KR100602553B1

KR100602553B1 - 구제역에 대한 합성 펩티드 백신

Info

Publication number: KR100602553B1
Application number: KR1020007014480A
Authority: KR
Inventors: 창 이 웡; 밍 쉔
Original assignee: 유나이티드 바이오메디칼 인크.
Priority date: 1998-06-20
Filing date: 1999-06-21
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2019-06-21
Also published as: BR9912178A; AU754939B2; CA2330178A1; KR20010053042A; CN1354674A; BRPI9912178B1; CN101386641B; CN101386641A; WO1999066954A1; JP2002518461A; CN101469017B; CN101353373A; CN100435846C; AU4826699A; TWI232108B; IL139464A0; AR019152A1; EP1089759A4; EP1089759B1; CA2330178C

Abstract

본 발명은 구제역 바이러스 (FMDV)의 VP1 캡시드 단백질 유래의 표적 항원 부위를 포함하는 면역원으로서의 펩티드 조성물의 용도에 관한 것이다. 항원 부위는 FMDV 감염의 예방 및 구제역 (FMD)의 근절을 위하여 바람직하게는 직접 합성법을 통한 통상의 펩티드 결합에 의해 헬퍼 T 세포 에피토프, 바람직하게는 다른 면역자극 서열에 공유적으로 연결된다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 돼지, 소, 양, 염소 및 감염되기 쉬운 야생 종을 포함하는 동물에서 다양한 균주 또는 혈청형의 FMDV를 시험관 조건에서 효과적으로 중화할 수 있는 고역가의 폴리클로날 항체의 생성을 이끌어내기 위한 면역원으로서의 그러한 펩티드 조성물의 용도, 및 혈청형에 관계없이 FMDV 감염의 발생을 예방하고(거나) 감소하여 FMD의 근절을 수행하기 위한 백신으로서의 그러한 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 조성물에 사용되는 펩티드, 및 1종 이상의 이들 펩티드를 함유하는 면역분석 및(또는) 진단 키트, 및 이러한 물질을 사용하여 포유류에서 FMDV를 진단하는 방법에 관한 것이다.

구제역 바이러스, VP1 캡시드 단백질, 펩티드 조성물, 백신

Description

구제역에 대한 합성 펩티드 백신 {Synthetic Peptide Vaccines for Foot-and-Mouth Disease}

본 발명은 바람직하게는 직접 합성법을 통한 통상적인 펩티드 결합(들)에 의해 헬퍼 T 세포의 에피토프 및 바람직하게는 다른 면역자극 서열에 공유적으로 결합된 구제역 바이러스 (FMDV)의 VP1 캡시드 단백질 유래의 표적 항원 부위를 포함하는, FMDV 감염의 예방 및 구제역 (FMD)의 근절을 위한 면역원으로서의 펩티드 조성물의 용도에 관한 것이다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 돼지, 소, 양, 염소 및 감염되기 쉬운 야생 종을 포함하는 동물에서 다양한 균주 또는 혈청형의 FMDV를 시험관 조건에서 효과적으로 중화할 수 있는 고역가의 폴리클로날 항체의 생성을 이끌어내기 위한 면역원으로서의 그러한 펩티드 조성물의 용도, 및 혈청형에 관계없이 FMDV 감염의 발생을 예방하고(거나) 감소하기 위한 백신으로서의 그러한 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 조성물에 사용되는 펩티드 또는 그의 세그먼트, 및 1종 이상의 이들 펩티드를 함유하는 면역분석 및(또는) 진단 키트에 관한 것이다.

구제역 (FMD)은 경제적으로 가장 중요한 가축 질환이다. 소, 돼지, 양 및 염소와 같은 아틸오닥틸라 (Artiodactyla) 목의 분지제 동물이 감염되기 쉽다. 원인이 되는 작용제인 구제역 바이러스 (FMDV)는 4개의 캡시드 단백질 (VP1-VP4) 및 비구조적인 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 RNA 게놈을 갖는 피코나비리대 (Picornaviridae) 과의 아프토바이러스이다. FMDV 게놈, 캡시드 및 비구조 단백질에 대한 코딩 영역, 및 단백질이 절단되는 프로세싱 경로를 도 1에 개략적으로 나타내었다 (참조. Tesar et al., Virus Genes, 1989; 3:29-44).

FMD는, 감염되고 노출된 동물을 격리하여 제거하고 화학적으로 불활성화된 바이러스 조성물로 백신접종하여 제어된다. FMDV는 항원 다양성이 현저하기 때문에 이들의 백신을 제조하는 것은 매우 어려운 일이다. A, O, C, 아시아, 사우쓰 아프리카 유형의 SAT-1, 2 및 3의 7종의 별개의 혈청형이 보고된 바 있으며, 이들 각각은 여러 하위유형으로 재분류될 수 있다. 혈청형 A, O, 및 아시아의 바이러스가 가장 일반적이다. 혈청형 A 바이러스가 가장 변이적이며, 30종 초과의 하위유형을 갖는다.

혈청형 사이에는 교차보호가 없으므로, 한 혈청형의 바이러스의 감염으로부터 회복되거나, 백신접종된 동물은 여전히 나머지 6개의 혈청형의 바이러스로 감염되기 쉽다. 더욱이, 혈청형 내에서의 항원 변이 정도는 한 하위유형에 대한 백신 효과가 동일한 혈청형 내의 또 다른 하위유형에 대하여 보호적일 수 없을 정도이다. 따라서, 현재의 백신은 국소적 순환으로 바이러스 균주를 모니터함으로서 측정된 각 연관 혈청형 또는 하위유형의 대조 균주를 포함하는 불활성화된 바이러스의 혼합물을 기초로 한다. 발병을 방지하기 위하여는 변이체의 출현을 포함한 야생의 단리체들 사이의 항원 관계 및 백신 제조를 위하여 사용되는 바이러스에 대한 주기적인 감시가 필요하다.

따라서, 현재의 백신 생성을 위해서는 효능의 보증과 함께, 여러 바이러스 균주를 증식시키고, 불활성화시키는 것이 필요하며, 새로운 변이체의 출현에 의한 보호적 효능의 손실을 방지하기 위하여 현재의 야생 균주로 주기적으로 제품을 재제작하여야 한다. 항원 변이의 면에서 면역원성 효능을 유지하기 위한 여러 바이러스 균주를 제조하는 방법은 제작 동안 효능 및 수율 면에서 균주 대 균주 변이성에 따른 과중한 문제를 초래한다.

불활성화된 바이러스 백신의 경우 주기적인 수정에 대한 필요는 백신 제작에 대한 새로운 방해물을 형성한다. 새롭게 생성된 야생 균주에 의한 발병이라는 문제에 부응하도록 백신이 수정되는 경우, 발병 균주는 조직 배양으로 충분히 증식되도록 인공적으로 적응되어야 한다. 조직 배양의 적응을 위한 선별 공정은 보호 면역원성의 감소를 초래하여 생산을 더 지연시킨다 (Barteling and Vreeswijk, Vaccine, 1991; 9:75-88 Brown, Vaccine, 1992; 10:1022-1026).

불활성화된 FMDV 백신의 다른 중요한 단점은 생안전성 및 안정성의 문제와 관련있다. 바이러스는 인접 환경의 오염 방지를 위해서 고-봉쇄 설비에서 제조되어야 한다. 이러한 잠재적인 위험은 적격의 백신 공급자를 소수로 제한하고, 백신 시판의 공급을 제한하며, 이전에는 FMDV가 없었던 지역에서의 발병에 대응하는 노력을 방해한다. 불활성화된 바이러스 제품의 무해성이 절대적으로 보장될 수는 없다. 유럽에서의 최근 질환의 여러 경우는 불완전하게 불활성화된 바이러스로 인한 것이었다. 이러한 위험은 질환이 없었던 지역에서 백신을 사용하지 않게 하여, 기존에 영향받지 않는 지역에 면역 보호가 없게 한다.

제품이 불안정성할 뿐만 아니라 제품마다 변이되는 것은, 불활성화된 바이러스 백신의 조성이 복합적이고 규정되어 있지 않기 때문이다. 이러한 복합 혼합물은 면역효능을 보장하기 위해서는 이를 정기적인 간격으로 조사해야 한다. 몇몇 국가에서는, 이것은 매년 3회로 빈번히 있을 수 있다. 불안정한 제품의 효능을 유지하기 위해서는 냉장실이 필요한데, 몇몇 국가에서는 이를 보장하기가 어려운 경우가 종종 있다.

복합 조성물에서 추가로 중요한 사안은 해로운 효과에 대한 가능성이다. 과민성 쇼크는 드문 일이긴 하지만, 그럼에도 불구하고, 문제를 일으키기에 충분히 자주 발생한다. 이들 단점은 문헌 (Brown, Chapter 11 in Molecular Aspects of Picornavirus Infection and Detection, eds Semler and Ehrenfeld, American Society for Microbiology: Washiton, DC, 1989, pp. 179-191)에 기재되어 있다. 현재의 FMDV 백신의 복합 조성물로부터 유래되는 또다른 단점은 감염되었던 동물과 백신접종된 동물을 혈청학적 실험을 통해 구별하기가 어렵다는 것이다 (Lubroth et al., Vaccine, 1996; 14:419-427). 부위 특이적인 면역원을 기초로 한 백신은 감염에 의하여 유도된 항체와 백신 유도된 항체를 구별하는 면역진단 키트의 고안을 용이하게 하므로, 백신접종 프로그램의 효과를 보장할 수 있다.

기존의 상업적인 백신의 단점으로 이들을 더욱 안전하고, 더욱 잘 한정된 소단위 제품으로 대체하기 위한 연구가 장려되었다. 그러나, 승인되기 위해서는 그러한 제품들은 현재 시판되는 불활성화된 바이러스 백신의 것과 동등한 면역원성일 필요가 있으며, 항원 변이체에 대한 넓은 보호 스펙트럼을 제공할 필요가 있다.

FMDV에 대해 규정된 소단위 백신의 고안을 위한 시도는 바이러스 입자의 파괴 및 도 1에 나타낸 그 구성 단백질의 동정으로 시작되었다. 이것은 무손상 불활성화 바이러스 입자에 비교하여 면역원성 활성의 현저한 손실을 초래하였다 (Brown, 1989). 그러나, 이제 VP1으로 일괄적으로 표시되는 분리된 캡시드 단백질은 비록 그 활성이 하위유형 특이적이고 무손상 불활성화 바이러스의 경우보다 더 낮은 수준이긴 하지만 그 자체가 소 및 돼지에 투여되면 중화 항체 및 면역성을 촉발할 수 있는 능력을 가진다는 것을 발견하였다. 다른 바이러스 단백질은 중화 활성을 촉발하지 못했다 (Laporte et al., C R Acad Sci Paris, 1973; 276:3399-3401 및 Bachrach et al., J. Immunol., 1975; 115: 1636-1641).

VP1의 중화 활성으로 인해 이 단백질에 주의가 집중되었으며, 초기에는 이것이 유전공학적인 소단위 백신에 대한 후보물질로서 심각하게 고려되기도 했다 (Kleid et al., Science, 1981; 214: 1125-1129). 재조합 VP1의 면역원성이 동물 보호에는 불충분하다는 것이 곧 분명해졌다 (Brown, 1989; Brown, 1992). 그럼에도 불구하고, 이 작업으로 VP1에 대한 면역원성 결정자가 밝혀졌으며, 합성 펩티드를 기재로 하는 더욱 강력한 부위 특이적 소단위 백신이 가능해졌다.

브롬화시안 및 단백질 분해법에 의해 생성된 VP1 절단 산물을 실험한 스트로마이어 등 (J Gen Virol, 1982; 59:295-306), 가장 높은 변이성 영역에 해당하는 아미노산 서열의 합성 펩티드를 실험한 비틀 및 레너 (WO83/03547), X-선 결정법에 의해 FMDV의 표면 노출 부위를 동정한 아카르야 등 (Nature, 1989, 337:709-711), 및 VP1에서 두드러진 양쪽성 나선형 형태를 예측하여 중화 항체를 촉발하는 펩티드를 선별한 파프 등 (EMBO J., 1982; 7:869-874)에 의해 VP1의 면역원성 부위가 맵핑되었다. 4가지 접근법 모두가 중화 항체를 촉발하는 결정자를 함유하는 것으로서 VP1의 전체 잔기 137-160의 루프 영역에 집중되었다.

모든 7종의 혈청형에 속하는 FMDV 단리체들에서 유래한, "G-H 루프"로 명명된 VP1의 141-160 영역에 해당하는 혈청형 특이적 펩티드가 기니아 피그에서 보호 수준의 중화 항체를 촉발한다는 것이 밝혀졌다 (Francis et al., Immunology, 1990; 69:171-176). 이들 영역은 바이러스의 혈청형 특이성까지 수반하는 지배적인 면역원성 부위를 함유하는 것이 분명하다. 이들 141-160 VP1 펩티드에 대한 면역원성의 초기 관찰은 운반 단백질 KLH (키홀 렘펫 헤모시아닌)에 접합된 합성 펩티드를 사용하여 달성되었는데, 이는 잘 정의된 합성 면역원의 제조 이점에 역행하는 절차였다. 그러나, 200-213 Pro-Pro-Ser-141-158-Pro-Cys-Gly 키메라 구축물에 연결된, 하위유형 O 단리체에서 유래한 2개의 VP1 서열이 소의 감염을 보호하는 수준의 항체를 촉발한다는 것을 밝혀낸 디마치 및 브룩 (미국특허 제4,732,971호)에 의해 VP1 합성 면역원의 개발이 진전되었다. 그럼에도 불구하고, 이러한 효과의 효능은 펩티드 면역원의 면역원성이 낮아 제한되었다. 동형 피내 (intradermalingual) 투여로부터 보호를 달성하기 위해서는 1 내지 5 mg의 고 투여량이 필요하였으며, 5 mg의 투여량을 투여한 3 마리 동물 중 1 마리는 보호되지 않았다. 실제 사용하기 위해서는, 백신 제형이 이를 소량의 펩티드 면역원으로 동형 및 이형 투여하는 경우 둘다에서 완전한 보호를 제공할 것이 요구된다.

FMDV에 효과적인 펩티드 백신을 위한 중요한 요소는 중화 항체의 촉발을 담당하는 B 세포 에피토프 제시에 최적인 VP1의 G-H 루프 도메인의 정확한 서열을 선별하는 것이다. 펩티드에 의한 도메인의 최적 제시를 위한 프레임은 단일 아미노산 위치처럼 작은 변화에 의해 영향을 받을 수 있다 (Moore, Chapter 2 in Synthetic Peptides A User's Guide, ed Grant, WH Freeman and Company: New York, 1992, pp63-67). 면역지배 G-H 루프 중화 결정자를 포함하는 바람직한 합성 면역원은 잔기 141-160 (WO83/0357; Francis et al, 1990), 141-158 (미국특허 제4,732,971호), 142-158 (Parry et al, WO91/03255), 137-168 (Morgan and Moore, Am J Vet Res, 1990; 51:40-45), 138-156 (Taboga et al, J Virol, 1997; 71:2602-2614), 및 130-160에서 선택된 임의의 인접한 20개 아미노산 서열 (WO 83/03547)을 포함하여 개시되었다. 분명히, G-H 루프 VP1 중화 부위의 제시에 최적인 VP1의 독특한 세그먼트에 대한 합의는 일치되지 못했다.

이외에도, 기존의 펩티드 백신에서의 B 세포 에피토프의 제한된 다양성은 매우 다양한 FMDV에 대한 보호에 필요한 넓은 반응성의 중화 항체를 자극하기에는 불충분하였다. 현재까지, 비교적 제한된 특이성을 갖는 항체만이 도출되었으며, 시간이 지남에 따라 이탈 돌연변이체를 생성하는 점 돌연변이의 발생으로 인해 이러한 제한된 특이성의 가치조차 더욱 제한된다 (Taboga et al, 1997). 다양한 균주 및 이탈 돌연변이체의 출현에 의해 초래되는 일시적 변이 중의 항원 변이를 극복하기에 충분히 넓은 면역원성을 갖는 펩티드 백신을 제공하는 별법의 방법이 필요하다.

FMDV 백신용 합성 펩티드의 면역원성에 영향을 미치는 또다른 중요 요인은 숙주에 적합한 헬퍼 T 세포 에피토프를 면역 시스템에 제시하는 것이다. 짧은 합성 펩티드는 항체 결합 부위 뿐 아니라 헬퍼 T 세포 수용체 및 클래스 II MHC 분자와 반응하는 도메인까지 함유하는 경우에만 백신으로서의 효능을 발휘할 수 있다 (Babbitt et al., Nature, 1985; 317:359-361). 141-160 VP1 펩티드 단독인 경우에는 기니아 피그 및 생쥐에 대해 어느 정도 면역원성이며, 이는 상기 서열에 이들 종에 적합한 T 세포 에피토프가 존재함을 가리킨다. 이러한 실험 동물에서의 결과와는 달리, 소 및 돼지에서의 백신 실험은 상기 VP1 도메인이 T 세포 에피토프에 대한 면역 반응성이 너무 가변적이어서 이들 경제적으로 중요한 이계교배 종의 각 개체를 적합하게 보호할 수 없다는 것을 보여준다 (Rodriguez et al, Virology, 1994; 205:24-33; 및 Taboga et al, J Virol, 1997; 71:2606-2614). 최근에는 FMDV 구조 단백질 영역에 해당하는 다른 합성 펩티드가 동정되었으며, 이는 헬퍼 T 세포 부위로 작용한다. VP1 아미노산 21-40에 해당하는 펩티드가 소에서 VP1 중화 루프 서열에 대하여 T 세포를 보조하는 것으로 밝혀졌다 (Collen et al, J Immunol, 1991; 146:749-755); 그러나, 이러한 T 세포 에피토프의 존재는 소에서 일관된 보호를 제공하기에는 불충분하였다 (Taboga et al., 1997). 여전히 적절한 헬퍼 T 세포 결정자의 선별과 관련된 정보가 없을 뿐만 아니라, 공지된 FMDV 펩티드 백신에서 B- 및 T-세포 에피토프의 최적의 배향도 알려져 있지 않다.

전통적인 백신보다 더 우수한 효능 및 범위를 갖는 FMDV에 대한 합성 펩티드 기재 백신에 대한 필요가 남아 있다. 상기 논의된 선행기술의 펩티드는 이러한 필요를 적절하게 해결하지 못한다.

본 발명의 목적은 이러한 필요에 부응하는 합성 펩티드 FMD 백신을 제공하는 것이다. 이러한 목적을 달성하기 위하여 사용되는 방법은

1. 고 친화도 에피토프의 동정을 위한 효과적인 절차,

2. 결합 화학을 통한 작은 수의 펩티드 합성으로 B 세포 및 T 세포 에피토프의 확장된 목록을 나타내기 위한 수단,

3. B 세포 표적 에피토프를 효과적인 헬퍼 T 세포 (Th) 에피토프와 결합시키고, Th 에피토프를 집단의 변이 면역 반응성에 적합하게함으로써 B 세포 표적 에피토프의 면역원성을 증강시키는 수단, 및

4. 고리형 구속력 (cyclic constraints)을 도입하여 바람직한 형태적 특징을 안정화시키는 것이다.

합성 펩티드는, 새로운 백신 및 진단법의 개발을 위하여 단백질 표면 상의 면역지배 결정자 또는 에피토프를 동정하기 위한 "에피토프 맵핑"에 사용되었다. 에피토프 맵핑은 항체-면역원 결정자의 상호작용에 참여하는 부위를 식별하기 위하여 관심 단백질 상의 영역에 해당하는 일련의 중복 펩티드를 사용한다. 가장 일반적으로, 에피토프 맵핑은 비교적 짧은 길이의 펩티드를 사용하여 선형 결정자를 정확하게 검출한다. "PEPSCAN"으로 알려진 신속한 에피토프 맵핑 방법은 고체 지지체에 결합된, 8 내지 14개 아미노산 길이의 중복 펩티드 수 백개의 동시 합성을 기초로 한다. 결합된 펩티드는 항체에 결합할 수 있는 능력에 대하여 시험된다. 이러한 접근법은 선형 결정자의 국소화에 효과적이나, 백신 개발에 필요한 면역지배 에피토프는 일반적으로 높은 친화도의 불연속의 에피토프이며, PEPSCAN 방법으로는 규정하기가 어렵다 (Meloen et al., Ann Biol Clin, 1991; 49:231-242).

또다른 방법은 15 내지 60개 잔기 범위로 다양한 길이의 일군의 네스트 (nest) 및 중복 펩티드에 의존하는 것이다. 신속하고 동시에 이루어지는 PEPSCAN 합성법과 달리, 이들 긴 펩티드는 수고스러운 일련의 독립적인 고체상 펩티드 합성법에 의하여 합성된다. 그 후 생성된 일군의 네스트 및 중복 펩티드는 단순한 불연속 에피토프를 포함하여 해당하는 최우수 면역지배 결정자로서의 긴 펩티드를 동정하기 위한 항체 결합 연구 및 실험적 면역화에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 HTLV I/II (미국특허 제5,476,765호) 및 HCV (미국특허 제5,106,726호) 유래의 면역지배 부위의 맵핑에 대한 왕의 연구로 예시되며, gp120 서열 상에서 HIV 중화 에피토프를 최적으로 제시하는 정확한 위치를 선별하는데 사용되었다 (Wang et al., Science, 1991; 254:285-288).

위치 또는 집단의 차이 및 과변이 항원의 일시적 변이를 포함하는 넓은 범위의 서열을 포함하고, 개개의 펩티드 면역원의 제한된 능력을 만회하기 위한 조합 펩티드 라이브러리가 고안되었다. 예를 들면, 비변이 잔기의 구조적 틀 (framework) 주변에 다중 위치 치환이 조직화되어 있는 특정 펩티드 항원이 고안될 수 있다. 이러한 조합은 면역지배 부위의 형태를 유지하면서 해당 및 예측되는 항원 변이를 수용한다. HIV 및 HCV의 과변이 면역지배 부위에 해당하는 이러한 조합 펩티드는, 문헌 (Gras-Masse et al. Peptide Research, 1992; 5:211-216)에서는 "믹소토프 (Mixotope)"로 기재되었고 문헌 (Wang et al., WO 95/11998)에서는 "구조 합성 항원 라이브러리" 또는 "SSAL (Structured Synthetic Antigen Library)"로 기재되었다.

"구조 합성 항원 라이브러리" 또는 "SSAL"은 그 부위의 항원성, 진단 가치 또는 치료적 생활성을 유지할 수 있는 더 큰 비변이 구조적 틀 내에 포함된 관련 펩티드 서열의 정열된 군으로 이루어진다.

수학식 1은 대표적인 SSAL 아미노산 서열을 제공한다.

<수학식 1>
AA_1j AA_2j ... AA_ij ... AA_xj

서열 AA_1j 내지 AA_xj는 SSAL에서의 펩티드의 N-말단에서 C-말단까지의 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 라이브러리에서의 각 펩티드는 길이 x를 가지며, x는 각 라이브러리에서 일정하다. 각 아미노산 위치 i에서 j는 1 내지 n으로, 여기서 n은 i번째 위치에서 알려진 (또는 소망되는) 상이한 아미노산의 수를 나타낸다. 갭 또는 삽입의 정교한 도입 또는 자연적인 발생 (예를 들면 표 1에서의 VP1 서열 배열에서의 것)은 상이한 x 값을 갖는 별도의 SSAL 합성에 의해 수용된다.

수학식 2는 SSAL 서열의 소정의 변이 위치 i에서 아미노산의 상대 비율의 합의 수학식이다.

수학식 2는 각 위치 i에서 n개의 각 아미노산의 몰분율의 합은 동일하다는 것을 설명한다. 위치 i에서 j번째 아미노산 [AA_ij]의 몰분율은 (1) 자연계에 존재하는 FMDV 혈청형의 하위유형 군 중에서 AA_ij의 지배성 및 임의로는 (2) 이탈 돌연변이체를 예측하기 위한 유사 아미노산을 포함시키고자 하는지의 여부에 따라 선택한다. 아미노산 AA_ij은 일반적으로 자연 발생 아미노산에서 선택되나, 오르니틴 및 노르루이신과 같은 변형 아미노산 및 D-아미노산과 같은 비자연 아미노산이 포함될 수 있다. 이들 식에 따라, 길이 x를 갖는 SSAL의 모든 변형 서열이 단일 합성으로 동시에 제조될 수 있다.

SSAL의 서열은, 관련 항원 군의 기본 아미노산 서열을 배열하고, 배열체 내에서 비변이 및 변이 좌위를 동정함으로써 결정된다. 비변이 좌위는 일반적으로 SSAL의 구조 틀을 나타낸다. SSAL내에서의 동의성은 배열체 내에서 임의의 원형 서열에 대하여 상이한 아미노산 잔기를 함유하는 좌위에 의하여 결정된다. 각 비변이 위치에 존재하는 아미노산을 결정한 후에, SSAL 라이브러리에서 각각의 다른 아미노산을 제공하는 변이체의 수로부터 해당 변이 위치에서의 동의성 정도를 결정한다. 그 후, SSAL은 비변이 위치에서는 단일 아미노산을 사용하고 변이 위치에서는 필요한 동의성 아미노산을 사용하여 합성한다.

변이 위치에서의 아미노산 잔기의 상대 비율은 서로 동일하도록 고정되거나, 또는 동일하지 않는 비율을 나타낼 수 있다. 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 변이 위치에서의 아미노산 비율은 자연 서열에서 발견되는 각 아미노산의 상대적인 지배성을 반영하도록 정한다. 표 2 및 3에서 예시된 SSAL 라이브러리는 그러한 바람직한 구현예 (여기서, 아래첨자는 SSAL에서의 각 변이 위치에서 각 잔기의 상대 양을 나타냄)를 나타낸다. SSAL에 존재하는 펩티드의 큰 비율은 자연 상에서 관찰되지 않는 변이 아미노산의 조합을 나타낼 수 있다는 것을 주목해야 한다. SSAL의 이러한 특징은 새롭게 출현하는 FMDV 균주에 의한 FMDV 감염에 대하여 본 발명의 펩티드 조성물에 의하여 부여되는 보호 정도를 증가시킨다.

따라서, 단순한 방식으로, SSAL 내에서의 특정 아미노산 및 선택적으로 각 위치에서 그의 출현 빈도는 배열에 사용되는 상이한 항원의 기본 서열에 의해 제한된다. 이탈 돌연변이를 예상하여, 배열된 에피토프 내의 변이 좌위에서 자연상에 존재하는 것으로 알려지지 않은 아미노산이 선택적으로 라이브러리에 도입될 수 있다. 예를 들면, 특정 유형의 아미노산의 여러 또는 모든 잔기 (예를 들면, 소수성, 대전된, 중성 또는 극성)가 임의의 변이 좌위에 도입될 수 있다. 특정 좌위에 도입된 아미노산 유형은 항원 배열 내의 변이 좌위에서 발견되는 지배적인 유형의 아미노산에 의해 결정될 수 있다 (WO95/11998).

"혼합 (promiscuous) Th"라고 불리우는 에피토프는 효율적인 T 세포 보조를 일으키고, 그들 스스로는 면역원성이 불량하여 B 세포 에피토프와 혼합될 때 강력한 펩티드 면역원을 생성할 수 있다. 잘 고안된 혼합 Th/B 세포 에피토프 키메라 펩티드는 Th 반응을 촉발할 수 있고, 생성된 항체는 다양한 MHC 일배체를 발현하는 유전학적으로 다양한 집단 내의 대부분의 구성원과 반응한다. 혼합 Th는 홍역 바이러스 F 단백질, 간염 B 바이러스 표면 항원, 및 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis) 주 외막 단백질을 포함하는 바이러스 및 세균 기원의 강력한 면역원으로부터 유래된 특정 서열에 의해 제공될 수 있다. 많은 공지된 혼합 Th는 데카펩티드 호르몬 LHRH에 해당하는 불량한 면역원성 펩티드를 유효하게 하는데 효과적인 것으로 나타났다 (미국특허 제5,759,551호).

효과적인 Th 에피토프는 길이 LHRH의 약 15 내지 약 50 아미노산 잔기 크기이며 (미국특허 제5,759,551호), 때때로 공통의 구조적 특징을 공유하고 많은 특정 표지 서열을 가질 수 있다. 예를 들면, 공통의 특징은 양쪽성 나선으로, 나선의 한면에 소수성 아미노산 잔기가 지배적이고, 주위 면에 대전되고 극성인 잔기가 지배적인 알파-나선 구조이다 (Cease et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1987; 84:4249-4253). Th 에피토프는 종종 Gly 또는 대전된 잔기와 2 내지 3개의 소수성 잔기가 뒤따르고, 이어 대전된 또는 극성 잔기가 뒤따르는 추가의 기본 아미노산 패턴을 갖는다. 이러한 패턴은 이른바 로트바드 서열 (Rothbard sequence)로 정의된다. 또한, Th 에피토프는 양대전된 잔기에 이어 대전된 잔기 4번째, 5번째 및 8번째 위치에 소수성 잔기가 있는 1, 4, 5, 8 규칙을 준수한다. 이들 구조 모두는 공통의 소수성의 대전된 및 극성 아미노산으로 이루어지기 때문에 각 구조는 단일 Th 에피토프내에 동시에 존재할 수 있다 (Partidos et al., J Gen Virol, 1991; 72:1293-1299). 전부는 아니더라도 혼합 T 세포 에피토프의 대부분은 상기 설명된 주기성 중 적어도 하나를 따른다. 이들 특징은 다양한 MHC 분자의 인식과 관련된 위치에서 동의성을 제공하며 비변이 위치를 유지할 수 있는 SSAL Th 에피토프를 포함하여 이상적인 인공 Th 부위의 고안에 적용될 수 있다. MHC 결합 모티프를 위한 변이 위치 및 바람직한 아미노산의 목록이 이용가능하다 (Meister et al., Vaccine 1995; 13:581-591). 예를 들면, WO95/11998에서 "SSAL1TH1"으로 설명된 동의성의 Th 에피토프는 홍역 바이러스의 F 단백질로부터 취한 혼합 에피토프 후에 모델링되 었다 (Partidos et al., 1991). SSAL1TH1 (WO95/11998)은 LHRH 표적 펩티드와 함께 사용하기 위하여 고안되었다. 홍역 에피토프와 유사하게, SSAL1TH1은 로트바드 서열 및 1, 4, 5, 8 규칙을 따른다.

(참조, 예를 들면 SSAL1TH1에서의 6, 9, 10 및 13 위치)

Th의 소수성 면 주변의 대전량을 증가시키기 위해서는 대전된 잔기 Glu 또는 Asp를 위치 1에 부가한다. 이때, 양쪽성 나선의 소수성 면은 2, 5, 8, 9, 10, 13 및 16의 소수성 잔기에 의해 유지되며, 2, 5, 8, 9, 10, 13 및 16에서의 변이는 넓은 범위의 MHC 제한 요소에 대한 결합능을 갖는 외관 (facade)을 제공한다. SSAL 특징의 순 효과는 인공 Th에 대한 면역 반응 범위를 확장시키는 것이다 (WO95/11998). 이러한 SSAL내에서의 모든 변이체는 표적 B 세포 에피토프 및 다른 서열을 함께 사용하여 단일의 고체상 펩티드 합성법으로 동시에 제조된다.

펩티드 면역원은 일반적으로 단백질보다 더 가요성이며, 임의의 선호되는 구조를 유지하려는 경향이 없다. 따라서, 고리형 구속력을 도입하여 펩티드 면역원을 안정화하는 것이 유용할 수 있다. 올바르게 고리화된 펩티드 면역원은 표적 에피토프를 모방하고 그의 형태를 보존할 수 있어서, 항체가 실제 분자상에서의 그 부위에 반응성을 갖도록 한다 (Moore, Chapter 2 in Synthetic Peptides A User's Guide, ed Grant, WH Freeman and Company: New York, 1992, pp63-67). 이것은 FMDV 면역지배 VP1 루프 도메인을 대표하는 펩티드에서 아미노 및 카르복시 말단 모두에 시스테인 잔기를 부가하고 2개의 시스테인 잔기의 산화를 통해 고리화함으로써 달성되었다 (WO 83/03547). 그러나, VP1 루프 도메인에 대한 더욱 효과적인 펩티드 유사체는 여전히 요구된다.

본 발명에 의해 면역원적으로 더욱 효과적인 형태를 갖는 펩티드가 제공된다. 이것은 자연적인 에피토프의 더욱 정확한 모방을 초래하는 시스테인 잔기의 위치를 발견함으로써 수득되었다 (Valero et al. Biomedical Peptides, Proteins and Nucleic Acids, 1995; 1:133-140).

<발명의 요약>

본 발명은 상기 논의한 펩티드 기술 및 펩티드 고안 요소, 즉 정확한 에피토프 맵핑, SSAL 라이브러리 펩티드, 강력한 Th 에피토프의 고안 및 고리형 구속력을 갖도록 고안된 펩티드 면역원을 제공한다. 이들 펩티드 면역원은 효과적인 합성 FMDV 백신을 위한 기초가 된다. 이러한 펩티드는 최적화된 위치와 형태적 구속력을 가지면서 VP1 중화 부위를 제시하고, FMDV 혈청형 변이에 의해 요구되는 넓은 범위의 서열을 제시하며, Th 반응에 광범위하게 반응성이라는 점에서 바람직하다.

또한, 본 발명은 구제역 바이러스 (FMDV)의 VP1 캡시드 단백질 유래의 표적 항원 부위를 포함하는, FMDV 감염의 예방 및 FMD 근절을 위한 면역원으로서의 펩티드 조성물의 용도를 제공하며, 이때 상기 항원 부위는 바람직하게는 직접 합성법을 통한 통상적인 펩티드 결합(들)에 의해 헬퍼 T 세포 에피토프 및 임의로는 다른 면역자극 서열에 공유 결합되는 것이 바람직하다.

더욱 특별하게는, 본 발명은 돼지, 소, 양, 염소, 및 FMDV 감수성 야생종을 포함하는 동물에서 시험관 조건에서 다양한 FMDV 균주 또는 혈청형을 효과적으로 중화시킬 수 있는 고역가의 폴리클로날 항체의 생성을 이끌어내기 위한 면역원으로서의 펩티드 조성물의 용도, 및 항원 다양성과 상관없이 FMDV 감염의 출현을 효과적으로 예방하고(거나) 감소시켜 FMD를 근절시키기 위한 백신으로서의 그러한 조성물의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 조성물에 사용되는 펩티드, 및 하나 이상의 이들 펩티드 또는 그의 세그먼트를 포함하는 면역분석 및(또는) 진단 키트에 관한 것이다.

본 발명의 표적 항원 부위는 FMDV A₁₂ 균주의 VP1 단백질 유래의 아미노산 서열 정보를 기초로 한 에피토프 맵핑을 통하여 선별되었으며, FMDV VP1 단백질의 아미노산 134 내지 168에 위치한 중화 결정자를 최적으로 제시하는 틀을 대표한다. 이들 잔기는 배열하기 위한 목적으로 도입된 위치 142의 갭의 존재에 의해 표 1에서 아미노산 "134-169"로 나타난다 (서열 1). 본 명세서에서는 편의상 이들을 아미노산 134-169로 언급할 것이지만, 논의하는 실제 단편은 잔기 134-168 (서열 1)임이 이해될 것이다.

본 발명의 표적 항원 부위는 바람직하게는 G-H 루프 부위의 자연적으로 발생하는 FMDV VP1 서열로부터 두 개의 자연 아미노산이 시스테인으로 치환되고, 이들 시스테인 사이에 약 20 내지 약 25 잔기를 갖는 고리 구조 (예를 들면, 서열 2)가 형성되도록 시스테인 사이에 디술피드 결합이 형성됨으로써 변형된다. 다른 혈청형의 VP1에 대한 해당 표적 부위는 관련된 혈청형의 상동의 G-H 루프 부위 세그먼 트로부터 유래될 수 있다.

또한, 본 발명은 서열 1의 최적화된 프레임에 따른 컨센서스 서열을 가지며 비변이 구조 틀 내에 고 변이 위치가 함유된 FMDV VP1 표적 항원 부위를 제공하며, 이때 각각의 고 변이 위치에 가장 빈번히 사용되는 아미노산은 특정 FMDV 혈청형과 관련된 일군의 FMDV 하위유형으로부터의 VP1 서열을 분석하여 결정된 것으로 대표된다.

또한, 본 발명은 서열 1의 최적화된 표적 항원 펩티드 프레임에 따른 구조 합성 항원 라이브러리 (또는 SSAL)를 제공하며, 이때 각 SSAL은 비변이 구조 틀에 표적 항원 펩티드의 항원성을 유지할 수 있는 서열이 부여된, 단일 펩티드 합성으로 동시 제조된 관련 펩티드의 정렬된 군으로 이루어진다.

이외에도, 본 발명의 펩티드 및 그의 유사체의 표적 부위는 예르시니아 (Yersinia)로부터 취한 면역자극 인바신 (invasin) 펩티드 (Inv) (서열 22), 외래 병원균 유래의 혼합 Th 에피토프, FMDV 단백질 유래의 자가 Th 에피토프 (예를 들면, 서열 24, 표 5), 인공 Th 에피토프 (예를 들면, 서열 25 및 26, 표 6), 및 직접 합성법을 통한 기타를 포함하는 합성 면역자극 요소에 공유 결합을 통하여 일렬로 조합되어 면역원성이 부여된다. 본 발명의 펩티드는 하기 식으로 나타낼 수 있다.

(A)_n-(FMDV 항원)-(B)_o-(Th)_m-X, 또는

(A)_n-(Th)_m-(B)_o-(FMDV 항원)-X, 또는

(FMDV 항원)-(B)_o-(Th)_m-(A)_n-X, 또는

(Th)_m-(B)_o-(FMDV 항원)-(A)_n-X

여기서, 각 A는 독립적으로 아미노산 또는 일반적인 면역자극 서열이고,

각 B는 독립적으로 아미노산 또는 하기에서 추가로 정의되는 화학적 링커이고,

각 Th는 독립적으로 헬퍼 T 세포 에피토프, 또는 그의 면역 증강 유사체 또는 세그먼트를 구성하는 아미노산 서열이며,

"FMDV 항원"은 하기에서 추가로 정의되는 합성 펩티드 항원이며,

X는 아미노산 α-COOH 또는 α-CONH₂이고,

n은 0 내지 약 10 이며,

m은 1 내지 약 4이고,

o는 0 내지 약 10이다.

또한, 보강제 및(또는) 전달 비히클 및 백신 제조에 일반적으로 혼입되는 기타 성분과, FMDV VP1 표적 항원부위에 대한 폴리클로날 항체가 생성되는 투여량에 대한 처방이 제공된다.

본 발명은 돼지, 소, 양, 염소 및 FMDV 감수성 야생종을 포함하는 동물에서 고역가의 폴리클로날 항체 생성을 유도하는 면역원으로서의 펩티드 조성물의 용도에 관한 것이다. 항체에 의하여 매개되고, 본 발명의 펩티드 조성물에 의하여 유도되는 FMDV 보호 기작은 혈청형 또는 하위유형에 상관없이 다양한 균주의 FMDV를 시험관 조건에서 효과적으로 중화하고, 이에 따라 FMDV 감염으로부터의 보호적 면역성을 초래하고, FMD를 근절시킨다.

도 1은 FMDV 게놈의 기구, 번역 산물이 바이러스 단백질로 절단되는 프로세싱 경로, 및 캡시드 및 비구조 단백질의 명명을 나타내는 도.

도 2a는 구조 합성 항원 라이브러리 "A SSAL(1) (COMPLETE) (134-169)"의 아미노산 조성을 나타내는 도. 아래첨자는 해당 위치에서의 각 아미노산의 상대 양을 나타낸다.

도 2b는 구조 합성 항원 라이브러리 "A SSAL(1) (COMPLETE) [134(N→C)-158(Q→C)-169]"의 아미노산 조성을 나타내는 도.

도 3a는 구조 합성 항원 라이브러리 "A SSAL(2) (COMPLETE) (134-169)"의 아미노산 조성을 나타내는 도.

도 3b는 구조 합성 항원 라이브러리 "A SSAL(2) (COMPLETE) [134(N→C)-158(Q→C)-169]"의 아미노산 조성을 나타내는 도.

도 4a는 구조 합성 항원 라이브러리 "O SSAL (COMPLETE) (134-169)"의 아미노산 조성을 나타내는 도.

도 4b는 구조 합성 항원 라이브러리 "O SSAL (COMPLETE) [134-158(T→C)-169]"의 아미노산 조성을 나타내는 도.

본 발명은 구제역 바이러스 (FMDV)의 VP1 캡시드 단백질에서 유래한 1종 또는 바람직하게는 2종 이상의 표적 항원 펩티드를 포함하는, 면역원으로서의 펩티드 조성물의 용도에 관한 것이며, 이때 상기 항원성 펩티드는 바람직하게는 헬퍼 T 세포 에피토프 및 임의로는 다른 면역자극 서열에 공유 결합된다. 공유 결합은 바람직하게는 직접 합성법을 통해 생성된 펩티드 결합(들)이다.

펩티드 조성물은 동물에서의 FMDV 감염의 예방에 유용하며, FMD 근절을 조장할 것으로 기대된다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 돼지, 소, 양, 염소, 및 감수성 야생종을 포함하는 동물에서 시험관 조건에서 다양한 FMDV 균주 또는 혈청형을 효과적으로 중화시킬 수 있는 고역가의 폴리클로날 항체의 생성을 이끌어내는 면역원으로서의 펩티드 조성물의 용도, 및 혈청형에 관계없이 FMDV 감염을 예방하여 FMD 근절을 달성하기 위한 백신으로서의 그러한 조성물의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 조성물에 사용되는 펩티드, 및 하나 이상의 이들 펩티드 또는 그의 세그먼트를 포함하는 면역분석 및(또는) 진단 키트에 관한 것이다. 하나 이상의 이들 펩티드 또는 그의 세그먼트를 포함하는 면역분석 및(또는) 진단 키트는 백신 유도된 항체 및 감염에 의하여 유도된 항체를 식별하는 데 유용하며, 따라서 FMDV 감염의 존재를 선별하고(거나) 백신접종 프로그램의 효과를 모니터하는데 사용될 수 있다.

본 발명은

(a) 제1항에 따른 펩티드를 고체 지지체에 부착하는 단계,

(b) 상기 고체 지지체에 부착된 펩티드를 펩티드에 대한 항체의 결합을 수행하는 조건 하에서 포유류의 항체를 함유하는 시료에 노출하는 단계, 및

(c) 상기 고체 지지체에 부착된 펩티드에 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 포유류에서의 FMDV 감염의 진단 방법을 제공한다.

인터넷 주소가 http://www.pdb.bnl.gov/pdb.bin/pdbids인 부룩하벤 내셔널 레이보레이토리 (Brookhaven National Laboratory)에서 입수가능하고 아카랴 등의 문헌 (Nature 337: 709-711, 1989)에 보고된 FMDV VP1의 3차원 구조로부터 추론된 G-H 루프의 잔기에 대한 가능한 루프 형태 및 표면 노출에 대한 고려를 기초로 하여 FMDV VP1의 주요한 중화 결정자 (G-H 루프)를 포함하는 표적 항원 서열을 최적화하였다. 펩티드 구조물의 고안시에 고리화시킬 후보 위치를 도입하고, 연속 합성으로 다른 면역자극 요소와 함께 또는 다른 면역자극 요소없이 혼합 Th 에피토프에 공유 부착시킴으로써 면역원으로서의 변형 및 비변형 서열을 합성하였다. 변형 펩티드 구축물은 가변적인 (mobile) 펩티드가 잠재적으로 더욱 생물학적으로 관련된 형태로 안정되하도록 특정 디술피드 결합을 도입한 고리형 펩티드로 합성하였다. 관련 면역원성의 VP1 항원 부위를 포함하는 합성 구축물은, 고도면역 혈청을 준비하고 상기 혈청을 FMDV 중화 분석에서의 효능에 대해 실험함으로써 동정하였다. 구체적으로, 본 발명의 표적 항원 부위는 FMDV 균주 A₁₂의 VP1 단백질의 아미노산 서열을 기초로 하는 에피토프 맵핑을 통해 선별하였다 (실시예 2).

표 1에서 표적 항원 펩티드에 대한 프레임인 서열 1로 나타낸 AA134-169가 FMDV VP1상의 G-H 루프 중화 결정자의 면역원 제시에 최적인 것으로 밝혀졌다. 항원 펩티드의 표적 항원 부위는, 134 위치에서의 천연 아스파라긴 및 157 위치에서의 글루타민을 시스테인으로 치환하고 치환된 시스테인 사이에 디술피드 결합을 형성시켜 고리형 구조 (서열 2)를 형성시킴으로써 자연 발생 FMDV VP1 서열로부터 변형될 수 있다. 단일 디술피드 루프 구조가 표 1에 서열 3으로 나타낸 바와 같이 보존되는 한, 상기 고리형 구조는 또한 VP1의 134-157 세그먼트의 임의의 말단으로부터 취한 1 내지 13개의 추가 아미노산을 포함한다. 본 발명의 표적 항원 펩티드의 예로서 하기 서열을 갖는 FMDV VP1에 대한 표적 부위가 제공된다 (시스테인 치환체는 굵은 문자로 표시됨).

<서열 2>

유사하게, 다른 혈청형의 VP1에 대한 해당 표적 부위는 관련된 혈청형의 상동 세그먼트로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 치환 펩티드 유사체는 하기 서열 5 및 서열 7의 각각의 서열을 갖는 표 1에 나타낸 서열 배열을 통하여 FMDV 혈청형 O 및 아시아의 해당 서열에 따라 제조될 수 있다.

<서열 5>

<서열 7>

또한, 본 발명은 서열 1 (AA134-169)의 최적화된 프레임에 따른 컨센서스 서열을 가지며 비변이 구조 틀 내에 고 변이 위치가 함유된 고리형 및 선형 FMDV VP1 표적 항원 펩티드를 제공하며, 이때 각각의 고 변이 위치에 대하여 가장 빈번히 사용되는 아미노산은 특정 FMDV 혈청형과 관련된 일군의 바이러스의 VP1 서열을 분석하여 결정된 것으로 대표된다. 이러한 본 발명의 컨센서스 서열의 예로서 표 1에 나타낸, 혈청형 A (서열 8, 9), 혈청형 O (서열 10, 11) 및 혈청형 아시아 (서열 12, 13)의 FMDV 변이체 유래의 6종의 컨센서스 서열이 제공된다.

또한, 본 발명은 또한 서열 1의 최적화된 표적 항원 펩티드에 따른 고리형 또는 선형의 구조 합성 항원 라이브러리 (또는 SSAL)를 제공하며, 이때 각 SSAL은 비변이 구조 틀에 표적 항원 펩티드의 항원성을 유지할 수 있는 서열이 부여된, 단일 펩티드 합성으로 동시 제조된 관련 펩티드의 정렬된 군으로 이루어진다. 본 발명의 이러한 SSAL의 예로서, 표 2, 3, 4 및 10 각각의 혈청형 A (서열 14-17), 혈청형 O (서열 18, 19) 및 혈청형 아시아 (서열 20, 21, 35)로부터 수집된 FMDV 하위유형 군 유래의 복합 서열을 갖는 9개의 SSAL이 제공된다.

표적 VP1 부위는 짧은 펩티드 서열이다. 본 발명의 펩티드로 이들을 합성할 때, 이 펩티드들은 일반적으로 약한 면역원이다. 이들 짧은 펩티드는 제한되지 않는 예로서 간염 B 표면 및 코어 항원 헬퍼 T 세포 에피토프 (HBsTh 및 HBcTh), 백일해 독소 헬퍼 T 세포 에피토프 (PT Th), 파상풍 독소 헬퍼 T 세포 에피토프 (TT Th), 홍역 바이러스 F 단백질 헬퍼 T 세포 에피토프 (MVF Th), 클라미디아 트라코마티스 주 외막 단백질 헬퍼 T 세포 에피토프 (CT Th), 디프테리아 독소 헬퍼 T 세 포 에피토프 (DT Th), 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum) 서큠스포로조이트 헬퍼 T 세포 에피토프 (PF Th), 쉬스토소마 만소니 (Schistosoma mansoni) 트리오스 포스페이트 이소머라제 헬퍼 T 세포 에피토프 (SM Th), 에스케리키아 콜리 TraT 헬퍼 T 세포 에피토프 (TraT Th)를 포함하는 외부 병원균 유래의 혼합 Th 에피토프에 화학적으로 연결되어 면역강화될 수 있다. 혼합 Th의 대표적인 예로서 본원에서 선택된 병원균 유래의 Th는 미국특허 제5,759,551호에 서열 2 내지 9, 및 42 내지 52로서; 클라미디아 보조 부위 P11은 스택 등의 문헌 (Immunology, 1993; 79:1-9); 및 HBc 펩티드 50-69는 페라리 등의 문헌 (J Clin Invest, 1991; 88:214-222)에 열거되어 있으며, 본원에 참고로 도입된다. 혼합 Th는 또한 본원에 참고로 도입되는 FMDV 단백질 유래의 자가 Th 에피토프 (표 5, 예를 들면 서열 24), 또는 표 6의 예를 들면 서열 25, 26, 36, 37 및 38에 나타낸 고안된 인공 Th 에피토프를 포함한다.

본 발명의 면역원은 모두가 FMDV의 주요 중화 결정자의 정확한 표적화를 제공하는 부위 특이적 면역 반응성이다. 구체적인 예는 본 발명의 펩티드의 구현예, 예를 들면 서열 2, 11로서 제공된다. 추가의 예는 유전학적으로 다양한 숙주 집단에서 FMDV VP1 단백질 상의 표적화된 부위에 대하여 광범위한 반응성의 강력한 중화 항체가 생성되도록 FMDV VP1 항원 부위 (예를 들면 표 7 내지 10의 서열 27-34)에 대한 합성 면역자극 요소를 결합시킨 본 발명의 바람직한 펩티드로서 제공된다. 이들 항-VP1 항체는 FMDV를 효과적으로 중화시켜 FMDV 감염으로부터 보호한다.

활성 면역화에서, 본원에서 언급된 용어 "면역원"은 FMDV의 VP1 단백질 상에 존재하는 G-H 루프에 대한 항체를 유도하여 다중 혈청형의 FMDV의 효과적인 중화를 초래함으로써 FMDV 감염을 예방할 수 있는 펩티드 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드 조성물은 바람직하게는 혼합 헬퍼 T 세포 에피토프 (Th 에피토프) 및 선택적으로 다른 면역자극 요소를 함유하는 합성 펩티드를 포함한다. Th 펩티드는 효과적인 항체 반응을 일으키기 위하여 표적 항원 부위의 N- 또는 C- 말단과 인접하도록 스페이서 (예를 들면 Gly-Gly)를 두고 FMDV VP1 표적 항원 부위 (예를 들면 서열 1-21, 35)에 공유적으로 부착된다. 면역원은 또한 예를 들면 세균 예르시니아 (Yersinia) 종 유래의 인바신 단백질 (Brett et al., Eur J Immunol, 1993, 23:1608-1614) (서열 22)의 영역에 해당하는 일반적인 면역자극 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 일반적인 면역자극 영역은 펩티드를 통한 부착을 위한 스페이서를 포함할 수 있다.

본 발명의 펩티드는 하기 식으로 나타낼 수 있다.

(A)_n-(FMDV 항원)-(B)_o-(Th)_m-X, 또는

(A)_n-(Th)_m-(B)_o-(FMDV 항원)-X, 또는

(FMDV 항원)-(B)_o-(Th)_m-(A)_n-X, 또는

(Th)_m-(B)_o-(FMDV 항원)-(A)_n-X

각 B는 독립적으로 아미노산, -NHCH(X)CH₂SCH₂CO-, -NHCH(X)CH₂SCH₂CO(ε-N)Lys-, -NHCH(X)CH₂S-숙신이미딜(ε-N)Lys- 및 -NHCH(X)CH₂S-(숙신이미딜)로 이루어지는 군에서 선택되고,

X는 아미노산 α-COOH 또는 α-CONH₂이고,

n은 0 내지 약 10 이며,

m은 1 내지 약 4이고,

o는 0 내지 약 10이다.

본 발명의 펩티드 면역원은 약 35 내지 약 100 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 45 내지 약 90 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 약 75 아미노산 잔기를 포함한다.

A가 아미노산인 경우, 임의의 비자연적으로 발생하는, 또는 임의의 자연적으로 발생하는 아미노산일 수 있다. 비자연적으로 발생하는 아미노산에는 β-알라닌, 오르니틴, 노르루이신, 노르발린, 히드록시프롤린, 티록신, γ-아미노 부티르산, 호모세린, 시트룰린 등이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 자연적으로 발생하는 아미노산에는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루이신, 루이신, 리신, 메티오닌, 페닐 알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린이 포함된다. 더욱이, m이 1보다 크고, A 기 중 둘 이상이 아미노산이면, 각 아미노산은 독립적으로 동일하거나 상이할 수 있다.

A가 인바신 도메인일 경우, 이는 예르시니아 종의 인바신 단백질 유래의 면역자극 에피토프이다. 이들 면역자극 특성은 T 세포, 특히 활성화된 면역 또는 기억 T 세포 상에 존재하는 β1 인테그린 분자와 상호작용할 수 있는 인바신 도메인의 능력으로 인한 것이다. β1 인테그린과 상호작용하는 것으로 밝혀진 인바신 도메인의 특정 서열은 브레트 등의 문헌 (Eur J Immunol, 1993)에 기재되어 있다. 혼합 Th 에피토프에 연결시키기 인바신 도메인 (Inv)의 바람직한 구현예는 본원에 참고로 도입되는 앞서의 미국특허 제5,759,551호에 기재되어 있다. 바람직한 Inv 도메인은 서열 Thr-Ala-Lys-Ser-Lys-Lys-Phe-Pro-Ser-Tyr-Thr-Ala-Thr-Tyr-Gln-Phe (서열 22)를 갖거나, 또는 또다른 예르시니아 종에서의 해당 부위 유래의 그의 면역자극 상동체이다. 따라서, 이러한 상동체는 그가 면역자극 특성을 보유하는 한, 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 삽입을 함유하여 균주마다의 변이를 수용할 수 있다. (A)_n은 바람직하게는 이를 통하여 Inv 도메인이 펩티드에 연결되는 스페이서, 예를 들면 Gly-Gly를 포함한다. 한 바람직한 구현예에서, (A)₃은 인바신 도메인 (Inv), 글리신 및 글리신의 순서인, 즉 (Inv)-Gly-Gly이다.

B는 스페이서이며, 앞서 설명된 자연 발생 또는 비자연 발생 아미노산일 수 있는 아미노산이다. 각 B는 독립적으로 동일하거나 상이하다. B의 아미노산은 또한 혼합 Th 에피토프 및 FMDV VP1 항원 부위 (예를 들면, 서열 1-21 및 35) 또는 반응성이고 면역학적으로 기능성인 그의 유사체 사이에 스페이서, 예를 들면 Gly-Gly를 제공할 수 있다. Gly-Gly 스페이서는 B 세포 에피토프로부터 Th 에피토프를 물리적으로 분리할 뿐 아니라 Th 에피토프와 FMDV VP1 항원의 연결에 의하여 생성된 임의의 인공적인 2차 구조를 파괴하여 Th 및(또는) B 세포 사이의 반응에 대한 저해를 제거할 수 있다. B의 아미노산은 또한 Th 및 FMDV VP1 표적 항원 부위의 분리를 강화하는 가요성 힌지 (hinge)로서 작용하는 스페이서를 형성할 수 있다. 가요성 힌지를 코딩하는 서열의 예는 면역글로블린 중사슬 힌지 부위에서 발견된다. 가요성 힌지 서열은 종종 프롤린이 풍부하다. 하나의 특별히 유용한 가요성 힌지는 서열 Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (서열 23)으로 제공되며, 여기서 Xaa는 임의의 아미노산, 바람직하게는 아스파르트산이다. B의 아미노산에 의하여 제공되는 형태적 분리는 제시된 펩티드 면역원 및 적절한 Th 세포 및 B 세포 사이의 더욱 효과적인 상호작용을 허용하여 Th 에피토프 및 항체-유발 에피토프에 대한 면역 반응을 강화한다.

Th는 Th 에피토프를 포함하는 아미노산 (자연 또는 비자연 아미노산)의 서열이다. Th 에피토프는 연속의 또는 불연속의 에피토프로 이루어질 수 있다. 따라서, Th의 모든 아미노산이 에피토프의 부분일 필요는 없다. 이에 따라, Th 에피토프의 유사체 및 세그먼트를 포함하는 Th 에피토프는 FMDV VP1 항원 부위 (예를 들면, 서열 1-21, 35) 및 그의 면역학적 기능 유사체에 대한 면역 반응을 강화하거나 자극할 수 있다. 면역지배적이며 혼합성의 Th 에피토프는 넓은 다양한 MHC 유형을 갖는 동물 및 인간 집단에서 고도의 넓은 반응성이다 (Partidos et al., 1991; 미국특허 제5,759,551호). 대상 펩티드의 Th 영역은 약 10 내지 약 50 아미노산, 바람직하게는 약 10 내지 약 30 아미노산을 가진다. 다중 Th 에피토프 (즉, m ≥ 2)가 존재하면, 각 Th 에피토프는 독립적으로 동일하거나 상이하다. Th 세그먼트는 FMDV VP1 항원 부위에 대한 면역 반응을 강화하거나 자극하기에 충분한 Th 에피토프의 인접한 부분이다.

본 발명의 에피토프에는 외부 병원균, 예를 들면 HBs Th, HBc Th, PT Th, TT Th, MVF Th, CT Th, DT Th, DF Th, SM Th, 및 Tra Th 유래의 Th; FMDV 단백질 유래의 자가 Th (표 5의 예를 들면 서열 24); 고안된 인공 Th (예를 들면, 표 6의 서열 25, 26, 36, 37 및 38) 및 면역학적으로 기능성인 유사체가 포함되나 이들에 제한되지 않는다. 면역학적으로 기능성인 Th 유사체에는 이들 임의의 Th 에피토프의 면역증강 유사체, 반응성 유사체 및 세그먼트가 포함된다. 면역학적 기능성인 Th 유사체는 바람직하게는 기본적으로 Th 에피토프의 Th-자극 기능을 변형하지 않는 Th 에피토프에서의 1 내지 약 10 아미노산 잔기의 보존적 치환, 부가, 결실 및 삽입을 포함한다.

"FMDV VP1 항원 부위"는 FMDV A₁₂ 균주의 VP1 단백질의 아미노산 134-168 (즉, 서열 1), 및 FMDV A₁₂ 균주의 VP1 단백질의 아미노산 134-168에 상동성인 FMDV A₁₂ 균주 이외의 FMDV 균주의 VP1 단백질의 단편인 펩티드를 의미한다. FMDV VP1 항원 부위는 또한 FMDV A₁₂ 균주의 VP1 단백질의 아미노산 134-168에 해당하는 혈청형 A, O 또는 아시아의 FMDV 균주의 VP1 단백질의 아미노산 서열 유래의 컨센서스 서열을 갖는 펩티드; 및 서열 14, 16, 18, 및 20의 유전자 정의에 부응하는 펩티드를 의미한다. FMDV VP1 항원 부위는 또한 본원에서 정의된 SSAL의 일원인 펩티드를 의미한다.

본 발명에 따라 FMDV VP1 항원 부위 (예를 들면, 서열 1-21, 35)의 반응성이며 면역학적으로 기능성인 유사체는 추가로 펩티드 유사체 (예를 들면, 서열 1-21, 35)가 FMDV VP1 항원 부위와 반응성인 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 한 1 내지 약 4의 아미노산 잔기의 보존적 치환, 부가, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다. 보존적 치환, 부가, 결실 또는 삽입은 본원에서 정의된 자연 또는 비자연 아미노산으로 달성될 수 있다.

표적 항원 부위는, 134 위치에서의 천연 아스파라긴 및 157 위치에서의 글루타민을 시스테인으로 치환하고 이들 시스테인 사이에 디술피드 결합을 형성시켜 고리형 구조 (서열 2)를 생성시킴으로써 G-H 루프 부위의 자연 발생 FMDV VP1 서열로부터 변형되는 것이 바람직하다. 또한, 단일 디술피드 루프 구조가 보존되는 한, 이들 고리형 구조는 VP1의 134-157 세그먼트의 임의의 말단으로부터 취한 1 내지 13개의 추가 아미노산을 포함할 수 있다 (서열 3). 천연 서열로부터의 변형은 표 1에서 (N→C), (Q→C), (R→C) 및 밑줄친 아미노산으로 나타낸다. 시스테인이 도입된 펩티드 서열은 SSAL, 예를 들면 서열 15, 17 및 19로 제공될 수 있으며, 이들 SSAL도 마찬가지로 FMDV VP1 항원 부위로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 바람직한 펩티드 면역원은 FMDV VP1 항원 부위 (예를 들면 서열 1-21, 35) 또는 그의 면역학적 기능성인 유사체 및 Th 펩티드를 함유하는 펩티드이다. 더욱 바람직한 펩티드 면역원은 FMDV VP1 항원 부위 또는 반응성이며 면역학적 기능성인 그의 유사체; 스페이서 (예를 들면, Gly-Gly); HBs Th, HBc Th, MVF Th, PT Th, TT Th, 자가 FMDV Th (예를 들면, 서열 24) 또는 인공 Th (예를 들면, 서열 25, 26, 36, 37 및 38) 또는 그의 유사체인 Th 에피토프,; 및 선택적으로 Inv 영역 (서열 22) 또는 그의 유사체를 함유하는 구축물이다.

본 펩티드 면역원과 둘 이상의 Th 에피토프의 혼합물을 함유하는 백신은 더 넓은 집단에서 면역효능을 강화할 수 있고, 따라서 FMDV VP1 항원 부위에 대한 개선된 면역 반응을 제공할 수 있다.

본 발명의 펩티드 면역원은 당업자에게 공지된 화학 합성 방법에 의하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 필드 등의 문헌 (Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W.H. Freeman & Co., New York, NY, 1992, p.382) 참조.

따라서, 펩티드는 측쇄 보호된 아미노산을 사용한 t-Boc 또는 Fmoc 화학에 의해 α-NH₂ 보호된 고체상 합성법의 자동화된 메리필드 기술을 사용하여 예를 들면 어플라이드 바이오시스템스 펩티드 합성기 모델 430A 또는 431 상에서 합성될 수 있다. B 세포 및 T 세포 에피토프에 대한 구조 합성 항원 라이브러리 (SSAL)를 포함하는 펩티드 구축물의 제조는 소정의 변이 위치에서 고안에서 구체화된 적당한 비율로 커플링을 위한 다른 아미노산 혼합물을 제공함으로써 달성될 수 있다.

목적의 펩티드 면역원의 완전한 조합 후에, 표준 절차에 따라 수지를 처리하여 수지로부터 펩티드를 절단하고, 아미노산 측쇄 상의 관능기를 탈보호시킨다. 유리 펩티드를 HPLC로 정제하고, 생화학적으로, 예를 들면 아미노산 분석 또는 서열분석으로 특성화한다. 펩티드에 대한 정제 및 특성화 방법은 당 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다.

VP1 G-H 루프 및 Th 부위를 함유하는 본 발명의 합성 펩티드 구축물을 생성하는 다른 화학적 수단에는 "티오에테르" 연결의 형성을 통한 할로아세틸화 및 시스테인화된 펩티드의 라이게이션이 포함된다. 예를 들면, Th-함유 펩티드의 C-말단에 시스테인을 첨가하고, 시스테인의 티올기를 사용하여 FMDV VP1 항원 부위 (예를 들면, 서열 1-21) 또는 반응성이며 면역학적 기능성인 그의 유사체의 N-말단에 부착된 리신 잔기의 N^α 클로로아세틸-변형 또는 말레이미드-유도화된 α- 또는 ε-NH₂ 기와 같은 친전자성 기에 공유 결합을 형성할 수 있다. 이러한 방식으로, Th-(FMDV VP1 항원 부위) 또는 그의 반대인 (FMDV VP1 항원 부위)-Th의 구축물이 수득될 수 있다.

본 면역원은 또한 중합될 수 있다. 중합반응은 예를 들면 통상적인 방법을 사용하는 면역원과 가교결합제의 반응, 예를 들면, 글루타르알데히드와 리신 잔기의 NH₂ 기 사이의 반응에 의하여 달성될 수 있다. 또 다른 방법에 의하여, 예를 들면 "(A)_n-Th_m-Gly-Gly-(FMDV VP1 항원 부위)-X"와 같은 합성 면역원은 합성 면역원의 N-말단에 부가된 추가의 시스테인을 이용하여 중합되거나 또 다른 면역원과 공중합될 수 있다. N-말단 시스테인의 티올기는 분지된 폴리-리실 코어 분자 (예를 들면, K₂K, K₄K₂K 또는 K₈K₄K₂K)의 N-말단에 부착된 리신 잔기의 할로아세틸-변형 아미노산 또는 말레이미드-유도화된 α-NH₂ 또는 ε-NH₂ 기와의 "티오에테르" 결합의 형성에 사용될 수 있다. 본 면역원은 또한 분지된 폴리-리실 코어 수지 상에 직접적으로 목적의 펩티드 구축물의 합성을 통하여 분지된 중합체로서 제조될 수 있다 (Wang et al., Science, 1991; 254:285-288).

이외에, 긴 합성 펩티드 면역원은 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 분자 클로닝 기술에 대한 많은 표준 매뉴얼이 재조합 DNA 및 RNA의 발현에 의하여 본 발명의 펩티드를 제조하는 상세한 절차를 제공한다. 본 발명의 펩티드를 코딩하는 유전자를 구축하기 위하여, 아미노산 서열을 바람직하게는 유전자가 발현될 유기체에서의 용도에 최적화된 코돈을 사용하는 핵산 서열로 역번역한다. 이어서, 통상적으로 펩티드를 코딩하는 중복 올리고뉴클레오티드 및 필요한 조절 요소를 합성함으로써 펩티드를 코딩하는 유전자가 만들어진다. 합성 유전자를 조합하고, 목적의 발현 벡터에 삽입한다. 본 발명에 포함되는 합성 핵산 서열은 본 발명의 펩티드, 면역학적 기능성인 상동체 및 유사체를 코딩하는 것을 포함하고, 핵산 구축물은 그에 의해 코딩되는 펩티드의 면역원성 특성을 변경하지 않는 비코딩 서열에서의 변화를 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산이 제공된다. 합성 유전자를 적합한 클로닝 벡터에 삽입하여 재조합체를 수득하고 특성화한다. 그 후, 펩티드를 선택된 발현 시스템 및 숙주에 적합한 조건 하에서 발현한다. 펩티드를 표준 방법으로 정제하고 특성화한다.

본 발명의 펩티드 조성물의 효능은 실시예에서 예시된 것처럼 동물, 예를 들면 기니아 피그 및 돼지에 면역원 제형 (예를 들면 서열 27-34, 36)을 주입하고, 이어서 FMDV VP1 항원 부위 (예를 들면, 서열 1-21, 35, 및 반응성의 면역학적 기능성인 그의 상동체)에 대한 체액 면역 반응을 모니터함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 또 다른 관점은 제약상 허용되는 전달 시스템 중에 본 발명의 하나 이상의 펩티드 면역원의 면역학적 유효량을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 따라서, 본 펩티드는 보강제, 제약상 허용되는 담체 또는 백신 조성물에 일반적으로 제공되는 기타 성분을 사용하여 백신 조성물로 제형될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 성분은 알럼, 불완전 프로인트 보강제, 리포신, 사포닌, 스쿠알렌, L121, 에멀시겐, 모노포스포릴 리피드 A (MPL), QS21, ISA35, ISA206, 및 ISA720을 포함하는 보강제 또는 유화제 뿐만아니라, 다른 효능있는 보강제 및 유화제이다. 본 제형은 예를 들면 면역원 봉입 또는 미립자와의 공투여에 의하여 달성될 수 있는 즉시 방출 및(또는) 지속성 방출, 전신 면역성의 유도 및(또는) 국소 점막 면역의 유도를 위한 제형을 포함한다. 이러한 제형은 당분야의 숙련자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다. 본 제형은 피하, 경구, 근육내 또는 다른 비경구 또는 장용 경로를 포함하는 임의의 편리한 경로로 투여될 수 있다. 유사하게, 백신은 단일 투여 또는 다중 투여로 투여될 수 있다. 면역화 스케쥴은 당업자에 의해 용이하게 결정된다.

본 발명의 핵산은 그 자체가 이른바 "DNA 백신"으로 유용할 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 본 발명의 면역원 펩티드의 발현은 환자 자신의 세포에서 펩티드 를 코딩하는 핵산을 그 세포에 도입함으로써 유도된다. DNA 백신의 제조 및 사용 방법은 미국특허 제5,580,859호, 제5,589,466호, 및 제5,703,055호; 및 또한 WO97/02840 및 문헌 (W. McDonnell and F. Askari, New Engl. J. Med., 1996, 334:2-45)에서 설명되며, 이들 모두가 참고로 본원에 도입된다. 본 발명의 펩티드 및 펩티드 컨쥬게이트의 제조 및 사용 방법은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.

본 발명의 백신 조성물은 본 발명의 하나 이상의 펩티드 면역원의 유효량 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 적합한 투여 단위 형태에서의 그러한 조성물은 일반적으로 kg 체중 당 약 0.5 ㎍ 내지 약 1 mg의 면역원을 함유한다. 다중 투여로 전달될 때, 투여 단위 형태 당 적당한 양으로 편리하게 분할될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 펩티드 조성물로 제시된 면역원의 초기 투여, 예컨대 0.2 내지 2.5 mg, 바람직하게는 1 mg을, 바람직하게는 근육내로 주입한 후, 이어서 반복 (부스터) 투여로 투여된다. 투여량은 백신 및 치료 분야에 공지된 것처럼 대상의 연령, 체중 및 일반적인 건강에 따라 달라진다.

FMDV VP1 항원 부위 면역원에 대한 면역 반응은 오'하간 등의 문헌 (Vaccine, 1991; 9:768-771)에 기재된 유형의 생체분해성 미립자 중에 봉입하거나 상기 미립자상에 봉입하여 전달함으로써 개선될 수 있다. 면역원은 보강제와 함께 또는 보강제 없이 생체분해성 미립자에 캡슐화되어 국소 점막 면역을 포함하는 면역반응을 강화하고, 경구 투여 및 국소 투여의 경우에서 지속성 또는 주기성 반응을 위한 시간 조절 방출을 제공할 수 있다 (O'Hagan et al., 1991; and Eldridge et al., Molec Immunol, 1991, 28:287-294).

그러한 펩티드 조성물은 FMDV에 대한 중화 항체의 유도 및 FMD의 예방 및 근절을 위한 백신으로서 유용하다.

본 발명을 설명하기 위하여 특정 펩티드 면역원 및 조성물이 하기 실시예에서 제공된다. 이들 실시예는 단지 서술 목적이며, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하기 위한 것으로 해석되지 않는다.

본 실시예의 표적 항원 펩티드는 실시예 1에 약술된 고체상 방법에 의하여 합성되었다. FMDV VP1 항원 부위는 다른 FMDV 혈청형 및 하위유형 (예를 들면, 서열 1-7) 및 컨센서스 부위 (예를 들면, 서열 8-13), 및 SSAL 펩티드 (예를 들면, 서열 14-21, 35) 유래의 유사체 및 펩티드 상동체를 포함하여 공지된 바이러스 단리체로부터 채택된 선형 및 고리 펩티드로 예시된다. 본 실시예에 사용된 각 펩티드는 면역원 요소 사이에 Gly-Gly 스페이서를 가지지만 (예를 들면, 서열 30-32), 본 발명의 펩티드는 또한 다른 스페이서를 갖거나 (예를 들면, 서열 23) 또는 스페이서가 없을 수 있다. Th는 본원에 참고로 도입된 간염 B 바이러스 및 다른 바이러스와 같은 외부 병원균 유래의 혼합 보조 부위, FMDV 유래의 자가 Th (예를 들면, 서열 24), 및 인공 Th (예를 들면, 서열 25, 26 및 36-38)을 포함한다. 이들 실시예의 펩티드는 또한 선택적인 일반 면역자극 부위 (예를 들면, 서열 22)를 포함한다.

<실시예 1>

표적 항원 펩티드의 평가를 위한 통상적인 절차

FMDV 관련 합성 펩티드

Fmoc 화학을 사용하여 어플라이드 바이오시스템스 자동화 펩티드 합성기 (모델 430, 431 및 433A) 상에서 메리필드 고체상 합성법으로 VP1의 FMDV G-H 루프 영역 유래의 서열을 갖는 펩티드를 합성하였다. B 세포 또는 T 세포 에피토프 (예를 들면, "O SSAL" (서열 19) 또는 "1, 4, 9 PALINDROMIC Th" (서열 26)에 대한 구조 합성 항원 라이브러리 (SSAL)을 포함하는 펩티드 구축물의 제조는 소정의 변이 위치에서 커플링하기 위하여 표 2, 3, 4, 6 및 10에 나타낸 SSAL에 대한 고안 식에서 구체화된 적절한 비율로, 또는 고안된 식에서 특정되지 않았다면 등몰 비로 추가의 아미노산의 혼합물을 준비함으로써 달성하였다. 목적의 펩티드의 완전한 조합후에, 트리플루오로아세트산을 사용하는 표준 절차에 따라 수지를 처리하여 수지로부터 펩티드를 절단하고, 아미노산 측쇄 상의 보호기를 탈보호하였다. 고리 펩티드의 경우, 절단된 펩티드를 물 중의 15 % DMSO에 48 시간 동안 용해하여 시스테인간의 내부 디술피드 결합 형성을 촉진하였다. 절단되고, 추출 및 세척된 펩티드를 HPLC로 정제하고, 매스 스펙트로메트리 및 역상 HPLC로 특성화하였다. 이들을 백신 개발을 위한 면역원 또는 면역화된 동물로부터 수득된 혈청과의 반응성을 평가하기 위한 항원 기질로 사용하였다.

기니아 피그 및 돼지 면역화

합성 FMDV VP1 표적 항원 펩티드 면역원에 대한 면역원성 연구에 3마리의 던칸 하틀레이 기니아 피그 (암컷, 9주령, 450 g, 바이러스 없음) 및 돼지 (암컷, 9주령)의 실험군을 사용하였다. 각 동물에 특정 보강 제형에 유화된 단일 표적 항 원 펩티드 또는 그의 혼합물인 본 발명의 펩티드 조성물을 함유하는 FMDV 백신을 투여당 100 ㎍으로 0 및 3주에 근육내로 면역화하였다. 면역원성 실험을 위하여 동물을 0, 3, 5 및 8 또는 10주에 채혈하였다.

면역원성 평가

합성 표적 항원 펩티드 면역원에 대한 면역원성 실험은 고체상 항원으로서 단지 표적 중화 부위만을 함유하는 해당 FMDV VP1 표적 항원 펩티드를 사용하여 합성 FMDV VP1 펩티드-기재 ELISA로 수행하였다. 계열 희석된 실험 동물 혈청을 실험하고, 양성 역가를 희석률 역수의 Log₁₀ 값으로서 표현하였다. 혈청양성 시료를 한데 모으고, 하기 설명한 것처럼 면역원성 실험을 확장시켜 FMDV의 다양한 단리체에 대한 중화 활성을 측정하였다.

합성 VP1 (AA134-168) 펩티드 기재 ELISA

10 ml NaHCO₃ 완충액, pH 9.5 중에서 웰 당 100 ㎕를 사용하여 5 ㎍/ml의 FMDV VP1 부위 펩티드로 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시킴으로써 피복된, 펩티드-피복된 96웰 플레이트에서 펩티드 기재 ELISA를 수행하였다. 펩티드 피복된 웰을 PBS 중의 3 중량% 겔라틴 250 ㎕와 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켜 비특이적 단백질 결합 부위를 차단하고, 0.05 부피%의 TWEEN 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하고, 건조시켰다. 달리 언급하지 않는다면, 20 부피%의 정상 염소 혈청, 1 중량%의 겔라틴 및 0.05 부피%의 TWEEN을 함유하는 PBS를 사용하여 실험 시료를 1:20 (부피 대 부피)으로 희석시켰다. 희석된 시료 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 1시간 동안 37 ℃에서 반응시켰다. 그 후, 웰을 PBS 중의 0.05 부피%의 TWEEN 20으로 6회 세척하여 미결합된 표지 항체를 제거하였다. 양고추냉이 퍼옥시다제 표지된 염소 항-기니아 피그 또는 항-돼지 IgG 100 ㎕를 PBS 중의 1 부피%의 정상 염소 혈청, 0.05 부피%의 TWEEN 20 중에 미리 결정해 둔 최적 희석률로 각 웰에 첨가하고, 37 ℃에서 15 분간 반응시켰다. 웰을 PBS 중의 0.05 부피%의 TWEEN 20으로 6회 세척하여 미결합된 표지 항체 컨쥬게이트를 제거하고, 시트르산 나트륨 완충액 (pH 5.0) 중의 0.04 중량%의 오르토페닐렌디아민 (OPD) 및 0.12 부피%의 과산화수소를 함유하는 기질 혼합물 100 ㎕와 15분간 반응시켰다. 100 ㎕의 1.0 M H₂SO₄를 첨가하여 반응을 중지시키고, 492 nm에서의 흡광도 (A₄₉₂)를 측정하였다. Log₁₀으로 표현된 ELISA 값은 흡광도의 선형 회귀 분석을 기초로 하여 A₄₉₂ 컷오프 값을 0.5로 설정하여 계산하였다.

FMDV 바이러스

기본적으로 브라운 및 카트라이트의 문헌 (J Gen Microbiol, 1963; 31:179-186)에 설명된 것처럼 다양한 균주의 FMDV (예를 들면, 혈청형 A의 A₁₂ 및 A₂₄, 혈청형 O의 O₁, O₂ 등)을 플럼 아일런드 동물질환 센터 USDA (뉴욕주의 그린포트)에서의 격리하에 단층의 어린 햄스터 신장 (BHK) 세포에서 성장시키고, 정제하고, 1 % SDS 또는 1 % Nonidet P-40으로 펠렛을 처리한 후 15 내지 45 %의 수크로스 구배 하에서 원심분리하였다. 각 원심분리관의 내용물을 260 nm로 고정된 분광광도계의 유동 셀을 통해 펌핑하여 정제된 바이러스 피크를 식별하고, 단리하였다.

FMDV 중화 활성의 혈청학적 평가

돼지 (뇌 대정맥) 및 기니아 피그 (심장 천공)로부터 모든 혈액으로부터 혈청 시료를 가공하고 처리시까지 -20 ℃로 보관하였다. 1:100 혈청 시료의 희석액에 의한 중화된 바이러스의 수치 평가는 상기 설명된 대로 제조된 다양한 혈청형의 할당량 (10,000 MPD₅₀)을 사용하여 일련의 입력 바이러스 부하 증가에 대한 중화 결정법으로 달성하였다. 수행된 실험 방법 (Morgan and Moore, Am J Vet Res, 1990; 51:40-45)에 의해, 1:100 희석액에서 FMDV 미세플라크의 2.5 Log10 감소를 제공하는 혈청을 생성한 동물은 FMDV 감염에 대해 높은 보호 면역을 예견케한다.

<실시예 2>

서열 형태 및 면역자극 요소에 의한 FMDV 표적 항원 펩티드의 최적화

7개의 FMDV VP1 혈청형 A 펩티드를 표 7에 설명하였다. 이들의 해당 VP1 아미노산 서열을 표 1에 배열하고, 번호를 매겼다. 이 군의 Th-함유 펩티드는 표 5에서 설명된 VP1 21-40 (서열 24)으로 식별된 Glu-Thr-Gln-Ile-Gln-Arg-Arg-Gln-His-Thr-Asp-Val-Ser-Phe-Ile-Met-Asp-Arg-Phe-Val (서열 24)의 자가 FMDV Th 서열을 갖는다. Inv는 인바신 영역 서열이다 (서열 22). 표 7의 7개의 구축물 중 5개의 서열은 서열 1, 2 및 27-29에 따라 설명하였다. 이들 펩티드를 합성하고, 면역원성 평가를 위하여 면역 혈청을 생성하였다. 초기 면역화후 5 주 후에 얻은 혈청을 FMDV VP1 펩티드 반응성에 대하여 펩티드-ELISA로, 혈청형 A의 FMDV를 중화하는 능력에 대해 표적 바이러스로서 균주 A_FP를 사용하는 표준 FMDV 중화 분석법으로 분석하였다.

혈청의 효능을 혈청의 1:100 희석액에서 중화된 Log₁₀ 항-FMDV VP1 ELISA 역가 및 FMDV A_FP (MPD₅₀)의 Log₁₀값으로 표현하였다.

결과:

Th 및 고리화 없는 A₁₂ (134-159) 펩티드 p2228a, 및 고리 없는 p2229c는 각각 3 마리 중 1 마리 및 3 마리 중 2 마리에서 항-펩티드 항체를 유도하였다. 이와 달리, 더 긴 펩티드 p2224a, A₁₂ (134-169) 및 더 긴 고리 펩티드는 3마리 중 세 마리 모두에서 면역원성이었다. 또한, 고리화된 A₁₂(134-159) 펩티드 p2233c는 3마리의 기니아 피그 중 3마리에서 면역원성이 있다. 면역반응성 혈청 시료 중에서, 7개의 펩티드 구축물 모두의 경우에 ELISA 역가는 유사하였다.

그러나, 혈청 중화 활성에 의해 평가하였을 때 펩티드 구축물 사이에는 현저한 차이가 관찰되었으며 (표 7에 나타냄), 그 크기는 p2228a < p2224a < p2229c < p2225c < p2223a < p2236c였다.

중화 효능의 이러한 등급을 기초로, FMDV VP1 항원 펩티드의 최적화와 관련하여 하기 결론이 도출되었다:

(1) 134 내지 169의 AA 잔기에 걸친 긴 펩티드 구축물이 더 높은 중화 효능을 제공하며, 따라서 짧은 서열 (AA134-159)의 경우보다 바람직하다 (예를 들면, p2224a > p2228a, p2225c > p2229c, 및 p2236c > p2233c).

(2) 인공적으로 고리화된 합성 구조물이 더 우수한 형태를 제공하며, 따라서 그 대응하는 비-고리화된 구축물모다 더 바람직하다 (예를 들면, p2223a > p2229c 및 p2236c > p2225c).

면역자극 요소를 함유하는 합성 구축물이 더 높은 중화 효능을 제공하며, 따라서 없는 것보다 더욱 바람직하다 (예를 들면, p2236c > p2223a; p2229c > p2228a; 및 p2225c > p2224a).

<실시예 3>

VP1 단백질의 고변이성 부위의 컨센서스 서열을 사용하는 합성 구축물이 넓은 FMDV 중화를 제공

컨센서스 VP1 표적 항원 부위를 사용하는 2개의 합성 고리 구축물이 표 1에 나타낸 컨센서스 혈청형 O 서열 (서열 11)에 따라 고안되었다. Inv 영역 (서열 22)를 포함하는 면역자극 요소 및 표 6에 나타낸 인공 SSAL Th (서열 26)를 사용하여 하나의 컨센서스 펩티드를 합성하였다. 추가의 면역자극 서열없이 또 다른 펩티드를 합성하였다. 이들 FMDV VP1 구축물의 전체 구조는 표 8a의 p2569a (서열 11) 및 표 8b의 p2570c (서열 30)으로 나타내었다.

초기 면역화 후 3 주 및 5 주 후에 고도면역화된 기니아 피그로부터 얻은 혈청을 FMDV VP1 펩티드 반응성에 대하여 펩티드-ELISA로, 다중 혈청형 O, A 및 아시아의 FMDV를 중화하는 능력에 대해 표적 바이러스로서 FMDV 균주 A_FP, O-1PI, O-1 타이완, O_Fran, O_Taiwan, O_Kauf 및 아시아 1을 사용하는 표준 FMDV 중화 분석법으로 평가 하였다.

단일 면역화 3 주 후에 합성 FMDV 면역원 모두에 대하여 높은 면역효능을 나타내는 높은 항-FMDV VP1 펩티드 항체 역가가 관찰되었다. 그러나, 초기 면역후 3주의 초기에 나타난 혈청의 높은 중화 활성, 및 혈청형 A, O 및 아시아 전체의 넓은 특이성은 기대되지 않았다. 이러한 넓은 범위의 중화 활성은 불활성화된 바이러스 스톡으로 제조된 가장 우수한 FMDV 백신의 경우에 조차 드물게 관찰된다.

FMDV 표적 항원 펩티드의 컨센서스 고안은 넓은 반응성의 중화 활성의 FMDV 백신의 기초를 제공한다.

<실시예 4>

개선된 FMDV VP1 면역원성 및 FMDV 중화 범위를 위한 인공 Th 및 SSAL 표적 항원 펩티드

각각 구조 합성 항원 라이브러리 (SSAL)로 제조된 FMDV 항원 부위를 갖는 2개의 표적 항원 펩티드, p1522b (서열 31) 및 p1592c (서열 32)를 고안하였다. 이들 두 개의 펩티드는 표 9에서 설명하였다. p1522b (서열 31)의 SSAL 표적 항원 부위는 표 3의 혈청형 O의 하위유형으로부터 수집된 완전한 G-H 루프 VP1 부위를 나타낸다. 이러한 표적 항원 부위는 표 3에 서열 19로 나타낸 "O SSAL (COMPLETE)"에 따라 고안되었다. 유사하게 p1592c는 혈청형 아시아의 하위유형에 대하여 표 4에 열거된 모든 G-H 루프 서열을 나타내는 SSAL 표적 항원 부위를 포함한다. 이러한 아시아에 대한 SSAL 부위는 표 4에서 서열 21로 나타낸 "아시아 SSAL" 서열에 따라 고안되었다. 표 6의 "Syn Th(1, 2, 4)로 명명된 인공 Th (서열 25)를 면역원성을 위하여 1522b 및 p1592c에 연결하고, Inv 면역자극 부위 (서열 22)를 p1592c에 결합시켰다.

실시예 1에서 설명한 것처럼 이들 두 개의 SSAL 표적 항원 펩티드를 합성하고 이를 사용하여 3마리의 기니아 피그의 군을 고도면역화시켰다. 초기 면역후 5 주후 및 10 주후에 얻은 혈청을 FMDV VP1 펩티드 반응성에 대하여 펩티드-ELISA로, 혈청형 O, A 및 아시아의 FMDV를 중화하는 능력에 대해 표적 바이러스로서 FMDV 균주 A1, A12_FP, A_FL, A23, O-1_JH, O-1 p2 및 아시아 1을 사용하는 표준 FMDV 중화 분석법으로 평가하였다.

표적 항원 부위에 대한 높은 항-펩티드 역가 (>5.0 Log₁₀)은 초기 면역후 5주 후에 (더 이른 채혈은 없었음) p1522b 및 p1592c 모두에 의해 일어났다. 이들 균주 및 혈청형 사이의 서열에서의 넓은 변이에도 불구하고, 항-혈청 모두에서 3개의 상이한 혈청형 (즉, A, O 및 아시아)에 속하는 모두 7 개의 FMDV 균주의 넓고 효과적인 FMDV 중화가 관찰되었다. 이는 높은 변이성의 표적 항원/기능 부위에 대한 합성 펩티드 기재 백신의 고안에서 SSAL의 유용성을 입증한다.

FMDV 표적 항원 펩티드에 대한 SSAL 고안은 넓은 반응성의 중화 활성의 FMDV 백신에 대한 기초를 제공한다.

<실시예 5>

효과적인 FMDV 면역화를 위한 다중 혈청형 혼합물

합성 펩티드 p1520b, p1522b 및 p1888b (서열 33, 31 및 34)를 갖는 3개의 SSAL 표적 항원 펩티드의 혼합물이 표 10에 기재되어 있다. 이 혼합물은 인공 Th 에피토프 "Syn Th (1, 2, 4)" (서열 25)에 연결된 혈청형 A (서열 15, 표 2), 혈청형 O (서열 19, 표 3) 및 혈청형 아시아 (서열 35, 표 10)를 대표하는 SSAL 표적 항원 부위를 포함한다. 이 혼합물을 사용하여 3 마리 돼지의 군을 면역화하였다. 100 ㎍의 투여량으로 0 주째에는 프로인트 완전 보강제 중에 투여하고 3주째에는 프로인트 불완전 보강제 중에 투여하여 3주 간격으로 투여하였다. 초기 면역화 후 수득된 혈청을 FMDV VP1 항원 부위에 대한 면역원성에 대하여는 펩티드-ELISA로 평가하였고, 최근의 발병체로부터의 미지의 VP1 서열 O1-Taiwan의 균주를 표적 바이러스로서 사용하는 FMDV 중화 분석법으로 평가하였다. 모든 3 마리 돼지가 높은 항-펩티드 반응성으로 면역화에 반응하였다 (평균 FMDV VP1 ELISA 역가 3.7 Log₁₀). FMDV O1-Taiwan VP1 서열의 성질을 알지 못함에도 불구하고, 면역화된 3 마리 숙주로부터 수득하여 1:100으로 희석하고 모은 혈청은 4.5 Log₁₀의 현저한 중화 활성을 나타내었다. 이러한 중화 활성 수준은 FMDV 감염에 대한 보호 면역성을 예견케 한다. 백신의 FMDV 보호 성질의 예견을 위해서 플럼 아일런드 동물 질환 센터 (USDA) (Morgan and Moore, 1990)에서 축적된 방대한 경험을 기초로 할 때, 시험관 조건의 분석에서 2 Log₁₀의 FMDV (MPD₅₀)를 중화할 수 있는 혈청은 백신접종된 숙주가 FMDV 감염에 대해 효과적으로 보호될 것임을 예견케 한다.

이러한 관찰은 백신의 표적 숙주 중 하나인 돼지에서의 감염으로부터 보호능을 갖는 본 발명의 펩티드 조성물에 의한 백신접종에 대한 면역반응과 상호관련된다. 이것은 효과적인 보편적인 FMDV 백신 (즉, 다중 혈청형의 항원적 변이성 단리 체에 대해 유효한)으로 사용될 수 있는 본 발명의 FMDV VP1 펩티드 조성물의 효능을 입증하며, 이러한 성과는 1950년대 초기 불활성화된 FMDV 백신의 도입 이후로는 달성되지 않았다.

<실시예 6>

면역학적 상태의 평가를 위한 펩티드

FMDV 및 백신접종에 대한 노출과 관련하여 공지된 상태인 가축의 혈청학적 반응성을 평가하기 위하여 본 발명의 펩티드를 ELISA 실험에 도입하였다. 사용된 펩티드는 백신접종에 사용되는 대표적인 FMDV 균주가 되도록 선택하였으며, 동물이 노출될 수 있는 야생균주와 동일한 혈청형인 것으로 생각되었다.

실시예 1의 "합성 VP1 (AA134-168) 펩티드 기재 ELISA" 부분에서 설명된 것처럼 진단 실험용 키트를 제조하고 사용하였다. 플레이트를 고체상 항원으로서 균주 O1Campos (p2463=AA128-158(T→C)-169) 및 균주 O1Manisa (p2466=AA128-158(T→C)-169)에 해당하는 VP1 펩티드로 피복하였다. 이들 키트를 사용하여 9개월 전에 FMD가 발병한 나라의 가축으로부터 모은 혈청 시료를 실험하였다. 가축을 "감염 의심" 및 "백신접종 및 감염 의심" (발병이 일어난 지역으로부터의 가축), "백신접종" 및 "정상" (FMDV가 없는 것으로 생각되는 지역으로부터의 가축)의 그들의 공지된 상태로 분류하였다. 컷오프 값의 흡광도가 강한 반응성 대조군의 경우의 0.2 배 이상인 시료를 반응성인 것으로 점수를 매겼다. 결과는 표 11에 나타냈다.

이들 결과는 펩티드 기재 ELISA가 가축 노출을 예견케 함을 보여준다. 노출 된 가축은 약 20%의 현저한 반응성을 나타내는 반면, 정상 가축의 동물은 반응성을 나타내지 않았다. 노출된 가축의 경우의 20 % 반응성은 실험이 발병이 9개월 보다 더욱 가까운 시기에 수행되었다면 더 높았을 것이다. 백신접종된 가축에 대한 결과는 여러 공급자로부터 수득된 통상의 백신을 사용한 다양한 백신 프로그램의 효능에서 높은 변이성을 반영하여 놀라운 양의 변이성을 나타낸다.

본원에서 인용된 모든 문헌은 본원에 참고로 도입된다.

FMDV 헬퍼 T 세포 에피토프 (Th)

FMDV Th의 공급원	숙주 종	참고문헌
VP1 (35-53)	소	Van Lierop et al., Immunology 84:79, 1995
VP2 (74-88)	소	Van Lierop et al., Immunology 84:79, 1995
VP4 (20-34)	소	Collen et al., J. Gen. Virology 71:309, 1990
VP1 (21-40) (서열 24)	소	Collen et al., J. Immunology 146:749, 1991
VP1 (135-144)	생쥐	Zarorano et al., Virology 212:614, 1995
VP1 (62-76)	돼지	Rodriguez et al., Virology 205:24, 1994
VP1 (83-104)	돼지	Rodriguez et al., Virology 205:24, 1994
VP1 (188-209)	돼지	Rodriguez et al., Virology 205:24, 1994
VP1 (111-132)	돼지	Rodriguez et al., Virology 205:24, 1994

공지의 면역원성 상태의 가축에 대한 ELISA에 의한 반응성

종	가축 상태	n	번호. ELISA 반응성	% ELISA 반응성
돼지	감염 의심	108	21	19.4 %
돼지	백신접종한 감염 의심	70	16	22.8 %
돼지	백신접종	100	92	92.0 %
돼지	백신접종	31	17	54.8 %
돼지	백신접종	70	26	37.1 %
염소	백신접종	288	155	53.8 %
소	백신접종	33	5	15.1 %
소	백신접종	30	2	6.7 %
돼지	정상	100	0	0 %

(1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Wang, Chang Yi Shen, Ming (ii) TITLE OF INVENTION: SYNTHETIC PEPTIDE VACCINES FOR FOOT-AND-MOUTH DISEASE (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 37 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Morgan & Finnegan, L.L.P. (B) STREET: 345 Park Avenue (C) CITY: New York (D) STATE: NY (E) COUNTRY: USA (F) ZIP: 10154-0054 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: Windows 95 (D) SOFTWARE: Word 97 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 09/100,600 (B) FILING DATE: 20-Jun-1998 (C) CLASSIFICATION: (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Maria C.H. Lin (B) REGISTRATION NUMBER: 29,323 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 1151-4156 (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: 212-758-4800 (B) TELEFAX: 212-751-6849 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 35 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1: Asn Lys Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Gly Val Arg Gly 1 5 10 Asp Phe Gly Ser Leu Ala Pro Arg Val Ala Arg Gln 15 20 Leu Pro Ala Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 25 30 35 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 35 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: Cys Lys Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Gly Val Arg Gly 1 5 10 Asp Phe Gly Ser Leu Ala Pro Arg Val Ala Arg Cys 15 20 Leu Pro Ala Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 25 30 35 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 46 amino acids (B) TYPE: amino acid 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Val" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 23 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Ala or Glu" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 25 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Thr, Ala or Met" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 28 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Thr or Ala" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 29 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Ser or Tyr" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 36 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Lyr or Arg" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:19: Cys Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Arg 1 5 10 Gly Asp Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Arg 15 20 Xaa Leu Pro Xaa Xaa Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Xaa 25 30 35 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:20: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 34 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 1 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Thr, Pro or Arg" (ix) 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Leu Ala Pro Arg 50 55 60 Val Ala Arg Cys Leu Pro Ala Ser Phe Asn Tyr Gly 65 70 Ala Ile Lys 75 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:30 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 80 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:30: Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala 1 5 10 Thr Tyr Gln Phe Gly Gly Ile Ser Ile Ser Glu Ile 15 20 Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile Leu 25 30 35 Phe Gly Gly Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly 40 45 Glu Asn Ala Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln 50 55 60 Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr 65 70 Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys 75 80 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:31: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 56 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:31: Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr 1 5 10 Ile Ile Thr Thr Ile Asp Gly Gly Cys Lys Tyr Gly 15 20 Glu Asn Ala Val Thr Asn 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10 Glu Xaa Ile 15

Claims

(a) 서열 1;

(b) 구제역 바이러스 (FMDV (Foot-and-Mouth Disease Virus)) A₁₂ 균주 이외의 FMDV 균주의 VP1 단백질의 단편으로, FMDV A₁₂ 균주의 VP1 단백질의 아미노산 134 내지 168에 상동성인 펩티드;

(c) 혈청형 A, O 또는 아시아의 FMDV 균주의 VP1 단백질의 아미노산 서열 유래의 컨센서스 서열로 이루어지며, FMDV A₁₂ 균주의 VP1 단백질의 아미노산 134 내지 168에 해당하는 펩티드;

(d) 서열 14, 16, 18 및 20의 정의에 해당하는 펩티드;

(e) FMDV A₁₂ 균주의 VP1 단백질의 아미노산 134 내지 157에 해당하는 위치에 존재하는 아미노산이 시스테인으로 치환된 상기 (a) 내지 (d)에서 정의된 펩티드; 및

(f) VP1의 134 내지 157 세그먼트의 말단으로부터 취한 1 내지 13개의 추가 아미노산으로 추가로 이루어지는 상기 (a) 내지 (e)에서 정의된 펩티드

로 이루어진 군에서 선택되는 펩티드.
(a) 제1항에 따른 펩티드의 아미노산 서열 및

(b) 헬퍼 T 세포 에피토프 (Th)의 아미노산 서열

을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드.
(a) 제2항에 따른 펩티드의 아미노산 서열 및

(b) 일반적인 면역자극 서열의 아미노산 서열

을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드.
제1항에 있어서, FMDV A₁₂ 균주의 VP1 단백질의 아미노산 134 및 157에 해당하는 위치에 존재하는 아미노산이 시스테인으로 치환된 펩티드.
제4항에 있어서, 하나 이상의 펩티드가 서열 2 및 FMDV의 다른 균주 유래의 상동성 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드.
제1항에 있어서, 펩티드가 (e)에서 정의된 펩티드인 펩티드.
제6항에 있어서, 하나 이상의 펩티드가 서열 3 및 FMDV의 다른 균주 유래의 상동성 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드.
제1항에 있어서, FMDV VP1 표적 항원 부위가 서열 1, 서열 2, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12 및 서열 13으로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드.
서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21 및 서열 35로 이루어지는 군에서 선택되는 복수의 펩티드를 포함하는 구조 합성 항원 라이브러리.
하기 식으로 표시되는 펩티드 또는 펩티드 컨쥬게이트.

(A)_n-(FMDV 항원)-(B)_o-(Th)_m-X,

(A)_n-(Th)_m-(B)_o-(FMDV 항원)-X,

(FMDV 항원)-(B)_o-(Th)_m-(A)_n-X 또는

(Th)_m-(B)_o-(FMDV 항원)-(A)_n-X

여기서, 각 A는 독립적으로 아미노산 또는 서열 22이고,

각 B는 독립적으로 아미노산, -NHCH(X)CH₂SCH₂CO-, -NHCH(X)CH₂SCH₂CO(ε-N)Lys-, -NHCH(X)CH₂S-숙신이미딜(ε-N)Lys- 및 -NHCH(X)CH₂S-(숙신이미딜)로 이루어지는 군에서 선택되고,

각 Th는 독립적으로 HBs Th, HBc Th, PT Th, TT Th, MVF Th, CT Th, DT Th, DF Th, SM Th, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 36, 서열 37 또는 서열 38, 또는 그의 면역 증강 유사체 또는 세그먼트이며,

"FMDV 항원"은 (i) 제1항의 펩티드 서열, 및 (ii) 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21 및 서열 35로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열이고,

X는 아미노산 α-COOH 또는 α-CONH₂이고,

n은 0 내지 약 10 이며,

m은 1 내지 약 4이고,

o는 0 내지 약 10이다.
제10항에 있어서, Th 에피토프가 공지의 FMDV Th, 외래 병원균 유래의 공지된 Th, 서열 25, 26, 36 및 37, 및 그의 면역자극 유사체 또는 세그먼트로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 또는 펩티드 컨쥬게이트.
제10항에 있어서, 하나 이상의 A가 인바신 도메인 (Inv)인 펩티드 또는 펩티드 컨쥬게이트.
제12항에 있어서, 인바신 도메인이 서열 22 및 그의 면역자극 유사체 및 세그먼트로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 또는 펩티드 컨쥬게이트.
제10항에 있어서, 하나 이상의 B가 Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (서열 23) (여기서, Xaa는 임의의 아미노산임)인 펩티드 또는 펩티드 컨쥬게이트.
제10항에 있어서, n이 3이고, (A)₃이 (인바신 도메인)-Gly-Gly인 펩티드 또는 펩티드 컨쥬게이트.
면역학적 유효량의 제11항에 따른 하나 이상의 펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
제16항에 있어서, 상기 면역학적 유효량이 투여 당 kg(체중) 당 약 0.5 ㎍ 내지 약 1 mg인 제약 조성물.
제16항에 있어서, 하나 이상의 펩티드가 서열 1 내지 21 및 서열 35로 이루어지는 군에서 선택되는 제약 조성물.
제16항에 있어서, 펩티드(들)이 서열 1 내지 21 및 서열 35로 이루어지는 군에서 선택되는 제약 조성물.
인간을 제외한 포유류에서 항체를 생성할 수 있는 시간 및 조건 하에서 제16항의 제약 조성물을 상기 포유류에게 투여하는 것을 포함하는 인간을 제외한 포유류에서의 항-FMDV 항체의 유도 방법.
제19항에 있어서, 상기 포유류가 소, 돼지, 양 및 염소로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
제1항의 펩티드를 코딩하는 서열을 갖는 핵산.
(a) 제1항에 따른 펩티드를 고체 지지체에 부착하는 단계,

(b) 펩티드에 항체를 결합시키는 조건 하에서 상기 고체 지지체에 부착된 펩티드를 포유류 유래의 항체를 함유하는 시료에 노출시키는 단계, 및

(c) 상기 고체 지지체에 부착된 펩티드에 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계

를 포함하는 포유류에서의 FMDV 감염의 진단 방법.