KR100604037B1

KR100604037B1 - 항체 경쇄 카파 발현벡터

Info

Publication number: KR100604037B1
Application number: KR1020020045768A
Authority: KR
Inventors: 이종욱; 고인영; 송무영; 김창석; 이재선; 유태형; 김지민; 박상구
Original assignee: 주식회사유한양행
Priority date: 2002-08-02
Filing date: 2002-08-02
Publication date: 2006-07-24
Anticipated expiration: 2022-08-02
Also published as: KR20040012268A

Abstract

본 발명은 항체의 경쇄 카파 발현 벡터에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항체의 가변영역을 코딩하는 유전자의 연결지역(joining region)에 공통적으로 존재하는 제한효소 부위(restriction site) 및 항체의 불변영역을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 상기 발현 벡터는 다양한 가변영역 유전자를 직접 카세트 형식으로 삽입하여 경쇄 카파 전체 유전자를 발현할 수 있어, 다양한 치료용 항체 개발에 유용하게 사용된다.

치료용 항체, 발현벡터, 가변영역, 불변영역, 제한효소, 경쇄 카파

Description

항체 경쇄 카파 발현벡터 {A KAFA LIGHT CHAIN EXPRESSION VECTOR}

도 1는 본 발명의 발현벡터의 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 발현벡터의 제조과정을 도식적으로 나타낸 것이다.

본 발명은 항체의 경쇄 카파 발현 벡터에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항체의 가변영역을 코딩하는 유전자의 연결지역(joining region)에 공통적으로 존재하는 제한효소 부위(restriction site) 및 항체의 불변영역을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

치료용 항체의 개발은 전 세계적으로 여러 분야에서 이루어지고 있으며, 수많은 질병에 대한 치료용으로 항체를 개발하고 있다(Reichmann, L., Clark, M., et al. Nature 322, 323-327(1988); Paul Carter and H. Michael Shepard. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 4285-4289(1992); John Hakimi, and William P. Schneider. J. Immunology 151, 1075-1085(1993)).

현재 인간화 항체 및 키메라항체를 개발하기 위해서는 마우스 항체의 가변지역 유전자를 인간의 불변유전자와 유전자 재조합 방식으로 클로닝하여 인간화 항체를 만든 다음, 동물세포발현벡터로 클로닝하여 동물세포로 형질전환시킨 후 발현여부를 분석하는 방법을 사용하고 있다.

이와 같이, 항체 발현벡터의 경우 특정한 벡터 시스템이 존재하는 것이 아니라 기존에 사용되어온 동물세포발현벡터를 이용하여 항체유전자를 발현시키고 있으며, 현재 동물세포발현벡터로서 많이 사용되는 시스템은 pCDNA(인비트로젠사, 미국)벡터시스템으로서 각종 단백질 유전자를 클로닝하여 동물세포에서 발현시키고 있다. 그러나, 상기의 pCDNA 벡터시스템(인비트로젠사, 미국)의 경우 여러 단계의 클로닝을 거치고, 항체 유전자의 증폭을 위한 dhfr 유전자를 경쇄 또는 중쇄 발현벡터 내에 삽입시켜야 하는 문제점을 갖고 있다.

또한, 동물세포발현벡터를 이용하여 항체 유전자를 발현시키기 위해서는 경쇄 및 중쇄 유전자를 각각 발현시키기 위한 2종류의 발현벡터가 필요하며, 생명공학연구소에서 개발한 발현벡터 pKCdhfr의 경우, 항체 유전자의 증폭에 필요한 dhfr 유전자를 경쇄가 포함된 발현벡터에 삽입하여 제조하고, 또한 경쇄와 dhfr 유전자만 제외하면 동일하게 구성되어 있는 중쇄가 삽입된 발현벡터를 제조(J. Medical Virology 52:226-233, 1997)하였다.

그러나, 상기의 pKCdhfr 경쇄 발현벡터의 경우, 동일한 벡터 내에 SV40프로모터 및 벡터복제를 위한 복제기점(origin of replication, ORI), 그리고 전사의 종료를 위하여 사용되는 폴리에이(폴리아데닌, polyadenylation, poly A) 서열을 삽입하기 위해 동일한 SV40 바이러스의 유전자를 사용하여야 하는데, 이는 벡터내에서 자체적으로 재조합 등이 발생할 수 있는 단점을 갖고 있다.

최근 개발된 동물세포발현벡터 pMG(인비보젠사, 미국)는 동일 벡터 내에 2개의 다클로닝 염기서열(multi cloning site, MCS)을 포함하고 있어 항체 등과 같이 2개 이상의 단위체(subunit)로 구성된 단백질의 발현에 적합한 벡터시스템이다. 그러나, 이러한 벡터시스템을 이용하여 항체 유전자를 클로닝할 경우, 새로운 치료용 항체 개발에 있어서 클로닝 작업에 장기간의 연구기간이 소요되며, 항체 유전자의 증폭을 위해서는 dhfr 유전자를 외부벡터로부터 삽입하여야 하는 단점을 내포하고 있다.

따라서, 다양한 치료용 항체 개발을 위하여 다양한 가변지역 유전자 후보군을 벡터에 직접 삽입하여 가변영역-불변영역이 연결된 전체 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있는 새로운 발현벡터 시스템의 개발이 필요하다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 연구를 거듭한 결과, 경쇄 카파 가변영역을 코딩하는 유전자의 연결지역(joining region)에 공통적으로 존재하는 제한효소 부위(restriction site) 및 경쇄 카파 불변영역을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 개발하였으며, 본 발명의 발현벡터는 가변영역을 코딩하는 유전자를 직접 카세트 형식으로 클로닝하여 경쇄 카파 전체 유전자를 생산할 수 있으므로 다양한 치료용 항체 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 3의 염기서열을 프로모터의 하위에 가지는 경쇄 카파 발현 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

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본 발명은 경쇄 카파 가변영역을 코딩하는 유전자의 연결지역(joining region)에 공통적으로 존재하는 제한효소 부위(restriction site) 및 경쇄 카파 불변영역을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.

본 발명자들은 다양한 인간 항체의 가변영역을 코딩하는 유전자 및 불변영역을 코딩하는 유전자를 분석하였다. 그 결과, 경쇄 카파(κ)의 경우 그 가변영역을 코딩하는 유전자 말단의 연결지역이 제한효소 BsiW I 인지서열(CGTACG)을 공통적으로 포함하는 것을 발견하였다.
따라서 본 발명의 일태양에 따라, 서열번호 3의 염기서열을 프로모터 하위에 포함하는 발현 벡터가 제공되며, 바람직하게는 도 1의 유전자 지도를 가지는 발현 벡터가 제공된다. 본 발명의 발현 벡터는 BsiW I 제한효소 부위(restriction site)에 항체의 경쇄 카파 가변영역을 코딩하는 유전자가 효과적으로 도입될 수 있다.

본 발명에 따른 경쇄 카파 가변영역 발현벡터는 pCDNA(인비트로젠사, 미국)로부터 제한효소 BsiW I 부위를 제거하고, 여기에 BsiW I 인지서열을 포함하는 유전자 서열 및 항체의 경쇄 카파 불변영역을 코딩하는 유전자를 도입하여 제조할 수 있다. 상기 발현벡터는 프로모터로서 씨엠브이(CMV) 프로모터를 상위(upstream)에 포함하며, 비지에치 폴리에이((BGH 폴리아데닌, BGH polyadenylation, BGH poly A)를 하위(downstream)에 포함한다. 또한, dhfr(dehydrofolate reductase) 유전자를 삽입시켜 유전자의 증폭이 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포가 제공되며, 바람직하게는 E.coli XL1-Blue/pHAB-KC (수탁번호 : KCTC 10230BP)인 숙주세포가 제공된다.
상기 본 발명에 따른 발현벡터는 경쇄 카파 가변영역을 코딩하는 유전자를 상기 제한효소 부위에 직접 카세트 형식으로 삽입(클로닝)하므로서 가변영역 유전자와 불변영역 유전자가 연결된 경쇄 카파 전체 유전자를 생산할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이것이 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

삭제

실시예

실시예 1. 인간 항체 경쇄 염기서열 분석

인간 항체 경쇄 카파 아미노산 및 염기서열을 분석한 결과(NIH 91, 3242, 1991), 표 1과 같이 연결지역(joining region, JR)과 불변지역 시작위치에 제한효소 인지서열(CGTACG)인 BsiW I이 공통적으로 존재하는 것을 발견하였다.

경쇄 카파 가변영역을 코딩하는 유전자 말단의 연결지역(JK) 및 불변영역을 코딩하는 유전자의 시작위치(CK)

	아미노산 서열	염기 서열
JK1/CK1	--KRTV	---AAA CGT ACG GTG
JK2/CK1	--KRTV	---AAA CGT ACG GTG
JK3/CK1	--KRTV	---AAA CGT ACG GTG
JK4/CK1	--KRTV	---AAA CGT ACG GTG
JK5/CK1	--KRTV	---AAA CGT ACG GTG

실시예 2. 경쇄 연결 프라이머의 합성

상기 실시예 1에서 발견한 제한효소 인지서열을 이용하기 위하여 표 2과 같은 프라이머(primer)들을 합성하였다. 프라이머의 합성은 ABI DNA/RNA 합성기(synthesizer)를 이용하여 합성하였다.

합성 프라이머

서열번호	프라이머명	위치	염기서열
1	KCF	경쇄카파시작	AAACGT ACGGTG GCT GCA CCA TCT G
2	KACT	경쇄카파종결	T CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT CTT TG

실시예 3. 경쇄 카파 불변유전자의 클로닝

단계1. 전체 mRNA 추출

정상 사람 혈액을 원심분리하여 림프구들을 회수하고, 패스트트랙 (FastTrack) 2.0 mRNA 아이솔레이션 키트(isolation kit, 인비트로젠사, 미국)를 이용하여 회수된 림프구로부터 mRNA를 획득하였다. mRNA의 정량은 분광측광기 (spectrophotometer)를 사용하였으며, 260nm에서 흡광도를 측정하여 mRNA를 정량하였다.

단계2. 전체 cDNA 의 합성

전체 cDNA의 합성은 써모트랜스크립트 키트(Thermotranscript Kit, GibcoBRL사, 미국)를 사용하였다. 우선, 0.5㎍ mRNA를 올리고 디티(oligo dT) 또는 유전자특이 프라이머(Gene specific primer)인 서열번호 2(KACT)와 함께 섞은 후(이때, 전체부피는 10㎕이다.) 65℃에서 약 5분간 변성(denaturation)시키고 프라이머 어닐링(primer annealing) 시킨다. cDNA 합성은 역전사 효소(reverse transcriptase, 1㎕)를 이용하여 완충액(5㎕), 디티티(DTT, 0.1M, 2.5㎕), 디엔티피(dNTP, 2.5㎕), RNA 분해효소 억제제(RNase inhibitor, 1㎕), 및 멸균2차증류수 사용 조건하(이때, 전체 부피는 25㎕이다.)에서 50℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 95℃에서 5분간 불활성화 시켰다.

단계3. 경쇄 카파 불변유전자의 PCR 증폭

cDNA를 이용하여 경쇄 카파 불변유전자를 증폭하기 위하여 3㎕ cDNA와 표 2의 프라이머(primer)들을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였으며, 94℃에서 1분 30초, 55℃ 2분, 72℃ 3분의 반응조건으로 30회를 수행하여 약 350bp의 경쇄 카파 불변유전자 단편이 증폭된 것을 아가로즈 전기영동을 통하여 확인하였다.

단계4. 경쇄 카파 불변유전자의 PCR 벡터로의 클로닝

1.5% 아가로스 젤 전기영동을 수행한 후 QIAgen 익스트렉션 키트(extraction kit, Qiagen사, 미국)를 이용하여 회수한 350bp 유전자 단편에 페놀(200㎕) 및 클로로포름(200㎕)을 가하여 불순물을 제거하고, 에탄올(2.5ml)을 가하여 정제하였다. 정제된 유전자 단편을 pCRII 벡터(인비트로젠사, 미국)에 서브클로닝한 후, 대장균 XL1-Blue를 형질전환시켜 (Cohen, S. N. et al,. Proc. Natl. Acad. Sci. 69, 2110, 1972) 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 100㎍/㎖의 암피실린이 함유된 엘비(luria-bertani, LB)배지에서 하룻밤 배양한 뒤 플라스미드를 회수하였다. 회수한 플라스미드를 제한효소 EcoR I (바이오렙사, 미국)으로 절단하여 상기 유전자 단편이 존재함을 확인하였다. 또한, 서열분석 결과 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 가짐을 확인하였다. 상기에서 얻은 플라스미드를 pCR-KC로 명명하였다.

실시예 4. 경쇄 카파 발현벡터의 클로닝

단계1. Neo가 제거된 pCDNA3.1A 벡터의 개발

pCDNA3.1A 벡터(인비트로젠사, 미국)를 제한효소 Pvu II로 37℃에서 2시간동안 반응시켜 네오마이신(Neomycin) 저항성 유전자 발현시스템(SV40 promoter, ori, Neomycin, SV40 poly A) 유전자(이하,'Neo'라 한다)를 전체 벡터 유전자로부터 절단하고, 이를 1.0% 전기영동을 통하여 확인하여, Neo가 제거된 약 3.5Kb의 벡터 유전자만을 분리하였다. 상기에서 분리한 Neo가 제거된 벡터 조각을 셀프-라이게이션 (self-ligation) 하기 위하여 T4-DNA 연결효소(ligase) 1 unit을 넣고 16℃에서 하룻밤 방치하여 잘려진 벡터 말단을 연결시켰다. 상기 실시예 3의 단계4와 동일한 방법으로 대장균 XL1-Blue를 형질전환시켜 (Cohen, S. N. et al,. Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 2110, 1972) 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 100㎍/㎖의 암피실린이 함유된 엘비(luria-bertani, LB)배지에서 하룻밤 배양한 뒤 플라스미드를 회수하였다. 상기 회수된 플라스미드를 제한효소 Pvu II(바이오렙사, 미국)로 절단하고 아가로스 전기영동을 이용하여 Neo 유전자가 제거되었음을 확인하였다.

단계2. Neo가 제거된 pCDNA3.1A 벡터내로 dhfr 유전자의 삽입

단계1에서 개발된 벡터를 제한효소 HindIII/PvuI(바이오렙스, 미국)으로 절단하여 CMV 프로모터 및 암피실린 유전자 일부가 제거된 약 2Kb 의 유전자 단편을 회수하였다.또한, pKCdhfr 동물세포발현벡터(J. Medical Virology 52:226-233, 1997 )를 제한효소 HindIII/PvuI으로 절단하여 CMV 프로모터, dhfr 증폭유전자, 그리고 암피실린 저항성유전자 일부가 포함된 약 3Kb의 유전자 단편을 회수하였다. 상기에서 각각 회수된 약 2Kb의 유전자 단편과 약 3Kb 유전자 단편을 상기의 T4-DNA 연결효소(ligase)를 이용하여 연결시킨 후, 상기 실시예 3의 단계4와 동일한 방법으로 대장균 XL1-Blue를 형질전환시켜 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 암피실린이 포함된 배지에서 하룻밤 배양하여 플라스미드를 회수하였다. 회수한 플라스미드를 제한효소 HindIII/PvuI으로 절단하고, 아가로스 전기영동을 이용하여 약 2kb 및 약 3kb의 유전자 단편이 삽입되었음을 확인하였다. 상기 회수된 플라스미드를 pCDNA-dhfr 벡터로 명명하였다.

단계3. pHAB-KC 발현벡터의 개발

단계2에서 개발된 pCDNA-dhfr 벡터내에 상기 실시예 3에서 얻은 경쇄 카파 불변유전자를 삽입하기 위하여, pCDNA-dhfr 벡터를 제한효소 HindIII/NotI(바이오렙스, 미국)으로 절단하였다. 또한, 경쇄 카파 불변유전자가 삽입된 pCR-KC 벡터를 HindIII/NotI으로 절단하여 경쇄 카파 불변유전자만 회수한 다음, pCDNA-dhfr 벡터의 HindIII/NotI 제한효소 인지서열로 삽입하였다. 상기 실시예 3의 단계4와 동일한 방법으로 대장균 XL1-Blue를 형질전환하여 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체로부터 플라스미드를 회수하여, 제한효소 HindIII/NotI으로 절단한 후, 전기영동을 통하여 서열번호 3의 제한효소 부위를 포함하는 경쇄 카파 불변유전자가 삽입되었음을 확인하고, 상기 얻어진 형질전환체를 2002년 4월 18일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 E. coli XL1-Blue/pHAB-KC (수탁번호 : KCTC10230BP)로 기탁하였다.

본 발명에 따른 발현벡터는 다양한 항체의 경쇄 카파 가변영역 유전자를 직접 카세트 형식으로 삽입하여 경쇄 카파 전체 유전자를 효율적으로 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 발현벡터는 다양한 치료용 항체 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> YUHAN CORPORATION <120> THE LIGHT CHAIN EXPRESSION VECTOR FOR DEVELOPING THERAPEUTIC ANTIBODY <130> YU200207 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aaacgtacgg tggctgcacc atctg 25 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tctaacactc tcccctgttg aagctctttg 30 <210> 3 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa 60 tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta 120 cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag 180 gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa agcagactac 240 gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca 300 aagagcttca acaggggaga gtgttag 327 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 1 5 10 15 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 20 25 30 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 35 40 45 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 50 55 60 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 65 70 75 80 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 85 90 95 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims

항체 발현벡터에 있어서, 서열번호 3의 염기서열을 프로모터의 하위에 가지는 발현 벡터.
제1항에 있어서, dhfr (dehydrofolate reductase) 유전자를 더욱 포함하는 경쇄 카파 가변영역 발현 벡터.
제1항에 있어서, 도 1의 유전자 지도를 가지는 발현 벡터.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
제4항에 있어서, E. coli XL1-Blue/pHAB-KC (수탁번호 : KCTC10230BP)인 숙주세포.
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