간 증자한 배지에, 30분 내지 60분간 고온고압멸균을 실시한 곡류부산물 액체배지에서 25℃ 내지 35℃, 20시간 내지 72시간 동안 배양한 종균을 10% 내지 70% 접종하여 20℃ 내지 40℃로 배양한 결과 20시간 내지 72시간동안의 발효에서 배양된 베타글루칸 생산능력이 높음을 확인하였다.

배양시간(시간)	12	24	36	48	60	72	84
베타글루칸함량(%)	0.6	2.5	2.9	2.8	2.8	2.7	2.3

실험예 1. 아우레오바시디움 플루란스의 균체수 분석시험

본 발명의 실시예에서 아우레오바시디움 플루란스 균주의 증식된 개체수를 확인하기 위해 하기와 같이 실험하였다.

상기 사용된 액체배지는 와이엠 브로스, 엔비 브로스, 자펙크 브로스, 포테이토 브로스의 상업용 혼합배지와 밀기울, 말분, 미강이 혼합된 곡류 부산물배지로 25℃ 내지 35℃, 12시간 내지 72시간 동안 배양한 용액을 무균상태에서 1ml씩 채취하여 121℃, 15분간 습윤멸균된 증류수 9 ml에 희석하고 희석된 용액중의 1ml를 채취하여 9ml의 멸균 증류수에 희석하는 방법으로 각 배양액을 8회 희석한다. 이것을 다시 와이엠 아가(YM 브로스에 2wt%의 한천(agar)을 첨가한 것), 엔비 아가(NB-agar), 자펙크 아가(자펙크 브로스에 2wt%의 한천을 첨가한 것), 포테이토 아가(포테이토 브로스에 2wt%의 한천을 첨가한 것), 곡류부산물(곡물부산물 액체배지에 2wt%의 한천을 첨가한 것)에 종균수가 10⁸까지 희석된 배양액 0.1ml를 도말하여, 25℃ 내지 35℃의 온도에서 48시간동안 배양하여 종균의 개체수를 확인하고, 비교확인을 위하여 곡류부산물(밀기울을 50%로 한 곡류부산물, agar 2%)평판배지에 10⁸까지 희석된 각각의 배양액 0.1ml를 도말하고 48시간동안 배양하여 종균의 개체수를 비교한다.

실험예 2. 베타글루칸 함량실험

본 발명의 실시예에서 제조된 배양물에서 수용성베타글루칸 함량을 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

각 실시예의 배양물 1g을 인산 완충액(potasium phosphate buffer, pH 6)에 현탁한 후 10분간 10,000rpm으로 원심분리 한다. 상등액 1ml를 취하여 1ml의 0.2% 판크레아틴(pancreatin) 효소액과 혼합하여 37℃, 1시간 동안 반응시킨 후 반응액을 1.5ml의 에탄올과 혼합하여 4℃의 상태에서 8시간에서 12시간 방치 한다. 다시 12,000rpm, 10분간 원심 분리하여 상등액을 버리고 펠렛(pellet)을 0.05 M 인산카리 완충액에 완전히 현탁한 후 1ml 0.1% 라미나리아제(laminalinase, 베타글루칸을 당으로 분해시키는 효소)를 처리하여 40℃로 기질이 분해될 때까지 반응시키고, 반응이 끝난 시료로 환원당을 정량하였다.

실험에 사용한 효소 및 기질은 시그마(Sigma, USA)사에서 구입하였다.

실험결과 고상 배양한 것이 액상배양 이상의 수용성 베타글루칸 함량을 가지고 있었으며, 액상의 단일배양보다 고상배양을 한 것이 수용성 베타글루칸의 함량이 높음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 방법은 저가의 배지를 이용하여 고농도의 수용성 베타글루칸을 얻을 수 있는 효과를 갖는다.

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Claims

아우레오바시디움 플루란스 종균을 배지에 접종시켜 수용성 베타글루칸을 제조하는 방법에 있어서, 아우레오바시디움 플루란스 균주를 밀기울을 기본으로 하는 곡물부산물 액체배지에서 25~35℃에서 20~72시간 배양하여 증균시키고, 상기 증균된 아우레오바시디움 플루란스균주를 밀기울을 기본으로 하는 고체배지에 접종하여 20~40℃에서 20~72시간 고체배지를 발효시켜 곡물부산물 고체배지에서 고농도의 수용성 베타글루칸을 제조하는 방법.
제 1항에 있어서,

곡물부산물, 액체배지가 밀기울 50중량%와 말분 및 미강을 균일하게 혼합한 혼합물 50wt%로 조성된 혼합물 10~20중량%에 물 80~90중량%를 혼합하여서 조성된 것이고, 곡물부산물 고체배지가 밀기울 50중량%와 말분, 미강, 옥피를 균일하게 혼합한 혼합물 50wt%로 조성된 혼합물 30~70중량%에 물 50~70중량%를 혼합하여서 조성된 것인 곡물부산물 고체배지에서 고농도 수용성 베타글루칸을 제조하는 방법.
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