KR100568635B1

KR100568635B1 - 광회절 바이오센서

Info

Publication number: KR100568635B1
Application number: KR1020007005534A
Authority: KR
Inventors: 데니스 에스. 에버하트; 마크 엘. 존스; 로산 마리 케일러
Original assignee: 킴벌리-클라크 월드와이드, 인크.
Priority date: 1997-12-16
Filing date: 1998-12-16
Publication date: 2006-04-07
Anticipated expiration: 2018-12-16
Also published as: ES2294826T3; KR20010032322A; DE69838815T2; DE69838815D1; US6060256A; EP1040338A1; CA2309595A1; EP1040338B1; AU760500B2; CN1286753A; US6436651B1; CA2309595C; WO1999031486A1; AU1920599A; CN1171083C

Abstract

본 발명은 저가의 고감도 장치 및 매질중 존재하는 분석물을 탐지하고 그 양을 측정하는 방법에 관한 것이다. 장치는 분석물-특이성 수용체의 특정의 예정된 패턴 (25)이 그 위에 프린팅되는 금속화된 필름 (20)을 포함한다. 수용체가 프린팅되는 가소성 필름의 선택된 지역에 표적 분석물이 부착되면, 투과 및(또는) 반사광의 회절이 분석물의 물리적 차원 및 한정되고, 정확한 분석물 배치를 통해 발생한다. 육안 또는 임의로, 센싱 장치에 의해 용이하게 볼 수 있는 회절상이 형성된다.

분석물 탐지 장치, 수용체 물질, 바이오센서 장치.

Description

광회절 바이오센서{Optical Diffraction Biosensor}

본 발명은 분석물(analyte) 센서분야에 관한 것이며, 좀더 상세하게는 본 발명은 광회절 바이오센서를 생산하기 위해 금속 필름상에서 결합제를 미세접촉(microcontact) 프린팅하는 분야에 관한 것이다.

미세접촉 프린팅은 미크론 및 서브미크론 측면 치수(dimension)를 가진 유기 단일층의 패턴을 형성하는 기술이다. 이 기술은 특정 양식의 패턴을 형성함에 있어 실험적 단순함 및 유연성을 제공한다. 선행기술에서, 미세접촉 프린팅은 금 및 다른 금속상에 유기구조물을 형성하기 위해 장쇄 알칸티올레이트의 자기 결집(self-assembled) 단일층과 함께 사용되었다. 이들 패턴은 적절하게 배합된 에칭제에 의한 지지금속의 부식을 방지함으로써 나노메터 레지스트로서 거동하거나 또는 패턴의 친수성 부분위에 유체를 선택적으로 위치하게 할 수 있다. 일반적으로, 1 마이크론 미만일 수 있는 치수를 갖는 자기 결집 단일층의 패턴은 알칸티올을 "잉크"로서 사용하고, 또한 그들을 탄성 "스탬프"를 사용하여 금속 지지체상에 프린팅함으로써 형성된다. 스탬프는 광 또는 X선 미세석판인쇄, 또는 다른 기술에 의해 제조된 마스터를 사용하여 실리콘 탄성체를 주조함으로써 제조된다(본 명세서에 참고문헌으로서 전부 채택된 미국 특허출원 제 08/654,993호, 제 08/769,594호, 제 08/821,464호, 제 08/707,456호 및 제 08/768,449호 참조).

미세접촉 프린팅은 미세제조에 상당수의 새로운 가능성을 부여한다. 미세접촉 프린팅은 구성작용기만으로도 식별되는 패턴을 형성하는 것을 가능하게 하며, 이 가능성은 계면자유에너지와 같은 표면성질을 아주 정밀하게 조절할 수 있게 해준다. 선행기술에서, 미세접촉 프린팅은 분자 자기 결집(molecular self-assembly)에 의존한다. 자기 결집 단일층을 사용하여, 적어도 국부적으로는 열역학적 최소치(minimum)에 근접하고, 본질적으로 결함 배제적이고 자기치유적인 계가 만들어진다. 흡착 물질 또는 입자에 의한 표면 오염을 막는 최소한의 보호와 함께 단순한 공정으로 최종 구조에 놀랍게도 낮은 수준의 결함을 달성할 수 있다. 자기 결집 단일층을 사용하는 공정은 대기압, 비보호 실험실 분위기에서 수행될 수 있다. 따라서, 자기 결집 단일층을 사용하는 미세접촉 프린팅은 미세제조에 보통 사용되는 장비로의 상례적인 접근 수단이 없거나, 또는 장비의 총비용이 중대한 관심사인 실험실에서 유용하다. 패턴화된(patterned) 자기 결집 단일층은 많은 습윤-화학 에칭제에 대하여 레지스트로 작용하도록 고안될 수 있다.

또한 선행기술에서는, 5 내지 2000 나노메터 두께의 금 필름은 티탄을 하도한 Si/SiO₂ 웨이퍼 또는 유리시트상에서 전형적으로 지지된다. 티탄은 금과 지지체사이에서 부착 촉진제로서 작용한다. 그러나, 실리콘 웨이퍼는 단단하고, 깨지기 쉽고, 또한 빛을 투과시킬 수 없다. 이들 실리콘 웨이퍼는 또한 레터프레스, 그라비야, 오프셋 및 스크린 프린팅과 같은 대규모의 연속적인 프린팅 방법에 적합하지 않다(Printing Fundamentals, A. Glassman, Ed.(Tappi Press Atlanta, GA 1981) 및 Encyclopedia Britannica, vol. 26, pp. 76-92, 110-111(Encyclopedia Brittanica, Inc. 1991) 참조). 나아가, 실리콘은 Cr 또는 Ti와 같은 부착 촉진제로 별개의 단계에서 처리되어야 하며, 그렇지 않으면 Au는 적합하게 부착하지 않고, 안정하고 잘 정돈된 단일층의 형성을 방해할 것이다. 마지막으로, 실리콘은 가시광선을 투과시키지 않으므로 얻어진 회절 패턴은 투과된 빛이 아닌 반사된 빛으로 생성되어야 한다.

연속공정이 가능하고, 자기 결집 단일층을 사용하지 않는, 광학적으로 투명하고, 유연한 기질(substrate)상에서 패턴화된 수용체를 접촉 프린팅하는 용이하고, 효율적이고 또한 단순한 방법이 필요하다. 이와 같은 방법 및 이 방법으로 제조되는 장치는 더 단순하고, 자기 결집 단일층에 구속받지 않으며 또한 제조가 더 용이하다.

<발명의 간단한 설명>

본 발명은 매질(medium)중 존재하는 분석물을 탐지하고 이를 정량하는 저렴하고 감도 좋은 장치 및 방법에 관한 것이다. 장치는 분석물-특이적 수용체의 특정 예정(predetermined) 패턴이 프린팅된 금속 필름을 포함한다. 본 발명은 자기 결집 단일층을 사용하는게 아니라, 표면에 화학적으로 결합될 수 있다면 어떠한 수용체라도 사용될 수 있다는 점에서 더 일반적이다. 수용체가 프린팅된 플라스틱 필름의 선택된 영역에 빛을 산란시킬 수 있는 표적 분석물이 부착된 후, 분석물의 물리적 크기, 굴절율 및 정해진 정확한 배치를 통해 투과광 및(또는) 반사광의 회절이 발생한다. 분석물이 너무 작거나 또는 주위 매질에 비해 적합한 굴절율 차이를 가지지 않기 때문에 분석물이 가시광선을 산란시키지 않는 경우, 광을 회절시킬 수 있는 다른 방법은 분석물과 결합된 중합체 비드를 수용체에 부착시키는 것이다. 눈 또는 임의로는 광감지장치로 용이하게 볼 수 있는 회절상이 생산된다. 본 발명은 금속으로 피복된 고분자 필름, 및 분석물에 특이적으로 결합하는 수용성 물질을 그 위에 가지며 상기 고분자필름상에 프린팅되는 수용체층을 포함하는(comprising) 바이오센서이다.

본 발명은 미생물에 대한 결합제의 유도체를 사용하는 패턴화된 단일층의 접촉 프린팅법을 사용한다. 이와 같은 유도체의 일예는 티올이다. 목적하는 결합제는 티올화된 항체, 또는 항체단편, 단백질, 핵산, 설탕, 탄수화물 또는 분석물을 결합시킬 수 있는 다른 작용기일 수 있다. 유도체는 금속화된 중합체 필름과 같은 금속 표면에 화학흡착된다.

패턴화된 단일층으로는, 분석물-특이적 수용체 패턴을 통해 그 위의 분석물을 조절하여 배치하는 것이 가능하다. 그에 의해 생산된 본 발명의 바이오센싱 장치는 1차적으로 바이오센싱 장치를 선택된 분석물을 함유하는 매질에 노출시키고, 이어서 적합한 배양기간을 거쳐 예를 들어, 레이저 또는 포인트광원으로부터의 광을 필름을 통해 투과시켜 사용한다. 만약 분석물이 매질에 존재하고 또한 패턴화 단일층상의 수용체에 결합된다면, 광은 가시상 또는 근적외선상을 형성하는 방식으로 회절된다. 다시 말해, 분석물이 결합된 패턴화된 단일층은 단일층상의 수용체와 목적하는(of interest) 분석물과의 반응에 따라 변하는 광회절 패턴을 발생시킬 수 있다. 광은 가시광선 스펙트럼에 속할 수 있고, 필름으로부터 반사되거나 필름을 투과할 수 있고, 분석물은 단일층과 반응하는 특정 화합물 또는 입자일 수 있다. 광은 바람직하게 가시영역내의 백색광 또는 단색 전자기선일 수 있다. 본 발명은 또한 금 또는 다른 적합한 금속 또는 금속합금상의 단일층에 대한 유연성 지지체를 제공한다.

본 발명은 결합제의 잘 정리된 단일층 또는 얇은 층의 형성에 부착 촉진제를 요하지 않는 금 또는 다른 적합한 물질에 대한 지지체를 포함한다. 본 발명은 또한 회분식 제조보다는 연속식 프린팅에 적합한 금 또는 다른 물질의 층에 대한 지지체를 제공한다. 나아가, 본 발명은 대량 생산될 수 있는 저가의 일회용 바이오센서를 제공한다. 본 발명의 바이오센서는 분석물 탐지용 단일시험기로서 제조할 수 있거나 또는 다중시험기로서 포맷(format)될 수 있다. 본 발명의 바이오센서의 용도의 예로는 기저귀와 같은 가먼트에서의 화학적 또는 생물학적 오염탐지, 일반적으로는 과일 주스 또는 다른 음료와 같은 사전포장된 식품의 미생물에 의한 오염탐지 및 항원, 미생물 및 혈액성분 탐지용 진단키트와 같은 건강진단 응용분야 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명을 구현하기 위하여, 특정 종의 미생물용 영양소가 수용체 단일층에 혼합될 수 있다. 이와 같은 방식으로, 우선 본 발명의 바이오센서를 거기에 혼합된 영양소와 접촉시키고, 이어서 결합된 미생물의 증식에 적합한 조건하에서 바이오센서를 배양시킴으로써 매우 낮은 농도의 미생물을 탐지할 수 있다. 미생물은 회절패턴을 형성하기에 충분한 생물이 존재할 때 까지 증식시킨다.

본 발명은 또한 콘택트 렌즈, 안경, 창유리, 제약 바이알, 용매용기, 물병, 밴드에이드 등에 대해서 오염물을 탐지하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 및 다른 특성 및 잇점은 하기 개시된 실시양태의 상세한 설명을 검토한 후 명백해질 것이다.

도 1은 영양소 백킹(backing)을 가진 금속으로 도금된 밀라(MYLAR) 필름의 개략도이다.

도 2는 매질내에서 동시에 몇 몇 다른 분석물을 측정할 수 있는 바이오센서를 나타낸다.

도 3은 본 발명에 따른 수용체의 접촉 프린팅의 개략도이다.

도 4는 티올화된 항체 결합제로 프린팅된 표면의 효소 결합 면역흡착제 분석기(ELISA) 결과이다.

도 5는 프린팅된 항체에 부착후, 항원으로 코팅된 폴리스티렌 대용물(surrogate) 입자를 보여주는 사진이다.

도 6은 도 4에 기술된 시료에서 제조된 회절 패턴이다.

도 7은 패턴화된 항체 수용체에 부착된 칸디다 알비칸(Candida albicans)의 광학 현미경사진이다.

도 8은 패턴화된 수용체에 대한 칸디다 알비칸의 결합으로 인한 회절패턴이다.

본 발명은 개선된 바이오센싱 장치 및 매질내의 목적하는 분석물의 존재 또는 양을 탐지하고 정량하기 위해 이와 같은 바이오센싱 장치를 사용하는 방법을 특징으로 한다. 본 발명에 의해 탐지될 수 있는 분석물은 박테리아, 효모, 진균 및 비루스와 같은 미생물이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 선행 장치와는 대조적으로, 본 발명의 장치는 단지 몇 분간 지속하는 신속한 분석으로 매질중의 극히 적은 양의 분석물을 탐지할 수 있다. 나아가, 본 발명의 바이오센싱 장치에서는 광원외의 시그널 발생 또는 관련 전자부품을 요하지 않는다.

본 발명은 분석물의 존재를 나타내는 광회절에 기초한 1회용 바이오센서를 개발하는 것을 가능하게 하는 금속화된 가소성 필름상에 분석물-특이 수용체(티올화 결합제)를 미세접촉 프린팅하는 것을 포함한다(comprise). 표적 분석물이 수용체를 함유하는 가소성 필름의 선택된 영역에 부착한 후, 분석물의 물리적 크기 및 정해진 정확한 배치를 통해 투과광 및(또는) 반사광의 회절이 발생한다. 예를 들어, 효모, 진균 또는 박테리아는 조직화된 패턴으로 표면상에 놓여질 때 가시광선에 대한 회절성분으로 작용할 만큼 충분히 크다.

단순한 회절상을 발생시키는 것에 더하여, 분석물 패턴은 홀로그래픽 감지상 및(또는) 가시색 변화를 발생시킬 수 있다. 따라서, 홀로그램의 출현 또는 존재하는 홀로그램의 변화는 양성반응을 나타낼 것이다. 투과된 광의 회절에 의해 야기된 패턴은 분석물의 수용물질과의 결합에 의한 한가지 패턴에서 다른 패턴으로의 변환을 포함하는 특정 모양일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히 바람직한 실시양태에서는, 분석물이 본 발명의 바이오센싱 장치와 접촉한 후, 1시간 미만내에 회절패턴을 식별할 수 있다.

분석물과 서로 작용하여 광회절을 발생시키는 회절격자는 약 1/2 파장의 최소 주기성 및 주위매질의 굴절율과 다른 실상 또는 허상의 굴절율을 가져야 한다. 바이러스 또는 분자와 같은 매우 작은 분석물은 작은 분석물에 특이적인 더 큰 입자를 사용하여 간접적으로 탐지할 수 있다. 작은 분석물을 탐지할 수 있는 한가지 실시양태는 라텍스 비드 또는 폴리스티렌 비드와 같은 입자를 목적하는 분석물과 특이적으로 결합하는 항체와 같은 수용체 물질로 코팅하는 것을 포함한다(comprise). 본 발명에 사용될 수 있는 입자의 예로는 유리, 셀룰로오스, 합성 중합체 또는 플라스틱, 라텍스, 폴리스티렌, 폴리카르보네이트, 단백질, 박테리아 또는 진균 세포 등을 들 수 있으나. 이에 한정되는 것은 아니다. 입자형태는 구형이 바람직하나, 입자의 구조적 및 공간적 형태는 본 발명에서 중요한 것은 아니다. 예를 들어, 입자는 슬라이버(sliver), 타원체, 입방체, 임의의 모양 등일 수 있다. 바람직한 입자 크기는 약 0.2 ㎛ 내지 50 ㎛ 사이, 더욱 바람직하게는 0.4 ㎛ 내지 1 ㎛ 사이이다. 입자의 조성은 본 발명에 있어 중요한 것은 아니다.

최적의 입자크기는 입자의 굴절율 및 주위매질의 굴절율 함수인 것으로 이해된다. 투과상으로 본 발명에 사용하기 위한 최적의 입자크기를 분석하기 위한 방법은 하기식을 사용하는 것이다.

t_opt = λ/2(n2-n1)

상기식에서,

t_opt = 입자의 최적 높이

λ= 입사광의 파장

n2 = 입자의 굴절율

n1 = 주위매질의 굴절율

반사상에 대한 입자의 최적 높이는 상기 식을 2로 나누어 정한다.

금속화된 필름위의 단일층은 입자와의 결합에서 사용된 항원결정부(epitope)와 다른 분석물위의 항원결정부에 특이적으로 결합할 항체와 같은 수용체 물질 또는 결합제를 함유한다. 따라서, 바이러스 입자와 같은 작은 분석물이 있는 매질을 탐지하기 위해서 매질은 먼저 바이러스 입자가 결합된 라텍스 입자에 노출된다. 이어서, 임의로 라텍스 입자는 세척되고, 바이러스 특이 항체를 함유하는 단일층을 가진 금속화된 필름에 노출된다. 이어서 항체는 라텍스 비드위의 바이러스 입자와 결합하여 필름위의 단일층으로서 동일한 패턴으로 라텍스 비드를 고정시킨다. 결합된 라텍스 비드는 가시광선의 회절을 초래하기 때문에, 회절 패턴은 형성되고, 이는 액체중에 바이러스 입자의 존재를 나타낸다. 입자를 사용하는 다른 조합들은 당업자에게 잘 인식되어 있다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 항체와 같은 수용체가 본 명세서에 기술된 금속층에 부착된다. 이어서 항체는 수용체와 결합하는 분석물을 함유하는 환경에 노출된다. 분석물이 수용체와 결합한 후, 금속과 결합한 접합물(conjugate)을 인식하는 제2 수용체가 첨가된다. 적합한 시약 또는 시약들이 첨가될 때 고체 물질의 침전을 야기할 효소 및 무기물질이 이 제2 수용체에 결합된다. 예를 들어, 침전의 형성을 야기할 수 있는 효소는 테트라메틸벤지덴의 존재하의 과산화효소이다(본 명세서의 실시예 3 참조). 다른 예는 염화은의 존재하의 콜로이드성 금의 사용이다. 원소 은은 패턴화된 수용체층 위에서 침전되어 회절패턴을 형성할 것이다.

본 발명을 사용하여 탐지되는 것으로 여겨지는 분석물에는 박테리아, 효모, 바이러스; 류머티스인자; IgG, IgM, IgA 및 IgE 항체를 포함하는(그러나 상기 항체에 한정되는 것은 아님) 항체; 암배아성 항원; 연쇄구균 A군 항원; 바이러스 항원; 자기면역질환과 관련된 항원, 알레르겐, 종양 항원; 연쇄구균 B군 항원, HIV I 또는 HIV II 항원; 또는 이들 및 다른 바이러스에의 숙주반응(항체); RSV에 특이적인 항원 또는 바이러스에 대한 숙주반응(항체); 항원; 효소; 호르몬; 다당류; 단백질; 지질; 탄수화물; 약물 또는 핵산; 살모넬라종; 칸디다 알비칸스 및 칸디다 트로피칼스를 포함하는(그러나 이에만 한정되는 것은 아님) 칸디다종; 수막염균 군 A, B, C, Y 및 W 서브 135, 폐렴쌍구균, 대장균, 헤모필루스 인플루엔자 형 B; 미생물로부터 유래한 항원; 합텐; 남용약물; 치료약물; 환경제; 및 간염에 특이적인 항원 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 특정 종류의 미생물에 대한 영양제가 단일층으로 혼입될 수 있다. 상기 방식으로, 먼저 본 발명의 바이오센서를 거기에 혼입된 영양제와 접촉시키고, 이어서 결합된 미생물의 증식에 적합한 조건하에서 바이오센서를 배양함으로써 매우 낮은 농도의 미생물을 탐지할 수 있다. 도 1에 나타난 하나의 실시양태에서, 밀라(MYLAR) 필름 (15)는 밀라 필름 (15)의 배면과 접촉하는 영양소 백킹(backing) (30)을 갖는다. 밀라 필름 (15)의 반대편은 그 위에 금속 필름 (20)을 갖는다. 금속 필름 (20)은 금이 바람직하다. 미생물에 특이적인 수용체 (25)는 금속 필름 (20)에 부착되어 있다. 사용시에 영양소는 밀라 필름을 통해 천천히 확산한다. 미생물이 수용체 (25)에 부착되면, 결합된 미생물은 영양소를 소모하고, 증식한다. 미생물이 증식하면서, 입사되는 광을 회절시키고, 그 결과 회절 패턴을 형성한다. 따라서, 이 실시양태에서는, 회절 패턴이 형성된다면, 그 이유는 결합된 미생물이 증식하기 때문이다. 물론, 경우에 따라서는 미생물은 패턴화된 단일층상에 영양소가 존재하지 않아도 회절 패턴을 형성하기에 충분히 증식할 수 있다.

본 발명의 일부는, 금속화된 필름에 미세프린팅될 수 있고 목적하는 분석물과 특이적으로 결합할 수용체 물질이다. 따라서, 수용체 물질은 특정 결합쌍의 일부로서 정의되고, 그 예로는 항원/항체, 효소/기질, 올리고뉴클레오티드/DNA, 킬레이터/금속, 효소/억제제, 박테리아/수용체, 바이러스/수용체, 호르몬/수용체, DNA/RNA 또는 RNA/RNA, 올리고뉴클레오티드/RNA 및 이들 종의 무기종의 상호작용 뿐 만 아니라 어느 다른 종과 이들 종들과의 결합 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

부착층에 결합된 수용체 물질은 분석물 또는 목적하는 분석물과 특이적으로 결합하는 능력을 특징으로 한다. 수용체 물질로서 사용될 수 있는 물질의 다양성은 오로지 제 2 물질(partner)과-선택된 시료에 대해-선택적으로 결합하는 물질의 종류에 의해서 제한될 뿐이다. 수용체 물질의 전체 분류에 속하는 하위 부류의 예로는 독소, 항체, 항체 단편, 항원, 호르몬 수용체, 기생충, 세포, 합텐, 대사물질, 알레르겐, 핵산, 핵물질, 자기항체, 혈단백질, 세포 단편, 효소, 조직 단백질, 효소 기질, 조효소, 뉴런 전달물질, 바이러스, 바이러스 입자, 미생물, 단백질, 다당류, 킬레이터, 약물 및 특정 결합쌍의 기타 물질(member) 등이 있다. 이 열거들은 부착층상으로 코팅되어 박막 분석 시스템을 형성할 수 있는 많은 다른 물질중의 일부만을 구체화한 것이다. 목적하는 선택된 분석물이 무엇이든지, 수용체물질은 목적하는 분석물과 특정적으로 결합하도록 고안된다.

목적하는 분석물을 함유하는 매트릭스는 액체, 고체 또는 기체일 수 있고, 그 예로서는 점액, 타액, 소변, 분뇨물, 조직, 골수, 뇌척수액, 혈청, 플라스마, 전혈, 담, 완충용액, 추출용액, 정자, 질분비물, 심막, 위, 복막, 흉막 또는 기타 다른 세척액 등이 있다. 목적하는 분석물은 항원, 항체, 효소, DNA 단편, 비손상 유전자, RNA 단편, 작은 분자, 금속, 독소, 환경제, 핵산, 세포질성분, 섬모 또는 편모 성분, 단백질, 다당류, 약제 또는 표 A에 열거된 물질과 같은 기타 다른 물질일 수 있다. 예를 들어, 박테리아에 대한 수용체 물질은 표면 멤브레인 성분, 단백질 또는 지질, 다당류, 핵산 또는 효소를 특정적으로 결합시킬 수 있다. 박테리아에 특이적인 분석물은 다당류, 효소, 핵산, 멤브레인 성분, 박테리아에 대한 반응에서 숙주에 의해 생산된 항체일 수 있다. 분석물의 존재는 전염병(박테리아 또는 바이러스에 의함), 암 또는 다른 대사성질환 또는 증상을 가리킬 수 있다. 분석물의 존재는 식품독성 또는 다른 독성 노출을 의미할 수 있다. 분석물은 약물 남용을 가리킬 수 있거나 또는 치료제의 수준을 모니터링할 수 있다.

이 기술이 사용될 수 있는 가장 일반적으로 접하게 되는 분석법중 하나는 면역분석법이다. 그러나, 일반적으로 이 기술은 핵산 탐사, 효소/기질, 및 다른 리간드/수용체 분석 포맷에도 적용될 수 있다. 자기면역분석법에서 항체는 수용체 물질로서 작용하거나 또는 목적하는 분석물일 수 있다. 수용체 물질, 예를 들어 항체 또는 항원은 시험 장치의 부착층상에서 안정하고 밀집성이며 반응성의 층을 형성하여야 한다. 만약 항원이 탐지대상이고, 항체가 수용체 물질이라면, 항체는 목적하는 항원에 특이적이어야 하고, 항체(수용체 물질)는 항원(분석물)이 시험기 표면에 유지되도록 충분히 항원을 결합시켜야 한다. 경우에 따라서는, 분석물은 수용체 물질을 단순히 결합시킬 수 없으나, 수용체 물질의 탐지할 수 있을 정도의 변형을 초래할 수 있다. 이 상호작용은 시험기 표면에서 질량(mass)의 증가 또는 시험기 표면상의 수용체 물질의 양의 감소를 야기할 수 있다. 후자의 예로는 분해성(degradative) 효소 또는 물질의 특이적이고 고정된 기질과의 상호작용이 있다. 이 경우, 목적하는 분석물과의 상호작용전에 회절 패턴을 볼 수 있으나, 만약 분석물이 존재한다면 회절 패턴은 사라질 것이다. 결합, 이종혼합(hybridization) 또는 분석물과 수용체 물질과의 상호작용이 일어나는 특정 메카니즘은 본 발명에서 중요한 것은 아니나, 최종 분석 방법(protocol)에서 사용된 반응 조건에 영향을 줄 수 있다.

일반적으로, 수용체물질은 회절패턴을 형성하게 될 양식으로 부착층에 수동적으로 부착될 수 있다. 필요하다면, 부착층에 의해 시험표면상에 도입된 자유 관능기는 수용체 물질의 시험표면에의 공유 부착(covalent attachment)에 사용될 수 있다. 수용체 물질의 부착에 이용 가능한 화학물질은 당업자에게 공지되어 있다.

수용체물질을 부착층에, 분석물이 결합하고 부착층에 광을 투과시킬 때 회절패턴을 형성하는 양식으로 부착시키는 데는 각종 기술을 사용할 수 있다. 이산(dissrete) 배열 또는 패턴의 용액의 도포; 분무, 잉크 젯 또는 다른 날인법(imprinting method); 또는 적합한 용매계로부터의 스핀 코팅에 의해 시험 표면을 수용체 물질로 코팅할 수 있다. 선택된 기술은 상당수의 시험 표면을 코팅하는데 필요한 수용체 물질의 양을 최소화하여야 하고, 이 기술을 적용하는 동안 수용체 물질의 안정성/기능성을 유지하여야 한다. 이 기술은 또한 매우 일정하고 반복 가능성이 있는 양식으로 수용체 물질을 부착층에 적용하거나 부착시켜야 한다.

수용체 물질은 항원, 항체, 올리고뉴클레오티드, 킬레이터, 효소, 박테리아, 선모 박테리아, 편모 박테리아 물질, 핵산, 다당류, 지질, 단백질, 탄수화물, 금속, 바이러스, 호르몬 및 상기 물질에 대한 수용체로 구성된 군으로부터 선택된 물질로부터 형성된다. 바람직한 실시양태에서, 목적하는 분석물이 수용체 물질과 제2 결합제 사이에 놓여져 있을 때, 다색광의 투과에 반응하여 눈으로 패턴을 탐지할 수 있도록 바이오센싱 장치는 형성되고 배치된다.

분석물이 존재하게 될 매질은 고체, 겔상, 액체 또는 기체일 수 있다. 체액중의 분석물을 탐지하기 위해, 액은 소변, 혈청, 플라스마, 척수액, 담, 전혈, 타액, 비뇨생식기 분비물, 분뇨 추출물, 심막, 위, 복막, 흉막 세척액, 질 분비물 및 인후스웝으로 구성된 군으로부터 선택되고, 이 방법은 임의로 회절 패턴의 외관을 측정하기 위해 회절분석계를 사용하기도 한다. 본 발명의 바이오센싱 장치로 사용될 수 있는 가장 일반적인 기체는 공기이다.

본 발명의 바이오센싱 장치는 금속화된 중합체 필름, 바람직하게는 열가소성 중합체 필름상에 패턴화된 단일층을 접촉 프린팅하는 방법, 그에 의해 생산된 조성물 및 이 조성물의 이용을 사용한다. 이 패턴화된 단일층을 통해 분석물 수용체를 함유할 수 있는 액체를 그 위에 조절하여 배치하는 것이 가능하다. 본 명세서에서 사용된 "그 위의 패턴화된 단일층"이란 용어는 고체 패턴을 포함하는 금속화된 고분자 필름 위의 어느 패턴으로 있는 단일층을 의미한다.

그 위에 단일층을 가진 필름이 단일층과 반응할 수 있는 분석물에 노출되었을 때, 필름은 단일층과 목적하는 분석물과의 반응에 따라 변하는 광회절 패턴을 형성할 것이다. 액체는 물과 같은 높은 표면장력유체일 수 있다. 광은 가시광선 스펙트럼에 속할 수 있고, 필름으로부터 반사되거나 또는 필름을 투과할 수 있고, 분석물은 단일층과 반응하는 모든 화합물일 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 방법은 기질이 단일층의 굴절율의 변화를 야기할 조건하에서 잠재적으로 분석물을 함유하는 시험 시료와 기질을 접촉시키는 것을 포함한다. 광이 단일층을 가진 금속화된 열가소성 중합체를 투과할 경우, 가시 패턴이 형성되고, 광을 표면에 일직선으로 쏘이거나 또는 직접 물질을 통해 봄으로써 관찰할 수 있다.

한가지 실시양태에서는, 본 발명은 미세접촉 프린팅된 금속화된 필름이 계량봉(dipstick)의 끝에 놓아지는 계량봉 형태로 구체화된다. 실제, 분석하고자 하는 분석물이 존재할 수 있고, 몇 분간 남아있을 수 있는 액체에 계량봉을 적신다. 이어서 계량봉을 제거하고, 이어서 금속화된 필름에 광을 투사하거나, 필름 뒤편에서 필름을 광으로 관찰한다. 만일 패턴이 관찰된다면, 이 액체에는 분석물이 존재하는 것이다.

본 발명의 다른 실시양태에서는, 다중 분석물 시험이 동일한 지지체상에서 고안된다. 도 2에 나타난 바와 같이, 몇 몇 미세접촉 프린팅된 금속화된 필름 (70), (75), (80) 및 (85)가 스트립(strip) (50)에 주어지고, 각각의 필름은 그 위에 프린팅된 단일층 패턴(60)을 가진다. 각각의 미세접촉 프린팅된 금속화된 필름 (70), (75), (80) 및 (85)는 상이한 분석물에 대해 다른 상이한 수용체 물질을 가진다. 따라서 본 발명은 각종 미세접촉 프린팅된 금속화된 필름이 본 발명의 바이오센서 디바이서의 사용자가 단일 시험으로 매질중의 다중 분석물의 존재를 탐지할 수 있게 어떠한 배열로도 포맷될 수 있다는 것을 알 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서는, 바이오센서는 점착성있게 백킹된 스티커 또는 전사지(decal)에 부착될 수 있고, 이어서 스티커 또는 전사지는 경질 표면 또는 용기벽에 놓여질 수 있다. 바이오센서는 식품용기 또는 유리 바이알과 같은 용기의 용기의 내부 표면에 놓여질 수 있다. 이어서 용기안에 미생물 오염의 존재여부를 정하기 위해 바이오센서를 관찰할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 수용체층은 하기 일반식으로 표현된다.

X-R-Y

X는 금속 또는 금속 산화물과 반응성이다. 예를 들어, X는 대칭 또는 비대칭 이황화물(-R'SSR, -RSSR), 황화물(-R'SR, -RSR), 디셀레나이드(-R'Se-SeR), 셀레나 이드(-R'SeR, -RSeR), 티올(-SH),니트릴(-CN), 이소니트릴, 니트로(-NO₂), 셀레놀(-SeH), 3가 인화합물, 이소티오시아네이트, 크산테이트, 티오카르바메이트, 포스핀, 티오산 또는 디티오산, 카르복시산, 히드록시산 및 히드록삼산 등일 수 있다.

R은 임의로 헤테로 원자에 의해 방해(ingterruption)받을 수 있고, 최적의 고밀도 패킹을 위해 바람직하게 비-가지인 연결기이다. 연결기는 입체장애를 억제하고(하거나), Y의 활성도를 증가시키는 것을 돕는다.

Y는 수용체 층의 기능성을 부여하는 분자이다. Y는 우선적으로 목적하는 분석물을 연결시키는 모든 분자일 수 있다. Y는 독소, 항체, 항체 단편 항원, 호르몬 수용체, 기생충, 세포, 합텐, 대사물질, 알레르겐, 핵산, 핵물질, 자기항체, 혈단백질, 세포 단편, 효소, 조직 단백질, 효소 기질, 조효소, 뉴런 전달제, 바이러스, 바이러스 입자, 미생물, 단백질, 다당류, 킬레이터, 약물 및 특정 결합쌍의 어떤 다른 군(member)일 수 있다.

작용기 X를 부여하기 위해 항체 또는 항원 단편과 같은 잠재적 결합제와 반응할 수 있는 바람직한 시약에는 하기 화학식을 갖는 술포-LC-SPDP(Pierce Chemical Co. Rockford, 미국 일리노이주)가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

술포-LC-SPDP는 술피드릴 및 아미노기와 반응성이고, 따라서 항체 또는 다른 단백질 수용체, 프로테오글리칸, 지질단백질, 당단백질과 같은 단백질, 글루코사민 또는 갈락토사민(그러나 이에 한정되는 것은 아님)을 포함하는 아미노 설탕과의 반응에 적합하다.

도 3에 개략적으로 나타낸 전형적인 실험과정에서, 사진석판술으로 생산된 마스터를 유리 또는 플라스틱 페트리(Petri) 접시에 놓고, 10:1 비(w:w 또는 v:v) 혼합물 또는 SYLGARD

실리콘 탄성체 184 및 SYLGARD

실리콘 탄성체 184 경화제(Dow Corning Corporation)을 그 위에 붓는다. 탄성체를 실온에서 약 30분간 방치하고, 압력을 낮추어 가스를 제거하고, 이어서 60℃에서 4 내지 16시간 동안 경화시키고(curing), 부드럽게 마스터에서 벗겨낸다.

탄성 스탬프의 잉킹은 약 10초 에서 약 10분 사이동안 약 0.1 mG/mL 내지 약 0.5 mG/mL 농도의 수용체 "잉크"에서 탄성 스탬프를 적시고, 이어서 스탬프를 질소가스하에서 건조시킴으로써 수행한다. 액체가 주위분위기하에서 또는 질소 기체 기류에 노출시킴으로써 스탬프의 표면상에서 액체가 육안으로 보이지 않을 때까지(전형적으로 약 60초간) 스탬프를 건조시킨다. 잉킹에 이어서, 스탬프는 금속화된 표면에 적용된다(전형적으로 손에 의함). 매우 가벼운 손압을 사용하여 스탬프와 표면사이의 완전한 접촉을 돕는다. 스탬프는 바람직하게 약 10초 에서 약 200초 사이동안 표면에 남아있어야 한다. 스탬프가 표면상에 남아있어야 할 실제 시간은 사용된 잉크에 따라 변할 것이다. 이어서 스탬프는 표면에서 부드럽게 벗겨낸다. 바람직한 실시 양태로서 이어서 연결된 수용체를 함유하지 않는 금속의 모든 표면부분을 덮기 위해서 부동화 단계와 함께 수용체 프린팅 한다. 부동화는 분석물의 비-특정 결합을 제거하는 것을 돕는다.

스탬프의 탄성체 성질은 발명의 성공에 중요하다. 폴리디메틸실록산(PDMS)은, 경화될 경우 심지어 상당히 돋아나온(relief) 표면에 대해서도 스탬프와 표면의 우수한 등각 접촉을 가능하게 할 정도로 충분히 탄성이고, 이 접촉은 수용체 "잉크"의 금 필름으로의 효과적인 접촉 이동(transfer)에 필수적이다. PDMS의 탄성 성질은 또한 스탬프가 마스터에서 제거될 경우 중요하다: 만약 스탬프가 마스터와 마찬가지로 단단하다면, 2가지 기질중 하나를 손상시키지 않고 경화후 스탬프와 마스터을 분리하기 곤란할 것이다. PDMS는 또한 서브미크론 단위의 치수를 가진 특성이더라도 그 모양을 유지하기에 충분히 단단하다. 패턴은 200 nm 폭과 같은 작은 선으로 성공적으로 발생하였다. PDMS의 표면은 낮은 계면자유에너지(y = 22.1 dyne/cm)를 가지며, 스탬프는 금속화 필름에 견고하게 부착하지 않는다. 스탬프는 동일한 스탬프가 성능의 심각한 저하 없이 몇 달에 걸쳐 100 번까지 사용될 수 있다는 점에서 내구성이 우수하다. PDMS의 중합체 특성은 스탬프로 하여금 심하게 팽윤하지 않고 알칸티올 잉크를 흡수하게 함으로써 잉킹 공정에서 중요한 역활을 담당한다. 스탬프는 연속 프린팅 작업이 가능하도록 프린팅 롤상에서 생산될 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물의 더욱 상세한 설명이 따른다. 본 명세서에서 인용된 모든 문헌은 참고문헌으로써 채택된다.

금속 물질이 침착될 수 있다면 어느 열가소성 필름이라도 본 발명에서 중요하다. 열가소성 필름의 예로는 폴리에틸렌-테레프탈레이트(MYLAR

), 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌, 아크릴로니트릴-메틸 아크릴레이트 공중합체, 셀로판, 에틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트, 셀룰로오스 프로피오네이트, 셀룰로오스 트리아세테이트와 같은 셀룰로오스 중합체, 셀룰로오스 트리아세테이트, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체, 이오노머(에틸렌 중합체) 폴리에틸렌-나일론 공중합체, 폴리프로필렌, 메틸 펜텐 중합체, 폴리비닐 플루오라이드 및 방향족 폴리술폰과 같은 중합체가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 가소성 필름은 80% 초과의 광투명도를 가진다. 다른 적합한 열가소성 플라스틱 공급업자는(supplier)는 예를 들어, "Modern Plastics Encyclopedia(McGraw-Hill Publishing Co., New York 1923-1996)" 와 같은 참고문헌에서 발견할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 그 위에 금속으로 코팅된 열가소성 필름은 약 5% 에서 95% 사이의 광투명도를 가진다. 본 발명에서 사용되는 열가소성 필름에 대한 더욱 바람직한 광투명도는 약 20% 에서 80% 사이이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 열가소성 필름은 최소한 약 80% 광투명도를 가지며, 금속 코팅의 두께는 회절 패턴이 반사되거나 또는 투과된 광에 의해 형성될 수 있도록 20%를 초과하는 광투명도를 유지할 수 있을 정도이다. 이는 약 20 nm 두께의 금속 코팅에 상응한다. 그러나, 본 발명의 다른 실시양태에서는, 금 두께는 약 1 nm 에서 1000 nm 사이일 수 있다.

필름상의 침착을 위한 바람직한 금속은 금이다. 그러나, 은, 알루미늄, 크롬, 구리, 철, 지르코늄, 백금 및 니켈 뿐 만 아니라 이들 금속의 산화물이 사용될 수 있다. 산화크롬이 금속화된 층을 만드는 데 사용될 수 있다.

원칙적으로, 적절한 크기의 주름을 갖는 표면이 마스터로서 사용될 수 있다. 미세접촉 프린팅 방법은 탄성 스탬프가 주조되는 적합한 릴리프 구조로 시작한다. 이 '마스터' 주형(template)은 사진석판술로 또는 상업적으로 이용가능한 회절 격자와 같은 다른 방법에 의해 생길 수 있다. 한가지 실시양태에서, 스탬프는 폴리디메틸실록산으로부터 제조될 수 있다.

한가지 실시양태에서, 본 발명은 광활성 수용체 표면이 배열되고 배치되어 목적하는 한가지 분석물에 대해 표면상에서 다수의 시료의 동시 분석이 가능하게 하고 자동화된 액체 취급 기구(예를 들어 피펫기구)가 배열되고 배치되어 시료 또는 시약 용액을 표면에 분배하게 하는 광분석 장치를 특징으로 한다.

본 발명은 광범위한 응용분야를 가지며, 각종 특정 결합쌍 분석법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 장치는 항원 또는 항체 탐지용 면역 검정법에서 사용될 수 있다. 장치는 핵산의 탐지뿐 만 아니라 효소활성의 결정 및 작은 유기 분자(예를 들어, 남용약물, 치료약물, 환경제)의 탐지용 직접적, 간접적 또는 경쟁적 탐지설계에 사용에 채택될 수 있다.

스탬프는 공기 또는 알칸티올의 과잉 확산을 방지하기 위해 물과 같은 유체하에서 적용될 수 있다. 대량 또는 연속적인 프린팅법을 위해, 공기속에서 프린팅하는 것이 바람직한데, 그 이유는 짧은 접촉시간이 이들 방법에 적합하기 때문이다.

본 발명의 한가지 실시양태에서, 패턴은 수용체층을 가진 금속화된 열가소성 중합체상에 형성된다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 패턴의 릴리이프는 수용체층 으로 형성된다. 스탬핑 공정후, 임의로 플라스틱상의 금속화된 지역은 예를 들어 헥사데실메르캅탄과 같은 메틸 종결된 단일층으로 부동화된다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 더 잘 예시될 수 있으나, 이것이 본 발명의 범위를 한정하는 수단으로 곡해되어서는 안 될 것이다. 그와는 반대로, 본 명세서를 읽은 후, 본 발명의 정신을 훼손하지 않고 그들 자신이 당업자들에게 제안할 수 있는 각종 다른 실시양태, 변형 및 그의 대응예예 의지하게 될 수 있다는 것을 명확히 인지하어야 할 것이다.

실시예 1

항체의 "E. coli 0157:H7(Kirkegard & Perry Labs)"로의 유도체화의 예는 다음과 같다. 450 ㎕ 인산염 완충 식염수(PBS) 및 술포-LC-SPDP(Pierce Catalog #21650)의 10 mM 수용액 50 ㎕를 항체 1 mG에 첨가하였다. 실온에서 60분 후, D-Salt^TM 폴리아크릴아미드 탈염 칼럼(Pierce, Rockford, IL)중에서 용액의 염을 제거한다. 만약 이어서 이황화결합의 환원이 행해진다면, 아세테이트 염, pH 4.5를 사용하었고, 만약 항원 유도체가 이황화물로서 잔존한다면, PBS 완충제, pH 7.5를 사용하였다. 500 ㎕ 분획물을 칼럼으로부터 모았고, 항체 유도체를 가진 분획물은 Coomassie

Plus 단백질 분석을 사용하여 결정하였다.

실시예 2

실시에 1에서 생성되는 티올화 항체, 즉 이황화물 또는 티올을 금 코팅된 밀 라

상에서 접촉 프린팅시킨다. 탄성 스탬프를 0.5 mG/mL 농도의 티올화된 항체중에 적시고, 이어서 스탬프를 질소기체하에서 건조시키고, 이어서 금 코팅된 밀라

필름과 10 내지 120초간 접촉시킨다.

실시예 3

본 실시예에서는, 축합 형태가 생성된다. 실시예 2에서 기술된 바와 같은 프린팅후, 비-패턴화된 지역은 헥사데칸티올과 같은 다른 티올과 반응된다. 축합 형태가 남아있었고, 이는 티올화된 항체가 흡착되고 배출되지 않았다는 것을 나타낸다. 프린팅된 표면의 효소 결합 면역흡착제 분석(ELISA)결과 패턴화된지역에서 양성이었고, 이는 패턴중에 활성 항체가 존재함을 입증한다(도 4). ELISA는 실시예 1에서 사용된 대장균(E. coli) 항체에 특이적인 항체와 결합된 과산화효소를 이용하였다. 패턴화된 항체 샌드위치상의 테트라메틸벤지덴 침전은 회절 패턴을 형성하였다. 항원으로 변형된 폴리스티렌 대용물 입자표면은 또한 수용체층에 패턴화된 흡착을 형성한다. 테트라메틸벤지덴 침전에 의해 형성된 회절 패턴은 도 6에 나타나있다.

실시예 4

통상적인 기술을 사용하여 E Coli 0157:H7 항원(Kirkegaard & Perry Labs, Cat# 50-95-90)의 에틸디메틸아미노디카르보디이미드(EDAC-Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)를 1 마이크론 폴리스티렌 라텍스구에 카르보디이미드 결합시켜 대용물 폴리스티렌 입자를 생산하였다. 디이미드 2 wt% 용액을 카르복실레이트로 변형된 PS 라텍스(Bangs: 10¹⁰ 입자/mL)과 4시간 동안 반응시키고, 이어서 이 활성 입자들을 항원의 400 uG/mL 용액에 노출시켰다. 10⁸ 입자/mL로 희석된 이 대용물을 실시예 2에서 기술된 바와 같이 생산된 E. Coli 0157:H7의 패턴화된 항원을 함유하는 센서에 60분간 노출시켰다. 인산염 완충액으로 세척한 후, 시료를 건조시키고, 사진촬영(도 5)한 결과, 실시예 3에서 기술된 바와 같은 회절패턴을 형성하는 것으로 나타났다.

실시예 5

자기 집합 단일층(SAM)의 존재를 알 수 있는 한가지 판정기준은 화학 에칭제에 대한 증가된 내성이고, 알칸 티올 자기집합 단일층의 존재는 금에 시아나이드 에칭에 대한 내성을 부여하는 것으로 입증된다. 본 발명의 티올화 단백질 또는 올리고뉴클레오티드 결합제가 금위에서 보호 SAM을 형성하는지 여부를 정하기 위해 시아나이드 에칭을 수행한다. 금 코팅된 폴리에스테르 필름(35 nM 금 두께)을 칸디다 알비칸(0.5 mG/mL), 티올화 단백질 G(0.5 mG/mL), 티올화 올리고뉴클레오티드(10 ㎛)에 대한 티올화 항체, 또는 칸디다 알비칸(오직 물리흡착; 0.5 mG/mL)에 대한 비유도체화 항체의 수용액에 노출시켰고, 금위에서 SAM을 형성하는 것으로 알려진 헥사데칸 티올의 에탄올 용액(HDT;5.7 mM)을 양성대조용(positive control)으로서 사용하였다. 티올 함유 결합제에 16시간 노출시킨후, 코팅된 금 시료를 제거하고, 용매(물 또는 에탄올)로 완전히 씻어 내고, 질소기류하에서 건조시켰다.

결합제 코팅된 시료를 수산화칼륨(0.5 M) 함유 시안화칼륨 수용액(100 mM)에 담그고, 한편 공기(산소)를 용액에 버블링하였다. 11분간 에칭한 후, 시료를 제거하고, 물로 씻어 내고, 육안으로 잔존하는 금의 양을 평가하였다. 표 1은 관찰 결과를 요약한 것이다. HDT 시료가 그 표면상에서 가장 금이 많이 남아있는 유일한 시료이다. 티올화 항체는 아주 적은 양의 금(약 5% 유효범위)을 가졌고, 나머지 시료는 에칭후 금이 전혀 남아있지 않았다. 이러한 결과는 HDT와 다르게 광회절 바이오센서를 제조하기 위해 사용된 티올화 결합제는 보호 SAM을 형성하지 않는다는 것을 보여준다.

시아나이드 에칭 실험 요약

시료	에칭후 관찰 결과
헥사데칸 티올(HDT)	70-80%
티올화 항체	약 5%(랜덤 반점)
항체(표면상에 물리흡착됨)	잔존 금 없음
티올화 단백질 G	잔존 금 없음
티올화 올리고뉴클레오티드	잔존 금 없음

실시예 6

칸디다 알비칸에 대한 패턴화된 항체를 가진 시료를 하기와 같이 제조하였다. 금/폴리에스테르(10 nM 금 두께)를 베타 카세인(시그마 카탈로그 # C6905)의 5 mG/mL 인산염완충식염수 용액(pH 7.2)에 10분간 담그어 사전처리하였다. 시료를 증류수로 완전히 씻어내고, 강질소 기류하에서 건조시켰다. 10-마이크론 지름원의 x, y 배열을 가진 폴리디메틸 실록산 스탬프를 사용하여 접촉 프린팅을 수행하였다. 스탬프를 0.5 mG/mL 항체 유도체 수용액에 담그어 칸디다 알비칸에 티올화 항체(초기 다중클론 항체는 Fitzgerald Industries International, Inc., 미국 메사츠세츠주 콩코드로부터의 카탈로그 # 20-CR04 이었음)로 코팅하였다. 10분 후, 스탬프를 제거하고, 강한 질소기류를 사용하여 완전히 건조시켰다. 카세인 처리 시료상에서 접촉프린팅을 수행하였고, 이 때 노출시간은 1초 내지 2분이 적합하였다. 접촉시간은 2분이 바람직하였다. 프린팅후, 시료를 다시 증류수로 씻어 내고, 건조시켰다.

테이프를 벗긴 성인 팔뚝피부를 밀리리터당 10⁶ 효모세포 농도로 접종하고, 센서를 테이프 함유 효모의 최상부에 올려 놓음으로써 칸디다 알비칸의 발아관(germ tube)-함유(bearing) 세포에 센서 시료를 노출시켰다. 효모세포의 센서로의 전이는 몇 초만의 접촉(도 7)에 의해 달성된다. 효모세포의 센서로의 패턴화된 부착을 현미경분석에 의해 확인하었고, 레이저로 방사선조사 결과 회절상을 얻었다(도8).

칸디다 알비칸의 발아관-함유 세포로 접종되었던 다른 표면은 한천평판 및 HUGGIES

베이비 와이프(Baby Wipe) 였다. 또한, 항체 기초 센서에 이들 표면을 노출시킨 결과 세포의 패턴화된 부착 및 회절상이 얻어졌다.

당업자들은 이제 본 발명의 정신을 훼손하지 않고, 예시된 실시예에 관해서 본 명세서에 개시된 발명에 어떤 변형이 가능하다는 것을 알 수 있을 것이다. 본 발명은 바람직한 실시예의 관점에서 기술되었지만, 본 발명은 무수한 재배치, 변형 및 변경에 적합하고 또한 이와 같은 모든 재배치, 변형 및 변경은 첨부된 청구의 범위에 속하게 됨을 의도한다는 것을 인식하여야 할 것이다.

Claims

금속으로 코팅된 중합체 필름, 및

이 중합체 필름상에 프린팅되며, 분석물과 특이적으로 결합하는 수용체물질을 그 위에 갖는 패턴화된 수용체층

을 포함하는 바이오센서.
제 1항에 있어서, 상기 패턴화된 수용체층이, 바이오센서가 분석물이 결합될 때 투과광 또는 반사광을 회절시켜 회절패턴을 형성시킬 수 있는 양식으로 프린팅된 바이오센서.
제 2항에 있어서, 회절패턴이 가시적인 것인 바이오센서.
제 3항에 있어서, 회절패턴이 육안으로 보이는 것인 바이오센서.
제 2항에 있어서, 회절패턴이 홀로그램을 형성하는 것인 바이오센서.
제 1항에 있어서, 금속이 금, 은, 크롬, 니켈, 백금, 알루미늄, 철, 구리, 산화크롬 또는 지르코늄인 바이오센서.
제 6항에 있어서, 금속이 금인 바이오센서.
제 6항에 있어서, 금속 코팅의 두께가 약 1 nm 에서 1000 nm 사이인 바이오센서.
제 1항에 있어서, 중합체 필름이 폴리에틸렌-테레프탈레이트, 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌, 아크릴로니트릴-메틸 아크릴레이트 공중합체, 셀로판, 에틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트, 셀룰로오스 프로피오네이트, 셀룰로오스 트리아세테이트와 같은 셀룰로오스 중합체, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체, 이오노머(에틸렌 중합체) 폴리에틸렌-나일론 공중합체, 폴리프로필렌, 메틸 펜텐 중합체, 폴리비닐 플루오라이드 및 방향족 폴리술폰인 바이오센서.
제 9항에 있어서, 중합체 필름이 폴리에틸렌-테레프탈레이트인 바이오센서.
제 1항에 있어서, 열가소성 필름이 광학적으로 투명한 바이오센서.
제 1항에 있어서, 열가소성 필름이 5% 에서 95% 사이의 광투명도를 갖는 바이오센서.
제 1항에 있어서, 열가소성 필름이 약 20% 에서 80% 사이의 광투명도를 갖는 바이오센서.
제 1항에 있어서, 패턴화된 수용체층이 하기 일반식을 갖는 화합물로부터 형성된 것인 바이오센서.

X-R-Y

상기식에서,

X는 중합체 필름상의 금속 또는 금속 산화물과 반응성인 기이고,

R은 임의의 연결기이고,

Y는 임의의 목적하는 특성을 갖는 화합물이다.
제 14항에 있어서, R의 길이가 0 내지 12개의 탄소원자인 바이오센서.
제 14항에 있어서, X가 하기 식으로 이루어진 화합물로부터 발생되는 바이오센서.
제 1항에 있어서, 분석물이 박테리아, 효모, 진균, 바이러스, 류머티스인자, IgG, IgM, IgA 및 IgE 항체, 암배아성 항원, 연쇄구균(Streptococcus) A군 항원, 바이러스 항원, 자기면역질환과 관련된 항원, 알레르겐, 종양 항원, 연쇄구균 B군 항원, HIV I 또는 HIV II 항원, 항체 바이러스, RSV에 특이적인 항원, 항체, 항원, 효소, 호르몬, 다당류, 단백질, 지질., 탄수화물, 약물 또는 핵산, 수막염균(Neisseria meningitides) 군 A, B, C, Y 및 W 서브 135, 폐렴쌍구균(Streptococcus pneumoniae), 대장균(E. Coli) K1, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) 타입 B, 미생물로부터 유래한 항원, 합텐, 남용약물, 치료약물, 환경제, 또는 간염에 특이적인 항원인 바이오센서.
제 17항에 있어서, 분석물이 박테리아, 효모, 진균 또는 바이러스인 바이오센서.
제 1항에 있어서, 수용체 물질이 항원, 항체, 뉴클레오티드, 킬레이터, 효소, 박테리아, 효모, 진균, 바이러스, 섬모 박테리아, 편모 박테리아 물질, 핵산, 다당류, 지질, 단백질, 탄수화물, 금속, 호르몬 및 상기 물질에 대한 수용체인 바이오센서.
제 19항에 있어서, 진균이 칸디다종인 바이오센서.
제 19항에 있어서, 박테리아가 살모넬라종인 바이오센서.
제 1항에 있어서, 바이오센서가 용기의 내벽에 부착되어 있는 바이오센서.
제 22항에 있어서, 용기가 바이알인 바이오센서.
제 21항에 있어서, 용기가 식품 용기인 바이오센서.
제 1항에 있어서, 바이오센서가 가먼트의 내벽에 부착되어 있는 바이오센서.
제 24항에 있어서, 가먼트가 기저귀인 바이오센서.
제 1항에 있어서, 분석물이 입자에 부착되어 있는 바이오센서.
제 27항에 있어서, 입자가 유리, 셀룰로오스, 라텍스, 폴리스티렌, 폴리카르보네이트, 단백질 또는 미생물 세포로 이루어진 바이오센서.
제 27항에 있어서, 입자가 약 0.2 nm 내지 50 nm인 바이오센서.
제 29항에 있어서, 입자가 약 0.4 ㎛ 내지 1㎛인 바이오센서.
제 29항에 있어서, 입자크기가 하기 식에 의해 정해지는 바이오센서.

t_opt = λ/2(n2-n1)

상기식에서,

t_opt = 입자의 최적 높이

λ= 입사광의 파장

n2 = 입자의 굴절율

n1 = 주위매질의 굴절율.
금속으로 코팅된 중합체 필름,

및 이 중합체 필름상에 프린팅되며, 분석물과 특이적으로 결합하는 수용체 물질을 그 위에 갖는 패턴화된 수용체층을 포함하는 바이오센서에 분석물을 접촉시키는 단계,

분석물이 패턴화된 수용체층에 결합되어 있는 바이오센서를 통해 광을 투과시켜 회절패턴을 형성시키는 단계

를 포함하는 분석물의 탐지방법.
제 32항에 있어서, 광이 바이오센서로부터 반사되는 것인 방법.
제 32항에 있어서, 회절패턴이 가시적인 것인 방법.
제 34항에 있어서, 회절패턴이 육안으로 보이는 것인 방법.
제 32항에 있어서, 회절패턴이 홀로그램을 형성하는 것인 방법.
제 32항에 있어서, 금속이 금, 은, 크롬, 니켈, 백금, 알루미늄, 철, 구리, 산화크롬 또는 지르코늄으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
제 37항에 있어서, 금속이 금인 방법.
제 37항에 있어서, 금속 코팅의 두께가 약 1 nm 에서 1000 nm 사이인 방법.
제 32항에 있어서, 중합체 필름이 폴리에틸렌-테레프탈레이트, 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌, 아크릴로니트릴-메틸 아크릴레이트 공중합체, 셀로판, 에틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트, 셀룰로오스 프로피오네이트, 셀룰로오스 트리아세테이트와 같은 셀룰로오스 중합체, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체, 이오노머(에틸렌 중합체) 폴리에틸렌-나일론 공중합체, 폴리프로필렌, 메틸 펜텐 중합체, 폴리비닐 플루오라이드 및 방향족 폴리술폰인 방법.
제 40항에 있어서, 중합체 필름이 폴리에틸렌-테레프탈레이트인 방법.
제 32항에 있어서, 열가소성 필름이 광학적으로 투명한 것인 방법.
제 32항에 있어서, 열가소성 필름이 5% 내지 95%의 광투명도를 갖는 방법.
제 32항에 있어서, 열가소성 필름이 약 20% 내지 80%의 광투명도를 갖는 방법.
제 32항에 있어서, 패턴화된 수용체층이 하기 일반식을 갖는 화합물로부터 형성된 것인 방법.

X-R-Y

상기식에서,

X는 중합체 필름상의 금속 또는 금속 산화물과 반응성인 기이고,

R은 임의의 연결기이고,

Y는 임의의 목적하는 특성을 갖는 화합물이다.
제 45항에 있어서, R의 길이가 0 내지 12개의 탄소 원자인 방법.
제 45항에 있어서, X가 하기 화학식으로 이루어진 화합물로부터 발생되는 방법.
제 32항에 있어서, 분석물이 박테리아, 효모, 진균, 바이러스, 류머티스인자, IgG, IgM, IgA 및 IgE 항체, 암배아성 항원, 연쇄구균(Streptococcus) A군 항원, 바이러스 항원, 자기면역질환과 관련된 항원, 알레르겐, 종양 항원, 연쇄구균 B군 항원, HIV I 또는 HIV II 항원, 항체 바이러스, RSV에 특이적인 항원, 항체, 항원, 효소, 호르몬, 다당류, 단백질, 지질, 탄수화물, 약물 또는 핵산, 수막염균(Neisseria meningitides) 군 A, B, C, Y 및 W 서브 135, 폐렴쌍구균(Streptococcus pneumoniae), 이.콜라이(E. coli) K1, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) 타입 B, 미생물로부터 유래한 항원, 합텐, 남용약물, 치료약물, 환경제, 또는 간염에 특이적인 항원인 방법.
제 48항에 있어서, 분석물이 박테리아, 효모, 진균 또는 바이러스인 방법.
제 49항에 있어서, 진균이 칸디다종인 방법.
제 49항에 있어서, 박테리아가 살모넬라종인 방법.
제 32항에 있어서, 수용체 물질이 항원, 항체, 뉴클레오티드, 킬레이터, 효소, 박테리아, 효모, 진균, 바이러스, 섬모 박테리아, 편모 박테리아 물질, 핵산, 다당류, 지질, 단백질, 탄수화물, 금속, 호르몬 및 상기 물질에 대한 수용체인 방법.
제 32항에 있어서, 바이오센서가 용기의 내벽에 부착되어 있는 방법.
제 53항에 있어서, 용기가 바이알인 방법.
제 54항에 있어서, 용기가 식품 용기인 방법.
제 32항에 있어서, 바이오센서가 가먼트의 내벽에 부착되어 있는 방법.
제 56항에 있어서, 가먼트가 기저귀인 방법.
제 32항에 있어서, 분석물이 입자에 부착되어 있는 방법.
제 58항에 있어서, 입자가 유리, 셀룰로오스, 라텍스, 폴리스티렌, 폴리카르보네이트, 단백질 또는 미생물 세포로 이루어진 방법.
제 58항에 있어서, 입자가 약 0.2 nm 내지 50 nm인 방법.
제 60항에 있어서, 입자가 약 0.4 ㎛ 내지 1 ㎛ 인 방법.
제 58항에 있어서, 입자크기가 하기 식에 의해 정해지는 방법.

t_opt = λ/2(n2-n1)

상기식에서,

t_opt = 입자의 최적 높이

λ= 입사광의 파장

n2 = 입자의 굴절율

n1 = 주위매질의 굴절율
분석물이 패턴화된 수용체층에 결합한 후, 그것에 의해 패턴화된 수용체층이 회절상을 형성할 수 있는 양식으로 금속으로 코팅된 중합체 필름에 수용체층을 적용시키는 것을 포함하는 바이오센서의 제조 방법.
a. 금속으로 코팅된 중합체 필름, 및

이 중합체 필름상에 프린팅되며, 분석물과 특이적으로 결합하여 분석물/제1 수용체 물질 접합물을 형성하는 제1 수용체 물질을 그 위에 갖는 패턴화된 수용체층을 포함하는 바이오센서에 분석물을 접촉시키는 단계,

b. 분석물/제1 수용체 물질 접합물에 특이적으로 결합하며, 침전물을 형성하는 물질에 결합되어 있는 제2 수용체 물질에, 분석물/제 1 수용체 물질 접합물을 갖는 바이오센서를 접촉시키는 단계,

c. 단계 b로부터의 바이오센서를 침전의 형성을 야기할 시약과 접촉시키는 단계, 및

d. 분석물이 패턴화된 수용체층에 결합되어 있는 바이오센서를 통해 광을 투과시켜 회절패턴을 형성시키는 단계를 포함하는 분석물의 탐지방법.
제 64항에 있어서, 침전물을 형성하는 물질이 과산화효소 또는 콜로이드성 금인 방법.
제 64항에 있어서, 시약이 테트라메틸벤지덴 또는 할로겐화은인 방법.
제 64항에 있어서, 제 2 수용체 물질이 제 1 수용체 물질에 특이적인 것인 방법.
제 64항에 있어서, 제 1 수용체 물질이 효소에 접합된 항체인 방법.
제 64항에 있어서, 제 2 수용체 물질이 항체인 방법.