KR100597699B1

KR100597699B1 - 면역원성이 증강된 ｄｎａ 백신 조성물

Info

Publication number: KR100597699B1
Application number: KR1020040006347A
Authority: KR
Inventors: 박기석; 박수형; 양세환; 이창근; 최소영; 류성호; 김윤동; 성영철
Original assignee: 학교법인 포항공과대학교; 주식회사 제넥신
Priority date: 2003-01-30
Filing date: 2004-01-30
Publication date: 2006-07-07
Anticipated expiration: 2024-01-30
Also published as: WO2004067020A1; US20070053923A1; KR20040070099A

Abstract

본원에는 펩타이드 면역증강제(adjuvant) 및 면역원성 단백질을 코딩하는 DNA 백신을 포함하는 백신 조성물이 기술되어 있다. 또한, 상기한 백신 조성물을 투여하여 면역반응을 증강시키는 방법이 기술되어 있다.

백신 조성물, 펩타이드 면역증강제, DNA 백신, Y 펩타이드(WKYMV-d-M-NH2)

Description

면역원성이 증강된 ＤＮＡ 백신 조성물{DNA vaccine composition with enhanced immunogenicity}

도 1은 HIV DNA 백신을 Y 펩타이드와 함께 투여한 경우의 면역 반응을 나타내는 그래프이다.

도 2는 HIV DNA 백신을 Y 펩타이드 단독, 인플루엔자 NP 유전자 DNA 단독 또는 이들 모두와 함께 투여한 경우의 면역 반응을 나타내는 그래프이다.

본 발명은 DNA 백신 조성물에 관한 것으로서, 특히 펩타이드 면역증강제(adjuvant)를 면역원성 단백질을 코딩하는 DNA 백신과 함께 포함하여 면역반응을 증강시킨 백신 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기한 백신 조성물을 투여하여 면역반응을 증강시키는 방법에 관한 것이다.

바이러스, 세균, 기생체 또는 종양 항원을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 벡터는 숙주세포에서 주입된 후 각각의 항원을 발현하며, 이러한 노출된(naked) DNA 벡터를 폴리뉴클레오타이드 백신(PNV) 또는 DNA 백신이라 한다. 단백질 또는 펩타이드를 기초로 하는 서브유닛 백신에 비해, DNA 백신은 항원 특이적인 체액성 면역 반응 외에도 세포성 면역반응, 특히 강력한 Th1 및 CTL 반응을 일으킬 수 있으며 안전하고 제작이 용이하며 경제적인 여러 가지 장점들로 인해 기존의 재조합 단백질 백신 (recombinant protein vaccine)이나 재조합 바이러스 벡터 백신 (recombinant viral vector vaccine)의 대안으로 각광을 받고 있다. 종래의 백신은 주로 체액성 면역 반응을 유도하는 경우가 많으며 이런 경우 세포 내부로 침투하는 바이러스에 대한 면역 반응이 효과적이지 못하는 단점이 있었다.

그러나, 기존의 백신에 대한 많은 장점에도 불구하고 DNA 백신이 실제 사람에게서 사용되기 위해서는 개선되어야 할 여지가 남아 있다. DNA 백신은 재조합 바이러스 백신보다 상대적으로 낮은 면역 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다 (Donnelly JJ, Ulmer JB, Shiver JW and Liu MA. DNA vaccines. Annu Rev Immunol 1997, 15:617-48; Leitner WW, Ying H and Restifo NP. DNA and RNA-based vaccines: principles, progress and prospects. Vaccine 1999, 18:765-77). 또한, 지금까지 DNA 백신만으로는 특정 질병의 발생을 완전히 예방할 수 있다는 보고가 없다. 이런 이유로 해서 DNA 백신의 효능을 높이기 위한 많은 노력들이 진행되어 왔다 (Rodriguez F and Whitton JL. Enhancing DNA immunization. Virology 2000, 268:233-8; Schneider J, Gilbert SC, Blanchard TJ, et al. Enhanced immunogenicity for CD8+ T cell induction and complete protective efficacy of malaria DNA vaccination by boosting with modified vaccinia virus Ankara. Nat Med 1998, 4:397-402).

DNA 백신을 이용하는 다양한 시도들을 다음과 같이 구분지울 수 있다:

한 가지 접근 방법은 DNA로부터 발현량을 증가시키거나, APC나 근육 세포에 DNA가 보다 더 잘 트랜스펙션(trnasfection) 될 수 있게 해주는 방법으로 항원의 양을 증가시켜주는 방법이다. 발현량을 증가시키기 위해 새로운 프로모터나 전사를 증가시켜 주는 유전적 요소들을 사용하거나, 코돈 최적화 방법을 사용하기도 한다 (Rodriguez F and Whitton JL. Enhancing DNA immunization. Virology 2000, 268:233-8; Uchijima M, Yoshida A, Nagata T, Koide Y. Optimization of codon usage of plasmid DNA vaccine is required for the effective MHC class I-restricted T cell responses against an intracellular bacterium. J Immunol 1998, 161:5594-9; Deml L, Bojak A, Steck S et al. Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein. J Virol 2001, 75:10991-1001). APC나 근육 세포에 트랜스펙션 정도를 높이기 위해서 다양한 트랜스펙턴트들을 사용하거나 APC와의 만날 확률을 높이기 위해 림프 기관에 직접 DNA 백신을 접종하는 방법들도 시도된 적이 있다 (Rodriguez F and Whitton JL. Enhancing DNA immunization. Virology 2000, 268:233-8; Perrie Y, Frederik PM, Gregoriadis G. Liposome-mediated DNA vaccination: the effect of vesicle composition. Vaccine. 2001, 19:3301-10; Maloy KJ, Erdmann I, Basch V et al. Liposome-mediated DNA vaccination: the effect of vesicle composition. Vaccine. 2001, 19:3301-10).

두 번째 접근 방법은 항원을 변형(modification)시켜서 면역원성을 증가시키는 방법이다. 항원들이 세포 내에서 분해 정도를 높이고, MHC 분자에 더 용이하게 접근하게 해주거나, 파상풍균 독소(tetanus toxin)의 무독성C (FrC) 단편 등을 항원과 함께 융합 단백질의 형태로 만들어 주는 방법들이다. LIMP-II (lysosomal integral membrane protein II)의 사이토졸 부분 또는 유비퀴틴(ubiquitin)을 항원에 붙여 주어서 프로테오좀(proteasome) 또는 리소좀(lysosome)으로 항원이 잘 가게 해줌으로써 MHC 분자에 의한 에피토프의 제시를 증가시키게 된다 (Rodriguez F and Whitton JL. Enhancing DNA immunization. Virology 2000, 268:233-8: Anderson R, Gao XM, Papakonstantinopoulou A, Fairweather N, Roberts M, Dougan G. Immunization of mice with DNA encoding fragment C of tetanus toxin. Vaccine 1997, 15:827-9; Zhu D, Rice J, Savelyeva N, Stevenson FK. DNA fusion vaccines against B-cell tumors. Trends Mol Med 2001, 7:566-72).

세 번째 접근 방법은 화학 물질을 사용하여 DNA 백신의 효능을 증가시키고자 하는 시도들이다. 알룸(Alum), 박스펙틴(vaxfectin) 또는 모노포스포릴 지질(monophosphoryl lipid: MPL) A 등을 DNA 백신과 섞어서 접종함으로써, 면역 반응을 높이는 방법을 들 수 있다 (Wang S, Liu X, Fisher K et al. Enhanced type I immune response to a hepatitis B DNA vaccine by formulation with calcium- or aluminum phosphate. Vaccine 2000, 18:1227-35; Hartikka J, Bozoukova V, Ferrari M et al. Vaxfectin enhances the humoral immune response to plasmid DNA-encoded antigens. Vaccine 2001; 19:1911-23; Lodmell DL, Ray NB, Ulrich JT, Ewalt LC. DNA vaccination of mice against rabies virus: effects of the route of vaccination and the adjuvant monophosphoryl lipid A (MPL). Vaccine 2000, 18:1059-66).

마지막으로, 면역증강제(adjuvant)로써 사이토킨, 케모킨 또는 공동-자극 분자 (co-stimulatory molecule)등을 발현하는 DNA를 DNA 백신과 함께 접종하는 방식은 간편하게 DNA 백신의 효능을 증강시킬 수 있는 방법이다 (Scheerlinck JY. Genetic adjuvants for DNA vaccines. Vaccine 2001; 19:2647-56). 최근에 IL-12 유전자를 변형시켜 얻어진 마우스 IL-12 N220L의 경우에는 HCV E2 DNA 백신에 사용하였을 때, 지속적인 장기 CD8⁺ T 림프구 기억 반응(long-term CD8⁺ memory response)을 유도하였다 (Ha SJ, Chang J, Song MK et al. Engineering N-glycosylation mutations in IL-12 enhances sustained cytotoxic T lymphocyte responses for DNA immunization. Nat Biotechnol 2002; 20:381-6).

상기한 바와 같은 노력에도 불구하고, 여전히 보다 증강된 면역반응을 유도하기 위한 연구가 진행되고 있다.

본 발명자들은 상기 언급된 DNA 백신의 면역원성을 개선시키기 위하여 노력 하던 중 기존 DNA 백신에 펩타이드를 면역증강제(adjuvant)로 제공하였을 때 면역반응이 증강되며, 또한 인플루엔자 NP(necleoprotein) 유전자를 펩타이드 면역증강제와 함께 투여하였을 때 면역반응이 더욱 증강된다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

발명의 요지

본 발명은 펩타이드 면역증강제(adjuvant) 및 면역원성 단백질을 코딩하는 DNA 백신을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

상기 DNA 백신은 바람직하게는 DNA 플라스미드 형태이며, 바이러스, 세균, 기생체 및 진균 기원의 면역원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역원에 대한 것이고, 보다 바람직하게는 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 감염 질환, 단순 포진 바이러스(HSV) 감염 질환, 인플루엔자 바이러스 감염 질환, A형 간염, B형 간염, 파필로마 바이러스 감염 질환, 결핵, 종양 성장, 자가면역 및 알러지중에서 선택된 질환에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 면역원에 대한 것이며, 더욱 바람직하게는 HIV의 면역원에 대한 것이다.

상기 펩타이드 면역증강제는 바람직하게는 2 내지 30개, 보다 바람직하게는 4 내지 10개, 더욱 바람직하게는 6개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이며, 보다 바람직하게는 6번째 잔기인 메티오닌은 D형으로 치환되었으며 C 말단은 -COOH 대신 -NH₂로 치환된 Y펩타이드인, WKYMV-d-M-NH이다.

상기 조성물은 바람직하게는 추가로 인플루엔자 바이러스의 유전자를 포함할 수 있으며, 인플루엔자 바이러스의 유전자는 플라스미드에 삽입된 형태가 바람직하고, 인플루엔자 바이러스의 유전자는 뉴라미니다제를 코딩하는 유전자가 바람직하다.

또한, 본 발명은 펩타이드 면역증강제(adjuvant) 및 면역원성 단백질을 코딩하는 DNA 백신을 포함하는 백신 조성물을 투여하여 면역반응을 증강시키는 방법에 관한 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 펩타이드 면역증강제(adjuvant) 및 면역원성 단백질을 코딩하는 DNA 백신을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 "면역원성(immunogenic)"이란 체액성 면역, 세포성 면역, 이들을 모두 유도할 수 있는 능력을 의미한다. 면역원성은 면역반응을 유도할 수 있는 물질인 "면역원(immunogen)"의 특성과 주입한 동물의 면역원에 반응하는 능력에 의존하며, 면역원 접촉 후 T세포, NK세포, B세포, 대식세포 등의 증식과 성숙이 유도되며 인터루킨-1 인터페론-γ 등의 사이토카인이 생성된다. 그러므로 면역원 접촉 후 사이토카인이 증가한 정도를 측정하면 면역원성을 확인할 수 있다. 면역원이 보이는 반응의 크기 및 반응이 관찰된 개체의 비율에 기초하여 우수한 예방적, 치료적 효과를 가지는 백신으로 사용될 수 있는지 여부를 판단 할 수 있다. 본 발명에서는 구체적으로 IFN-γ ELISPOT 검정법을 통해서 면역반응의 정도를 측정하였 다. 그러나 본 명세서의 방법에 한정되지 않고 다양한 응용과 활용이 가능하다. 예를 들어, 체액성 면역 반응은 단방사 면역 확산 분석법(SRID), 효소 면역 분석(EIA), 또한 적혈구응집억제분석(HAI)등에 의해 분석할 수 있고, 세포성 면역반응을 측정하기 위해서는 지연성 과민성 측정이나 또는 목적 항원에 대한 임파세포의 증식 반응 측정 등을 통하여 분석할 수 있다.

본 명세서에서 DNA 백신은 하나 이상의 면역원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 다양한 재조합 벡터, 예를 들어 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 등의 형태를 취할 수 있으며, 플라스미드 벡터가 바람직하다. 본 명세서에서 벡터는 DNA 단편이 숙주 세포로 도입되기 위한 수단을 의미하며, 이러한 벡터는 형질 발현에 관련된 기본적 구성요소, 프로모터, 구조유전자, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널 등을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 일반적으로 DNA 백신의 경우 생체내로의 전달 효율이 낮은 단점이 있으므로, 최적의 프로모터, 인핸서 등을 사용하여 목적 유전자의 발현을 증진시킬 필요가 있다. 진핵 세포에서 발현되는 백터의 제조에 유용한 프로모터의 예로는 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV), 예를 들면 HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰 로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV), 예를들면 CMV 조기 발현 프로모터(immediately early promoter), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 로우스 사코마 바이러스(RSV)프로모터 뿐만 아니라, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈, 사람 근육 크레아틴, 사람 메탈로티오네인 유래의 프로모터가 있으나 이것으로 제한되지는 않는다. 폴리 아데닐화 시스널의 예로는, SV40 폴리A 서열 및 LTR A 서열이 있으나 이것으로 제한되지는 않는다. 인핸서는 사람 액틴, 사람 미오신, 사람 헤모글로빈, 사람 근육 크레아틴과, CMV, RSV 및 EBV와 같은 바이러스성 인핸서를 포함하는 군에서 선택될 수 있으나 이것으로 제한되지 않는다. 또한, Kozak 영역과 같은 기타 영역을 유전자 작제물에 포함할 수 있다. CMV 바이러스의 초기 발현 프로모터와 인핸서 서열 및 SV40의 복제기점 및 폴리(A) 서열을 포함하는 발현 벡터가 바람직하며 본 발명에서는 상기 조건을 충족시키는 벡터로 pGX10을 사용하였다. 본 명세서에서 발현 벡터란 개체의 세포 내에 존재하는 경우 삽입물이 발현되도록 삽입물에 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 이러한 유전자 작제물인 발현 벡터를 제조 및 정제하기 위해 표준 재조합 DNA 기술을 이용할 수 있다. DNA 백신은 노출(naked)된 상태나, 리포좀, 예를 들어 레시틴 리포좀으로 패킹(packing)되거나 또는 콜로이달 골드 입자(colloidal gold particle)로 코팅되어 사용될 수 있다.

벡터에 삽입되는 유전자는 이의 발현물이 면역반응을 유도하는 항원으로 작용하여 면역원이 될 수 있는 다양한 유전자를 포함할 수 있다. 둘 이상의 항원을 코딩하고자 할 경우, 단일 유전자 발현 기구, 즉 하나의 프로모터에 여러 구조 유 전자를 연속적으로 배치하여 융합된 하이브리드 형태로 제조할 수도 있고, 단일 벡터에 다중 프로모터 시스템을 이용하여 각 유전자가 각각의 프로모터 시스템에서 독립적으로 발현되고 조절되도록 할 수도 있다. 그리고 발현되는 항원성 폴리펩타이드의 유전자는 하나 이상의 결실, 삽입, 치환, 또는 그 밖의 변형에 의해 원래의 폴리펩타이드와 다른 아미노산 서열을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. 그러나 이런 변이체는 원래의 폴리펩타이드와 마찬가지로 체액성 면역 또는 세포성 면역을 자극하는 능력을 가져야 한다.

본 발명의 백신 조성물에 포함되는 DNA 백신은 바람직하게는 진핵 세포에서의 발현에 필요한 조절 성분들이 작동가능하게 연결된 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이는 DNA 플라스미드 형태일 수 있다. 이러한 DNA 백신은 바람직하게는 바이러스, 세균, 기생체, 진균 기원의 면역원을 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드이다. 상기한 기원의 면역원은 예를 들어 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 감염 질환, 단순 포진 바이러스(HSV) 감염 질환, 인플루엔자 바이러스 감염 질환, A형 간염, B형 간염, 파필로마 바이러스 감염 질환, 결핵, 종양 성장, 자가 면역, 알러지 등의 질환에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "면역증강제(adjuvant)"는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자 등을 말한다. 면역증강제는 항원의 표면적을 증가시키거나, 체내에서 항원의 정체를 연장시켜 림프 시스템이 항원에 접근할 수 있도록 하거나, 항원 방출을 지 연시키거나, 항원을 대식구에 표적화 시키거나, 대식구를 활성화시키는 등을 포함하는 다양한 메카니즘에 의해 작용하는 것으로 보고 되었다(H. S. Warren et al., Annu. Rev. Immunol,. 4:369(1986)). 전형적인 면역증강제에는 프로인드(Freund) 면역증강제 및 알루미늄 화합물(aluminum compound)이나 무라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide), 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide: LPS) 등이 알려져 있으며, 이러한 면역증강제는 단독으로도 사용되거나 기타 다른 제제와 함께 투여될 수 있다. 특히, 본 발명에서는 DNA 백신과 함께 사용하였을 때 면역반응을 증강시키는 펩타이드를 의미한다.

본 발명에 따라 사용되는 펩타이드 면역증강제는 바람직하게는 2 내지 30개, 보다 바람직하게는 3 내지 15개, 더욱 바람직하게는 4 내지 10개, 보다 더 바람직하게는 5 내지 7개, 가장 바람직하게는 6개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이다. 바람직하게는, 면역증강제는 면역강화능(immunoenhancing activity)이 종결되면 조직에서 제거될 수 있는 생분해 가능한 물질이다. 본 발명의 구체적 실시에서 예시된 펩타이드는 WKYMVM의 서열을 가지고 6번째 잔기인 메티오닌은 D형으로 치환되었으며 C 말단은 -COOH 대신 -NH₂로 치환된 Y펩타이드다(WKYMV-d-M-NH₂).

본 발명의 실시에 사용된 Y 펩타이드는 헥사펩타이드(hexapeptide)로서, 이러한 임의적인 서열을 가지는 헵사펩타이드는 면역 세포를 활성화시키는 것으로 알려졌다. 그중에서 XKYX(P/V)M, 특히 WKYMVM-NH₂ 또는 WKYMVm(WKYMV-d-M-NH₂)은 높은 활성을 가지며, 백일해 독소-민감성 G 단백질 결합된 수용체(pertussis toxin- sensitive G protein coupled receptor)와 결합하여 이에 의해 매개된 PLC 활성화로 세포내 칼슘(Ca²⁺)농도가 증가되고 포스포이노시타이드(phosphoinositide)의 가수분해를 자극하여 면역 세포를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. 최근 WKYMVM-NH₂, WKYMVm(WKYMV-d-M-NH₂)이 반응하는 수용체가 염증과 면역 반응에 중요한 역할을 하는 FPR(formyl peptide receptor), FPRL1((formyl peptide receptor-like1)인 것으로 알려졌고, FPR, FPRL1을 자극하여 케모탁시스(chemotaxis), 슈퍼옥사이드 발생(superoxide generation), 엑소시토시스(exocytosis)등 다양한 식세포 반응의 활성화를 유도한다고 밝혀졌다. 본 발명의 백신 조성물에 사용된 상기한 펩타이드 면역증강제는, DNA 백신과 함께 사용되어 이의 면역반응을 증강시킬 수 있는 한, 아미노산 서열 중 일부 아미노산이 구조적 및 기능적으로 유사한 아미노산에 의해 치환될 수 있으며, 또한 새로운 아미노산이 추가되거나 결실될 수 있다.

구체적으로, 본 발명자는 HIV DNA 백신(pGX10-GE) 및 합성 펩타이드인 WKYMVm(WKYMV-d-M-NH₂)를 함께 투여하고 비장세포를 이용하여 IFN-γ ELISPOT 검정을 수행하였다. 자극제로는 Gag의 경우는 Gag 펩타이드 푸울 (Gag peptide pool: 10개의 아미노산이 중복되게 Gag의 앞부분에서부터 20개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 합성 것)을 사용하고 Env의 경우에는 마우스 CD8⁺ T 세포 에피토프 (V3 펩타이드)를 사용하였다. Y 펩타이드를 함께 사용함으로써 면역 반응이 증강되고 사용되는 Y 펩타이드의 양에 따라 면역 반응이 영향을 받았다. 특히, 2 ug의 Y 펩 타이드를 사용하였을 때 가장 높은 면역 반응을 보였다. 대조군 pGX10-GE에 의해서 유도된 면역 반응과 비교하여 보았을 때, Env에 대한 면역 반응의 경우는 2 ug의 Y 펩타이드를 사용하였을 때 약 3.8배의 반응 증가를 유도하였다. 그 이상 10 ug의 Y 펩타이드를 사용하였을 때는 2 ug을 사용하였을 때 보다 오히려 면역 반응이 약간 감소하는 경향을 보였다. Y 펩타이드의 면역 증강 효과는 Gag에 대한 면역 반응에서 더 확실하게 나타났다. 30 ug의 pGX10-GE만을 접종하였을 때, Gag에 대한 IFN-γ ELISPOT 반응은 배경 보다 약간 높은 정도였다 (38 SFC/10⁶ 비장세포). 이렇게 낮은 면역 반응이 0.08 ug의 Y 펩타이드를 함께 사용하였을 때 약 3.8배 증가하고, 2 ug의 Y 펩타이드를 함께 접종하였을 때 최대 10배 정도 까지 증가하게 되었다. Gag에 대한 면역 반응의 경우에도 10 ug의 Y 펩타이드를 사용하였을 때는 2 ug을 사용한 경우보다 약간 감소하는 경향을 보였다.

본 발명의 면역증강 백신 조성물을 사용한 면역반응의 증강 효과를 확인하기 위해 이용한 ELISPOT 검정법은 사이토킨 분비 세포의 절대적 숫자 및 빈도를 검출하기 위한 고민감성 마이크로플레이트-기초 검정법으로서, 항원(사이토킨)-분비 세포를 사이토킨-특이적 포획 항체-코팅된 웰에서 인큐베이션하고, 항원(사이토킨)-분비 세포를 세척하여 고정된 항체에 의해 포획된 분비된 분석물(사이토킨)만을 잔류시키며, 포획된 분석물을 분석물-특이적인 바이오티닐화된 검출 항체와 인큐베이션하고, 이어서 알칼라인 포스파타제와 결합된 스트렙트아비딘과 인큐베이션하며, 여기에 기질을 첨가하고 착색된 스폿의 형성을 관측한다. 스폿의 형성이 많을수록 분석물, 즉 사이토킨의 분비가 많다는 것을 의미한다. 통상 이용되는 사이토킨은 감마-인터페론이며, 본 발명에서도 감마-인터페론을 ELISPOT에 의해 검출하였다. 이러한 감마-인터페론의 증가는 펩타이드를 면역증강제로 포함하는 본 발명의 백신 조성물이 Th1 형태의 면역반응을 효과적으로 증대시킨다는 것을 입증하는 것이다.

본 발명의 백신 조성물은 추가로 인플루엔자 바이러스의 유전자 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 인플루엔자 바이러스의 유전자는 바람직하게는 인플루엔자 NP(nucleoprotein) 유전자이다.

인플루엔자 NP 유전자는 인플루엔자 NP 단백질을 코딩하는 유전자 또는 이러한 유전자와 70%, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖고 NP 단백질의 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 이러한 유전자의 전체 또는 일부를 사용할 수 있다. 인플루엔자 NP 유전자의 일부를 사용할 경우에는 인플루엔자 NP 단백질의 N-말단의 50% 이상, 또는 C-말단의 50% 이상을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자가 이용될 수 있다.

상기한 인플루엔자 NP 유전자는 바람직하게는 발현 벡터, 특히 플라스미드에 삽입한 형태로 사용된다. 이러한 인플루엔자 NP 유전자 DNA가 삽입된 발현 벡터는 CMV 프로모터, RSV 프로모터, β-액틴 프로모터, SV40 프로모터 등으로부터 선택되는 프로모터 및 SV40 폴리(A) 및 BGH 터미네이트 중에서 선택되는 전사 터미네이트를 갖는 발현 벡터가 사용될 수 있다. 구체적 예시로서, 본 발명에서는 인플루엔자 NP 유전자를 pTV2 발현 벡터에 삽입하여 작제한 pTV-NP로부터 뉴라미니다제(neuraminidase: NA)에 해당하는 부위를 pGX10 벡터에 삽입하여 작제한 pGX-NP를 사용하였다. Env에 대한 면역 반응의 경우는, Y 펩타이드와 pGX10-NP을 각각 사용했을 때와 유효범위 내에서 비슷한 수준의 면역 반응을 얻었으나, Gag에 대한 면역 반응의 경우에는 Y 펩타이드와 pGX10-NP를 함께 사용하였을 때, 각각을 사용한 경우보다 증가된 면역 반응을 유도 하였다.

인플루엔자 바이러스 유전자는 DNA 백신 조성물과 혼합물로 투여하거나, 또는 DNA 백신 조성물과 동시에, 또는 시간차를 두고 전 또는 후에 투여될 수 있는 등 투여시간과 투여 방식은 여러 요인에 따라 자유롭게 적용할 수 있다. 그리고 발현벡터에 의해 발현된 인플루엔자 바이러스의 폴리펩타이드는 하나 이상의 결실, 삽입, 치환, 또는 그 밖의 변형에 의해 원래의 폴리펩타이드와 다른 아미노산 서열을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. 그러나 이런 변이체는 원래의 폴리펩타이드와 마찬가지로 체액성 면역 또는 세포성 면역을 자극하는 능력을 가져야 한다.

DNA 백신과 펩타이드 및 추가적으로 인플루엔자 바이러스 유전자를 포함하는 본 발명의 백신 조성물은 HIV, HSV, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, 파필로마 바이러스, 결핵, 종양 성장, 자가 면역 및 알러지를 포함한 다양한 질환에 대한 면역반응을 유도하여 이러한 질환을 예방하거나 치료하기 위한 약제 조성물로 제형될 수 있다.

백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합될 수 있다. 이러한 부형제는 물, 염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올, 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 백신 조성물은 추가의 보조 물질, 예를 들어 습윤제, 유화제, pH 완충 제 등을 포함할 수 있다. 상기와 같은 백신 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다.

투여 경로는 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 경구 투여, 국소 투여, 점막내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약제 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

투여량은 투여형태, 투여경로, 연령, 건강, 체중, 중증도, 현재 치료법의 종류, 치료 횟수 등에 따라 변화될 수 있으며, 백신이 투여되었을 때 발현되는 DNA의 양 또한 DNA 작제물에 사용된 전사 프로모터 등의 조절서열의 세기나 발현된 유전자 생성물의 면역원성에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 근육 조직에 직접 투여하는 경우, 면역학적 또는 예방학적으로 효과적인 양은 약 1㎍ 내지 5mg, 바람직하게는 약 10㎍ 내지 2mg이다.

본 발명의 백신 조성물은 단독 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여할 수 있고 병용 투여하는 경우, 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다. 이는 단지 예시하기 위한 것으로써 하기 실시예에 의해서 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아 니다.

실시예 1: DNA 백신의 제조

pGX10-GE: pGX10-GE는 HIV의 Gag와 Env를 발현하는 DNA 백신이다. HIV DNA 백신 벡터인 pTX-GE (Lee Ah et al. Vaccine 1999, 17: 773-9)를 제한 효소 MluI과 HpaI으로 자른 후, 7.5kb 단편을 pGX10 벡터 [기탁번호: KCTC 10212BP, 기탁기관: KCTC (Korean Collection for Type Cultures), 기탁일: 2002.03.29]를 제한 효소 MluI과 XbaI으로 자른 후 얻은 2.2kb의 단편과 결합하여 수득하였다.

pGX10-NP: pGX10-NP는 pTV-NP [기탁번호: KCTC 10193BP, 기탁기관: KCTC (Korean Collection for Type Cultures), 기탁일: 2002.02.27]를 제한 효소 NotI과 XbaI으로 자른 후, 1.5kb의 인플루엔자 바이러스 (A/PR/8/34) 뉴라미나다제 (neuraminidase: NA)에 해당하는 부위를 pGX10 벡터를 제한 효소 NotI과 XbaI로 자른 후에 결합하여 수득하였다 (약 5.1kb).

실시예 2: 펩타이드 면역증강제의 제조

Y 펩타이드 (WKYMV-d-M-NH₂)를 합성하였으며, Y펩타이드는 6번째 잔기인 메티오닌이 D형으로 치환되고 C 말단은 -COOH 대신 -NH₂로 치환된 펩타이드다. 그리고 IFN-γ ELISPOT 검정의 자극제로 사용한 V3 펩타이드 (RIQRGPGRAFVTIGK, HIV Env의 마우스 CD8⁺ T 세포 에피토프) 및 HIV Gag 펩타이드 푸울을 PEPTRON (www.peptron.com)에서 합성하였다. HIV Gag 펩타이드 푸울은 10 아미노산씩 중복되게 20 아미노산 길이의 펩타이드로 나누어 합성하였다.

실시예 3: 면역증강 실험

실험 1:

본 실험에 사용된 마우스는 BALB/c 마우스 (암컷)는 일본 SLC (Shizuoka, Japan)로부터 구입한 것이며, POSTECH의 동물 사육 시설의 병원균 비함유 조건에서 마우스 관련 실험을 수행하였다.

6 내지 8주된 마우스에 30 ug의 pGX10-GE와 Y 펩타이드 (각각 0, 0.08, 0.4, 2 및 10ug)를 100 ul의 PBS(phosphate-buffered saline)에 섞어서 근육 주사로 접종하였다. 6주 후, 같은 양의 pGX10-GE와 Y 펩타이드를 한번 더 접종하여 부스팅하였다. 부스팅한지 2주 후에 그룹 당 2마리의 마우스를 죽여 비장 세포를 얻고 이를 이용하여 IFN-γ ELISPOT 검정을 수행하였다.

IFN-γ ELISPOT 검정은 다음과 같이 수행하였다.

96-웰 여과 플레이트 (Millipore, cat. #: MAIPN4550)를 50 ul의 5 ug/ml 래트 항-마우스 IFN-γ 항체 (Pharmingen, Cat. No.554431)로 밤새 4℃에서 결합시켰다. 내용물을 제거하고 플레이트에 200 ul의 10%의 태아 소 혈청이 첨가된 DMEM (dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 넣고 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 완전 배지 (RPMI-1640, 10 % 태아 소 혈청, 2 mM L-글루타민, 50 uM β-머캅토에탄올, 100 U의 페니실린/ml, 100 ug의 스트렙토마이신/ml)에 비장세포를 1 내지 10x10⁷/ml이 되게 희석하고, 이를 각 웰에 100 ul씩 (1 내지 10×10⁶ splenocyte/well) 첨가하였다. 웰에 비장세포가 10⁶이 되지 않은 경우에는 백신을 접종하지 않은 생쥐의 비장세포(naive splenocyte)를 (50 ul) 첨가하여 10⁶ 비장세포가 되게 만들어 주었다. 그렇지 않은 경우는 완전 배지를 50 ul 첨가하였다. HIV Env의 경우에는 V3 펩타이드 (RIQRGPGRAFVTIGK)를 , HIV Gag의 경우에는 Gag 펩타이드 푸울을 50 ul의 완전 배지에 섞어 각 웰에 첨가하였다. 최종 펩타이드 농도는 각각의 펩타이드가 1 ug/ml이 되게 해주었다. 20 내지 24시간 동안 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 반응시킨 뒤, 내용물을 제거하였다. 수도물을 웰에 가득 채운 후, 상온에서 15분간 방치하였다. 수도물을 제거하고 PBST (PBS에 Tween-20을 0.1%가 되게 첨가)로 2번 세척하였다. 바오티닐화된 래트 항-마우스 IFN-γ 항체 (Pharmingen, Cat. No. 554410)를 2 % BSA (PBST중)에 2 ug/ml 농도로 희석하여 각 웰에 50 ul씩 첨가하고 랩으로 싸서 상온에서 3시간 동안 방치하였다. 다시 내용물을 제거하고 PBST로 4번 씻어준 후에, 2 % BSA (PBST중)에 1:2000으로 희석한 스트렙토아비딘-알카리 포스파타제 (Pharmingen, Cat. No.554065)을 각 웰 당 50 ul씩 첨가하였다. 렙으로 플레이트를 싸서 상온에 1시간 동안 방치한 후에, PBST로 8번 씻어주었다. 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트/니트로 블루 테트라졸륨 (BCIP/NBT)을 각 웰 당 50 ul씩 넣고 발색시킨 후, 적정한 정도의 스폿이 형성되면 수도물로 씻어서 반응을 중지시켰다. 플레이트를 말린 후, 자동 ELISPOT 판독기를 이용하여 생성된 스폿을 측정하였다. 측정 값에서 자극제를 넣지 않은 완전 배지에 대해 생성된 스폿의 수를 빼주었다. 값은 10⁶ 비장세포당 생성된 스폿을 생성하는 세포의 수 (SFC: Spot Forming Cell)로 나타내었다. 각 그룹의 값은 2마리 마우스의 비장세포를 섞어서 실험한 결과이며, 삼중으로 수행한 IFN-γ ELISPOT 값의 평균값(average)을 표시한 것이며, 에러 바는 표준편차를 나타낸 것이다.

그 결과가 도 1 및 표 1에 나타나 있다. Y 펩타이드가 pGX10-GE의 면역원성을 증가시키며, 2 ug의 Y 펩타이드를 사용하였을 때 가장 효과적으로 작용하는 것으로 나타났다. 도 1에 나타난 데이터에 대한 값을 표 1에 나타내었다:

	Env		Gag
Y 펩타이드(㎍)	평균	표준편차	평균	표준편차
10 2 0.4 0.08 0	617 1221 788 511 322	22 38 25 19 36	230 355 233 146 38	19 36 24 29 8

Y 펩타이드를 함께 사용하면 면역 반응이 증가하고 사용되는 Y 펩타이드의 양에 따라 면역 반응이 영향을 받음을 알 수 있다. 구체적으로, 2 ug의 Y 펩타이드를 사용하였을 때 가장 높은 면역 반응을 보였다. 대조군 GX10-GE에 의해서 유도된 면역 반응과 비교하여 보았을 때, Env에 대한 면역 반응의 경우는 2 ug의 Y 펩타이드를 사용하였을 때 약 3.8배의 반응 증가를 유도하였다. 그 이상 10 ug의 Y 펩타이드를 사용하였을 때는 2 ug을 사용하였을 때 보다 오히려 면역 반응이 약간 감소하는 경향을 보였다. Y 펩타이드의 면역 증강 효과는 Gag에 대한 면역 반응에서 더 확실하게 나타났다. 30 ug의 pGX10-GE만을 접종하였을 때, Gag에 대한 IFN-γ ELISPOT 반응은 배경 보다 약간 높은 정도였다(38 SFC/10⁶ 비장세포). 이렇게 낮은 면역 반응이 0.08 ug의 Y 펩타이드를 함께 사용하였을 때 약 3.8배 증가하고, 2 ug의 Y 펩타이드를 함께 접종하였을 때 최대 10배 정도 까지 증가하게 되었다. Gag에 대한 면역 반응의 경우에도 10 ug의 Y 펩타이드를 사용하였을 때는 2 ug을 사용한 경우보다 약간 감소하는 경향을 보였다.

실험 2:

Y 펩타이드와 pGX10-NP를 함께 사용하였을 때, 더욱 증가된 면역 반응을 얻을 수 있는지 알아 보았다. 6 내지 8주된 마우스에 아래 표 2에 표시된 백신들을 100 ul의 PBS에 섞어서 근육 주사로 접종하였다:

그룹	백신
I	pGX10-GE (30 ug) + pGX10-mock (20 ug)
II	pGX10-GE (30 ug) + pGX10-mock (20 ug) + Y 펩타이드 (2 ug)
III	pGX10-GE (30 ug) + pGX10-mock (10 ug) + pGX10-NP (10 ug)
IV	pGX10-GE (30 ug) + pGX10-mock (10 ug) + pGX10-NP (10 ug) + Y 펩타이드 (2 ug)

5주 후에, 그룹 당 2마리의 마우스를 죽여 비장세포를 얻어서 IFN-γ ELISPOT을 수행하였다. 그 결과가 도 2 및 표 3에 나타나 있다. Env에 대한 면역 반응의 경우는, Y 펩타이드와 pGX10-NP을 각각 사용했을 때와 유효범위 내에서 비슷한 수준의 면역 반응을 얻었으나, Gag에 대한 면역 반응의 경우에는 Y 펩타이드와 pGX10-NP를 함께 사용하였을 때, 각각을 사용한 경우보다 상당히 증가된 면역 반응을 유도하였다. 도 2에 나타난 데이터에 대한 값을 표 3에 나타내었다:

	면역 반응
	Env		Gag
	평균	표준편차	평균	표준편차
그룹 I 그룹 II 그룹 III 그룹 IV	133 263 348 304	16 76 46 17	23 43 96 135	6 11 22 14

본 발명에 따른 백신 조성물을 투여하여 면역반응을 유도함에 있어 펩타이드 면역증강제 단독 또는 펩타이드 면역증강제와 인플루엔자 NP 유전자 DNA를 함께 투여하여 면역반응을 증강시킴으로써 다양한 면역원에 대한 증강된 면역반응을 유도할 수 있어, 감염성 질환, 자가면역 질환, 암 등에 대한 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

(a) Y 펩타이드 WKYMV-d-M-NH₂ 및 (b) 면역원성 단백질을 코딩하는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 중에서 선택된 재조합 벡터인 DNA 백신을 포함하는 백신 조성물.
제1항에 있어서, DNA 백신이 DNA 플라스미드인 조성물.
제1항에 있어서, DNA 백신이 바이러스, 세균, 기생체 또는 진균 기원의 면역원에 대한 것인 조성물.
제3항에 있어서, DNA 백신이 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 감염 질환, 단순 포진 바이러스(HSV) 감염 질환, 인플루엔자 바이러스 감염 질환, A형 간염, B형 간염, 파필로마 바이러스 감염 질환, 결핵, 종양 성장, 자가면역 및 알러지중에서 선택된 질환에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 면역원에 대한 것인 조성물.
제4항에 있어서, DNA 백신이 HIV의 면역원에 대한 것인 조성물.
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제1항에 있어서, 인플루엔자 바이러스의 유전자를 추가로 포함하는 조성물.
제8항에 있어서, 인플루엔자 바이러스의 유전자가 플라스미드에 삽입된 형태인 조성물.
제9항에 있어서, 인플루엔자 바이러스의 유전자가 뉴라미니다제를 코딩하는 유전자인 조성물.