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KR100574684B1 - 암세포 성장 억제기능 및 세포주기 조절 기능을 가지는신규 시남알데하이드 유도체, 이의 제조방법 및 이를유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 - Google Patents

암세포 성장 억제기능 및 세포주기 조절 기능을 가지는신규 시남알데하이드 유도체, 이의 제조방법 및 이를유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 Download PDF

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KR100574684B1 KR1020030037198A KR20030037198A KR100574684B1 KR 100574684 B1 KR100574684 B1 KR 100574684B1 KR 1020030037198 A KR1020030037198 A KR 1020030037198A KR 20030037198 A KR20030037198 A KR 20030037198A KR 100574684 B1 KR100574684 B1 KR 100574684B1
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Abstract

본 발명은 암세포 성장 억제기능 및 세포주기 조절기능을 가지는 신규 시남알데하이드 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화합물은 분열하는 세포를 세포분열 주기중 G2/M기에 고정시킴으로써 세포주기를 조절하고, 이를 통해 암세포의 성장을 억제하는 활성을 가지고 있어 암세포 성장 억제제 또는 세포주기 조절제로 사용할 수 있다.
시남알데하이드, 세포주기 조절제, 암세포 성장 억제제

Description

암세포 성장 억제기능 및 세포주기 조절 기능을 가지는 신규 시남알데하이드 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물{CINNAMALDEHYDE DERIVATIVES INHIBITING GROWTH OF TUMOR CELL AND REGULATING CELL CYCLE, PREPARATIONS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS THEREOF}
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 암세포 성장 억제기능 및 세포주기 조절 기능을 가지는 신규 시남알데하이드 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
<화학식 1>
Figure 112003020653968-pat00001
(상기에서, R1, R1′, R2, R2′, R3 및 R3′은 하기에서 기재한 바와 같다)
신체를 구성하고 있는 세포들의 분열, 증식 및 분화는 생명 현상을 유지하는 기본이다. 정상적인 기능을 이루기 위해 세포의 증식 및 성장은 정교한 세포내 신호전달 체계에 의해서 조절되며, 이러한 일련의 과정은 세포가 외부로부터 받은 신호를 여러 단백질(PLC, PKC, Shc, Grb2, Raf, MAPK, MEK 등)과 분자 매개체(GTP, cAMP 등)를 통해 핵내의 세포 시계로 전달시킴으로써 이루어진다. 이러한 과정 중에서 어느 한 부분에 이상이 발생하게 되면 자체적인 조절 기작에 의해서 균형을 유지하기도 하지만 대부분의 경우에는 질병으로 발전하게 된다. 특히, 세포내 핵에서 일어나는 세포주기는 세포들의 생명유지를 조절하는 중요한 과정 중의 하나이다.
세포주기는 Gap1(G1), DNA 합성단계(S), Gap2(G2) 및 분열기(M)로 이루어진다. 상기 세포주기 이외에도 세포가 높은 밀도로 존재하거나, 낮은 농도의 성장 인자의 환경에서 장기간 방치되면, 세포는 휴면기라고 불리는 성장 멈춤(Go)상태로 들어가게 된다.
세포주기에는 체크 포인트(check point)라고 불리는 복잡한 네트워크가 있어서 세포 시계가 정확히 G1-S-G2-M의 순서로 진행되도록 유도해 준다. 이러한 체크 포인트의 조절 메커니즘에 장애가 발생되는 경우, 유전 물질의 불안정성을 증가시켜 조절되지 않은 세포 성장을 야기하게 되고, 암과 같은 무절제한 세포 성장을 유도하게 된다.
핵 외부로부터의 신호 전달과 영양 상태가 양호하면 G1기의 세포 크기가 커지고, 세포주기로 진입하게 해 준다. 세포주기 작동은 효모에서는 시작 시점(start point), 포유세포에서는 제한 시점(restriction point)라고 불리는 G1 체크 포인트에서 이루어진다. 이 지점을 지난 후 특별한 제동이 없으면 세포는 자동적으로 4단계의 세포주기를 거쳐서 자신의 게놈을 복제하고 분열하게 된다. 포유 세포에서의 이들 단계를 자세히 살펴보면 다음과 같다. 체크 포인트가 존재하는 G1기는 새로운 세포를 만들기 위한 준비 단계로서 이때에 성장인자와 충분한 영양이 공급되지 못하면 세포주기는 멈추게 되고 성장멈춤기인 Go 상태로 접어들게 된다. 그러나 충분한 영양이 공급되고 다양한 성장 인자들이 준비되면 세포 주기는 S단계로 진행되게 된다. 이 때에 세포는 자신의 게놈을 복제하여, 두 카피(copy)의 염색체를 만들 뿐만 아니라 두 세포로 분열되기 위해 세포질내의 여러 인자들이 복제된다. S기가 끝나면 세포는 제2의 체크 포인트로 알려진 G2 단계로 진입한다. 이 G2 기간 동안의 주요 메커니즘은 DNA 복제와 완성을 조절하며 분열기로의 진입을 준비한다. 그러므로 세포의 구성에 필요한 다양한 인자들이 이때에 생산된다. 두 세포로 분열되는데 필요한 인자들이 충분히 만들어진 후에 세포의 실질적 분열이 일어나는 분열기인 M기로 진행되며, M기는 시간적으로 가장 짧은 단계이다. 복제된 게놈이 세포의 양극으로 분리되어 두 개의 딸세포가 만들어지는 단계이기 때문이다. 이런 일련의 과정은 한 세포가 성장하여 두 세포로 분열되기 위해서 모든 세포가 거치는 과정이므로 세포의 생명유지에 매우 중요한 과정이다. 그러므로 세포주기의 연구와 이들을 조절하는 물질의 개발은 세포 성장 기작의 연구 및 세포주기 이상에서 발생하는 암의 예방제 또는 치료제 개발에 필수적이라 할 수 있다(Nature Review Cancer, 2001, 1, 222-231).
앞에서 언급한 것과 같이 포유 세포는 G1기에 존재하는 제1의 체크 포인트 또는 G2/M에 있는 제2의 체크 포인트를 조절함으로써 그 성장을 조절할 수 있다. 이러한 두 체크 포인트의 비정상적인 진행이 세포 노화나 암 등의 질병 발생과 연결된다. 이러한 체크 포인트에서 중요한 역할을 하는 것이 사이클린 D(cycline D; D1, D2, D3 등)들이다. 이들은 사이클린 의존형 키나제(cyclin dependent kinase, CDK; CDK2, CDK4, CDK6)에 결합하여 이들 효소의 활성을 조절하며, 인산화된 단백질의 인산기를 제거하는 CDC25 등이 세포주기 전체를 조절하는데 있어서 매우 중요한 역할을 하게 된다. 이러한 연구결과들을 바탕으로 다양한 세포주기 조절제들이 종양과 같은 난치성 질병 치료제로 개발되고 있다(Current Opinion in Chemical Biology, 2002, 6, 472-278).
이에 본 발명자들은 신규 시남알데하이드 유도체가 세포주기 중 G2/M기만을 선택적으로 저해하는 것을 밝히고, 본 발명의 시남알데하이드 유도체가 암을 포함하여 비정상적인 세포 성장을 나타내는 각종 질병에 대하여 암세포 성장 억제제 및 세포주기 조절제로 개발될 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 세포주기 중 G2/M기를 선택적으로 저해하여 암세포 등의 비정상적인 세포 성장을 억제하는 암 세포 성장 억제제 또는 세포주기 조절제로 사용될 수 있는 시남알데하이드 유도체 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 시남알데하이드 유도체를 제공한다.
Figure 112003020653968-pat00002
(상기에서 R1과 R1′은 같고, R2과 R2′는 같고, R3과 R3′은 같고, R1, R2 및 R3은 독립적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 벤질옥시, 아세틸옥시, 발러릴옥시, 벤조일옥시, C1∼C4 알킬, C1∼C4 알콕시, 헤테로사이클 또는 벤젠사이클이다)
상기 화학식 1의 바람직한 화합물은 하기와 같다.
1) 2,3-비스-벤질리덴숙신알데하이드
(2,3-bis-benzylidenesuccinaldehyde);
2) 2,3-비스-(2-플루오로벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(2-fluorobenzylidene) succinaldehyde);
3) 2,3-비스-(2-클로로벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(2-chlorobenzylidene)succinaldehyde);
4) 2,3-비스-(2-브로모벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(2-bromobenzylidene)succinaldehyde);
5) 2,3-비스-(2-메톡시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(2-methoxy-benzylidene)succinaldehyde);
6) 2,3-비스-(3-클로로벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(3-chloro-benzylidene)succinaldehyde);
7) 2,3-비스-(4-하이드록시-3-메톡시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(4-hydroxy-3-methoxybenzylidene)succinaldehyde);
8) 2,3-비스-(3,4-다이메톡시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(3,4-dimethoxybenzylidene)succinaldehyde);
9) 2,3-비스-(4-클로로벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(4-chloro-benzylidene)succinaldehyde);
10) 2,3-비스-(4-하이드록시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(4-hydroxy-benzylidene)succinaldehyde);
11) 2,3-비스-(4-메틸벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(4-methyl-benzylidene)succinaldehyde);
12) 2,3-비스-(4-메톡시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(4-methoxy-benzylidene)succinaldehyde);
13) 2,3-비스-(2-프로필옥시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(2-propyl-oxybenzylidene)succinaldehyde);
14) 2,3-비스-(2-알릴옥시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(2-allyloxy-benzylidene)succinaldehyde);
15) 2,3-비스-(2-아이소프로필옥시벤질리덴)숙신알데하이드
2,3-bis-(2-isopropyl-oxybenzylidene)succinaldehyde);
16) 2,3-비스-(2-벤질옥시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(2-benzyl-oxybenzylidene)succinaldehyde);
17) 2,3-비스-(2-(4-클로로벤질옥시)벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(2-(4-chlorobenzyloxy)benzylidene)succinaldehyde);
18) 2,3-비스-(2-(4-브로모벤질옥시)벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(2-(4-bromobenzyloxy)benzylidene)succinaldehyde);
19) 2,3-비스-(2-(4-나이트로벤질옥시)벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(2-(4-nitrobenzyloxy)benzylidene)succinaldehyde);
20) 2,3-비스-(3-프로필옥시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(3-propyloxy-benzylidene)succinaldehyde);
21) 2,3-비스-(3-아이소프로필옥시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(3-isopropyloxybenzylidene)succinaldehyde);
22) 2,3-비스-(3-벤질옥시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(3-benzyl-oxybenzylidene)succinaldehyde);
23) 2,3-비스-(3-메톡시-4-프로필옥시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(3-methoxy-4-propyloxybenzylidene)succinaldehyde);
24) 2,3-비스-(3-메톡시-4-아이소프로필옥시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(3-methoxy-4-isopropyloxybenzylidene)succinaldehyde);
25) 2,3-비스-(4-아세틸옥시-3-메톡시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(4-acetyloxy-3-methoxybenzylidene)succinaldehyde);
26) 2,3-비스-(4-발러릴옥시-3-메톡시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(4-valeryloxy-3-methoxybenzylidene)succinaldehyde);
27) 2,3-비스-(4-벤조일옥시-3-메톡시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(4-benzoyloxy-3-methoxybenzylidene)succinaldehyde);
28) 2,3-비스-(4-프로필옥시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(4-propyloxybenzylidene)succinaldehyde);
29) 2,3-비스-(4-아이소프로필옥시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(4-isopropyloxybenzylidene)succinaldehyde);
30) 2,3-비스-(4-발러릴옥시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(4-valeryl-oxybenzylidene)succinaldehyde);
31) 2,3-비스-(4-벤질옥시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(4-benzyloxy-benzylidene)succinaldehyde);
32) 2,3-비스-(4-벤조일옥시벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(4-benzoyl-oxybenzylidene)succinaldehyde);
33) 2,3-비스-(4-(2-플루오로벤조일옥시)벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(4-(2-fluorobenzoyloxy)benzylidene)succinaldehyde);
34) 2,3-비스-(4-(4브로모벤조일옥시)벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-bis-(4-(4-bromobenzoyloxy)benzylidene)succinaldehyde);및
35) 2,3-비스-(2-(N-메틸피페라진)벤질리덴)숙신알데하이드
(2,3-비스-(2-(N-methylpiperazine)benzylidene)succinaldehyde)
본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 세포 분열 주기에서 분열하는 세포를 G2/M기에 고정시킴으로써 세포주기를 조절하고, 이를 통해 암세포의 성장을 억제하는 활성을 가지고 있어 암세포 성장 억제제 또는 세포주기 조절제로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 시남알데하이드 유도체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 시남알데하이드 유도체를 제조하는 방법은 R1, R2 및 R3으로 치환된 벤즈알데하이드 화합물(I)의 선형 이량화반응(linear dimerization)으로 이루어진다. 구체적으로는 하기 반응식 1에서 나타난 바와 같이, 2,5-다이메톡시테트라하이로퓨란(2,3-dimethoxytetrahydrofuran), 포타슘 아세테이트(potassium acetate), 아세트산(acetic acid) 및 물의 존재하에서, R1, R2 및 R3으로 치환된 벤 즈알데하이드 화합물(I)을 선형 이량화반응시켜 본 발명에 따른 시남알데하이드 유도체(II)를 제조한다.
Figure 112003020653968-pat00003
(상기에서 R1, R2, R3, R1′, R2′및 R3′은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.)
또한, 상기 R1, R2 및 R3으로 치환된 벤즈알데하이드(benzaldehyde) 화합물(I)은 통상적으로 판매되는 화합물을 구입하여 사용할 수 있고, 또는 염기의 존재하에서 할로겐 또는 하이드록시와 같은 치환성이 높은 치환기로 치환된 벤즈알데하이드 화합물과 알킬레이션 시약을 반응시켜 수득할 수 있다.
또한, 상기 선형 이량화반응을 먼저 실시한 후, R1, R2, R3, R 1′, R2′또는 R3′치환기를 변형시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 시남알데하이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 암세포 성장 억제제 또는 세포주기 조절제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 화학식 1의 시남알데하이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의 약품제제의 형태로 사용될 수 있다.
상기 화학식 1의 시남알데하이드 유도체는 각종의 투여 경로를 통하여 유효한 양으로 투여할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 함께 함유한다. 보다 구체적으로, 약제학적으로 허용되는 담체로는 멸균용액, 정제, 코팅정 및 캡슐과 같은 공지된 제형들에 사용될 수 있는 표준의 약제학적 담체라면 어느 것이든 가능하다. 통상적으로 담체는 전분, 밀크, 당, 특정종류의 클레이, 젤라틴, 스테아린산, 탈크, 식물성 기름 또는 오일, 검, 글리콜류 등의 부형제 또는 기타 다른 공지의 부형제를 포함할 수 있으며 또한 풍미제, 색소 첨가제 및 다른 성분들이 포함될 수 있다. 본 발명의 시남알데하이드 유도체를 유효성분으로 함유한 조성물을 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상적인 방법으로 경구, 정맥내, 근육내, 경피 투여의 방법에 의해 투여할 수 있지만, 이들 방법에만 한정되는 것은 아니다. 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 또는 하나 이상의 화학식 1의 화합물에 하나 또는 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용한다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제가 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 시남알데하이드 유도체를 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화 한다.
본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율, 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 1 일에 1 회 내지 3 회 나누어 투여할 수 있으며 바람직하기로는 10∼20㎎/㎏, 더욱 바람직하게는 5∼10mg/kg의 농도로 투여되도록 제형화될 수 있다. 상기 제제의 정확한 양, 투여경로 및 횟수는 제제의 특성, 투여대상의 체중 및 상태, 그리고 사용하고자 하는 특정 유도체의 특성에 따라 다양하게 결정할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
2,3-비스-벤질리덴숙신알데하이드(2,3-bis-benzylidensuccinaldehyde)
Figure 112003020653968-pat00004
250㎖ 둥근 바닥 플라스크에 벤즈알데하이드(15.9㎖, 150mmol)를 넣고, 2,5-다이메톡시테트라하이드로퓨란(10㎖, 75mmol), 포타슘 아세테이트(10g, 100mmol), 아세트산(5㎖, 80mmol) 및 물 5㎖를 첨가한 후 12시간 동안 110℃에서 환류시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 냉각시키고, 물을 첨가하고 클로로포름100㎖로 3회 추출하였다. 모은 클로로포름층을 물로 3회 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 감압하에서 클로로포름을 제거하고, 얻어진 잔사를 컬럼크로마토그래피로 분리, 정제하여 노란색 결정인 표제 화합물을 수득율 10%로 합성하였다.
mp:109∼110℃;
Rf:0.5 (Hex:EA=6:4);
1H-NMR(CDCl3/TMS)(ppm): δ1.08(t, 6H, -CH3, J = 7.5 Hz), 1.86(m, 4H, -CH2-, J = 7.5 Hz), 3.96(m. 4H, CH2-, J = 6.6 Hz), 6.73∼7.44(m, 8H), 8.12(s, 2H, CH=C-), 9.66(s, 2H, CH=O)
<실시예 2∼12>
벤즈알데하이드 대신에 하기 표 1에서 기재되어 있는 R1, R2 및 R3 으로 치환 된 벤즈알데하이드를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
<실시예 13>
2,3-비스(2-프로필옥시벤질리덴)숙신알데하이드(2,3-bis(2-propyloxybenzyliden)succinaldehyde)
Figure 112003020653968-pat00005
(단계 1) 2-프로필옥시벤즈알데하이드(2-propyloxybenzaldehyde)
250㎖ 둥근바닥 플라스크에 2-하이드록시벤즈알데하이드(6.1g, 50mmol)를 넣고 아세토나이트릴 50㎖를 첨가하였다. 그리고 나서 포타슘 카보네이트(8.28g, 60 mmol)와 1-요오드프로판(9.35g, 55mmol)을 넣고 12시간 동안 85℃에서 환류시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 냉각시키고, 물을 첨가하고 클로로포름 100㎖로 3회 추출하였다. 모은 클로로포름층을 물로 3회 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 감압하에서 클로로포름을 제거하고, 얻어진 잔사를 컬럼크로마토그래피로 분리, 정제하였다. 프로필기의 결합 여부를 수소 NMR 스펙트럼을 통하여 확인한 후 다음 실험에 이용하였다.
(단계 2) 2,3-비스(2-프로필옥시벤질리덴)숙신알데하이드
250㎖ 둥근바닥 플라스크에 단계 1의 생성물인 2-프로필옥시벤즈알데하이드(5g, 30 mmol)를 넣고 2,5-다이메톡시테트라하이드로퓨란(2㎖, 15mmol), 포타슘 아세테이트 2g, 아세트산 1㎖ 및 증류수 1㎖를 첨가한 후 12시간 동안 110℃에서 환류시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 냉각시키고, 물을 첨가하고 클로로포름 100 ㎖로 3회 추출하였다. 모은 클로로포름층을 물로 3회 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 감압하에서 클로로포름을 제거하고, 얻어진 잔사를 컬럼크로마토그래피로 분리, 정제하여 노란색 결정인 표제 화합물을 수득율 10%로 합성하였다.
mp:109∼110℃;
Rf:0.5 (Hex:EA=6:4);
1H-NMR(CDCl3/TMS) (ppm): δ1.08(t, 6H, -CH3, J = 7.5 Hz), 1.86(m, 4H, -CH2-, J = 7.5 Hz), 3.96(m. 4H, CH2-, J = 6.6 Hz), 6.73∼7.44(m, 8H), 8.12(s, 2H, CH=C-), 9.66(s, 2H, CH=O)
<실시예 14∼19>
1-요오드프로판 대신에 하기 표 1에서 기재되어 있는 R1의 알킬기를 함유하 는 알킬레이션 시약을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 13과 동일한 방법으로 실시하였다.
<실시예 20>
2,3-비스-(3-프로필옥시벤질리덴)숙신알데하이드(2,3-bis(3-propyloxybenzyliden)succinaldehyde)
Figure 112003020653968-pat00006
(단계 1) 3-프로필옥시벤즈알데하이드(3-propyloxybenzaldehyde)
250㎖ 둥근 바닥 플라스크에 3-하이드록시벤즈알데하이드(6.1g, 50mmol)를 넣고 아세토나이트릴 50㎖를 첨가하였다. 그리고 나서, 포타슘 카보네이트(8.28g, 60 mmol)와 치환기인 1-요오드프로판(9.35g, 55mmol)을 넣고 85℃에서 10시간 동안 환류시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 냉각시키고, 물을 첨가하고 클로로포름 100㎖로 3회 추출하였다. 모은 클로로포름층을 물로 3회 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 감압하에서 클로로포름을 제거하고, 얻어진 잔사를 컬럼 크로마토그래피로 분리, 정제하였다. 프로필기의 결합 여부를 수소 NMR 스펙트럼을 통하여 확인한 후 다음 실험에 이용하였다.
(단계 2):2,3-비스-(3-프로필옥시벤질리덴)숙신알데하이드
250㎖ 둥근바닥 플라스크에 단계 1의 생성물인 3-프로필옥시벤즈알데하이드 (5g, 30mmol)를 넣고 2,5-다이메톡시테트라하이드로퓨란(2㎖, 15mmol), 포타슘 아세테이트 2g, 초산 1㎖ 및 증류수 1㎖를 첨가한 후, 110℃에서 12시간 동안 환류시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 냉각시키고, 물을 첨가하고 클로로포름 100㎖로 3회 추출하였다. 모은 클로로포름층을 물로 3회 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 감압하에서 클로로포름을 제거하고, 얻어진 잔사를 컬럼크로마토그래피로 분리, 정제하여 갈색의 분말 1g을 수득율 10%로 얻었다.
mp: 93∼94℃;
Rf:0.52 (Hex:EA=6:4);
1H-NMR(CDCl3/TMS)(ppm): δ0.99(t, 6H, -CH2-CH3, J = 7.2 Hz), 1.76(m, 4H, CH2-CH2, J = 6.9 Hz), 3.81(m, 4H, CH2-CH2, J = 1.2 Hz), 6.88∼7.26(m, 8Harom), 7.67(s, 2H, CH=C-), 9.65(s, 2H, CH=O)
<실시예 21∼22>
1-요오드프로판 대신에 하기 표 1에서 기재되어 있는 R2의 알킬기를 함유하 는 알킬레이션 시약을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 20과 동일한 방법으로 실시하였다.
<실시예 23>
2,3-비스-(4-프로필옥시-3-메톡시벤질리덴)숙신알데하이드(2,3-bis-(4-propyloxy-3-methoxybenzyliden)succinaldehyde)
Figure 112003020653968-pat00007
(단계 1):2,3-비스-(4-하이드록시-3-메톡시벤질리덴)숙신알데하이드(2,3-bis-(4-hydroxy-3-methoxybenzyliden)succinaldehyde)
250㎖ 둥근 바닥 플라스크에 바닐린(45.65g, 300mmol)을 넣고, 2,5-다이메톡시테트라하이드로퓨란(20㎖, 150mmol), 포타슘 아세테이트 20g, 아세트산 10㎖ 및 증류수 10㎖를 첨가한 후 110℃에서 12시간 동안 환류시켰다. 반응물을 냉각시킨 후 증류수를 첨가하고 클로로포름 100㎖로 3회 추출하였다. 클로로포름으로 3회 추출한 후, 클로로포름층을 증류수로 3회 세척하고, 무수 황산마그네슘상에서 건조시키고, 감압농축 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 표제 화합물 1.5g 을 분리하였다. 생성물을 수소 NMR 스펙트럼을 통하여 구조를 확인하였다.
(단계 2):2,3-비스-(4-프로필옥시-3-메톡시벤질리덴)숙신알데하이드
100 ㎖ 둥근바닥 플라스크에단계 1의 생성물인 2,3-비스-(4-하이드록시-3-메톡시벤질리덴)숙신알데하이드 (30mg, 0.08mmol)를 넣고 아세토나이트릴 30㎖를 첨가하여 완전히 녹였다. 그리고 나서, 포타슘 카보네이트(30mg, 0.18mmol)와 1-요오드프로판(30mg, 0.18mmol)을 넣고 85℃에서 12시간 동안 교반시켰다. 박층크로마토그래피를 이용하여 반응의 종결을 확인하고, 반응 혼합물을 여과하여 감압 농축 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 노란색의 분말인 표제 화합물 20mg을 얻었다.
mp:95∼96℃;
Rf:0.15 (Hex:EA=4:6);
1H-NMR(CDCl3/TMS)(ppm):δ1.01(t, 6H, CH2-CH3, J = 7.2 Hz), 1.80∼1.87(m, 4H, CH2-CH3, J = 6.9 Hz), 3.70(s, 6H, -OCH3), 3.97(t, 4H, -OCH 2-CH2, J = 6.6 Hz), 6.78∼7.17(m, 6H), 7.63(s, 2H, CH=C-), 9.64(s, 2H, CH=O)
<실시예 24∼34>
1-요오드프로판 대신에 하기 표 1에서 기재되어 있는 R3의 알킬기를 함유하는 알킬레이션 시약을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 23과 동일한 방법으로 실시하였다.
<실시예 35>
2,3-비스-(4-메틸피페라진)숙신알데하이드(2,3-bis-(4-methylpiperazine)succinaldehyde)
Figure 112003020653968-pat00008
(단계1):2-(N-메틸피페라진)벤즈알데하이드(2-(N-methylpiperazine)benzaldehyde)
250㎖ 둥근 바닥 플라스크에 2-플루오로벤즈알데하이드(42.16㎖, 400mmol)를 넣고 DMF 100㎖를 첨가하였다. 그리고 나서 포타슘 카보네이트(8.28g, 60mmol)와 N-메칠피페라진(44.4㎖, 400mmol)을 넣고 150℃에서 10시간 동안 환류시켰다. 반응의 종결을 확인하고, 증류수 400㎖를 첨가한 후, 유기물을 에칠 아세테이트 200㎖로 3회 추출하였다. 에칠 아세테이트 층을 증류수로 3회 씻은 후, 감압 건조하였다. 생성물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제된 2-(N-메틸피페라진)벤즈알데하이드를 얻었다.
(단계 2):2,3-비스-(4-메틸피페라진)숙신알데하이드
250㎖ 둥근 바닥 플라스크에 단계 1의 생성물인 2-(N-메틸피페라진)벤즈알데하이드(4.5g, 30mmol)를 넣고, 2,5-다이메톡시테트라하이드로퓨란(2㎖, 15mmol), 포타슘아세테이트 2g, 아세트산 1㎖ 및 증류수 1㎖를 첨가한 후, 110℃에서 12시간 동안 환류시켰다. 천천히 냉각시킨 후 증류수를 첨가하고 클로로포름 100㎖로 3회 추출한 후, 클로로포름층을 증류수로 3회 세척하고, 무수 황산마그네슘에서 건조시키고, 감압 농축 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 노란색의 결정인 표제 화합물 4.5g을 수율 65%로 얻었다.
mp: 218-220℃;
Rf:0.3 (CHCl3:MeOH = 8:2);
1H-NMR(CD3OD3/TMS)(ppm): δ2.25(s, 6H, OCH3), 2.40∼2.85(brd, 16H, N-CH2-CH2-N), 6.94(dt, 2H, J =1.2, 7.5 Hz), 7.04(dd, 2H, 2H, J =1.2, 7.8 Hz), 7.22(dd, 2H, J =1.2, 7.8 Hz), 7.32(dt, 2H, J =1.2, 7.5 Hz), 7.92(s, 2H, CH=C-), 9.70(s, 2H, CH=O)
상기 실시예에 의해 제조된 본 발명의 화합물을 표 1에 나타내었다.
No. R1=R1' (ortho) R2=R2' (meta) R3=R3' (para) m.p.(℃)
1 -H H H 150-151
2 -F H H 141-142
3 -Cl H H 177-178
4 -Br H H 194-195
5 -OCH3 H H 163-164
6 -H Cl H 107-108
7 -H -OCH3 -OH 177-178
8 -H -OCH3 -OCH3 149-150
9 -H H -Cl 172-173
10 -H H -OH 244-246
11 -H H -CH3 177-178
12 -H H -OCH3 204-207
13 -OCH2CH2CH3 H H 109-110
14 -OCH2CHCH2 H H 117-118
15 -OCH(CH3)2 H H 109-110
16 -OCH2C6H5 H H 120-121
17 -OCH2C6H4-4-Cl H H 186-187
18 -OCH2C6H4-4-Br H H 210-211
19 -OCH2C6H4-4-NO2 H H 116-117
20 H -OCH2CH2CH3 H 93-94
21 H -OCH(CH3)2 H 116-117
22 H -OCH2C6H5 H 126-127
23 H -OCH3 -OCH2CH2CH3 95-96
24 H -OCH3 -OCH(CH3)2 119-120
25 H -OCH3 -OCOCH3 149-151
26 H -OCH3 -OCO(CH2)3CH3 gel
27 H -OCH3 -OCOC6H5 107-110
28 H H -OCH2CH2CH3 152-153
29 H H -OCH(CH3)2 200-202
30 H H -OCO(CH2)3CH3 gel
31 H H -OCH2C6H5 119-120
32 H H -OCOC6H5 207-208
33 H H -OCOC6H4-2-F 197-199
34 H H -OCOC6H4-4-Br 223-225
35 N-메틸피페라진 H H
<실험예 1>
세포 주기 분석
세포 주기 분석을 위하여 인체 결장암 세포주 SW620(ATCC) 또는 HCT116(ATCC)을 10% FBS를 함유한 RPMI1640(Gibco/BR) 배지 또는 DMEM 배지(Gibco/BR)를 이용하여 T25 플라스크(배양액 7.5㎖)에 분주한 후, 12시간 동안 37℃ 배양기에서 배양시켰다. 12시간 동안 배양 후, 대조군으로 쓰일 세포 배양액에는 DMSO를 최종 농도가 0.1%(7.5㎕)가 되도록 넣어주고, 처리군에는 다양한 농도로 본 발명에 따른 화합물을 DMSO에 녹인 시료를 배양액에 7.5㎕ 씩 첨가하였다. DMSO나 시료를 처리한 세포주는 처리후 각각 48시간째에 분리하여 세포분석을 위해 사용하였다.
세포 주기 분석을 위하여 배양된 세포는 플라스크에서 배지를 제거한 후, 트립신을 이용하여 배양 플라스크에서 분리하고 300g에서 5분 동안 원심분리하였다. 분리된 세포는 포스페이트 완충액(phsphate buffer solution, PBS)을 이용하여 두 차례 씻어줌으로써 배지 성분을 제거하였다. 이렇게 준비된 세포에 70% 에탄올 3㎖를 처리하고 -20℃에서 12시간 동안 방치하여 세포를 고정시켰다. 에탄올로 고정된 세포는 300g로 3분 동안 원심분리한 후, 다시 차가운 PBS로 두 번 세포를 씻어내어 잔여 에탄올을 제거하였다. 세포를 500㎕ PBS를 가하여 골고루 섞어 준 후, 100 ㎍/㎖ RNase A 50㎕를 처리하여 37℃에서 30분간 방치하고, 1㎎/㎖ 프로피디움 요오드(propidium iodide;soluble in PBS) 10㎕를 처리하여 세포 DNA를 염색하였다.
염색된 세포는 Becton-Dickinson FACS calibur (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 20,000개 세포의 세포주기를 측정하였고, 벡톤-디킨슨 모디피트(Becton-Dickinson Modifit) 세포주기 분석 프로그램을 이용하여 세포주기 의 G1, S, G2/M기에 있는 세포의 양을 백분율로 계산하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다. 하기에서 HCT116 GI50 (uM)와 SW620 GI50 (uM)는 본 발명에 따른 화합물을 결장암 세포주인 HCT116과 SW620을 대상으로하여 처리한 후, 암세포의 성장을 50 % 저해하는 농도를 가리킨다.
No. HCT116 GI50 (μM) SW620 GI50 (μM) G2/M at 1μM (%) SW620 G2/M at 1μM(%) HCT116
1 8.39 1.52 45 42
2 4.02 10.73 58 48
3 0.91 0.91 47 40
4 1.05 2.14 36 38
5 3.72 1.55 50 55
6 3.62 90.58 66 60
7 7.87 3.53 38 30
8 5.49 10.46 75 71
9 3.62 24.16 67 63
10 1.36 1.02 65 61
11 1.03 5.17 44 40
12 9.62 10.24 57 59
13 5.28 2.11 62 65
14 5.28 2.64 76 72
15 5.34 5.34 69 70
16 1.41 0.63 80 43
17 0.84 0.54 76 71
18 2.63 4.64 70 75
19 5.19 7.09 39 32
20 2.74 6.74 76 72
21 4.23 0.61 74 75
22 7.59 3.58 65 68
23 0.62 2.28 56 50
24 0.71 0.91 55 48
25 17.68 66.31 48 43
26 11.18 54.04 47 46
27 2.95 13.87 77 79
28 0.82 0.55 70 72
29 0.82 1.06 47 49
30 20.98 65.05 65 63
31 3.58 7.38 62 64
32 11.94 5.97 52 56
33 7.43 5.57 71 72
34 30.42 16.66 62 60
35 5.23 0.72 79 52
상기 표 2에서 보여지는 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물을 투여한 결장암 세포주 SW620 또는 HCT116에 대한 세포주기 분석한 결과, G2/M기의 세포수를 증가시킴으로써 세포주기 중 G2/M기를 선택적으로 정지시킴을 알 수 있다.
<실험예 2>
암세포에서의 세포 주기 저해 활성 측정
SW620 또는 HCT116 세포를 100mm 세포 배양 접시에 2 x 106 cells로 접종하였다. 18시간 후 화합물을 1 μM 농도로 처리하고 세포를 48시간 동안 키운 다음, 트립신(trypsin)을 처리하여 세포를 배양 접시에서 떨어뜨렸다. PBS(Phosphate buffered saline) 5㎖을 넣고, 1500 rpm에서 5분 동안 2번 원심분리 하여 트립신을 제거하였다. PBS로 2번 세척한 후 상층액을 버리고, PBS 1 ㎖을 추가로 넣은 후 70% 차가운 알코올 3∼5㎖을 처리하여 -20℃에서 12시간 동안 세포를 고정시켰다. 알코올로 고정시킨 세포를 1500 rpm으로 5분간 원심분리하여 알코올을 제거하고 PBS로 두 번 세척하여 잔여 알코올을 완전히 제거하였다. RNase(10 ㎍/㎖)를 넣어 RNA를 제거하고 PI(propidium iodide, 50 ㎍/㎖)로 DNA를 염색하였다. 37℃에서 30분 동안 방치한 후 20,000개의 세포의 세포 주기를 FACScalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA)로 측정하였고, 세포 주기 분석 프로그램인 모디프트 프로그램(Modifit's program, Becton Dickinson)을 이용하여 세포 주기의 G0-G1, S, G2-M기에 있는 세포의 양을 백분율로 계산하였다. 본 발명에 따른 화합물 대신에 DMSO를 사용한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법을 처리하여 세포 주기의 G0-G1, S, G2-M기에 있는 세포의 양을 백분율로 계산하였다.
그 결과는 표 3에 나타내었다.
세포주 화합물 농도 % of Cells
G0-G1 S G2-M
HCT116 대조군 화합물 16 화합물35 1 μM 34.22 22.36 15,52 44.63 34.35 32.37 24.16 43.29 52.11
SW620 대조군 화합물 16 화합물35 1 μM 47.45 6.64 8,74 39.57 13.15 12.73 12.97 80.21 78.53
상기 표 3에서 보여지는 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물 16과 화합물 35는 세포주기 중 암세포를 G2-M기에 멈추게 하는 것을 볼 수 있다. 따라서 본 발명의 화합물은 세포주기 중 G2/M기를 선택적으로 저해하여 암세포 등의 비정상적인 세포 성장을 억제하는 암세포 성장 억제제 또는 세포주기 조절제로 사용할 수 있음을 알 수 있다.
상기 기술한 바와 같이, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 세포 분열 주기에서 분열하는 세포를 G2/M기에 고정시킴으로써 세포주기를 조절하고, 이를 통해 암세포의 성장을 억제하는 활성을 가지고 있어 암세포 성장 억제제 또는 세포 주기 조절제로 사용할 수 있다.

Claims (5)

  1. R1과 R1′은 N-메틸피페라진, R2와 R2′는 수소, R3와 R3′는 수소로 표시되는 하기 화학식 1로 표시되는 2,3-비스-(2-(N-메틸피페라진)벤질리덴)숙신알데하이드.
    <화학식 1>
    Figure 112005073354528-pat00009
  2. 삭제
  3. 하기 반응식 1에서 나타난 바와 같이, 2,5-다이메톡시테트라하이로퓨란, 포타슘 아세테이트, 아세트산 및 물의 존재하에서, R1은 N-메틸피페라진, R2 및 R3는 수소로 치환된 벤즈알데하이드 화합물(I)을 선형 이량화반응시켜 2,3-비스-(2-(N-메틸피페라진)벤질리덴)숙신알데하이드를 제조하는 방법.
    <반응식 1>
    Figure 112005073354528-pat00010
    (상기 R1과 R1′은 같고, R2과 R2′는 같고, R3과 R3′는 같다)
  4. 하기 화학식 1로 표시되는 시남알데하이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 암세포 성장 억제제.
    <화학식 1>
    Figure 112005073354528-pat00011
    (상기 R1과 R1′은 같고, R2과 R2′는 같고, R3과 R3′은 같고, R1, R2 및 R3은 독립적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 벤질옥시, 아세틸옥시, 발러릴옥시, 벤조일옥시, C1∼C4 알킬, C1∼C4 알콕시, 헤테로사이클 또는 벤젠사이클이다)
  5. 삭제
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