KR100653726B1

KR100653726B1 - Ｎｕｒ77 유전자의 활성자를 포함하는 신규한 혈관신생제

Info

Publication number: KR100653726B1
Application number: KR1020040087940A
Authority: KR
Inventors: 이미옥; 유영건
Original assignee: 이미옥
Priority date: 2004-11-01
Filing date: 2004-11-01
Publication date: 2006-12-04
Anticipated expiration: 2024-11-01
Also published as: KR20060038790A

Abstract

본 발명은 유효성분으로서 Nur77 유전자를 활성화시키는 활성자 (activator)를 포함하는 혈관신생제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, (a) 약제학적 유효량의 Nur77 유전자를 활성화시키는 활성자 (activator); 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

혈관신생, Nur77, 6-머르캅토퓨린, HIF-1, VEGF

Description

Ｎｕｒ77 유전자의 활성자를 포함하는 신규한 혈관신생제{Novel Angiogeneic Agent Comprising Activator of Ｎｕｒ77 Gene}

도 1a-1c는 6-MP가 Nur77의 유도를 통한 HIF-1α의 단백질 레벨을 증가시킴을 보여주은 겔 사진이다. 도 1a에서, HepG2 세포 (1.25 x 10⁶ 세포/웰) 및 HeLa 세포 (5 x 10⁵ 세포/웰)를 6-웰 배양 플레이트에 씨딩하고, 1% FBS를 포함하는 배지에서 하룻밤 동안 배양하였다. 세포를 100 μM CoCl₂로 처리하거나 표시된 농도의 6-MP로 24시간 동안 처리하였다. Nur77, HIF-1α및 VEGF의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 도 1b에서, HepG2 세포 (2.5 x 10⁶ 세포/디쉬) 및 HeLa 세포 (8 x 10⁵ 세포/디쉬)를 60-cm² 디쉬에 씨딩하고, 1% FBS를 포함하는 배지에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이어, 세포를 50 μM 6-MP로 표시된 시간 동안 처리하였다. Nur77 및 HIF-1α의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 도 1c에서, NIH3T3 세포 (5 x 10⁵ 세포/웰)를 6-웰 배양 플레이트에 씨딩하고 하룻밤 동안 배양하였다. 세포를 3 ㎍ p3XFLAGTM7.1-DN-Nur77 또는 공벡터로 형질전환시켰다. 형질전환 24시간 후, 배지를 1% FBS를 포함하는 배지로 교체하였다. 24시간 경과 후, 세포를 100 μM CoCl₂로 처리하거나 표시된 농도의 50 μM 6-MP로 24시간 동안 처리하였다. HIF-1α, Nur77, VEGF 및 DN-Nur77의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. α-튜블린의 발현을 대조군으로 모니터링하였다. 동일한 3 세트의 실험을 실시하였고, 모두 유사한 결과가 나왔다.

도 2는 6-MP가 HIF-1α의 전사 활성을 증가시킨다는 사실을 보여주는 그래프이다. HepG2 세포 (1.5 x 10⁵ 세포/웰)를 12-웰 배양 플레이트에 씨딩하고 하룻밤 동안 배양하였다. Nur77 프로모터 (-454 ~ +57)-Luc 리포터 (0.2 ㎍), NBRE-Luc 리포터 (0.2 ㎍), HRE-Luc (0.1 ㎍) 또는 VEGF 프로모터 (-2003 ~ 23)-Luc (0.3 ㎍) 리포터를 세포에 형질전환시켰다. 형질전환 24시간 후, 세포를 6-MP의 표시된 농도로 24시간 동안 처리하였다. P/I는 PMA (10 ng/㎖)와 이오노마이신 (0.5 μM)으로 6시간 처리한 양성 대조군을 나타낸다. 세포 용해물을 수득하고 분석하였다. β-gal 활성으로 형질전환 효율에 대한 루시퍼라아제 활성을 표준화 하였다. 데이터는 3개의 독립된 실험 결과에 대한 평균ㅁ SD이다.

도 3a-3c는 6-MP가 HIF-1α단백질의 안정화를 증가시킨다는 사실을 보여주는 사진이다. 도 3a에서, HeLa 세포 (5 x 10⁵ 세포/웰)를 6-웰 배양 플레이트에 씨딩하고, 1% FBS를 포함하는 배지에서 하룻밤 동안 배양하였다. 24시간 배양 후, 세포를 100 μM CoCl₂ 또는 50 μM 6-MP로 24시간 동안 처리하였다. 처리 후, HIF-1α, VEGF 및 Nur77의 전사체의 발현을 RT-PCR로 분석하였다. β-액틴의 발현을 대조군으로 모니터링 하였다. 도 3b에서, NIH3T3 세포 (5 x 10⁶ 세포/웰)를 6-웰 배양 플레이트에 씨딩하고, 1% FBS를 포함하는 배지에서 하룻밤 동안 배양하였다. 24시간 배양 후, 세포를 100 μM CoCl₂ 또는 50 μM 6-MP로 24시간 동안 처리하였다. 처리 후, 10 μM 사이클로헥사마이드 (CHX)를 표시된 배양 시점에 첨가하였다. HIF-1α 및 Nur77의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. α-튜블린의 발현을 대조군으로 모니터링 하였다. 도 3c에서, 4-챔버 슬라이드 유리에 전날 플레이팅한 293 세포(1.5 x 10⁴ 세포/챔버)를 Polyfect^TM를 이용하여 GFP-HIF-1α로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 100 μM CoCl₂ 또는 50 μM 6-MP로 24시간 동안 처리하였다. 처리 후, 세포를 고정화하고 면역형광 현미경으로 관찰하였다. 핵을 염색하기 위하여 DAPI를 이용하였다. 동일한 3 세트의 실험을 실시하였고, 모두 유사한 결과가 나왔다.

도 4a 및 4b는 VHL과 MDM2의 HIF-1α과의 상호작용은 6-MP의 존재 하에서 감소됨을 보여주는 사진이다. NIH3T3 세포 (8 x 10⁵ 세포)를 60-cm² 디쉬에 씨딩하고, 하룻밤 동안 배양한 다음, 3 ㎍ pCMV-Myc-VHL로 형질전환시켰다. 형질전환 1시간 후, 세포를 10 μM MG132으로 1시간, 100 μM CoCl₂로 24시간 또는 50 μM 6-MP로 24시간 동안 처리하였다. 처리 후, 세포를 파괴한 다음, 전체 세포 용해액을 수득하였다. 500 ㎍ 전체 세포 용해액을 anti-HIF-1α항체로 면역침전시키고, anti-Myc 또는 anti-MDM2 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅으로 프로빙하였다. HIF- 1α, Myc-VHL 및 MDM2의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. α-튜블린의 발현을 대조군으로 모니터링하였다. 동일한 3 세트의 실험을 실시하였고, 모두 유사한 결과가 나왔다.

도 5a 및 5b는 6-MP가 HIF-1의 6-MP가 HIF-1α의 트랜스활성화 기능을 향상시킨다는 것을 보여주는 사진이다. 도 5a에서는 6-MP가 Gal4-HIF-1α의 활성을 증가시킴을 보여준다. HepG2 세포 (1.5 x 10⁵ 세포/웰)를 12-웰 배양 플레이트에 씨딩하고, 하룻밤 동안 배양한 다음, Gal4-tk-Luc 리포터 (0.2 ㎍)으로 형질전환시켰다. 형질전환 24시간 후, 세포를 100 μM CoCl₂ 또는 6-MP로 24시간 동안 처리하였다. 처리 후, 세포 용해액을 수득하고 분석하였다. β-gal 활성으로 형질전환 효율에 대한 루시퍼라아제 활성을 표준화 하였다. 데이터는 3개의 독립된 실험 결과에 대한 평균±SD이다. 도 5b에서는 6-MP가 HIF-1α의 전사활성화를 증가시킬 때 CBP와의 상호작용이 증가함을 보여주고 있다. NIH3T3 세포 (8 x 10⁵ 세포/디쉬)를 60-cm² 디쉬에 씨딩하고, 1% FBS-함유 배지에서 하룻밤 동안 배양하였다. 세포를 100 μM CoCl₂또는 6-MP로 24시간 동안 처리하였다. 500 ㎍ 전체 세포 용해액을 anti-HIF-1α항체로 면역침전시키고, anti-CBP 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅으로 프로빙하였다. HIF-1α및 CBP의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. α-튜블린의 발현을 대조군으로 모니터링하였다. 동일한 3 세트의 실험을 실시하였고, 모두 유사한 결과가 나왔다.

도 6a 및 6b는 6-MP가 HIF-1α의 단백질 양을 증가시킬 뿐만 아니라 인간 혈관 내피 세포에서 튜브 형성도 증가시킴을 나타낸다. 도 6a에서, HUVECs (2 x 10⁶ 세포/디쉬)를 100-cm² 디쉬에 씨딩하고 1% FBS-함유 배지에 하룻밤 동안 배양하였다. 세포를 저산소 상태 (0.1% O₂)에 노출시키거나 또는 정상산소 상태에서 6-MP의 표시된 농도 24시간 동안 처리하였다. HIF-1α, Nur77 및 VEGF의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. α-튜블린의 발현을 대조군으로 모니터링하였다. 동일한 3 세트의 실험을 실시하였고, 모두 유사한 결과가 나왔다. 도 6b에서, HUVECs (2 x 10⁴ 세포/웰)을 10% FBS와 내피세포 성장 보조제를 함유하는 배지가 있는 96-웰 플레이트의 Matrigel-코팅층 위에 플레이팅 하였다. 세포를 6-MP의 표시된 농도로 24시간 동안 처리하였다. 양성 대조군으로서, 세포를 저산소 상태 (0.1% O2)에 24시간 동안 노출시켰다. 배양 후, 모세관-유사 튜브 형성을 광학 현미경 하에서 관찰하였다. 동일한 3 세트의 실험을 실시하였고, 모두 유사한 결과가 나왔다.

본 발명은 신규한 혈관 신생제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 Nur77 유 전자를 활성화시키는 활성자 (activator)를 포함하는 신규한 혈관신생제에 관한 것이다.

저산소상태-유도성 인자-1 (HIF-1)는 유용 산소의 변화에 대한 세포의 적응에 필수적인 역할을 수행한다 (1). 저산소 상태에서, HIF-1은 산소 운반을 증가시키는 역할을 하는 단백질들을 인코딩하는 다양한 유전자들의 전사를 촉진시켜, 대사 적응을 가능하게 하고 세포 생존을 증가시킨다. HIF-1은 α및 β서브유니트로 구성되어 있고, 이 둘은 염기성 헬릭스-루프-헬릭스 PER-ARNT-SIM (bHLH　PAS) 단백질 패밀리에 속한다. HIF-1β는 아릴 탄화수소 수용체 핵 트랜스로케이터로서, 정상산소 조건하에서 상당히 안정되지만, HIF-1α는 매우 불안정하여 유비퀴틴 프로테아좀 시스템에 의하여 신속하게 파괴된다 (2, 3).

종양-억제자 von Hippel　Lindau (VHL) 단백질은 산소의 존재하에서, 프롤린-564 잔기에 히드록실기가 결합된 HIF-1α와 상호작용을 하며, 이는 HIF-1α의 분해를 야기한다 (4, 5). 특이적 프롤릴 히드록실라아제 (PHDs)는 HIF-1α의 산소-의존성-분해 도메인에 있는 프롤린 잔기의 히드록실화를 촉매한다 (6-8). 3종의 인간 PHDs, 즉, PHD1, PHD2 및 PHD3는 다양한 위치에서 발현되지만, 각각의 동형체는 발현되는 전사체의 양이 서로 상이하다 (7). HIF-1α의 추가적인 활성화는 그의 핵내 전위, HIF-1β와의 이합체화, DNA 결합 그리고 cyclic-AMP-반응-요소-결합-단백질 (CBP)/p300와 같은 전사 공동활성자와의 작용 (recruitment)을 야기한다 (9). VHL과 HIF-1 억제인자 사이의 협동적 결합은 HIF-1α의 트랜스활성 화 기능을 억제한다 (10). 사실, HIF-1 억제인자는, 산소분자를 이용하여 HIF-1α의 아스파라긴-803을 변형시켜 HIF-1α와 그의 공동활성자의 해리를 초래하는 아스파라긴 히드록실라아제로 동정되었다 (11). 이러한 과정들은 Ras/Raf/MEK/p42/p44 시그널링 경로를 통하여 HIF-1α의 인산화가 이루어지는 해독후 변형에 의해 조절되며, 이는 HIF-1α의 트랜스활성화 기능을 강화시킨다 (12, 13). ARD-1에 의한 HIF-1α의 아세틸화는 VHL과의 상호작용을 강화시키며, 이는 HIF-1α의 프로테오좀 분해를 초래하는 것으로 확인되었다 (14).

저산소상태는 HIF-1을 활성화하는 강하면서도 일반적인 자극이지만, 다른 자극들, 예컨대 호르몬, 환경 및 세포내 자극들도, 세포-특이적 방식으로 HIF-1의 활성화를 유도하는 것으로 알려져 있다 (15-17). 세포 스트레스에 대한 반응에서 주요한 조절자인 p53은 HIF-1α와 직접적으로 상호작용을 하며, MDM2-매개 유비퀴틴화와 이어지는 HIF-1α의 프로테오좀 분해를 촉진시켜 HIF-1α의 양을 감소시킨다 (18). 이와 반대로, v-Src 및 RasV12와 같은 발암 단백질은 히드록실화 프롤린-564의 상실을 초래하여 결국 HIF-1α를 안정화시킨다. 최근에, 본 발명자들은 헤파티티스 B 바이러스 X 단백질, HBV의 주요한 트랜스활성자는, 세포외 시그널-조절 키나아제 (ERK)의 시그널링 경로를 통하여 HIF-1α를 안정화시킴으로써 HIF-1α의 전사활성을 증가시킴을 확인하였다 (19). 따라서, HIF-1α의 안정화는 다양한 세포내 단백질에 의해 조절되며, 이와 같은 사실은 저산소증과 다른 생리적 신호 사이의 확인되지 않은 크로스토크가 있음을 시사한다.

Nur77 (또는 NGFI-B, N10, TIS1, TR3 및 NAK-1로 알려짐)은 유전자 발현을 조절하는 전사 인자의 스테로이드/갑상선 수용체 슈퍼패밀리의 오펀 (orphan) 멤버이다. Nur77은 N-말단 트랜스활성화 도메인, DNA-결합 도메인 및 C-말단 리간드 결합 도메인으로 이루어져 있다 (20). Nur77은 Nur77-결합 반응 엘리먼트 (NBRE)에 단량체로 결합하며, NBRE는 RAR/RXR 패밀리의 전형적 인식 모티트인 헥사뉴클레오타이드 (5'-AGGTCA-3')와 이 헥사뉴클레오타이드에 선행하는 2개의 A 잔기를 포함한다(21). 또한, Nur77은 동형이형체로 DNA에 결합하거나 헤테로이형체로 레티노이드 X 수용체에 결합한다 (22, 23). 과다발현될 때 Nur77은 계속적으로 활성화되며, 이는 Nur77가 리간드 자극을 요구하지 않음을 시사한다. 다양한 실험적 증거를 통하여, Nur77이 주요한 두 가지 세포 반응, 즉 세포 증식 및 아폽토시스에 관여함을 알 수 있다. Nur77 발현은 성장인자 및 유사분열인자에 의해 빠르게 유도된다 (24-26). 표피성장인자 (EGF) 및 혈청은 Nur77의 발현을 유도하며, 이는 유사분열 효과를 발휘한다 (27). 또한, Nur77은 미성숙 흉선세포 및 T-세포 하이브리도마에서 T-세포 수용체 시그널링에 의해 신속하게 유도되며, 이어 아폽토시스에 의한 세포 사멸이 따른다 (28-30). 아폽토시스는, 화학요법 의약을 포함하는 다양한 아폽토시스-유도제에 의해 유도되며, 아폽토시스 과정은 Nur77이 마이토콘드리아에 트랜스로케이션되는 것과 연관된다 (27, 31). 최근에, Nur77과 Bcl-2 아폽토시스 시스템 사이의 상호작용은, Bcl-2를 보호자로부터 킬러로 전환시킨다는 사실이 보고되었다 (32). Nur77은 세포 증식 및 아폽토시스 모두에 관여하기 때문에, Nur77은 종양의 발생 및 발전에 관여하는 것으로 여겨지며, 이는 상기 두 세포 과정의 균형의 파괴로부터 유래되는 것으로 판단된다.

한편, 혈관신생 (angiogenesis)는 새로운 혈관이 조직 또는 기관내에 형성되는 멀티-스텝 과정이다. 혈관신생은 정상적인 조직에서는 거의 관찰되지 않는다. 다양한 병리학적 조직, 예컨대, 고형암 (Folkman et al. J. Exp. Med. 133:275(1971)), 활액 (Brown et al., Lancet I: 682:685(1980)), 인간 심근 경색 (Kumar et al., Lancet II: 364-367(1983)), 당뇨병성 망막증을 갖는 인간과 동물의 망막의 유리액 (Hill et al., Experientia 39:583-585(1983); D. Amore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3068-3073(1981); Kissun et al., Br. J. Ophth. 66:165-169(1982)), 및 상처액 (Branda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7773-7777(1982))으로부터 혈관신생 인자들이 분리되었다.

기저막으로 둘러싸인 내피세포 및 혈관주위세포 (pericytes)는 모세혈관을 형성한다. 혈관신생은 내피세포 및 백혈구로부터 방출되는 효소에 의한 기저막의 파괴로부터 시작된다. 이어, 혈관의 루멘에 있는 내피세포는 기저막을 통하여 돌출된다. 혈관신생 자극자는 내피세포가 파괴된 기저막을 통하여 이동되도록 유도한다. 이동한 세포는 유사분열과 증식을 거치면서 모혈관으로부터 스프라우팅 (sprouting)한다. 내피세포 스프라우트 (sprout)들은 서로 융합하여 모세루프를 형성하여 결국 새로운 혈관을 형성하게 된다.

혈관신생에 대한 일반적인 내용은 Maciag, T., Molecular and Cellular Mechanisms of Angiogenesis, in IMPORTANT ADV. ONCOL., pp. 85-98(1990)에 개시되어 있다.

VEGF (vascular endothelial growth factor)와 bFGF (basic fibroblast growth factor)와 같은 성장인자들은 혈관신생을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.한편, 혈관신생을 촉진시킬 수 있는 작은 분자량의 의약은 혈관신생 부전 (insufficiency)과 연관된 질환 또는 상태를 치료하는 데 획기적인 방법을 제공할 것이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 혈관신생을 효과적으로 유도할 수 있는 물질을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, Nur77 유전자를 활성화시키는 활성자 (activator)가 혈관신생을 촉진시킬 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 혈관신생제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 유효성분으로서 Nur77 유전자의 활 성자 (activator)를 포함하는 혈관신생제를 제공한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 (a) 약제학적 유효량의 Nur77 유전자를 활성화시키는 활성자 (activator); 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 유전자 발현을 조절하는 전사 인자의 스테로이드/갑상선 수용체 슈퍼패밀리의 오펀 (orphan) 멤버인, Nur77 (또는 NGFI-B, N10, TIS1 및 NAK-1로 알려짐) 유전자의 발현을 활성화시키며, 발현된 Nur77은 저산소상태-유도성 인자-1α (Hypoxia-inducible factor-1α: HIF-1α)의 유전자의 발현을 증가시키고 HIF-1α의 전사활성을 향상시키며, 전사인자인 HIF-1α에 의해 VEGF (vascular endothelial growth factor) 유전자의 발현이 증대되어 결국 혈관신생이 촉진된다는 분자적 기전을 발견하였다. 본 발명은 이러한 분자적 기전의 발견에 기초한 것이다.

본 발명에 있어서, 타깃이 되는 유전자는 Nur77 유전자 또는 Nur77 패밀리 유전자는 NGFI-B 유전자라고도 한다. Nur77 패밀리 유전자에 속하는 유전자는 Nur77 (NGFI-Bα), Nurr1 (NGFI-Bβ)와 Nor1 (NGFI-Bγ)이 있다 (Wilson TE et al., Mol Cell Biol. 13:5794-5804(1993); Drouin et al., J Steroid Biocjem Mol Biol 65:59-63(1998); Law SW et al., Mol Endocrinol 6:2129-2135(1992); Ohkura N et al., Biochem Biophys Res Commun 205:2959-1965(1994)). 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 특별한 언급이 없는 한, Nur77 패밀리 유전자들의 활성을 촉 진하는 활성자들도 포함된다.

본 명세서에서, 표현 "Nur77 유전자를 활성화시키는 활성자 (activator)"는 (a) Nur77 유전자의 발현 활성화; 및/또는 (b) 발현된 Nur77 단백질의 전사 활성능증진을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, Nur77 유전자를 활성화시키는 활성자는 6-머르캅토퓨린, 6-머르캅토퓨린-리보사이드, 6-머르캅토퓨린-2'-데옥시리보사이드, 6-머르캅토퓨린-모노하이드레이트 및 6-머르캅토퓨린-9-β-D-리보퓨라노사이드를 포함하며, 가장 바람직하게는 상기 Nur77 패밀리 유전자의 활성자는 6-머르캅토퓨린 (6-MP)이다 (Senali Abayratna Wansa KD, et al, J Biol Chem. 278:24776-24790(2003); Ordentlich P et al, J Biol Chem. 278:24791-24799 (2003)).

하기 실시예는 6-머르캅토퓨린에 의해 Nur77 유전자를 활성화시키는 경우 종국적으로 혈관신생이 촉진됨을 보여주고 있으나, 하기 실시예에 규명된 분자적 기전에 따르면, Nur77 유전자를 활성화시키는 어떠한 물질도 혈관신생을 촉진시킬 수 있는 능력을 갖고 있다는 것은 당업자가 충분히 인식할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 적용되어 치료 효과를 발휘할 수 있는 질환 (diseases) 또는 상태 (conditions)는 혈관신생 부전 (insufficiency)과 연관된 질환 (diseases) 또는 상태 (conditions), 즉 충분한 혈관형성을 위하여 혈관신생이 요구되는 질환 또는 상태로서, (a) 당뇨병성 궤양; (b) 괴저; (c) 치유를 위해 혈관신생이 요구되는 상처; (d) 뷰르그병; (e) 고혈압; (f) 허혈성 질환 (예컨대, 뇌혈관 허혈, 신장 허혈, 폐 허혈, 지절 허혈 및 허혈성 심근경색); (g) 심한 폐색성 혈관 질환; 그리고 (h) 심혈관 질환을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 혈관신생 부전과 연관된 질환 또는 상태에 적용될 수 있으므로, 본 발명은 (a) 약제학적 유효량의 Nur77 유전자를 활성화시키는 활성자 (activator); 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생 부전-연관 질환 또는 상태의 치료용 약제학적 조성물로 표현될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또 는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 혈관신생 성장 인자를 추가적으로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 혈관신생 성장 인자는 산성 또는 염기성 FGF, VEGF, EGF (epidermal growth factor), TGF (transforming growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), TNF (tumor necrosis factor), HGF (hepatocyte growth factor) 및 IGF (insulin-like growth factor)를 포함한다.

종래에 혈관신생제로 이용되고 있는 것은 거대 분자량의 단백질 의약이 주종을 이루고 있는데, 본 발명의 혈관신생제는 작은 분자량을 갖는 화학 의약으로서 혈관신생 부전-관련 질환 또는 상태를 치료하는 데 새로운 전기 (breakthrough)를 제공할 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

세포 배양 및 저산소 상태 처리

인간 간암세포주, HepG2 (ATCC HB 8065), 인간 경부암세포주, HeLa (ATCC CCL-2), 인간 배아성 신장세포주, 293 (ATCC CRL-1573) 및 마우스 섬유아세포주 NIH3T3 (CRL-1658)는 ATCC (American Type Culture Collection)으로부터 구입하였다. 세포들은 10% FBS (fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM (Dubelco's modified eagles medium)에서 유지하였다. 인간 탯줄 혈관 내피세포 (HUVEC)는 한양대학교 병리학교실의 공 구박사로부터 기증 받았고, 이는 20% FBS, 내피세포 성장 보조제 (Sigma, St. Louis., MO) 및 50 ㎍/㎖의 페니실린과 스트렙토마이신 (Invitrogen)을 함유하는 M199 배지 (Join Bio)에서 유지시켰다. 패시지 3 내지 10의 HUVECs를 이용하였다. 세포들은 5% CO₂ 및 95% 공기를 갖는 함습 항온기에서 37℃로 유지하였다. 저산소 상태 (0.1% O₂)에 노출시킬 때에는, 세포를 5% CO₂, 10% H₂ and 85% N₂의 혐기성 항온기 (Forma Scientific)에서 37℃로 배양하였다. 저산소상태는 세포를 100 μM CoCl₂ (Sigma Chemical)로 처리함으로써 화학적으로 유도하였다. 세포를 저산소 상태에 노출시킬 때에는, 특별하게 다른 언급이 없는 한, 1% FBS를 포함하는 배지를 이용하였다.

웨스턴 블롯팅 및 면역침전

150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7.4, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 프로테아제 억제제를 포함하는 용해 완충액에서 얼음 위에서 30분 동안 세포를 파괴하고, 원심분리하여 전체 세포 용해액을 얻었다. 전체 세포 용해액으로부터 얻은 50 ㎍ 단백질을 8-15% SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 하고, 폴리비닐리덴 디플루오리드 막 (Bio-Rad)에 전이시켰다. 0.1% Tween-20을 포함하는 PBS내의 5%(w/v) 비지방 건조 밀크로 블롯킹을 실시하고, Nur77, HIF-1α, VEGF, MDM2, CBP, Myc (Santa Cruz Biotech), FLAG (Sigma) 또는 α-튜블린 (Oncogene)에 대한 특정 항체와 반응시켰다. 면역침전을 위하여, 500 ㎍ 전체 세포 용해액을 1-㎍ 항-HIF-1α 항체와 반응시켰다. 40 ㎕ 단백질-A 또는 단백질-G 아가로스 슬러리를 첨가하여, 형성된 면역-복합체를 침전시켰다. 면역-복합체를 용해 완충액으로 5번 세척한 다음, SDS-PAGE를 실시하고, PVDF 막에 전이시켰다. anti-Myc, anti-MDM2 or anti-CBP 항체로 막을 처리하였다. HRP (horseradish peroxidase)-접합 2차 항체 (Zymed Lab)를 이용하였고, Super Signal (Pierce)을 이용하여 면역반응성 단백질을 검출하였다. 단백질 농도는 BCA (bicinchoninic acid) (Pierce) 분석으로 정량화하였다.

플라스미드 및 일시적 형질전환

Nur77 프로모터 (-454 to 57)-Luc, NBRE-Luc, 및 HRE-tk-Luc, VEGF 프로모터 (-2068 to +50)-Luc, Gal4-tk-Luc 리포터 컨스트럭트를 구축하였다 (19, 33, 34)에 기재된 방법에 따라 구축하였다. Nur77의 절단형 컨스트럭트, Nur77_Hga(aa 252 to 601)를 얻기 위하여 PCR 증폭물을 p3XFLAG^TM7.1 (Sigma)의 EcoRI/BamHI 위치에 삽입하여 p3XFLAG^TM7.1-Nur77_Hga(도미넌트-네가티브 Nur77, DN-Nur77)를 얻었다. GFP 태깅-HIF-1α, GFP-HIF-1α를 제작하기 위하여, PCR 증폭물을 pEGFP-C3에 삽입하였다. Myc-VHL를 위한 진핵세포 발현 벡터는 논문 (19)에 기재된 방법에 따라 수득하였다. 모든 컨스트럭트를 시퀀싱으로 확인하였다.

단백질의 일시적 발현을 위하여, NIH3T3 및 HeLa 세포 (6-웰 플레이트에서 5 x 10⁵ 세포/웰 또는 8 x 10⁵ 세포/60-cm² 디쉬)를 씨딩하고 하룻밤 동안 배양하였다. Polyfect (Qiagen Inc.)를 이용하여, 세포를 3-6 ㎍의 발현 벡터로 형질전환시켰다 (19). 리포터 유전자 분석을 위하여, HepG2 세포를 (2 x 10⁵ 세포/웰) 12-웰 배양 플레이트에 씨딩하고, LipofectaminePlus^TM를 이용하여 리포터 플라스미드 (0.1 to 0.3 ㎍), β-갈락토시다아제 (β-gal) 발현 벡터 (0.2 ㎍)로 형질전환시켰다. 처리가 종료된 후, 루시퍼라아제 활성을 Analytical luminescence luminometer를 이용하여 결정하였다. 형질전환 효율을 확인하기 위하여, 상응하 는 β-gal 활성을 이용하여 루시퍼라아제 활성을 표준화하였다.

역전사효소-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)

RNeasy 키트 (Qiagen Inc.)를 이용하여 총 RNA를 얻었다. PCR 반응을 수행하되, HIF-1α의 프라이머 (전방향: 5'-CAAGTGCATCATTAAGACTG-3', 역방향: 5'-GGCTGCTCCAGGTCCTGGCG-3'), VEGF의 프라이머 (전방향: 5'-TGGAGTT TGCTAAACGTCTG-3', 역방향: 5-GTAGCTTATCTACTTTTGTC-3'), Nur77의 프라이머 (전방향: 5'-CGACCCCCTGACCCCTGAGTT-3', 역방향:5'-GCCCTCAAGGTGTTGGAGAAGT-3'), 및 α-액틴의 프라이머 (5'-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3', 역방향:5'-TTGGCTTAGGGTTCAG GGGGG-3')를 이용하여 해당 유전자를 증폭하였다 (19). 유전자의 증폭이 지수적으로 유지될 때 결과를 분석하였다.

면역형광 분석

4-챔버 슬라이드 유리상에 전날 플레이팅한 293 세포 (1.5 x 10⁴ 세포/챔버)를 Polyfect^TM을 이용하여 0.5 mg GFP-HIF-1α로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 100 μM CoCl₂로 24시간 동안 처리하거나 또는 처리하지 않았다. 처리 후, 세포를 5분 동안 50% 아세톤/50% 메탄올로 고정화하고, 면역형광 현미경으로 세포를 관찰하였다 (Olympus). 핵을 염색하기 위하여 4,6-디아미디노-2 페닐인돌 (DAPI)를 사용하였다.

튜브 형성 분석

96-웰 플레이트를 40 ㎕ Matrigel (BD Biosciences)를 사용하여 1시간 동안 37℃에서 코팅하였다. HUVECs를 10% FBS와 내피세포 성장 보조제가 함유된 배지에 현탁시키고, 2 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 3개의 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 저산소 상태 (0.1% O₂) 상태에서 배양하거나 또는 정상산소 상태에서 6-MP로 24시간 동안 처리하였다. 세포 및 튜브의 형태학적 변화를 광학 현미경 하에서 관찰하고, JVC 디지털 카메라로 사진 촬영을 하였다 (TKC1380U; JVC, Yokohama, Japan).

실험결과

6-MP는 Nur77의 유도를 통하여 HIF-1α의 전사활성을 증가시킨다.

Nur77은 HIF-1α의 전사활성을 증가시켜 HIF-1의 다운스트림 유전자인 VEGF의 발현을 증가시킨다. 6-MP는 Nur77 패밀리의 활성자로 알려져 있기 때문에, 본 발명자들은 6-MP가 Nur77의 활성화를 통하여 저산소 시그널링을 조절할 수 있는 지 여부를 조사하였다. CoCl₂로 유도된 저산소 상태 하에서, Nur77, HIF-1α 및 VEGF 단백질의 발현이 유도되었다. 6-MP 처리는 Nur77뿐만 아니라 HIF-1α 및 VEGF도 유도하였다 (도 1a). Nur77의 유도는 처리후 30분 정도에서 관찰되었고, 이러한 현상은 최소 24시간 동안 계속되었다. Nur77의 유도는 HIF-1α와 VEGF의 단백질 레벨의 증가가 수반되었다 (도 1a). 유사한 결과가 다른 세포주, HeLa에서도 관찰되었다 (도 1a 및 1b). 이어, 본 발명자들은 6-MP 처리 전에 플라스미드 인코딩 도미넌트-네가티브 (DN) Nur77를 형질전환시켰다 (도 1c). DN-Nur77의 존재 하에서, Nur77뿐만 아니라 HIF-1α 및 VEGF의 유도도 강하게 억제되었고, 이와 같은 결과는 6-MP에 의한 HIF-1α의 유도가 주로 Nur77에 의해 중재됨을 보여주는 것이다.

6-MP에 의해 증가된 HIF-1α단백질이 전사 활성을 나타내는 지 여부를 확인하기 위하여, 리포터-유전자 분석을 실시하였다. 6-MP를 처리하였을 때, Nur77-결합 반응 엘리먼트 (NBRE)를 코딩하는 리포터 컨스트럭트가 양-의존적으로 활성화 되었다. 또한, Nur77유전자-프로모터를 포함하는 리포터도 6-MP 처리에 의해 활성화 되었다. 상기 두 리포터에 대하여, 가장 높은 처리농도, 100 μM에서 얻은 활성은, Nur77의 공지 활성자인 PMA (phorbol myristate acetate) 및 이오노마이신에 의해 얻은 활성보다 약 2배 정도 높았다 (도 2). 상술한 실험 결과는 6-MP가 Nur77의 트랜스활성 기능뿐만 아니라 Nur77의 전사도 유도함을 나타낸다. 도 1에 나타난 단백질-레벨에서의 유도와 일치되게, 저산소 반응 엘리먼트 (HRE) 또는 VEGF-프로모터를 포함하는 리포터는 6-MP의 존재 하에 활성화 되었고 (도 2), 이 결과는 6-MP가 HIF-1의 전사 활성을 증가시킴을 보여준다.

6-MP는 HIF-1α단백질의 안정화를 증가시킨다.

HIF-1α의 전사 활성은 주로 HIF-1α 단백질의 축적에 의해 조절되기 때문 에, 본 발명자들은 6-MP가 HIF-1α단백질의 안정화를 증가시킬 수 있는 지 여부를 조사하였다. 우선, RT-PCR을 이용하여 mRNA 레벨을 측정함으로써 6-MP가 HIF-1α의 전사를 유도하는 지 여부를 평가하였다. VEGF의 mRNA는 6-MP 처리에 의해 상당히 유도되었지만, HIF-1αmRNA 레벨은 변화가 없었다 (도 3a). Nur77 프로모터를 포함하는 리포터 분석의 결과와 일치되게, Nur77의 mRNA는 크게 유도되었다. 상술한 결과들이 6-MP가 전사의 유도에 의하지 않고 HIF-1α단백질의 안정화를 증가시킨다는 사실을 보여주기 때문에, 본 발명자들은 사이클로헥사마이드 (de novo단백질 합성을 저해함)의 존재 하에서 HIF-1α단백질을 측정하였다. 정상산소 상태 하에서, HIF-1α의 대부분은 5분 내에 파괴되었으나, CoCl₂ 또는 Nur77의 존재 하에서는 60분까지 HIF-1α의 완전성이 유지되었다 (도 3b). 녹색 형광 단백질 (GFP)-융합 HIF-1α를 이용한 면역형광 연구를 통하여 HIF-1α단백질의 발현을 분석할 때, CoCl₂의 부재 하에서는 (GFP)-HIF-1α은 거의 검출되지 않았으나, CoCl₂의 존재 하에서는 단지 핵에 축적되었다 (도 3c). 유사하게, (GFP)-HIF-1α의 레벨은, 6-MP를 처리하였을 때 증가되고 핵 내에 축적되었다. 상기 실험결과는 Nur77이 핵 내에서 HIF-1α의 단백질 레벨을 증가시킨다는 사실을 보여준다.

6-MP에 의한 HIF-1α의 안정화에 대한 분자적 기전

본 발명자들은 6-MP에 의한 HIF-1α의 안정화에 대한 분자적 기전을 연구하였다. HIF-1α과 VHL (von Hippel　Lindau) 사이의 상호작용 (이어, HIF-1α의 유비퀴틴-프로테아좀 파괴가 이어진다)에 Nur77이 영향을 미치는 지 여부를 조사하였다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 프로테아좀 기능을 억제하는 MG132로 세포를 처리하였을 때, HIF-1α과 VHL의 결합은 강하였고, 이는 VHL이 HIF-1α에 결합하는 것은 저산소 상태에서 HIF-1α의 파괴에 선행함을 나타낸다. 그러나, 이러한 결합은 CoCl₂ 또는 6-MP의 존재 하에서 완전히 없어졌다. Myc-VHL의 단백질 레벨은 변화되지 않았는 바, 이 결과는 HIF-1α가 VHL과 적합한 결합을 이루는 것을 6-MP가 상실시킨다는 것을 보여 준다.

HIF-1α의 유비퀴틴화/프로테아좀 파괴는 MDM2에 의해 조절된다. 따라서, 본 발명자들은 HIF-1α가 MDM2에 결합하는 것을 Nur77이 감소시키는 지 여부를 조사하였다. MG132의 존재 하에서 MDM2는 HIF-1α에 강하게 결합하였다. 그러나, 이 결합은 CoCl₂ 또는 6-MP의 존재 하에서 크게 감소하였다. MDM2 단백질 레벨은 상기 시약들의 존재 하에서 감소되었고, 이 결과는 HIF-1α와 MDM2의 물리적 상호작용의 상실이 6-MP의 존재 하에서 MDM2 단백질 레벨의 감소에 기인함을 나타낸다 (도 4). 종합적으로 상술한 결과를 통해서, HIF-1α의 안정성은 6-MP에 의해 증가되며, 이는 VHL과 MDM2가 HIF-1α의 유비퀴틴화 (프로테아좀 파괴를 야기한다)를 유도하지 않기 때문이라는 사실을 알 수 있다.

Nur77이 HIF-1α의 단백질 안정성 및 트랜스활성화를 유도하기 때문에, 6-MP가 HIF-1α의 트랜스활성화 기능을 직접적으로 증가시키는 지 여부를 조사하였다. 이러한 목적으로, Gal4-driven 리포터 시스템을 이용하였다. Gal4-HIF-1α는 CoCl₂ 또는 6-MP의 존재 하에서 Gal4-tk-Luc 활성을 크게 증가시켰다 (도 5a). 상술한 결과와 일치되게, HIF-1α와 공동활성자 CBP (CREB 결합 단백질)의 상호작용은 6-MP의 존재 하에서 증가되었다 (도 5b). 종합적으로, 상술한 결과들을 통하여, 6-MP가 HIF-1α와 CBP의 상호작용을 향상시켜 HIF-1α의 트랜스활성화를 증가시킨다는 것을 알 수 있다.

6-MP는 인간 혈관 내피 세포의 형성을 증가시킨다.

혈관내의 내피는 저산소 상태에 반응하는 가장 민김한 조직이기 때문에, HUVECs 내 HIF-1α의 안정화를 6-MP가 유도할 수 있는 지 여부를 조사하였다. 도 6a에서 볼 수 있듯이, 6-MP는 HIF-1α 및 Nur77의 단백질 양을 증가시킨다. 또한, VEGF의 단백질 양도 6-MP에 의해 크게 증가하였고, 이 결과는 HIF-1α의 안정화가 6-MP의 존재 하에서 혈관의 내피 세포에서 발생한다는 것을 보여 준다. 모세관 형성은 VEGF에 의한 혈관신생의 주 현상이기 때문에, 본 발명자들은 HUVECs가 모세관을 형성하는 능력에 6-MP가 영향을 미치는 지 여부를 조사하였다. matrigel 상에서 배양된 HUVECs는 저산소 상태에서 과도한 네트워크를 형성하였다. 세포를 정상산소 상태에서 10 μM 6-MP로 처리하였을 때, 저산소 상태와 동일할 정도로 튜브 형성이 증가하였다. HUVECs에서의 튜브 형성은 6-MP 처리 후에 양-의존적으로 증가하였다 (도 6b). 상술한 결과들은, 6-MP가 HIF-1α의 전사 활성을 증가시키고, 이는 강한 혈관신생 인자인 VEGF의 발현을 촉진하며, 결국 내피 세포 의 튜브 형성을 초래함을 나타낸다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 유효성분으로서 Nur77 유전자를 활성화시키는 활성자 (activator)를 혈관신생제를 제공한다. 본 발명의 혈관신생제는 Nur77 (또는 NGFI-B, N10, T1S1, TR3 및 NAK-1으로 알려짐) 유전자를 활성화시켜, 종국적으로 혈관신생을 효과적으로 증대시킨다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims

(a) 약제학적 유효량의 6-머르캅토퓨린(6-MP), 6-머르캅토퓨린-리보사이드, 6-머르캅토퓨린-2'-데옥시리보사이드, 6-머르캅토퓨린-모노하이드레이트 및 6-머르캅토퓨린-9-β-D-리보퓨라노사이드로 구성된 군으로부터 선택되는 Nur77 유전자를 활성화시키는 활성자 (activator) 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는,

당뇨병성 궤양; 괴저; 치유를 위해 혈관신생이 요구되는 상처; 뷰르그병; 고혈압; 뇌혈관 허혈, 신장 허혈, 폐 허혈, 지절 허혈 및 허혈성 심근경색을 포함하는 허혈성 질환; 심한 폐색성 혈관 질환; 및 심혈관 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 혈관신생 부전-연관 질환 치료용 약제학적 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 Nur77 유전자의 활성자는 6-머르캅토퓨린 (6-MP)인 것을 특징으로 하는 혈관신생 부전-연관 질환 치료용 약제학적 조성물.