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KR100523409B1 - 9,11-에폭시 스테로이드의 제조방법 및 이 제조방법에유용한 중간체 - Google Patents

9,11-에폭시 스테로이드의 제조방법 및 이 제조방법에유용한 중간체 Download PDF

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KR100523409B1
KR100523409B1 KR10-2004-7021389A KR20047021389A KR100523409B1 KR 100523409 B1 KR100523409 B1 KR 100523409B1 KR 20047021389 A KR20047021389 A KR 20047021389A KR 100523409 B1 KR100523409 B1 KR 100523409B1
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Abstract

다중 신규 반응식, 신규 공정 단계 및 신규 중간체가 에폭시멕스레논 및 화학식 I
(화학식 I)
(식에서, -A-A-는 -CHR4-CHR5- 또는 -CR4=CR5- 기를 나타내고,
R3, R4 및 R5 는 독립적으로 수소, 할로, 히드록시, 저급 알킬, 저급 알콕시, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시 카르보닐, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1은 알파-배향의 저급 알콕시카르보닐 또는 히드록시알킬 라디칼을 나타내고;
-B-B- 는 -CHR6-CHR7- 기 또는 알파- 또는 베타- 배향의 기
(화학식 III)
(식에서, R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로, 저급 알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노 및 아릴옥시로부터 선택된다)를 나타내고;
R8 및 R9 는 독립적으로 수소, 히드록시, 할로, 저급 알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R8 및 R9 는 함께 카르보고리형 또는 헤테로고리형 고리 구조를 구성하거나, 또는 R6 또는 R7 과 함께 5-원 고리형 D 고리에 융합된 카르보고리형 또는 헤테로고리형 고리 구조를 구성한다)의 다른 화합물의 합성을 위해 제공된다.

Description

9,11-에폭시 스테로이드의 제조방법 및 이 제조방법에 유용한 중간체 {PROCESSES FOR PREPARATION OF 9,11-EPOXY STEROIDS AND INTERMEDIATES USEFUL THEREIN}
(기술분야)
본 발명은 9,11-에폭시 스테로이드 화합물, 특히 20-스피록산 시리즈와 그것들의 유사체들을 제조하기 위한 신규한 제조 방법, 스테로이드 화합물을 제조하는데 유용한 신규한 중간체들, 및 그러한 신규한 중간체들을 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 메틸 하이드로겐 9,11α-에폭시-17α-히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤 (에플레레논 또는 에폭시멕스레논으로도 언급됨)을 제조하기 위한 신규하고 유익한 방법에 관한 것이다.
(배경기술)
20-스피록산 시리즈 화합물을 제조하는 방법은 미국 특허 제 4,559,332 호에 설명되어 있다. 상기 미국 특허 제 4,559,332 호의 방법에 따라 제조된 화합물들은 하기 일반식의 개방된 산소 (open oxygen)를 함유하는 고리 E 를 가지고 있으며:
(화학식 IA)
(상기 식에서, -A-A- 는 -CH2-CH2- 또는 -CH=CH- 기를 나타내고;
R1 은 α-배향의 저급 알콕시카르보닐 또는 히드록시카르보닐 기를 나타내며;
-B-B- 는 -CH2-CH2- 기 또는 α- 또는 β-배향의 하기 기 III:
(화학식 III)
(상기 식에서, R6 및 R7 은 수소이다)을 나타내고;
X 는 두 개의 수소 원자 또는 옥소기를 나타내며;
Y1 및 Y2 는 함께 산소 가교 -O- 를 나타내거나, 또는 Y1 은 히드록시를 나타내고 Y2 는 히드록시, 저급 알콕시 또는 만약 X 가 H2 를 나타내는 경우 저급 알카노일옥시기를 나타낸다.)
X 가 옥소를 나타내고 Y2 가 히드록시를 나타내는 그러한 화합물의 염, 즉 해당하는 17β-히드록시-21-카르복실산의 염을 포함한다.
미국 특허 제 4,559,332 호에는 에폭시멕스레논 및 상기 식 IA 의 관련 화합물들을 제조하기 위한 많은 방법들이 설명되어 있다. 에폭시멕스레논을 새롭게 더 폭넓은 임상적인 용도로 사용하게 됨으로써 상기 및 다른 관련된 스테로이드들의 개선된 제조 방법이 필요하게 되었다.
본 발명의 주요 목적은 에폭시멕스레논, 다른 20-스피록산 및 공통된 구조적 특징을 가지고 있는 다른 스테로이드들의 개선된 제조 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 특징적인 목적들은: 일반식 IA 의 생성물 및 다른 관련된 화합물들을 고수율로 제조하는 개선된 제조 방법을 제공하고; 최소한의 단리 단계를 포함하는 그러한 제조 방법을 제공하며; 타당한 자본 비용을 제공할 수 있고 타당한 전환비용으로 작동될 수 있는 그러한 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 에폭시멕스레논에 대한 일련의 합성 방법; 에폭시멕스레논의 제조에 유용한 중간체들; 및 그러한 신규한 중간체들의 합성에 관한 것이다.
신규한 합성 방법은 바람직한 구체예의 설명 부분에서 상세하게 설명된다. 본 발명의 신규한 중간체들중에는 다음과 같은 것들이 있다.
일반식 IV 의 화합물은 다음의 구조를 갖는다:
(화학식 IV)
상기 식에서, -A-A- 는 -CHR4-CHR5- 또는 -CR4=CR5- 기를 나타내고;
R3, R4 및 R5 는 독립적으로 수소, 할로, 히드록시, 저급 알킬, 저급 알콕시, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시 카르보닐, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
R1 은 알파-배향의 저급 알콕시카르보닐 또는 히드록시카르보닐기를 나타내고;
R2 는 11α-이탈기로, 이것의 분리는 9- 와 11- 탄소 원자사이의 이중결합을 생성하는데 효과적이며;
-B-B- 는 -CHR6-CHR7- 기 또는 알파- 또는 베타- 배향의 다음의 기 III:
(화학식 III)
(상기 식에서, R6 및 R7 은 독립적으로 수소, 할로, 저급 알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어지는 군으로부터 선택된다)을 나타내고;
R8 및 R9 는 독립적으로 수소, 히드록시, 할로, 저급 알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 R8 및 R9 는 함께 카르보고리형 또는 헤테로고리형 고리 구조를 구성하거나, 또는 R6 또는 R7 과 함께 5-원 고리형 D 고리에 융합된 카르보고리형 또는 헤테로고리형 고리 구조를 구성한다.
식 IVA 의 화합물은 R8 및 R9 가 그것들에 부착되는 탄소와 함께 하기 구조를 형성하는 식 IV 의 화합물에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C(17)은 상기 정의된 바와 같다.
식 IVB 의 화합물은 R8 및 R9 가 함께 식 XXXIII 의 구조를 형성하는 식 IV 의 화합물에 상응한다:
(화학식 XXXII)
식 IVC, IVD 및 IVE 의 화합물들은 각각, -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소이며, R1 이 알콕시카르보닐, 바람직하게는 메톡시카르보닐인 식 IV, IVA, 또는 IVB 의 화합물에 해당한다. 식 IV 의 범주내에 속해있는 화합물들은 저급 알킬술포닐화제 또는 아실화제, 또는 할라이드 생성제를 식 V 의 범주내에 속하는 상응하는 화합물과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
식 V 의 화합물은 다음의 구조에 해당한다:
(화학식 V)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R1, R3, R8 및 R9 는 식 IV 에서 정의된 바와 같다.
식 VA 의 화합물은 R8 및 R9 가 그것들에 부착되는 탄소와 함께 다음의 구조를 형성하는 식 V 의 화합물에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C(17)은 상기 정의된 바와 같다.
식 VB 의 화합물은 R8 및 R9 가 함께 식 XXXIII 의 구조를 형성하는 식 IV 의화합물에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
식 VC, VD 및 VE 의 화합물들은 각각, -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소이며, R1 이 알콕시카르보닐, 바람직하게는 메톡시카르보닐인 식 V, VA, 또는 VB 의 화합물에 해당한다. 식 V 의 범주내에 있는 화합물들은 알칼리 금속 알콕시드를 식 VI 의 상응하는 화합물과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
식 VI 의 화합물은 다음 구조에 해당한다:
(화학식 VI)
상기 식에서 -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 IV 에서 정의된 바와 같다.
식 VIA 의 화합물은 R8 및 R9 가 그것들에 부착되는 고리 탄소와 함께 다음의 구조를 형성하는 식 VI 에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C(17)은 상기 정의된 바와 같다.
식 VIB 의 화합물은 R8 및 R9 가 함께 다음의 식 XXXIII 을 형성하는 식 VI 에 상응한다:
(화학식 XXXIII)
식 VIC, VID 및 VIE 의 화합물들은 각각, -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 VI, VIA, 또는 VIB 에 해당한다. 식 VI, VIA, VIB 및 VIC 의 화합물들은 각각 식 VII, VIIA, VIIB 또는 VIIC 의 상응하는 화합물을 가수분해함으로써 제조된다.
식 VII 의 화합물은 다음의 구조에 해당한다:
(화학식 VII)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 IV 에서 정의된 바와 같다.
식 VIIA 의 화합물은 R8 및 R9 가 그것들에 부착되는 고리 탄소와 함께 다음의 구조를 형성하는 식 VII 에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
*
상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C(17)은 상기 정의된 바와 같다.
식 VIIB 의 화합물은 R8 및 R9 가 함께 다음의 식 XXXIII 을 형성하는 식 VII 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
식 VIIC, VIID 및 VIIE 의 화합물들은 각각, -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 VII, VIIA, 또는 VIIB 중 어느 것에 해당한다. 식 VII 의 범주내에 있는 화합물은 식 VIII 의 범주내에 있는 화합물을 시안화함으로써 제조될 수 있다.
식 VIII 의 화합물은 다음의 구조에 해당한다:
(화학식 VIII)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 상기 식 IV 에서 정의된 바와 같다.
식 VIIIA 의 화합물은 R8 및 R9 가 그것들에 부착되는 고리 탄소와 함께 다음의 구조를 형성하는 식 VIII 에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C(17)은 상기 정의된 바와 같다.
식 VIIIB 의 화합물은 R8 및 R9 가 함께 다음의 식 XXXIII 을 형성하는 식 VIII 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
식 VIIIC, VIIID 및 VIIIE 의 화합물들은 각각, -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 VIII, VIIIA, 또는 VIIIB 중 어느 것에 해당한다. 식 VIII 의 범주내에 있는 화합물들은 하기에서 설명되는 바와 같은 식 XXX 의 화합물을 포함하고 있는 기질을, 11-히드록시기를 기질안에 α-배향으로 도입시키기에 효과적인 발효에 의하여 산화시킴으로써 제조된다.
식 IX 의 화합물은 다음의 구조에 해당한다:
(화학식 IX)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 IV 에서 정의된 바와 같고, R1 은 식 V 에서 정의된 바와 같다.
식 IXA 의 화합물은 R8 및 R9 가 그것들에 부착되는 고리 탄소와 함께 다음의 구조를 형성하는 식 IX 에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C(17)은 상기 정의된 바와 같다.
식 IXB 의 화합물은 R8 및 R9 가 그것들에 부착되는 고리 탄소와 함께 식 XXXIII 을 형성하는 식 IX 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
식 IXC, IXD 및 IXE 의 화합물들은 각각, -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 IX, IXA, 또는 IXB 중 어느 것에 해당한다. 식 IX 의 범주내에 있는 화합물들은 식 X 의 범주내에 있는 해당하는 화합물을 생체내 전환시킴으로써 제조될 수 있다.
식 XIV 의 화합물은 다음의 구조에 해당한다:
(화학식 XIV)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 IV 에서 정의된 바와 같다.
식 XIVA 의 화합물은 R8 및 R9 가 그것들에 부착되는 고리 탄소와 함께 다음의 구조를 형성하는 식 XIV 에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C(17)은 상기 정의된 바와 같다.
식 XIVB 의 화합물은 R8 및 R9 가 그것들에 부착되는 고리 탄소와 함께 다음의 식 XXXIII 의 구조를 형성하는 식 XIV 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
식 XIVC, XIVD 및 XIVE 의 화합물들은 각각, -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 XIV, XIVA, 또는 XIVB 중 어느 것에 해당한다. 식 XIV 의 범주내에 있는 화합물들은 식 XV 의 범주내에 있는 해당하는 화합물을 가수분해함으로써 제조될 수 있다.
식 XV 의 화합물은 다음의 구조에 해당한다:
(화학식 XV)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 IV 에서 정의된 바와 같다.
식 XVA 의 화합물은 R8 및 R9 가 그것들에 부착되는 고리 탄소와 함께 다음의 구조를 형성하는 식 XV 에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C(17)은 상기 정의된 바와 같다.
식 XVB 의 화합물은 R8 및 R9 가 그것들에 부착되는 고리 탄소와 함께 다음의 식 XXXIII 의 구조를 형성하는 식 XV 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
식 XVC, XVD 및 XVE 의 화합물들은 각각, -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 XV, XVA, 또는 XVB 중 어느 것에 해당한다. 식 XV 의 범주내에 있는 화합물들은 식 XVI 의 범주내에 있는 해당하는 화합물을 시안화함으로써 제조될 수 있다.
식 XXI 의 화합물은 다음의 구조에 해당한다:
(화학식 XXI)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 IV 에서 정의된 바와 같다.
식 XXIA 의 화합물은 R8 및 R9 가 그것들에 부착되는 고리 탄소와 함께 다음의 구조를 형성하는 식 XXI 에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C(17)은 상기 정의된 바와 같다.
식 XXIB 의 화합물은 R8 및 R9 가 함께 다음의 식 XXXIII 의 구조를 형성하는 식 XXI 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
식 XXIC, XXID 및 XXIE 의 화합물들은 각각, -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 XXI, XXIA, 또는 XXIB 중 어느 것에 해당한다. 식 XXI 의 범주내에 있는 화합물들은 식 XXII 의 범주내에 있는 해당하는 화합물을 가수분해함으로써 제조될 수 있다.
식 XXII 의 화합물은 다음의 구조에 해당한다:
(화학식 XXII)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 IV 에서 정의된 바와 같다.
식 XXIIA 의 화합물은 R8 및 R9 가 그것들에 부착되는 고리 탄소와 함께 다음의 구조를 형성하는 식 XXII 에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C(17)은 상기 정의된 바와 같다.
식 XXIIB 의 화합물은 R8 및 R9 가 함께 다음의 식 XXXIII 의 구조를 형성하는 식 XXII 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
식 XXIIC, XXIID 및 XXIIE 의 화합물들은 각각, -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 XXII, XXIIA, 또는 XXIIB 중 어느 것에 해당한다. 식 XXII 의 범주내에 있는 화합물들은 식 XXIII 의 범주내에 있는 화합물을 시안화함으로써 제조될 수 있다.
식 XXIII 의 화합물은 다음의 구조에 해당한다:
(화학식 XXIII)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 IV 에서 정의된 바와 같다.
식 XXIIIA 의 화합물은 R8 및 R9 가 그것들에 부착되는 고리 탄소와 함께 다음의 구조를 형성하는 식 XXIII 에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C(17)은 상기 정의된 바와 같다.
식 XXIIIB 의 화합물은 R8 및 R9 가 함께 다음의 식 XXXIII 의 구조를 형성하는 식 XXIII 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
식 XXIIIC, XXIIID 및 XXIIIE 의 화합물들은 각각, -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 XXIII, XXIIIA, 또는 XXIIIB 중 어느 것에 해당한다. 식 XXIII 의 범주내에 있는 화합물들은 식 XXIV 의 화합물을 하기에서 설명되는 바와 같이 산화함으로써 제조될 수 있다.
식 XXVI 의 화합물은 다음의 구조에 해당한다:
(화학식 XXVI)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 IV 에서 정의된 바와 같다.
식 XXVIA 의 화합물은 -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 XXVI 에 해당한다. 식 XXVI 의 범주내에 있는 화합물들은 식 XXVII 의 범주내에 있는 화합물을 산화함으로써 제조될 수 있다.
식 XXV 의 화합물은 다음의 구조에 해당한다:
(화학식 XXV)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 IV 에서 정의된 바와 같다.
식 XXVA 의 화합물은 -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 XXV 에 해당한다. 식 XXV 의 범주내에 있는 화합물들은 식 XXVI 의 화합물을 시안화함으로써 제조될 수 있다.
식 104 의 화합물은 다음의 구조에 해당한다:
상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 IV 에서 정의된 바와 같고, R11 은 C1 내지 C4 알킬이다.
식 104A 의 화합물은 -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 104 에 해당한다. 식 104 의 범주내에 있는 화합물들은 식 103 의 화합물을 열 분해시킴으로써 제조될 수 있다.
식 103 의 화합물은 다음의 구조에 해당한다:
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3 및 R11 은 식 104 에서 정의된 바와 같고, R12 는 C1 내지 C4 알킬이다.
식 103A 의 화합물은 -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 103 에 해당한다. 식 103 의 범주내에 있는 화합물들은 식 102 의 해당하는 화합물을 알칼리 금속 알콕시드와 같은 염기의 존재하에 디알킬 말로네이트와 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
식 102 의 화합물은 다음의 구조에 해당한다:
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3 및 R11 은 식 104 에서 정의된 바와 같다.
식 102A 의 화합물은 -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 102 에 해당한다. 식 102 의 범주내에 있는 화합물들은 식 101 의 해당하는 화합물을 염기의 존재하에 트리알킬 술포늄 화합물과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
식 101 의 화합물은 다음의 구조에 해당한다:
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3 및 R11 은 식 104 에서 정의된 바와 같다.
식 101A 의 화합물은 -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 101 에 해당한다. 식 101 의 범주내에 있는 화합물들은 11α-히드록시안드로스텐-3,17-디온 또는 식 XXXVI 의 다른 화합물을 산의 존재하에 트리알킬 오르토포르메이트와 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
식 XL 의 화합물은 다음의 식에 해당한다:
(화학식 XL)
상기 식에서, -E-E- 는 다음의 기들:
(화학식 XLIII)
(화학식 XLIV)
(화학식 XLV)
(화학식 XLVI)
및
(화학식 XLVII)
중에서 선택되며, R21, R22 및 R23 은 독립적으로 수소, 알킬, 할로, 니트로, 및 시아노로부터 선택되며; R24 는 수소 및 저급 알킬중에서 선택되고; R80 및 R90 은 독립적으로 케토 및 R8 및 R9 (식 IV 에 대하여 상기에서 정의된 바와 같음)를 구성할 수 있는 치환체들로부터 선택되며; -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 IV 에서 정의된 바와 같다.
식 XLA 의 화합물은 R21, R22 및 R23 이 독립적으로 수소, 할로겐 및 저급 알킬 중에서 선택되는 식 XL 에 해당한다.
식 XLB 의 화합물은 -E-E- 가 식 XLIII, XLIV, XLV 또는 XLVII 에 해당하는 식 XLA 에 해당한다. 식 XLC 의 화합물은 -E-E- 가 식 XLV 에 해당하는 식 XLB 에 해당한다. XLD 의 화합물은 -E-E- 가 식 XLVII 에 해당하는 식 XLB 에 해당한다.
식 XLE 의 화합물은 R80 및 R90 이 그것들에 부착되는 고리 탄소 원자와 함께 케토 또는 하기 식을 구성하는 식 XL 에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
(상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C(17) 은 상기에서 정의된 바와 같다);
또는
(화학식 XXXIII)
식 XLIE 의 화합물은 R80 및 R90 이 함께 케토를 형성하는 식 XL 에 해당한다.
식 XLF, XLG, XLH, XLJ, XLM, 및 XLN 의 화합물들은 각각 -A-A-, -B-B- 및 R3 이 상기에서 정의된 바와 같은 식 XL, XLA, XLB, XLC, XLD 및 XLE 의 화합물들에 해당한다.
식 XLI 의 화합물은 다음의 식에 해당한다:
(화학식 XLI)
상기 식에서, -E-E- 는 다음의 기들:
(화학식 XLIII)
(화학식 XLV)
(화학식 XLVI)
및
(화학식 XLVII)
중에서 선택되며, R18 은 C1 내지 C4 알킬이거나 또는 R18O- 기는 함께 O,O-옥시알킬렌 가교를 형성하고; R21, R22 및 R23 은 독립적으로 수소, 알킬, 할로, 니트로, 및 시아노로부터 선택되며; R24 는 수소 및 저급 알킬중에서 선택되고; R80 및 R90 은 독립적으로 케토 및 R8 및 R9 를 구성할 수 있는 치환체들로부터 선택되며; -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 IV 에서 정의된 바와 같다.
식 XLIA 의 화합물은 R21, R22 및 R23 이 독립적으로 수소, 할로겐 및 저급 알킬 중에서 선택되는 식 XLI 에 해당한다.
식 XLIB 의 화합물은 -E-E- 가 식 XLIII, XLIV, XLV 또는 XLVII 에 해당하는 식 XLIA 에 해당한다.
식 XLIC 의 화합물은 R80 및 R90 이 그것들에 부착되는 고리 탄소 원자와 함께 케토 또는 하기 식을 구성하는 식 XLI 에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
(상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C(17) 은 상기에서 정의된 바와 같다)
식 XLID 의 화합물은 치환체 XXXIV 가 구조식 XXXIII 에 해당하는 식 XLI 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
식 XLIE 의 화합물은 R80 및 R90 이 함께 케토를 형성하는 식 XLI 에 해당한다.
식 XLIF, XLIG, XLIH, XLIJ, XLIM, 및 XLIN 의 화합물들은 각각 -A-A-, -B-B- 및 R3 이 상기에서 정의된 바와 같은 식 XLI, XLIA, XLIB, XLIC, XLID 및 XLIE 의 화합물들에 해당한다. 식 XLI 의 범주내에 있는 화합물들은 식 XL 의 해당하는 화합물들을 하기에서 규정되는 바와 같이 가수분해함으로써 제조된다.
식 XLII 의 화합물은 하기 식에 해당한다:
(화학식 XLII)
상기 식에서, -E-E- 는 다음의 기들:
(화학식 XLIII)
(화학식 XLIV)
(화학식 XLV)
(화학식 XLVI)
및
(화학식 XLVII)
중에서 선택되고, R21, R22 및 R23 은 독립적으로 수소, 알킬, 할로, 니트로, 및 시아노로부터 선택되며; R24 는 수소 및 저급 알킬중에서 선택되고; R80 및 R90 은 독립적으로 케토 및 R8 및 R9 를 구성할 수 있는 치환체들로부터 선택되며; -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 IV 에서 정의된 바와 같다.
식 XLIIA 의 화합물은 R21, R22 및 R23 이 독립적으로 수소, 할로겐 및 저급 알킬 중에서 선택되는 식 XLII 에 해당한다.
식 XLIIB 의 화합물은 -E-E- 가 식 XLIII, XLIV, XLV 또는 XLVII 에 해당하는 식 XLIIA 에 해당한다.
식 XLIIC 의 화합물은 R80 및 R90 이 그것들에 부착되는 고리 탄소와 함께 케토 또는 하기 식을 구성하는 식 XLII 에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
(상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C(17) 은 상기에서 정의된 바와 같다)
식 XLIID 의 화합물은 치환체 XXXIV 가 구조식 XXXIII 에 해당하는 식 XLII 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
식 XLIIE 의 화합물은 R80 및 R90 이 함께 케토를 형성하는 식 XLII 에 해당한다. 식 XLIIF, XLIIG, XLIIH, XLIIJ, XLIIM, 및 XLIIN 의 화합물들은 각각 -A-A- 및 -B-B- 가 -CH2-CH2 이고 R3 이 수소인 식 XLII, XLIIA, XLIIB, XLIIC, XLIID 및 XLIIE 에 해당한다. 식 XLII 의 범주내에 있는 화합물들은 식 XLI 의 해당하는 화합물을 탈보호함으로써 제조된다.
식 XLIX 의 화합물은 하기 식에 해당한다:
(화학식 XLIX)
상기 식에서, -E-E- 는 식 XL 에서 정의된 바와 같고, -A-A-, -B-B-, R1, R3, R8 및 R9 는 식 IV 에서 정의된 바와 같다.
식 XLIXA 의 화합물은 R8 및 R9 가 그것들에 부착되는 고리 탄소와 함께 하기 구조식을 형성하는 식 XLIX 에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C (17) 은 상기에서 정의된 바와 같다.
식 XLIXB 의 화합물은 R8 및 R9 가 함께 하기 구조식 XXXIII 을 형성하는 식 XLIX 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
식 XLIXC, XLIXD, XLIXE 의 화합물들은 각각 -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2 이고 R3 이 수소이며 R1 이 알콕시카르보닐, 바람직하게는 메톡시카르보닐인 식 XLIX, XLIXA 또는 XLIXB 의 어느 하나에 해당한다. 식 XLIX 의 범주내에 있는 화합물들은 알코올성 또는 수성 용매를 적당한 염기의 존재하에 식 VI 의 해당하는 화합물과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
식 A203 의 화합물은 하기 식에 해당한다:
(화학식 A203)
상기 식에서, -E-E- 는 다음의 기들:
(화학식 XLIII)
(화학식 XLV)
(화학식 XLVI)
및
(화학식 XLVII)
중에서 선택되고, R18 은 C1 내지 C4 알킬 중에서 선택되며; R21 , R22 및 R23 은 독립적으로 수소, 알킬, 할로, 니트로, 및 시아노로부터 선택되고; R24 는 수소 및 저급 알킬중에서 선택되며; -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 IV 에서 정의된 바와 같다.
식 A203A 의 화합물은 R21, R22 및 R23 이 독립적으로 수소, 할로겐 및 저급 알킬중에서 선택되는 식 A203 에 해당한다.
식 A203B 의 화합물은 -E-E- 가 식 XLIII, XLIV, XLV 또는 XLVII 에 해당하는 식 A203A 에 해당한다.
식 A203C, A203D, 및 A203E 의 화합물들은 각각, -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 A203, A203A, 및 A203B 에 해당한다. 식 A203 의 범주내에 있는 화합물들은 식 A202 의 화합물을 하기에서 설명되는 바와 같이 환원시킴으로써 제조된다.
식 A204 의 화합물은 다음 구조식에 해당한다:
(화학식 A204)
상기 식에서, R19 는 C1 내지 C4 알킬이고 -E-E-, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 203 에서 정의된 바와 같다.
식 A204A 의 화합물은 R21, R22 및 R23 이 독립적으로 수소, 할로겐 및 저급 알킬중에서 선택되는 식 A204 에 해당한다.
식 A204B 의 화합물은 -E-E- 가 식 XLIII, XLIV, XLV 또는 XLVII 에 해당하는 식 A204A 에 해당한다.
식 A204C, A204D, 및 A204E 의 화합물들은 각각, -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 A204, A204A, 및 A204B 에 해당한다. 식 A204 의 범주내에 있는 화합물들은 식 A203 의 해당하는 화합물들을 가수분해함으로써 제조된다.
식 A205 의 화합물은 다음 구조식에 해당한다:
(화학식 A205)
상기 식에서, R20 은 C1 내지 C4 알킬이고 -E-E-, R19, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 204 에서 정의된 바와 같다.
식 A205A 의 화합물은 R21, R22 및 R23 이 독립적으로 수소, 할로겐 및 저급 알킬중에서 선택되는 식 A205 에 해당한다.
식 A205B 의 화합물은 -E-E- 가 식 XLIII, XLIV, XLV 또는 XLVII 에 해당하는 식 A205A 에 해당한다.
식 A205C, A205D, 및 A205E 의 화합물들은 각각, -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 A205, A205A, 및 A205B 에 해당한다. 식 A205 의 범주내에 있는 화합물들은 식 A204 의 해당하는 화합물들을 알칸올 및 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
식 A206 의 화합물은 다음 구조식에 해당한다:
(화학식 A206)
*상기 식에서, R19, R20, -E-E-, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 205 에서 정의된 바와 같다.
식 A206A 의 화합물은 R21, R22 및 R23 이 독립적으로 수소, 할로겐 및 저급 알킬중에서 선택되는 식 A206 에 해당한다.
식 A206B 의 화합물은 -E-E- 가 식 XLIII, XLIV, XLV 또는 XLVII 에 해당하는 식 A206A 에 해당한다.
식 A206C, A206D, 및 A206E 의 화합물들은 각각, -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 A206, A206A, 및 A206B 에 해당한다. 식 A206 의 범주내에 있는 화합물들은 식 A205 의 범주내에 있는 해당하는 화합물을 트리알킬 술포늄 할라이드와 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
식 A207 의 화합물은 다음 구조식에 해당한다:
(화학식 A207)
상기 식에서, R25 는 C1 내지 C4 알킬이고 -E-E-, R19, R20 , -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 A205 에서 정의된 바와 같다.
식 A207A 의 화합물은 R21, R22 및 R23 이 독립적으로 수소, 할로겐 및 저급 알킬중에서 선택되는 식 A207 에 해당한다.
식 A207B 의 화합물은 -E-E- 가 식 XLIII, XLIV, XLV 또는 XLVII 에 해당하는 식 A207A 에 해당한다.
식 A207C, A207D, 및 A207E 의 화합물들은 각각, -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 A207, A207A, 및 A207B 에 해당한다. 식 A207 의 화합물들은 식 A206 의 화합물들을 디알킬 말로네이트와 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
식 A208 의 화합물은 다음 구조식에 해당한다:
(화학식 A208)
상기 식에서, -E-E-, R80 및 R90 은 식 XLII 에서 정의된 바와 같고; -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 104 에서 정의된 바와 같으며; R19, R20, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 205 에서 정의된 바와 같다.
식 A208A 의 화합물은 R21 및 R22 가 독립적으로 수소, 할로겐 및 저급 알킬중에서 선택되는 식 A208 에 해당한다.
식 A208B 의 화합물은 -E-E- 가 식 XLIII, XLIV, XLV 또는 XLVII 에 해당하는 식 A208A 에 해당한다.
식 A208C 의 화합물은 R80 및 R90 이 그것들에 부착되는 고리 탄소와 함께 케토 또는 하기 식을 구성하는 식 A208 에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C(17) 은 상기에서 정의된 바와 같다.
식 A208D 의 화합물들은 치환체 XXXIV 가 하기 구조식 XXXIII 에 해당하는 식 A208C 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
식 A208E, A208F, A208G, A208H 및 A208J 의 화합물들은 각각 -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 A208, A208A, A208B, A208C 및 A208D 에 해당한다. 식 A208 의 범주내에 있는 화합물들은 식 A207 의 해당하는 화합물들을 열 분해함으로써 제조될 수 있다.
식 A209 의 화합물은 다음 구조식에 해당한다:
(화학식 A209)
상기 식에서, R80 및 R90 은 식 XLI 에서 정의된 바와 같고, -E-E- 및 -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 205 에서 정의된 바와 같다.
식 A209A 의 화합물은 R21 및 R22 가 독립적으로 수소, 할로겐 및 저급 알킬중에서 선택되는 식 A209 에 해당한다.
식 A209B 의 화합물은 -E-E- 가 식 XLIII, XLIV, XLV 또는 XLVII 에 해당하는 식 A209A 에 해당한다.
식 A209C 의 화합물은 -E-E- 가 식 XLIV 에 해당하는 식 A209B 에 해당한다.
식 A209D 의 화합물은 R80 및 R90 이 그것들에 부착되는 고리 탄소와 함께 케토 또는 하기 식을 구성하는 식 A208 에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C(17) 은 상기에서 정의된 바와 같다.
식 A209E 의 화합물들은 치환체 XXXIV 가 하기 구조식 XXXIII 에 해당하는 식 209D 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
식 A209F, A209G, A209H, A209J, A209L 및 A209M 의 화합물들은 각각 -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 A209, A209A, A209B, A209C, A209D 및 A209E 에 해당한다. 식 A209 의 범주내에 있는 화합물들은 식 A208 의 해당하는 화합물을 가수분해함으로써 제조될 수 있다.
식 A210 의 화합물은 다음 구조식에 해당한다:
(화학식 A210)
상기 식에서, R80 및 R90 은 식 XLI 에서 정의된 바와 같고, 치환기 -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 IV 에서 정의된 바와 같다.
식 A210A 의 화합물은 R80 및 R90 이 그것들에 부착되는 고리 탄소와 함께 케토 또는 다음 식을 구성하는 식 A210 에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C(17) 은 상기에서 정의된 바와 같다.
식 A210B 의 화합물은 치환체 XXXIV 가 다음 구조식 XXXIII 에 해당하는 식 A210A 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
식 A210C 의 화합물은 R80 및 R90 이 함께 케토를 형성하는 식 A210A 에 해당한다.
식 A210D, A210E, A210F 및 A210G 의 화합물들은 각각, -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 A210, A210A, A210B 및 A210C 에 해당한다. 식 210 의 범주내에 있는 화합물들은 -E-E- 가 인 식 209 의 화합물을 에폭시화함으로써 제조될 수 있다.
식 A211 의 화합물은 다음 식에 해당한다:
(화학식 A211)
상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 상기에서 정의된 바와 같다.
식 A211A 의 화합물은 R 및 R 이 함께 케토 또는 다음 식을 구성하는 식 A211 에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C(17) 은 상기에서 정의된 바와 같다.
식 A211B 의 화합물들은 치환체 XXXIV 가 구조식 XXXIII 에 해당하는 식 A211A 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
식 A211C 의 화합물들은 R80 및 R90 이 함께 케토를 형성하는 식 A210A 에 해당한다.
식 A211D, A211E, A211F, 및 A211G 의 화합물들은 각각, -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소인 식 A211, A211A, A211B 및 A211C 에 해당한다. 식 A211 의 범주내에 있는 화합물들은 식 A210 의 해당하는 화합물을 산화함으로써 제조될 수 있거나; 또는 -E-E- 가 C = CH- 인 식 A209 의 해당하는 화합물을 에폭시화하는 과정중에 제조될 수 있다. 식 A211 의 화합물들은 하기에서 설명되는 방식으로 식 I 의 화합물들로 전환될 수 있다.
식 L 의 화합물은 다음 구조식에 해당한다:
(화학식 L)
상기 식에서, R11 은 C1 내지 C4 알킬이고, -A-A-, -B-B-, R1, R2, R3, R8 및 R9 는 상기에서 정의된 바와 같다.
식 LA 의 화합물은 R8 및 R9 가 그것들에 부착되는 탄소 원자와 함께 다음 식을 구성하는 식 L 에 해당한다:
(화학식 XXXIV)
상기 식에서, X, Y1 및 Y2 는 상기에서 정의된 바와 같다.
식 LB 의 화합물들은 R8 및 R9 가 다음 식 XXXIII 에 상응하는 식 L 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
식 LC, LD, LE 의 화합물들은 각각, -A-A- 및 -B-B- 의 각각이 -CH2-CH2- 이고 R3 이 수소인 식 L, LA 및 LB 에 해당한다.
하기에서 설명되는 구체적인 반응 방법의 설명을 토대로, 이들 화합물이 특정 반응 방법에 대하여 아주 크게 활용된다는 것이 명백해질 것이다. 본 발명의 화합물들은 에폭시멕스레논 및 다른 스테로이드들에 대한 중간체로서 유용하다.
다른 목적 및 특징들도 이하에서 부분적으로 명백해지고 부분적으로 지적될 것이다.
바람직한 구체예의 설명
본 발명에 따라, 다음 식 I 에 부합하는 에폭시멕스레논 및 다른 화합물들을 제조하기 위한 다양한 신규 방법 방법이 고안되었다:
(화학식 I)
상기 식에서, -A-A- 는 -CHR4-CHR5- 또는 -CR4=CR5- 기를 나타내고;
R3, R4 및 R5 는 독립적으로 수소, 할로, 히드록시, 저급 알킬, 저급 알콕시, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 시아노 및 아릴옥시로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
R1 은 알파-배향의 저급 알콕시카르보닐 또는 히드록시알킬 기를 나타내고;
-B-B- 는 기 -CHR6-CHR7- 또는 알파- 또는 베타-배향의 하기 기 III:
(화학식 III)
(상기 식에서, R6 및 R7 은 독립적으로 수소, 할로, 저급 알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어지는 군으로부터 선택된다)을 나타내며;
R8 및 R9 는 독립적으로 수소, 히드록시, 할로, 저급 알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 R8 및 R9 는 함께 카르보고리형 또는 헤테로고리형 고리 구조를 구성하거나, 또는 R8 또는 R9 는 R6 또는 R7 과 함께 5-원 고리형 D 고리에 융합된 카르보고리형 또는 헤테로고리형 고리 구조를 구성한다.
*다른 언급이 없으면, 본 발명의 명세서에서 "저급" 으로 언급된 유기 기들은 최소한 7, 바람직하게는 1 내지 4 개의 탄소 원자를 함유한다.
저급 알콕시카르보닐 기는 바람직하게는 1 내지 4 개의 탄소 원자를 가지고 있는 알킬기, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸 및 tert-부틸 기로부터 유도된 것들이며; 특히 바람직한 것은 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐 및 이소프로폭시카르보닐 기이다. 저급 알콕시 기는 바람직하게는 상기 언급된 C1-C4 알킬 기들중 하나로부터 유도된 것, 특히 일차 C1-C 4 알킬 기로부터 유도된 것으로, 특히 바람직한 것은 메톡시 기이다. 저급 알카노일 기는 바람직하게는 1 내지 7 개의 탄소 원자를 가지고 있는 직쇄의 알킬로부터 유도된 것으로, 특히 바람직한 것은 포르밀 및 아세틸 기이다.
15- 와 16-위치 사이에 있는 메틸렌 가교는 바람직하게는 β-배향의 것이다.
본 발명의 방법들에 따라 제조될 수 있는 화합물들의 바람직한 부류는 미국 특허 제 4,559,332 호에 기재되어 있는 20-스피록산 화합물들로, 하기 식 IA 에 부합하는 것들이다:
(화학식 IA)
상기 식에서,
-A-A- 는 -CH2-CH2- 또는 -CH=CH- 기를 나타내고;
-B-B- 는 -CH2-CH2- 기 또는 알파- 또는 베타-배향의 하기 식 IIIA 를 나타내며:
(화학식 IIIA)
R1 은 알파-배향의 저급 알콕시카르보닐기 또는 히드록시카르보닐기를 나타내고;
X 는 두 개의 수소 원자, 옥소 또는 =S 를 나타내며;
Y1 및 Y2 는 함께 산소 가교 -O- 를 나타내거나, 또는
Y1 은 히드록시기를 나타내고 Y2 는 히드록시, 저급 알콕시 기를 나타내거나, 또는 만약 X 가 H2 를 나타내면, 또한 저급 알카노일옥시 기를 나타낸다.
바람직한 것은, 본 발명의 신규한 방법에 따라 제조된 20-스피록산 화합물들은 Y1 및 Y2 가 함께 산소 가교 -O- 를 나타내는 식 I 의 화합물들이다.
특히 바람직한 식 I 의 화합물들은 X 가 옥소기를 나타내는 식 I 의 화합물들이다. X 가 옥소기를 나타내는 식 IA 의 20-스피록산 화합물중에서, 가장 바람직한 것은 Y1 이 Y2 와 함께 산소 가교 -O- 를 나타내는 것들이다.
앞에서 언급된 바와 같이, 17β-히드록시-21-카르복실산은 또한 그것의 염 형태로 존재할 수 있다. 특히 금속 및 암모늄 염, 예컨대 알칼리 금속 및 알칼리 토금속 염, 예를 들면 나트륨, 칼슘, 마그네슘 및, 바람직하게는, 칼륨 염, 및 암모니아 또는 적당한, 바람직하게는 생리적으로 허용되는 유기 질소-함유 염기로부터 유도된 암모늄 염을 고려해볼 수 있다. 염기로서는 아민, 예를 들면 저급 알킬아민 (예컨대 트리에틸아민), 히드록시-저급 알킬아민 (예컨대 2-히드록시에틸아민, 디-(2-히드록시에틸)-아민 또는 트리-(2-히드록시에틸)-아민), 시클로알킬아민 (예컨대 디시클로헥실아민) 또는 벤질아민 (예컨대 벤질아민 및 N,N'-디벤질에틸렌디아민) 뿐만 아니라, 질소-함유 헤테로고리형 화합물, 예를 들면 방향족 특성을 가지고 있는 질소-함유 헤테로고리형 화합물 (예컨대 피리딘 또는 퀴놀린) 또는 최소한 부분적으로 포화된 헤테로고리형 고리를 가지고 있는 질소-함유 헤테로고리형 화합물 (예컨대 N-에틸피페리딘, 모르폴린, 피페라진 또는 N,N'-디메틸피페라진)이 고려된다.
또한 가장 바람직한 화합물로서는 R1 이 알콕시카르보닐을 나타내고, X 가 옥소를 타나내며, Y1 및 Y2 의 각각이 히드록시를 나타내는 식 IA 의 화합물의 알칼리 금속 염, 특히 칼륨염이다.
특히 바람직한 식 I 및 IA 의 화합물들은 예를 들면 다음과 같은 것들이 있다:
9α,11α-에폭시-7α-메톡시카르보닐-20-스피록스-4-엔-3,21-디온,
9α,11α-에폭시-7α-에톡시카르보닐-20-스피록스-4-엔-3,21-디온,
9α,11α-에폭시-7α-이소프로폭시카르보닐-20-스피록스-4-엔-3,21-디온, 및
상기 화합물들의 각각의 1,2-탈수 유사체;
9α,11α-에폭시-6α,7α-메틸렌-20-스피록스-4-엔-3,21-디온,
9α,11α-에폭시-6β,7β-메틸렌-20-스피록스-4-엔-3,21-디온,
9α,11α-에폭시-6β,7β;15β,16β-비스메틸렌-20-스피록스-4-엔-3,21-디온, 및
상기 화합물들의 각각의 1,2-탈수 유사체;
9α,11α-에폭시-7α-메톡시카르보닐-17β-히드록시-3-옥소-프레근-4-엔-21-카르복실산,
9α,11α-에폭시-7α-에톡시카르보닐-17β-히드록시-3-옥소-프레근-4-엔-21-카르복실산,
9α,11α-에폭시-7α-이소프로폭시카르보닐-17β-히드록시-3-옥소-프레근-4-엔-21-카르복실산,
9α,11α-에폭시-17β-히드록시-6α,7α-메틸렌-3-옥소-프레근-4-엔-21-카르복실산,
9α,11α-에폭시-17β-히드록시-6β,7β-메틸렌-3-옥소-프레근-4-엔-21-카르복실산,
9α,11α-에폭시-17β-히드록시-6β,7β;15β,16β-비스메틸렌-3-옥소-프레근-4-엔-21-카르복실산, 및
이들 산 각각의 알칼리 금속 염, 특히 칼륨 염 또는 암모늄, 및 언급된 카르복실산의 각각의 또는 그것의 염의 상응하는 1,2-탈수 유사체;
9α,11α-에폭시-15β,16β-메틸렌-3,21-디옥소-20-스피록스-4-엔-7α-카르복실산 메틸 에스테르, 에틸 에스테르 및 이소프로필 에스테르,
9α,11α-에폭시-15β,16β-메틸렌-3,21-디옥소-20-스피록사-1,4-디엔-7α-카르복실산 메틸 에스테르, 에틸 에스테르 및 이소프로필 에스테르,
9α,11α-에폭시-3-옥소-20-스피록스-4-엔-7α-카르복실산 메틸 에스테르, 에틸 에스테르 및 이소프로필 에스테르,
9α,11α-에폭시-6β,6β-메틸렌-20-스피록스-4-엔-3-온,
9α,11α-에폭시-6β,7β;15β,16β-비스메틸렌-20-스피록스-4-엔-3-온,
9α,11α-에폭시-17β-히드록시-17α-(3-히드록시-프로필)-3-옥소-안드로스트-4-엔-7α-카르복실산 메틸 에스테르, 에틸 에스테르 및 이소프로필 에스테르,
9α,11α-에폭시-17β-히드록시-17α-(3-히드록시프로필)-6α,7α-메틸렌-안드로스트-4-엔-3-온,
9α,11α-에폭시-17β-히드록시-17α-(3-히드록시프로필)-6β,7β-메틸렌-안드로스트-4-엔-3-온,
9α,11α-에폭시-17β-히드록시-17α-(3-히드록시프로필)-6β,7β;15β,16β-비스메틸렌-안드로스트-4-엔-3-온, 및
상기 언급된 안드로스탄 화합물들의 17α-(3-아세톡시프로필) 및 17α-(3-포르밀옥시프로필) 유사체, 및 안드로스트-4-엔-3-온 및 20-스피록스-4-엔-3-온 시리즈의 모든 언급된 화합물들의 1,2-탈수 유사체.
식 I 및 IA 의 화합물들, 및 동일한 구조적 특징을 가지고 있는 유사 화합물들의 화학적 명칭은 다음의 방식으로 현재 통용되는 명명법을 따라 유도된다: Y1 이 Y2 와 함께 -O- 를 나타내는 화합물들에 대해서는, 20-스피록산 (예를 들어 X 가 옥소를 나타내고 Y1 이 Y2 와 함께 -O- 를 나타내는 식 IA 의 화합물은 20-스피록산-21-온으로부터 유도된다)으로; Y1 및 Y2 의 각각이 히드록시를 나타내고 X 가 옥소를 나타내는 화합물들에 대해서는, 17β-히드록시-17α-프레그넨-21-카르복실산으로; 및 Y1 과 Y2 의 각각이 히드록시를 나타내고 X 가 두 개의 수소 원자를 나타내는 화합물들에 대해서는, 17β-히드록시-17α-(3-히드록시프로필)-안드로스탄으로 명명한다. 고리형 및 열려 있는 사슬 형태, 즉 락톤 및 17β-히드록시-21-카르복실산 및 그것의 염들은 각각, 후자가 단순하게 전자의 탈수 형태로 간주될 정도로 상호간에 밀접하게 관련이 있기 때문에, 본원에서는 특별히 다른 언급이 없는 한, 식 I 의 최종 생성물 및 출발 물질 및 유사한 구조의 중간체가 모두, 각각의 경우에, 모든 언급된 형태가 함께 존재하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에 따라, 고수율로 및 타당한 비용으로 식 I 의 화합물을 제조하기 위하여 여러 가지의 별도의 제조 방법이 고안되었다. 합성 방법의 각각은 일련의 중간체의 제조를 통하여 진행된다. 많은 이들 중간체들이 신규한 화합물이며, 이들 중간체의 제조 방법도 또한 신규한 방법들이다.
방법 1: 칸레논 또는 관련 물질을 이용한 출발
식 I 의 화합물을 제조하기 위하여 바람직한 한가지 반응 방법은 칸레논 또는 하기 식 XIII 에 상응하는 관련된 출발 물질을 사용하여 시작된다 (또는 다르게는, 제조 방법은 안드로스텐디온 또는 관련 출발 물질을 사용하여 시작될 수 있다):
(화학식 XIII)
상기 식에서,
-A-A- 는 -CHR4-CHR5- 또는 -CR4=CR5- 기를 나타내고;
R3, R4 및 R5 는 독립적으로 수소, 할로, 히드록시, 저급 알킬, 저급 알콕시, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
-B-B- 는 기 -CHR6-CHR7- 또는 알파- 또는 베타-배향의 하기 기:
(화학식 III)
(상기 식에서, R6 및 R7 은 독립적으로 수소, 할로, 저급 알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어지는 군으로부터 선택된다)를 나타내고;
R8 및 R9 는 독립적으로 수소, 히드록시, 할로, 저급 알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 R8 및 R9 는 함께 케토, 카르보고리형 또는 헤테로고리형 고리 구조를 구성하거나, 또는 R8 및 R9 는 R6 또는 R7 과 함께 5-원 고리형 D 고리에 융합된 카르보고리형 또는 헤테로고리형 고리 구조를 구성한다.
도 1 및 2 에 도시된 유형의 생체전환 방법을 사용하여, α-배향의 11-히드록시기가 식 XIII 의 화합물에 도입되고, 그로써 하기 식 VIII 의 화합물이 제조된다:
(화학식 VIII)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 XIII 에 대하여 정의된 바와 같다. 바람직하게는, 식 XIII 의 화합물은 하기 구조식:
(화학식 XIIA)
을 가지는 것이 좋고, 11α-히드록시 생성물은 하기 구조식:
(화학식 VIIIA)
을 가지는 것이 좋으며, X 가 옥소를 나타내고 Y2 가 히드록시를 나타내는 화합물들의 염을 포함한다:
상기 각각의 식에서,
-A-A- 는 -CH2-CH2- 또는 -CH=CH- 기를 나타내고;
-B-B- 는 -CH2-CH2- 기 또는 알파- 또는 베타-배향의 하기 기:
(화학식 IIIA)
를 나타내며;
R3 은 수소, 저급 알킬 또는 저급 알콕시이고;
X 는 두 개의 수소 원자, 옥소 또는 =S 를 나타내며;
Y1 및 Y2 는 함께 산소 가교 -O- 를 나타내거나, 또는 Y1 은 히드록시를 나타내고, Y2 는 히드록시, 저급 알콕시를 나타내거나, 또는 만약 X 가 H2 를 나타낸다면, 또한 저급 알카노일옥시를 나타낸다.
보다 바람직한 것은, 반응에서 생성된 식 VIIIA 의 화합물이 -A-A- 및 -B-B- 가 각각 -CH2-CH2-이고; R3 이 수소이며; Y1, Y2 및 X 가 식 XIIIA 에 대해 정의된 바와 같고; R8 및 R9 가 함께 하기의 20-스피록산 구조를 형성하는 경우의 식 VIIIA 의 화합물에 해당하는 것이다:
(화학식 XXXIII)
이 히드록실화 단계에서 사용될 수 있는 바람직한 유기체중에는 아스페르길루스 오크라세우스 (Aspergillus ochraceus) NRRL 405, 아스페르길루스 오크라세우스 ATCC 18500, 아스페르길루스 니거 (A. niger) ATCC 16888 및 ATCC 26693, 아스페르길루스 니듈란스 (A. nidulans) ATCC 11267, 리조푸스 오리자에 (Rhizopus oryzae) ATCC 11145, 리조푸스 스톨로니퍼 (R. stolonifer) ATCC 6227b, 스트렙토마이세스 프라디애 (Streptomyces fradiae) ATCC 10745, 바실루스 메가테리움 (Bacillus megaterium) ATCC 14945, 슈도모나스 크루시비애 (Pseudomonas cruciviae) ATCC 13262, 및 트리코테시움 로세움 (Tricothecium roseum) ATCC 12543 이 있다. 다른 바람직한 유기체로는 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum f. sp. cepae) ATCC 11171 및 리조푸스 아리주스 (R. arrhizus) ATCC 11145 가 있다.
상기 반응에 대하여 활성을 나타내는 다른 유기체들로는 압시디아 코에룰라 (Absidia coerula) ATCC 6647, 압시디아 글라우카 (A. glauca) ATCC 22752, 악티노뮤코아 엘레간스 (Actinomucor elegans) ATCC 6476, 아스페르길루스 플라비페스 (A. flavipes) ATCC 1030, 아스페르길루스 푸미가투스 (A. fumigatus) ATCC 26934, 뷰베리아 바씨아나 (Beauveria bassiana) ATCC 7159 및 ATCC 13144, 보트리오스파에리아 옵투사 (Botryosphaeria obtusa) IMI 038560, 칼로넥트리아 데코라 (Calonectria decora) ATCC 14767, 캐토미움 코클리오데스 (Chaetomium cochliodes) ATCC 10195, 코리네스포라 카씨이콜라 (Corynectria cassiicola) ATCC 16718, 쿤닝가멜라 블라케스레에아나 (Cunninghamella blakesleeana) ATCC 8688a, 쿤닝가멜라 에키눌라타 (C. echinulata) ATCC 3655, 쿤닝가멜라 엘레간스 (C. elegans) ATCC 9245, 쿠르불라리아 클라바타 (Curvularia clavata) ATCC 22921, 쿠르불라리아 루나타 (C. lunata) ATCC 12017, 실린드로카르폰 라디시콜라 (Cylindrocarpon radicicola) ATCC 1011, 에피코쿰 휴미콜라 (Epicoccum humicola) ATCC 12722, 곤그로넬라 부틀레리 (Gongronella butleri) ATCC 22822, 히포마이세스 크리소스페르무스 (Hypomyces chrysospermus) ATCC IMI 109891, 모르티에렐라 이사벨리나 (Mortierella isabellina) ATCC 42613, 뮤코르 뮤세도 (Mucor mucedo) ATCC 4605, 뮤코르 그리세오-시아누스 (M. griseo-cyanus) ATCC 1207A, 미로테시움 베루카리아 (Myrothecium verrucaria) ATCC 9095, 노카르디아 코랄리나 (Nocardia corallina) ATCC 19070, 패실로마이세스 카르네우스 (Paecilomyces carneus) ATCC 46579, 페니실룸 파툴룸 (Penicillum patulum) ATCC 24550, 피토마이세스 아트로-올리바세우스 (Pithomyces atro-olivaceus) IFO 6651, 피토마이세스 시노돈티스 (P. cynodontis) ATCC 26510, 피크노스포리움 종 (Pycnosporium sp.) ATCC 12231, 사카로폴리스포라 에리트라 (Saccharopolyspora erythrae) ATCC 11635, 세페도니움 크리소스페르뭄 (Sepedonium chrysospermum) ATCC 13378, 스타킬리디움 비콜로 (Stachylidium bicolor) ATCC 12672, 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스 (S. hygroscopicus) ATCC 27438, 스트렙토마이세스 푸르푸라센스 (S. purpurascens) ATCC 25489, 신케팔라스트룸 라세모숨 (Syncephalastrum racemosum) ATCC 18192, 탐노스틸룸 피리포르메 (Thamnostylum piriforme) ATCC 8992, 티에라비아 테리콜라 (Thielavia terricola) ATCC 13807, 및 베르티실리움 테오브로매 (Verticillium theobromae) ATCC 12474 가 있다.
11α-히드록실화에 대해 활성을 보일 것으로 예상되는 추가의 유기체로는 케팔로스포리움 아피디콜라 (Cephalosporium aphidicola)[Phytochemistry (1996), 42(2), 411-415], 코클리오볼루스 루나타스 (Cochliobolus lunatas)[J. Biotechnol. (1995), 42(2), 145-150], 티에게멜라 오르키디스 (Tieghemella orchidis)[Khim.-Farm. Zh. (1986), 20(7), 871-876], 티에게멜라 히알로스포라 (T. hyalospora)[Khim.-Farm. Zh. (1986), 20(7), 871-876], 모노스포리움 올리바세움 (Monosporium olivaceum)[Acta Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2), 103-110], 아스페르길루스 우스투스 (A. ustus)[Acta Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2), 103-110], 푸사리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum)[Acta Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2), 103-110], 베르티실리움 글라우쿰 (Verticillium glaucum)[Acta Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2), 103-110], 및 리조푸스 니그리칸스 (R. nigricans)[J. Steroid Biochem. (1987), 28(2), 197-201]가 있다.
안드로스텐디온과 멕스레논의 11β-히드록시 유도체는 각각 실시예 19A 및 19B 에서 설명되는 생체내 전환 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명자들은 유추에 의해 C11α-히드록시 치환체 대신에 C11β-히드록시 치환체를 가지고 있는 식 VIII 의 화합물의 상응하는 β-히드록시 이성질체가 또한, 11β-히드록실화를 수행할 수 있는 적당한 미생물, 예컨대 본원에 기재된 하나 또는 그 이상의 미생물을 이용하여 유사한 생체내 전환 방법을 사용하여 제조될 수 있다고 가정하였다.
칸레논 또는 식 XIII 의 다른 기질의 히드록실화를 위하여 제조 규모의 발효에 대한 준비 작업으로, 세포 접종물이 시드 (seed) 발효기가 포함되어 있는 시드 발효 시스템, 또는 일련의 둘 또는 그 이상의 시드 발효기에서 제조된다. 첫 번째 시드 발효기안에 살아있는 (working) 스톡 포자 현탁액을, 세포 성장을 위해 영양 용액과 함께 도입시킨다. 만약 제조에 필요한 또는 요구되는 접종물 부피가 첫 번째 시드 발효기에서 제조되는 부피를 초과하면, 접종물 부피는 시드 발효 트레인에 남아있는 발효기를 통한 진행에 의하여 점진적으로 및 기하학적으로 증폭될 수 있다. 바람직하게는, 시드 발효 시스템에서 제조되는 접종물은 충분한 부피의 것이고, 제조 발효기안에서의 신속한 반응의 개시, 상대적으로 짧은 생성 배치 주기, 및 높은 제조 발효기 활성을 이루기 위하여 생육가능한 세포인 것이 좋다. 시드 발효기의 트레인안에 있는 용기의 수가 어떻든 간에, 두 번째 및 후속되는 시드 발효기들은 바람직하게는 트레인의 각 단계에서의 희석 정도가 본질적으로 동일하도록 크기가 정해진다. 각각의 시드 발효기에서 접종물의 초기 희석률은 제조 발효기에서의 희석률과 대략 동일할 수 있다. 칸레논 또는 식 XIII 의 다른 기질은 제조 발효기안으로 접종물 및 영양 용액과 함께 충전되고 그 안에서 히드록실화 반응이 수행된다.
시드 발효 시스템안으로 충전된 포자 현탁액은 사용전에 극저온 조건하에서 보관된 워킹 스톡 세포 뱅크로 구성된 다수의 바이알로부터 취해진 워킹 스톡 포자 현탁액의 바이알로부터 충전된 것이다. 워킹 스톡 세포 뱅크는 계속해서 다음의 방식으로 제조된 마스터 스톡 세포 뱅크로부터 유도된다. 적절한 공급원, 예컨대 ATCC 로부터 얻은 포자 표본을 처음에 수성 배지, 예컨대 식염수, 영양 용액 또는 계면활성 용액 (예컨대 비이온성 계면활성제, 예를 들면 약 0.001 중량 % 농도의 트윈 20)중에 현탁시키고, 배양 플레이트중에 현탁액을 분포시키면 그 플레이트에서 포자가 증식하게 된다. 이 때 배양 플레이트에는 전형적으로 비-소화성 다당류, 예컨대 당을 토대로 하여 고체 영양분 혼합물이 포함되어 있다. 고체 영양분 혼합물에는 바람직하게도 약 0.5 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 글루코오스, 약 0.05 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 질소 공급원, 예컨대 펩톤, 약 0.05 중량 % 와 약 0.5 중량 % 사이의 인 공급원, 예컨대 암모늄 또는 디포타슘 하이드로겐 포스페이트와 같은 알칼리 금속 포스페이트, 약 0.25 중량 % 와 약 2.5 중량 % 사이의 효모 용해물 또는 추출물 (또는 다른 아미노산 공급원, 예컨대 고기 추출물 또는 뇌-심장 융합물), 약 1 중량 % 와 약 2 중량 % 사이의 아가 또는 다른 비-소화성 다당류가 함유되어 있다. 임의로, 고체 영양분 혼합물에는 추가로 약 0.1 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 맥아 추출물이 포함 및/또는 함유될 수 있다. 고체 영양분 혼합물의 pH 는 바람직하게는 약 5.0 과 약 7.0 사이이며, 필요에 따라 알칼리 금속 수산화물 또는 오르토인산에 의해 조정된다. 유용한 고체 성장 배지에는 다음과 같은 것들이 있다:
1. 고체 배지 #1: 1 % 글루코오스, 0.25 % 효모 추출물, 0.3 % K2HPO4, 및 2% 아가 (Bacto); pH 는 20 % NaOH 로 6.5 로 조정됨.
2. 고체 배지 #2: 2 % 펩톤 (Bacto), 1 % 효모 추출물 (Bacto), 2 % 글루코오스, 및 2 % 아가 (Bacto); 10 % H3PO4 로 pH 를 5 로 조정됨.
3. 고체 배지 #3: 0.1 % 펩톤 (Bacto), 2 % 맥아 추출물 (Bacto), 2 % 글루코오스, 및 2 % 아가 (Bacto); pH 는 5.3 이다.
4. 액체 배지: 5 % 폐당밀, 0.5 % 콘스팁 액, 0.25 % 글루코오스, 0.25 % NaCl, 및 0.5 % KH2PO4; pH 는 5.8 로 조정됨.
5. 디프코 (Difco) 균류 아가 (낮은 pH).
마스터 스톡 세포 뱅크의 개발에 사용된 아가 플레이트의 수는 마스터 스톡에 대한 미래의 요구에 따라 선택될 수 있지만, 전형적으로 약 15 개 내지 약 30 개의 플레이트가 선택된다. 적당한 성장 기간, 예컨대 7 일 내지 10 일이 경과한 후에, 플레이트들은 수성 부형제, 전형적으로는 식염수 또는 완충액의 존재하에 포자의 수확을 위해 스크랩핑되고, 그 결과의 마스터 스톡 현탁액은 1.5 ml 용량의 다수의 작은 바이알의 각각에 예컨대 1 ml 의 부피로 나누어 담아진다. 발효 조작의 연구 또는 제조에 사용하기 위한 워킹 스톡 포자 현탁액을 제조하기 위하여, 하나 또는 그 이상의 이들 두 번째 세대 마스터 스톡 바이알들의 내용물은 아가 플레이트중에 분포되어 상기에서 마스터 스톡 포자 현탁액을 제조하기 위하여 설명된 방식으로 아가 플레이트상에서 인큐베이션될 수 있다. 기본적인 제조 작동을 고려하는 경우 100 개 내지 400 개 정도의 많은 플레이트가 두 번째 세대 워킹 스톡을 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 각각의 플레이트는 별도의 워킹 스톡 바이알안으로 스크랩핑되는데, 이 때 각 바이알에는 전형적으로 1 ml 의 이미 제조된 접종물이 함유되어 있다. 영구적인 보존을 위해서는 마스터 스톡 현탁액과 두 번째 세대 생성 접종물 두가지가 유익하게도 액체 질소 또는 다른 극저온 액체가 함유되어 있는 극저온 저장 용기의 진공 공간에 보관된다.
도 1 에 예시된 방법에서, 펩톤과 같은 질소 공급원, 효모 유도체 또는 동등물, 글루코오스, 및 인산염과 같은 인 공급원을 포함하는 수성 성장 배지가 제조된다. 미생물의 포자는 시드 발효 시스템안에 있는 이 성장 배지중에서 배양된다. 바람직한 미생물은 아스페르길루스 오크라세우스 NRRL 405 (ATCC 18500)이다. 그렇게 제조된 시드 스톡은 그런 다음 식 XIII 의 기질과 함께 생성 발효기안으로 도입된다. 발효 육즙은 원하는 정도로 반응이 완료되기까지 반응이 진행되기에 충분한 시간동안 교반되고 통풍된다.
시드 발효기에 대한 배지에는 바람직하게는 다음과 같은 것들을 함유하는 수성 혼합물이 포함된다: 약 0.5 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 글루코오스, 약 0.05 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 질소 공급원, 예컨대 펩톤, 약 0.05 중량 % 와 약 0.5 중량 % 사이의 인 공급원, 예컨대 암모늄 또는 알칼리 금속 포스페이트, 예를 들면 일염기성 암모늄 포스페이트 또는 디포타슘 하이드로겐 포스페이트, 약 0.25 중량 % 와 약 2.5 중량 % 사이의 효모 용해물 또는 추출물 (또는 예컨대 증류기의 가용성 물질과 같은 다른 아미노산 공급원), 약 1 중량 % 와 약 2 중량 % 사이의 아가 또는 다른 비-소화성 다당류. 특히 바람직한 시드 성장 배지에는 약 0.05 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 질소 공급원, 예컨대 펩톤, 약 0.25 중량 % 와 약 2.5 중량 % 사이의 자가용해된 효모 또는 효모 추출물, 약 0.5 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 글루코오스, 및 약 0.05 중량 % 와 약 0.5 중량 % 사이의 인 공급원, 예컨대 일염기성 암모늄 포스페이트가 함유되어 있다. 특히 경제적인 방법의 작동은 약 0.5 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 콘스팁 액, 약 0.25 중량 % 와 약 2.5 중량 % 사이의 자가용해된 효모 또는 효모 추출물, 약 0.5 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 글루코오스 및 약 0.05 중량 % 와 약 0.5 중량 % 사이의 일염기성 암모늄 포스페이트가 함유되어 있는 다른 바람직한 시드 배양물을 사용함으로써 얻어진다. 콘스팁 액은 단백질, 펩티드, 탄수화물, 유기산, 비타민, 금속 이온, 미량 물질 및 포스페이트의 특히 경제적인 공급원이다. 콘스팁 액 대신에 또는 그것에 부가하여 다른 곡물류로부터 얻은 매시 (mash) 액이 사용될 수 있다. 배지의 pH 는 바람직하게는 예컨대 알칼리 금속 수산화물 또는 오르토인산의 첨가에 의하여 약 5.0 과 약 7.0 사이의 범위내에서 조정된다. 콘스팁 액이 질소 및 탄소의 공급원으로서 사용되는 경우, pH 는 바람직하게는 약 6.2 와 약 6.8 사이에서 조정된다. 펩톤 및 글루코오스를 포함하고 있는 배지는 바람직하게는 약 5.4 와 약 6.2 사이의 pH 로 조정된다. 시드 발효에 유용하게 사용되는 성장 배지중에는 다음과 같은 것들이 있다:
1. 배지 #1: 2 % 펩톤, 2 % 자가용해된 효모 (또는 효모 추출물), 및 2 % 글루코오스; pH 는 20 % NaOH 로 5.8 로 조정됨.
2. 배지 #2: 3 % 콘스팁 액, 1.5 % 효모 추출물, 0.3 % 일염기성 암모늄 포스페이트 , 및 3 % 글루코오스; pH 는 20 % NaOH 로 6.5 로 조정됨.
미생물의 포자는 전형적으로 현탁액의 ml 당 109 개 정도의 포자를 함유하고 있는 바이알로부터 상기 배지안으로 도입된다. 시드 세대의 최적 생산성은 시드 배양이 시작될 때 성장 배지로 희석한 것이 포자 군집의 밀도를 ml 당 약 107 이하로 감소시키지 않을 때 이루어진다. 바람직하게는, 포자는 시드 발효기에서의 패킹된 균사체 부피 (PMV)가 최소한 약 20 %, 바람직하게는 약 35 % 내지 약 45 % 가 될 때까지 시드 발효 시스템안에서 배양된다. 시드 발효 용기 (또는 시드 발효 트레인을 포함하고 있는 다수의 용기중 어느 한 용기)안에서의 사이클이 그 용기의 초기 농도에 좌우되기 때문에, 전체적인 공정을 가속화시키기 위하여 둘 또는 세 개의 용기 발효 단계를 제공하는 것이 바람직할 수도 있다. 그러나, 만약 시드 발효가 너무 많은 수의 단계를 통하여 수행된다면 활성에 손상을 줄수도 있기 때문에, 세 개 이상의 더 많은 시드 발효기를 일련적으로 사용하는 것을 피하는 것이 바람직하다. 시드 배양 발효는 약 23 ℃ 내지 약 37 ℃ 의 범위, 바람직하게는 약 24 ℃ 내지 약 28 ℃ 의 범위의 온도에서 교반하에 수행된다.
시드 발효 시스템으로부터의 배양물은 생성 성장 배지와 함께 생성 발효기 안으로 도입된다. 본 발명의 한 구체예에서, 비-멸균 칸레논 또는 식 XIII 의 다른 기질이 반응을 위한 기질로서 작용한다. 바람직하게는, 기질은 성장 배지중의 10 중량 % 내지 30 중량 % 의 슬러리의 형태로 생성 발효기에 첨가된다. 11α-히드록실화 반응에 활용될 수 있는 표면적을 증가시키기 위하여, 식 XIII 의 기질의 입자 크기가, 발효기에 기질이 도입되기 전에 오프 라인 미분기를 통하여 통과됨으로써 감소된다. 글루코오스를 함유하고 있는 멸균된 영양분 공급 스톡, 및 자가용해된 효모와 같은 효모 유도체를 함유하고 있는 두 번째 멸균 영양분 용액 (또는 증류기의 가용성 물질과 같은 다른 공급원을 기초로 한 동등한 아미노산 제형)이 또한 별도로 도입된다. 배지에는 약 0.5 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 글루코오스, 약 0.05 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 질소 공급원, 예컨대 펩톤, 약 0.05 중량 % 와 약 0.5 중량 % 사이의 인 공급원, 예컨대 암모늄 또는 알칼리 금속 포스페이트, 예를 들면 디포타슘 하이드로겐 포스페이트, 약 0.25 중량 % 와 약 2.5 중량 % 사이의 효모 용해물 또는 추출물 (또는 예컨대 증류기의 가용성 물질과 같은 다른 아미노산 공급원), 약 1 중량 % 와 약 2 중량 % 사이의 아가 또는 다른 비-소화성 다당류를 함유하고 있는 수성 혼합물이 포함되어 있다. 특히 바람직한 생성 성장 배지에는 약 0.05 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 질소 공급원, 예컨대 펩톤, 약 0.25 중량 % 와 약 2.5 중량 % 사이의 자가용해된 효모 또는 효모 추출물, 약 0.5 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 글루코오스, 및 약 0.05 중량 % 와 약 0.5 중량 % 사이의 인 공급원, 예컨대 일염기성 암모늄 포스페이트가 함유되어 있다. 다른 바람직한 생성 배지에는 약 0.5 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 콘스팁 액, 약 0.25 중량 % 와 약 2.5 중량 % 사이의 자가용해된 효모 또는 효모 추출물, 약 0.5 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 글루코오스 및 약 0.05 중량 % 와 약 0.5 중량 % 사이의 일염기성 암모늄 포스페이트가 함유되어 있다. 생성 발효 배지의 pH 는 바람직하게는 시드 발효 배지에 대하여 상술된 방식으로, 각각 펩톤/글루코오스 기초 배지 및 콘스팁 액 기초 배지에 대하여 동일한 바람직한 pH 범위로 조정된다. 유용한 생체전환용 성장 배지는 다음과 같은 것들이다:
1. 배지 #1: 2 % 펩톤, 2 % 자가용해된 효모 (또는 효모 추출물), 및 2 % 글루코오스; pH 는 20 % 의 NaOH 로 5.8 로 조정됨.
2. 배지 #2: 1 % 펩톤, 1 % 자가용해된 효모 (또는 효모 추출물), 및 2 % 글루코오스; pH 는 20 % NaOH 로 5.8 로 조정됨.
3. 배지 #3: 0.5 % 펩톤, 0.5 % 자가용해된 효모 (또는 효모 추출물), 및 0.5 % 글루코오스; pH 는 20 % NaOH 로 5.8 로 조정됨.
4.배지 #4: 3 % 콘스팁 액, 1.5 % 효모 추출물, 0.3 % 일염기성 암모늄 포스페이트, 및 3 % 글루코오스; pH 는 20 % NaOH 로 6.5 로 조정됨.
5. 배지 #5: 2.55 % 콘스팁 액, 1.275 % 효모 추출물, 0.255 % 일염기성 암모늄 포스페이트, 및 3 % 글루코오스; pH 는 20 % NaOH 로 6.5 로 조정됨.
6. 배지 #6: 2.1 % 콘스팁 액, 1.05 % 효모 추출물, 0.21 % 일염기성 암모늄 포스페이트, 및 3 % 글루코오스; pH 는 20 % NaOH 로 6.5 로 조정됨.
비-멸균 칸레논 및 멸균된 영양분 용액은 생성 배치 사이클에 대하여 각각 약 5 부 대 약 20 부, 바람직하게는 약 10 부 대 약 15 부, 바람직하게는 실질적으로 동일한 부로 생성 발효기에 사슬식으로 공급된다. 유익하게도, 기질은 초기에는 약 0.1 중량 % 와 약 3 중량 % 사이, 바람직하게는 약 0.5 중량 % 와 약 2 중량 % 사이의 농도를 이루기에 충분한 양으로, 시드 발효 육즙으로 접종되기 전에 도입되며, 그런 다음 주기적으로, 편리하게는 매 8 내지 24 시간마다 약 1 중량 % 와 약 8 중량 % 사이의 누적 비율로 첨가된다. 추가의 기질이 매 8 시간 간격으로 첨가되는 경우, 총 첨가는 기질이 단지 매일 매일 첨가되는 경우에 비교하여 약간 더 낮게, 예컨대 0.25 중량 % 내지 2.5 중량 % 정도 낮게 될 것이다. 후자의 경우에는, 누적 칸레논 첨가가 2 중량 % 내지 약 2 중량 % 의 범위내에서 이루어질 필요가 있다. 발효 반응중에 공급된 보충용 영양분 혼합물은 농축된 것으로, 예를 들면 약 40 중량 % 와 약 60 중량 % 사이의 멸균 글루코오스, 및 약 16 중량 % 와 약 32 중량 % 사이의 멸균 효모 추출물 또는 효모 유도체의 다른 멸균 공급원 (또는 다른 아미노산 공급원)을 함유하고 있는 혼합물이다. 도 1 의 생성 발효기에 공급된 기질이 멸균되지 않은 것이기 때문에, 원하지 않는 유기체의 성장을 제어하기 위하여 발효 육즙에 항생물질이 주기적으로 첨가된다. 카나마이신, 테트라사이클린, 및 케팔렉신과 같은 항생물질이 성장 및 생체내 전환에 불리하게 영향을 미치는 일 없이 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 이들 항생물질은 총 육즙의 양을 토대로 하여 약 0.0004 % 내지 약 0.002 % 사이의 농도로 발효 육즙에 도입되는데, 이중 총 육즙의 양을 토대로 하여 카나마이신 술페이트는 약 0.0002 % 와 약 0.0006 % 사이의 농도로, 테트라사이클린 HCl 은 약 0.0002 % 와 약 0.006 % 사이의 농도로, 및 케팔렉신은 약 0.001 % 와 약 0.003 % 사이의 농도로 포함된다.
전형적으로, 생성 발효 배치 사이클은 약 80 내지 160 시간 정도이다. 그러므로, 식 XIII 기질 및 영양 용액의 각각의 부분은 전형적으로 매 2 시간 내지 10 시간마다, 바람직하게는 매 4 시간 내지 6 시간마다 첨가된다. 유익하게도, 또한 항발포제가 시드 발효 시스템에, 및 생성 발효기에 혼입된다.
도 1 의 방법에서 바람직한 것은, 생성 발효기에 충전되는 접종물이 발효기안의 총 혼합물을 토대로 하여 약 0.5 내지 약 7 부피 % 인 것이 좋고, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 2 부피 % 인 것이 좋으며, 글루코오스 농도는 약 0.01 내지 약 1.0 중량 %, 바람직하게는 약 0.025 내지 약 0.5 중량 %, 보다 바람직하게는 약 0.05 내지 약 0.25 중량 % 사이로 유지되는 것이 좋으며, 이 때 글루코오스는 총 배치 충전량을 토대로 하여 약 0.05 내지 약 0.25 중량 % 의 비율로 주기적으로 첨가되는 것이 바람직하다. 발효 온도는 약 20 ℃ 내지 약 37 ℃, 바람직하게는 약 24 ℃ 내지 약 28 ℃ 의 범위로 조절되는 것이 편리하지만, 팩킹된 균사체 부피 (PMV)를 약 60 % 아래로, 보다 바람직하게는 약 50 % 아래로 유지하기 위해서는 온도를 반응중에 2 ℃ 씩 증가시키는 것이 바람직할 수 있으며, 그로써 발효 육즙의 점성이 만족할만한 혼합을 간섭하는 것을 방지할 수 있다. 만약 생체물질 성장이 액체 표면보다 위로 확대된다면, 생체물질내에 보유된 기질이 반응 조운 밖으로 운반될 수 있으며, 그렇게 되면 히드록실화 반응에 대해 이용할 수 없게 된다. 생산성을 위해서, PMV 는 발효 반응의 처음 24 시간 이내에 30 내지 50 %, 바람직하게는 35 내지 45 % 의 범위에 도달하는 것이 바람직하며, 그 이후에는 상기 언급된 한계내에서 추가의 성장을 제어하기 위하여 조건이 관리되는 것이 바람직하다. 반응중에, 발효 배지의 pH 는 약 5.0 과 약 6.5 사이, 바람직하게는 약 5.2 와 약 5.8 사이에서 조절되고, 발효기는 약 400 rpm 내지 약 800 rpm 의 속도로 교반된다. 용해된 산소 수준은 배치를 약 0.2 와 약 1.0 vvm 사이에서 통풍시킴으로써 포화도의 최소한 약 10 % 로 이루어지고, 발효기의 맨윗 공간의 압력은 대기압 내지 약 1.0 바 게이지, 가장 바람직하게는 약 0.7 바 게이지 부근에서 유지된다. 교반 속도는 또한 최소한의 용해된 산소 수준을 유지하기 위하여 필요에 따라 증가될 수 있다. 유익하게도, 용해된 산소는 약 10 % 이상으로, 실제로는 약 50 % 정도로 높게 유지되어 기질의 전환이 촉진된다. pH 를 5.5±0.2 로 유지하는 것이 또한 생체전환에 가장 적당하다. 발포는 통상적인 항발포제를 첨가함으로써 필요에 따라 조절된다. 모든 기질이 첨가된 후에, 반응은 바람직하게는 식 XIII 생성물의 남아있는 미반응된 식 XIII 기질에 대한 몰비가 최소한 9 대 1 이 될 때까지 계속된다. 그러한 생체전환은 상기에서 언급된 바와 같이 80 내지 160 시간 배치 사이클내에서 이루어질 수 있다.
고도의 전환은 초기 충전 수준 아래에 있는 초기의 영양분 수준의 고갈과 관련이 있고, 통풍 속도와 교반 속도를 조절함에 의해 기질이 액체 육즙 밖으로 튀어 나오는 것이 방지되는 것으로 알려져 있다. 도 1 의 방법에서, 영양분 수준은 고갈된 다음에 초기 충전 수준의 약 60 % 이하로, 바람직하게는 약 50 % 이하로 유지된 한편; 도 2 및 3 의 방법에서는, 영양분 수준은 감소되어 초기 충전 수준의 약 80 % 이하, 바람직하게는 약 70 % 이하에서 유지되었다. 통풍 속도는 바람직하게는 1 vvm 이하, 보다 바람직하게는 약 0.5 vvm 의 범위에 있는 것이 좋으며; 교반 속도는 600 rpm 이하인 것이 바람직하다.
식 VIII 의 제조에 특히 바람직한 방법은 도 2 에 예시되어 있다. 식 XIII 의 화합물 (예컨대 칸레논)의 11α-히드록실화에 바람직한 미생물은 아스페르길루스 오크라세우스 NRRL 405 (ATCC 18500)이다. 이 방법에서, 성장 배지에는 바람직하게 약 0.5 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 콘스팁 액, 약 0.5 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 글루코오스, 약 0.1 중량 % 와 약 3 중량 % 사이의 효모 추출물, 및 약 0.05 중량 % 와 약 0.5 중량 % 사이의 암모늄 포스페이트가 포함되어 있다. 그러나, 본원에서 설명된 바와 같은 다른 생성 성장 배지도 또한 사용될 수 있다. 시드 배양물은 본질적으로는 도 1 의 방법에 대해 설명된 방식으로, 본원에서 설명된 시드 발효 배지의 어떤 것이든지 사용하여 제조된다. 성장 배지중의 비-미분화된 칸레논 또는 식 XIII 의 다른 기질의 현탁액은 혼합기에서 무균적으로, 바람직하게는 기질의 약 10 중량 % 와 약 30 중량 % 의 상대적으로 높은 농도에서 제조된다. 바람직한 것은, 무균성 제조에 혼합 후 현탁액의 멸균 또는 저온 살균단계가 포함되는 것이다. 생성 배치에 필요한 멸균된 기질 현탁액의 전체적인 양은 배치의 시작 시점에, 또는 주기적인 사슬식 공급에 의하여 생성 발효기 안으로 도입된다. 기질의 입자 크기는 슬러리를 생성 발효기에 전달해주는 온-라인 전단 펌프에서 습식 분쇄에 의하여 감소되고, 그로써 오프-라인 미분화기를 사용할 필요가 없어진다. 멸균에 의해서보다는 저온살균에 의하여 무균성 조건이 이루어진 경우, 응집 정도는 대수롭지 않을 수 있지만, 입자 크기의 양성 대조표준을 제공하기 위하여 전단 펌프의 사용이 바람직할 수 있다. 멸균 성장 배지 및 글루코오스 용액은 본질적으로 상술된 것과 동일한 방식으로 생성 발효기 안으로 도입된다. 생성 발효기에 공급되는 모든 성분들은 도입전에 멸균되며, 그로써 항생물질이 필요하지 않게 된다.
바람직하게는, 도 2 의 방법을 작동중에, 접종물이 약 0.5 % 내지 약 7 % 사이의 비율로 생성 발효기안에 도입되는 것이 좋으며, 발효 온도는 약 20 ℃ 내지 약 37 ℃, 바람직하게는 약 24 ℃ 내지 약 28 ℃ 사이이고, pH 는 약 4.5 와 약 6.5, 바람직하게는 약 5.3 과 약 5.5 사이에서 예컨대 기체 암모니아, 수성 암모늄 수산화물, 수성 알칼리 금속 수산화물, 또는 오르토인산에 의하여 조절되는 것이 바람직하다. 도 1 의 방법에서와 같이, 온도는 생체물질의 성장을 제어하기 위하여 조정되어서 PMV 가 55 내지 60 % 를 초과하지 않는 것이 바람직하다. 초기 글루코오스 충전은 바람직하게는 약 1 중량 % 와 약 4 중량 % 사이, 가장 바람직하게는 약 2.5 중량 % 와 약 3.5 중량 % 사이가 좋지만, 발효중에 약 1.0 중량 % 아래로 떨어지도록 방치하는 것이 바람직하다. 보충용 글루코오스는 총 배치 충전량을 토대로 하여 약 0.2 중량 % 와 약 1.0 중량 % 사이의 비율로 주기적으로 공급됨으로써 발효 조운안의 글루코오스 농도는 약 0.1 중량 % 내지 약 1.5 중량 % 사이, 바람직하게는 약 0.25 중량 % 내지 약 0.5 중량 % 사이에서 유지된다. 임의로, 질소와 인 공급원이 글루코오스와 함께 보충될 수 있다. 그러나, 전체적인 칸레논 충전이 배치 사이클이 시작될 때 이루어지기 때문에, 영양분을 포함하고 있는 질소 및 인의 필요한 보충물도 또한 그 때 도입될 수 있으며, 그로써 반응중에는 보충용으로 단지 글루코오스 용액만이 사용될 수 있다. 교반의 속도 및 성질은 상당히 가변적이다. 적당히 격렬한 교반은 고체 기질과 수성 상 사이에 물질의 전달을 촉진한다. 그러나, 미생물이 미엘린의 분해를 방지하기 위해서는 낮은 전단력의 임펠러가 사용되어야 한다. 최적의 교반 속도는 배양 육즙 점도, 산소 농도, 및 용기, 배플 및 임펠러 형태에 의해 영향을 받는 바, 혼합 조건에 따라 200 내지 800 rpm 의 범위내에서 변화한다. 통상적으로, 바람직한 교반 속도는 350 내지 600 rpm 의 범위내에 있다. 바람직하게도 교반 임펠러는 아래쪽을 형하여 축을 따라 펌핑하는 기능을 제공함으로써 발효된 생체물질의 양호한 혼합을 도와주는 것이 좋다. 배치는 약 0.3 내지 약 1.0 vvm, 바람직하게는 약 0.4 내지 약 0.8 vvm 의 속도에서 통풍되는 것이 바람직하며, 발효기의 맨윗 공간의 압력은 약 0.5 내지 약 1.0 바 게이지인 것이 바람직하다. 온도, 교반, 통풍 및 후압은 생체내 전환중에 용해된 산소가 최소한 약 10 부피 % 의 범위에서 유지되도록 조절되는 것이 바람직하다. 총 배치 사이클은 전형적으로는 약 100 내지 약 140 시간이다.
도 2 의 방법을 작동시키는 원리가 실질적으로 전체적인 칸레논 충전의 초기 도입을 토대로 한 것이지만, 발효 육즙의 성장은 대량의 칸레논이 충전되기 전에 수행될 수 있음이 인지될 것이다. 임의로, 칸레논의 일부가 또한 나중에 배치에 첨가될 수도 있다. 그러나 일반적으로, 멸균된 칸레논 충전물의 최소한 약 75 % 가 발효 개시후 48 시간 이내에 전환 발효기안으로 도입되어야 한다. 더욱이, 생체전환 효소(들)의 생성을 촉진하기 위하여 최소한 약 25 중량 % 의 칸레논이 발효가 시작될 때 도입되거나, 또는 최소한 처음 24 시간이내에 도입되는 것이 바람직하다.
도 3 에 예시된 것과 같이 추가로 바람직한 방법에서, 전체 배치 충전물 및 영양분 용액은 접종물이 도입되기 전에 생성 발효 용기에서 멸균된다. 사용될 수 있는 영양분 용액은 그것들 중에서도 선호도가 있겠지만, 본질적으로 도 2 의 방법에서와 같다. 본 발명의 이 구체예에서, 교반기 임펠러의 전단 작용은 그렇지 않으면 멸균시 형성되는 경향이 있는 기질 응집물을 파괴한다. 만약 칸레논의 평균 입자 크기가 약 300 μ 이하이고, 입자의 최소한 75 중량 % 가 240 μ 보다 작다면, 반응은 만족할만하게 진행된다. 적당한 임펠러, 예를 들면 디스크 터빈 임펠러를 200 내지 800 rpm 의 범위내에서 적당한 속도로, 최소한 약 400 cm/초의 팁 속도에서 사용하는 것이, 생성 발효기내에서 멸균될 때 발생하는 경향이 있는 응집에도 불구하고 그러한 입자 크기 특성을 유지하기에 충분한 전단 속도를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 도 3 의 방법의 나머지 작동은 본질적으로 도 2 의 방법과 동일하다. 도 2 및 3 의 방법들은 도 1 의 방법을 능가하는 여러 가지 분명한 장점을 제공한다. 특별한 장점은 콘스팁 액과 같은 저렴한 비용의 영양분 베이스를 사용할 수 있는 가능성이다. 또한 항생물질에 대한 요구가 없어짐으로써, 공급 과정이 간단해지고, 칸레논 또는 다른 식 XIII 의 기질의 배치 멸균이 가능해진다는 추가의 장점이 현실화된다. 다른 장점은 반응 사이클중에 보충용으로 복잡한 영양분 용액보다 간단한 글루코오스 용액을 사용할 수 있는 능력이다.
도 1 내지 3 에 도시된 방법들에서, 식 VIII 의 생성물은 여과 또는 저속 원심분리에 의하여 반응 육즙으로부터 생체물질과 함께 분리될 수 있는 결정성 고체이다. 또는 달리, 생성물은 유기 용매를 사용하여 전체 반응 육즙으로부터 추출될 수 있다. 식 VIII 의 생성물은 용매 추출에 의하여 회수된다. 최대의 회수를 위해서는, 액체상 여과물과 생체물질 필터 또는 원심분리 케이크 두가지가 모두 추출 용매로 처리되지만, 통상 95 % 이상의 생성물이 생체물질과 결합되어 있는 상태이다. 전형적으로, 탄화수소, 에스테르, 염소처리된 탄화수소, 및 케톤 용매들이 추출에 사용될 수 있다. 바람직한 용매는 에틸 아세테이트이다. 다른 전형적인 적당한 용매로는 톨루엔 및 메틸 이소부틸 케톤이 있다. 액체상으로부터 추출하기 위해서는, 반응 용액의 부피와 대략 동일한 부피의 반응 용액이 접촉하게 되는 용매를 사용하는 것이 편리하다. 생체물질로부터 생성물을 회수하기 위해서는, 생성물이 용매에, 바람직하게는 기질의 초기 충전물에 비하여 대량의, 예컨대 초기 칸레논 충전물의 그람당 50 내지 100 ml 의 용매에 현탁되고, 그 결과의 현탁액은 바람직하게는 생체물질의 깊게 들어간 곳과 구멍으로부터 용매 상으로 생성물이 운반되는 것이 확실하게 이루어지도록 약 20 분 내지 수시간동안 환류된다. 그런 다음 생체물질이 여과 또는 원심분리에 의해 제거되고, 필터 케이크는 바람직하게도 신선한 용매 및 탈이온수 두가지로 세척된다. 수성 및 용매 세척물은 그런 다음 조합되어 분리되도록 방치된다. 식 VIII 의 생성물은 결정화에 의하여 용액으로부터 회수된다. 수율을 최대화하기 위해서는, 균사체가 신선한 용매에 두 번 접촉된다. 수성상의 분리가 완전해지도록 가라앉게 한 후, 생성물은 용매상으로부터 회수된다. 보다 바람직한 것은, 결정화가 시작될 때까지 용매가 진공하에 제거된 후, 농축된 추출물이 0 내지 약 20 ℃ 의 온도, 바람직하게는 약 10 내지 약 15 ℃ 의 온도로, 결정 침전 및 성장에 충분한 시간동안, 전형적으로는 약 8 내지 약 12 시간동안 냉각되는 것이다.
도 2 의 방법 및, 특히 도 3 의 방법이 특히 바람직하다. 이들 방법은 낮은 점도에서 작동되며, pH, 온도 및 용해된 산소와 같은 방법의 매개변수들의 조절이 훨씬 더 쉽다. 더욱이, 멸균 조건이 항생물질의 잦은 사용없이도 쉽게 보존될 수 있다.
생체전환 방법은 발열적이어서, 쟈켓이 덧입혀진 발효기 또는 생성 발효기내에 있는 냉각 코일을 사용하여 열이 제거되어야 한다. 또는 달리, 반응 육즙은 외부의 열 교환기를 통하여 순환될 수 있다. 용해된 산소는 바람직하게는 반응에 에너지를 제공하고 글루코오스의 CO2 및 H2O 로의 전환을 확실하게 하기에 충분한 최소한 약 5 부피 %, 바람직하게는 최소한 약 10 부피 % 의 수준으로, 육즙내의 산소 잠재력의 측정에 대한 반응으로 반응기안으로 도입되는 공기의 속도를 조절함에 의하여 유지된다. pH 는 약 4.5 와 약 6.5 사이에서 조절되는 것이 바람직하다.
식 XIII 의 기질의 11-히드록실화에 대한 대체 방법들의 각각에서, 생산성은 고체 기질로부터 수성 상, 또는 반응이 일어나는 것으로 여겨지는 상의 계면으로의 질량 전달에 의해 제한된다. 상기에서 나타난 바와 같이, 생산성은 기질 입자의 평균 입자 크기가 최소한 약 300 μ 이하로 감소되고, 입자의 최소한 75 중량 % 가 240 μ 보다 작은 한 질량 전달 속도에 의해 유의할만하게 제한되지는 않는다. 그러나, 이들 방법의 생산성은 칸레논 또는 식 XIII 의 다른 기질의 실질적인 충전물을 유기 용매에 담겨진 상태로 생성 발효기에 제공하는 특정한 대체 구체예에서 추가로 증강될 수 있다. 한가지 선택에 따르면, 기질은 물과 섞이지 않는 용매에 용해되고 수성 성장 배지 접종물 및 계면활성제와 혼합된다. 유용한 물과 섞이지 않는 용매로는 예를 들면 DMF, DMSO, C6-C12 지방산, C6-C12 n-알칸, 식물성 기름, 소르비탄, 및 수성 계면활성제 용액이 있다. 이 충전물의 교반으로 유기 액체상으로부터 반응 부위로의 기질의 질량 전달을 위한 계면적이 증가된 에멀젼 반응 시스템이 생성된다.
두 번째 선택사항은 기질을 물과 혼합되는 용매, 예컨대 아세톤, 메틸에틸 케톤, 메탄올, 에탄올, 또는 글레세롤에, 그것의 물중의 용해도보다 실질적으로 큰 농도로 용해시키는 것이다. 상승된 온도에서 초기 기질 용액을 제조함으로써, 용해도가 증가되고, 그로써 반응기안에 도입된 용액 형태의 기질의 양이 추가로 증가되고 궁극적으로 반응기 유료하중이 증강된다. 따뜻한 기질 용액이 성장 배지 접종물을 포함하고 있는 상대적으로 저온의 수성 충전물과 함께 생성 발효 반응기에 충전된다. 기질 용액이 수성 배지와 혼합될 때, 기질의 침전이 일어난다. 그러나, 실질적인 과포화 조건 및 적당히 격렬한 교반하에서는 결정 성장보다 핵화가 우선적으로 일어나며, 표면적이 큰 매우 미세한 입자들이 형성된다. 큰 표면적은 액체 상과 고체 기질 사이의 질량 전달을 촉진한다. 더욱이, 수성 액체 상중의 기질의 평형 농도가 물과 섞일 수 있는 용매의 존재시에 또한 증강된다. 따라서, 생산성이 촉진된다.
비록 미생물이 수성 상중에 있는 높은 농도의 유기 용매를 반드시 견딜 수는 없지만, 예컨대 약 3 중량 % 내지 약 5 중량 % 범위의 에탄올 농도가 유익하게 사용될 수 있다.
세 번째 선택사항은 시클로덱스트린 수용액중에 기질을 용해시키는 것이다. 예시적인 시클로덱스트린으로는 히드록시프로필-β-시클로덱스트린 및 메틸-β-시클로덱스트린이 있다. 기질:시클로덱스트린의 몰비는 약 1:0.5 내지 약 1:1.5 가 바람직하며, 보다 바람직하게는 약 1:0.8 내지 약 1:1 일 수 있다. 그런 다음 기질:시클로덱스트린 혼합물이 무균적으로 생체전환 반응기에 첨가될 수 있다.
11α-히드록시칸레논 및 11α-히드록실화 방법의 다른 생성물 (식 VIII 및 VIIIA)은 반응 배지를 여과하고 생성물을 여과 배지상에 수집된 생체물질로부터 추출함으로써 분리될 수 있는 신규한 화합물들이다. 종래의 유기 용매, 예컨대 에틸 아세테이트, 아세톤, 톨루엔, 염소처리된 탄화수소, 및 메틸 이소부틸 케톤이 추출에 사용될 수 있다. 그런 다음 식 VIII 의 생성물이 동일한 유형의 유기 용매로부터 재결정될 수 있다. 식 VIII 의 화합물들은 식 I 의 화합물, 특히 식 IA 의 화합물의 제조에 대한 중간체로서 실질적인 가치를 가지고 있다.
바람직하게도, 식 VIII 의 화합물은 -A-A- 및 -B-B- 가 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소, 저급 알킬 또는 저급 알콕시이며, R8 및 R9 가 함께 하기의 20-스피록산 고리를 형성하는 식 VIIIA 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
또한 방법 1 의 방법에 따르면, 식 VIII 의 화합물은 알칼리 조건하에 시안화물 이온의 공급원과 반응하여 하기 식 VII 의 엔아민 화합물이 생성된다:
(화학식 VII)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 상기에서 정의된 바와 같다.
기질이 식 VIIIA 에 해당하는 경우, 생성물은 하기 식 VIIA 이다:
(화학식 VIIA)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, Y1, Y2, 및 X 는 상기에서 식 XIIIA 에 대해 정의된 바와 같다. R3 은 수소인 것이 바람직하다.
식 VIII 의 11α-히드록실 기질의 시안화는, 그것을 케톤 시아노히드린, 가장 바람직하게는 아세톤 시아노히드린과 같은 시안화물 이온과 염기 및 알칼리 금속 염, 가장 바람직하게는 LiCl 의 존재하에 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 또는 달리, 시안화는 시아노히드린 없이 산의 존재하에 알칼리 금속 시안화물을 사용함으로써 이루어질 수 있다.
케톤 시아노히드린 방법에서, 반응은 용액중에서, 바람직하게는 디메틸포름아미드 또는 디메틸 술폭시드와 같은 아프로틱 극성 용매를 사용하여 수행된다. 엔아민의 형성은 기질 1 몰당 최소한 2 몰의 시안화물 이온 공급원이 필요하며, 바람직하게는 시안화물 공급원이 약간 더 많게 사용되는 것이다. 염기는 디알킬아민, 트리알킬아민, 알칸올아민, 피리딘 등과 같은 질소함유 염기인 것이 바람직하다. 그러나, 알칼리 금속 카보네이트 또는 알칼리 금속 수산화물과 같은 무기 염기도 사용될 수 있다. 바람직하게도, 식 VIII 의 기질은 초기에는 약 20 중량 % 와 약 50 중량 % 사이의 비율로 존재하며, 염기는 기질 1 당량당 0.5 내지 2 당량의 비율로 존재한다. 반응 온도는 중요하지 않지만, 생산성은 상승 온도에서 작동시킴으로써 증강된다. 그러므로 예를 들면, 트리에틸아민이 염기로서 사용되는 경우에, 반응은 유익하게도 약 80 ℃ 내지 약 90 ℃ 의 범위에서 수행된다. 그러한 온도에서는, 반응은 약 5 내지 약 20 시간내에 완료된다. 염기로서 디이소프로필에틸이 사용되고 반응이 105 ℃ 에서 수행되는 경우, 반응은 8 시간째에 종결된다. 반응 기간이 끝날 때에, 용매는 진공하에 제거되고 희석된 산, 바람직하게는 염산을 사용하여 pH 7 로 중성화된다. 이 용액으로부터 생성물이 침전되고, 그런 다음 증류수로 세척되고 공기 건조된다. 이탈된 HCN 은 비활성 기체로 스트립될 수 있고 알칼리 용액중에서 억제될 수 있다. 건조된 침전은 클로로포름이나 다른 적당한 용매중에 넣어진 후, 농축된 산, 예컨대 6 N HCl 로 추출된다. 추출물은 무기 염기, 바람직하게는 알칼리 금속 수산화물을 첨가함으로써 pH 7 로 중화되고, 0 ℃ 의 온도로 냉각된다. 그 결과의 침전물은 세척되고 건조된 후, 적당한 용매, 예컨대 아세톤으로부터 재결정되어 방법의 다음 단계에서 사용되기에 적당한 식 VII 의 생성물로 제조된다.
또는 달리, 반응은 물과 혼합될 수 있는 유기 용매, 예컨대 메탄올을 포함하고 있는 수성 용매 시스템중에서, 또는 물과 유기 용매, 예컨대 에틸 아세테이트를 포함하고 있는 2-상 시스템중에서 수행될 수 있다. 이 대체 방법에서는, 생성물은 반응 용액을 물로 희석한 후, 유기 용매, 예컨대 염화 메틸렌 또는 클로로포름을 사용하여 생성물을 추출하고, 그런 다음 농축된 광산, 예컨대 2N HCl 을 사용하여 유기 추출물로부터 다시 추출된다. [미국 특허 제 3,200,113 호 참조].
또 다른 대체 방법에 따르면, 반응은 물과 혼합될 수 있는 용매, 예컨대 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, N-메틸, 피롤리돈 또는 디메틸 술폭시드중에서 수행될 수 있고, 그런 다음 반응 생성물 용액은 물로 희석되고, 예컨대 알칼리금속 카보네이트를 첨가함으로써 알칼리성으로 된 후, 0 ℃ 내지 10 ℃ 로 냉각됨으로써 생성물의 침전이 유발된다. 바람직하게도, 시스템은 알칼리금속 하이포할라이트 또는 시안화물의 발생을 억제하는데 효과적인 다른 제제로 억제된다. 여과 및 물로 세척된 후, 침전된 생성물은 방법의 다음 단계에서 사용되기에 적당하다.
또 다른 대체 방법에 따르면, 식 VII 의 엔아민 생성물은 양성자 공급원의 존재하에 식 VIII 의 기질을 과잉의 알칼리 금속 시안화물, 바람직하게는 NaCN 과, 디메틸포름아미드 또는 디메틸아세트아미드와 같은 아프로틱 물-혼화성 극성 용매를 포함하고 있는 수성 용매중에서 반응시킴으로써 생성될 수 있다. 양성자 공급원은 바람직하게는 광산 또는 C1 내지 C5 카르복실산이며, 황산이 특히 바람직하다. 이례적으로 시안화 시약이 시판중인 DMF 중의 LiCN 인 경우에, 별도의 양성자 공급원이 첨가될 필요는 전혀 없다.
알칼리 금속염과 같은 시안화물 이온의 공급원은 바람직하게는 기질의 당량당 약 2.05 내지 약 5 몰 당량의 비율로 반응기에 충전된다. 광산 또는 다른 양성자 공급원은 4,5 와 6,7 의 이중결합을 가로지르는 HCN 의 첨가를 촉진하는 것으로 여겨지며, 바람직하게는 1 몰 당량의 기질 당 최소한 1 몰 당량의 비율로 존재한다; 그러나, 반응 시스템은 존재하는 산보다 많게 알칼리 금속 시안화물을 과잉량으로 유지함으로써 염기성으로 남아있어야 한다. 반응은 바람직하게는 약 1 내지 8 시간동안, 바람직하게는 약 1.5 내지 약 3 시간동안, 최소한 약 75 ℃, 전형적으로는 60 ℃ 내지 100 ℃ 의 온도에서 수행된다. 반응 기간이 끝날 때, 반응 혼합물이 바람직하게는 거의 실온으로 냉각되며, 생성물인 엔아민은 반응 혼합물을 산성화하고 그것을 바람직하게는 거의 얼음조 온도 주변의 온도에서 저온수와 혼합함으로써 침전된다. 산성화는 17-락톤을 닫는 것으로 여겨지며, 그것은 시안화에서 지배적인 염기성 조건하에서 열려지는 경향이 있다. 반응 혼합물은 편리하게도 반응중에 존재하는 동일한 산, 바람직하게는 황산을 사용하여 산성화된다. 물이 바람직하게는 생성물의 몰당 약 10 내지 약 50 몰 당량의 비율로 첨가된다.
식 VII 의 화합물은 신규한 화합물이고 식 I 의 화합물, 특히 식 IA 의 화합물의 제조를 위한 중간체로서 실질적인 가치를 가지고 있다. 바람직하게도, 식 VII 의 화합물은 -A-A- 및 -B-B- 가 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소, 저급 알킬 또는 저급 알콕시이며, R8 및 R9 가 함께 하기 식의 20-스피록산 고리를 구성하는 식 VIIA 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
가장 바람직한 식 VII 의 화합물은 5'R(5'α),7'β-20'-아미노헥사데카히드로-11'β-히드록시-10'α,13'α-디메틸-3',5-디옥소스피로[푸란-2(3H),17'α(5'H)-[7,4]메테노[4H]시클로펜타[a]페난트렌]-5'-카보니트릴이다.
식 VIII 의 화합물의 식 VII 의 엔아민으로의 전환에서, 식 VIII 의 화합물의 7-시아노 유도체가 미정제 생성물에서 크로마토그래피에 의하여 관찰되었다. 7-시아노 화합물은 전환 과정의 중간체인 것으로 여겨진다. 또한 7-시아노 중간체 자체가 반응하여 식 VIII 의 화합물의 5,7-시아노 유도체인 두 번째 중간체를 형성하고, 계속해서 반응하여 엔에스테르를 형성하는 것으로 가정되었다 [R. Christiansen et al., The Reaction of Steroidal 4,6-Dien-3-Ones With Cyanide, Steroids, Vol. 1, June 1963]. 이들 신규한 화합물은 또한 합성 중간체로서뿐만 아니라 크로마토그래피상의 마아커로서도 활용된다. 전체 방법 1 합성 방법의 이 단계에서의 바람직한 구체예에서, 이들 중간체는 7α-시아노-11α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-21-디카르복실산, γ-락톤, 및 5β,7α-디시아노-11α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레그난-21-디카르복실산, γ-락톤이다.
방법 1 의 합성의 다음 단계에서, 식 VII 의 엔아민은 가수분해되어 다음 식 VI 의 디케톤 화합물이 생성된다:
(화학식 VI)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 XIII 에서 정의된 바와 같다. 어떠한 수성 유기산 또는 광산이든지 가수분해에 대하여 사용될 수 있다. 염산이 바람직하다. 생산성을 증강시키기 위해서는, 물과 섞이는 유기 용매, 예컨대 디메틸아세트아미드 또는 저급 알칸올이 용매로서 사용되는 것이 바람직하다. 보다 바람직한 용매는 디메틸아세트아미드이다. 산은 식 VII 의 기질 1 당량당 최소한 1 당량의 비율로 존재하여야 한다. 수성 시스템에서, 엔아민 기질 VII 은 약 5 시간의 기간동안 약 80 ℃ 에서 식 VI 의 디케톤으로 실질적으로 전환될 수 있다. 상승된 온도에서의 조작은 생산성을 증가시키지만, 온도는 결정적인 요인이 아니다. 적당한 온도는 용매시스템 및 산의 휘발성을 토대로 하여 선택된다.
바람직하게도, 식 VII 의 엔아민 기질은 다음 식 VIIA 에 해당하고, 디케톤 생성물은 식 VIA 에 해당한다:
(화학식 VIIA)
및
(화학식 VIA)
상기 두가지 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, Y1, Y2 및 X 는 상기 식 XIIIA 에서 정의된 바와 같다. R3 은 수소인 것이 바람직하다.
반응 기간이 끝날 때, 용액은 0 내지 약 25 ℃ 로 냉각되어 생성물이 결정화된다. 생성물 결정은 적당한 용매, 예컨대 이소프로판올 또는 메탄올로부터 재결정되어 방법의 다음 단계에 사용하기에 적당한 식 VI 의 생성물이 생성된다; 그러나, 재결정화가 반드시 필요한 것은 아니다. 식 VI 의 생성물은 실질적으로 식 I, 특히 식 IA 의 화합물을 제조하기 위한 중간체로서 가치를 가지고 있다. 바람직하게도, 식 VI 의 화합물은 -A-A- 및 -B-B- 가 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소, 저급 알킬 또는 저급 알콕시이며, R8 및 R9 가 함께 하기 식의 20-스피록산 고리를 구성하는 식 VIA 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
가장 바람직한 식 VI 의 화합물은 4'S(4'α),7'α-헥사데카히드로-11'α-히드록시-10'β,13'β-디메틸-3',5,20'-트리옥소스피로[푸란-2(3H),17'β-[4,7]메타노[17H]시클로펜타[a]페난트렌]-5'β(2'H)-카보니트릴이다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 식 VII 의 생성물 엔아민은 상술된 방식으로 식 VIII 의 화합물로부터 생성되며, 본래 자리에서 식 VI 의 디케톤으로 전환된다. 발명의 이 구체예에서, 식 VIII 의 기질은 상술된 바와 같이, 양성자 공급원을 함유하고 있는 수성 용매중에서 과잉량의 알칼리 금속 시안화물과 반응되거나 또는 임의로 염기 및 LiCl 의 존재하에 과잉량의 케톤 시아노히드린과 반응된다. 그러나, 반응 혼합물이 냉각되고, 산성화된 후, 엔아민의 침전을 유발하는 것으로 계산된 비율로 물이 첨가되는 대신에, 실질적인 반응 혼합물의 냉각은 피하는 것이 바람직하다. 대신에 물과 산, 바람직하게는 광산, 예컨대 황산이 시안화 반응이 끝날 때 혼합물에 첨가된다. 첨가되는 산의 비율은 과잉량의 알칼리 금속 시안화물을 중화시키기에 충분한 것으로, 통상적으로 식 VIII 기질의 1 몰당 최소한 1 몰 당량, 바람직하게는 기질의 당량당 약 2 몰 내지 5 몰 당량이 요구된다. 그러나, 온도는 충분히 높게 유지되고, 희석률은 충분히 커서, 실질적으로 침전되는 것이 방지되며 엔아민의 디케톤으로의 가수분해가 액체상에서 진행되는 것이 가능해진다. 그러므로, 방법은 최소한의 간섭과 높은 생산성으로 진행된다. 가수분해는 바람직하게는 최소한 80 ℃, 보다 바람직하게는 약 90 ℃ 내지 약 100 ℃ 범위의 온도에서, 전형적으로는 약 1 시간 내지 약 10 시간, 보다 바람직하게는 약 2 시간 내지 약 5 시간의 전형적인 기간동안 수행된다. 그런 다음 반응 혼합물은 바람직하게는 0 ℃ 와 15 ℃ 사이의 온도로, 유익하게는 얼음조에서 약 5 ℃ 내지 약 10 ℃ 의 온도로 냉각되어 식 VI 의 생성물 디케톤이 침전된다. 고체 생성물은 여과에 의해 회수될 수 있으며, 불순물은 물로 세척함으로써 감소될 수 있다.
방법 1 합성의 다음 단계로, 식 VI 의 디케톤 화합물은 금속 알콕시드와 반응하여 카르보닐 기와 4-탄소 사이에 있는 결합의 분리를 통하여 4 와 7 위치 사이에 있는 케톤 가교가 열려져서 7 위치에 α-배향의 알콕시카르보닐 치환체가 형성되고 5-탄소에 있는 시안화물이 제거된다. 이 반응의 생성물은 하기 식 V 에 해당하는 히드록시에스테르 화합물이다:
(화학식 V)
상기 식에서 -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 XIII 에서 정의된 바와 같고, R1 은 저급 알콕시카르보닐 또는 히드록시카르보닐이다. 반응에 사용된 금속 알콕시드는 식 R10OM 에 해당하는 것으로, M 은 알칼리 금속이고, R10O- 는 R1 의 알콕시 치환체에 해당한다. 이 반응의 수율은 금속 알콕시드가 메톡시화 칼륨 또는 메톡시화 나트륨일 때 가장 만족스럽지만, 다른 저급 알콕시드도 사용될 수 있다. 칼륨 알콕시드가 특히 바람직하다. 페녹시드, 다른 아릴옥시드도 또한 사용될 수 있으며, 또한 아릴술파이드도 사용될 수 있다. 반응은 편리하게는 식 R10OH (식에서 R10 은 상기 정의된 바와 같다)에 해당하는 알코올의 존재하에 수행될 수 있다. 다른 종래의 용매도 사용될 수 있다. 바람직하게는, 식 VI 의 기질이 약 2 중량 % 와 약 12 중량 % 사이, 보다 바람직하게는 최소한 약 6 중량 % 의 비율로 존재한다. 바람직한 것은 R10OM 이 기질의 약 0.5 내지 약 4 몰 사이, 보다 바람직하게는 기질의 약 1 몰과 약 2 몰 사이의 비율로, 가장 바람직하게는 기질의 약 1.6 몰의 비율로 존재하는 것이다. 온도는 중요하지 않지만, 상승된 온도는 생산성을 증가시킨다. 반응 시간은 전형적으로 약 4 시간 내지 24 시간이며, 바람직하게는 약 4 시간 내지 16 시간이다. 편리하게도, 반응은 사용되는 용매의 종류에 따라 대기의 환류 온도에서 수행된다.
반응이 평형에 도달하기 위해 필요한 시간은 반응 혼합물에 첨가되는 알콕시드의 양과 알콕시드가 첨가되는 방식에 의해 영향을 받는다. 알콕시드는 한 번에 또는 여러번에 나뉘어서 또는 지속적으로 첨가될 수 있다. 알콕시드가 여러번에 나뉘어서 첨가되는 경우, 두 단계에 걸쳐 칼륨 메톡시드가 약 1.6 당량 첨가되는 것이 바람직하다. 이 두-단계 첨가에서, 1 당량의 칼륨 메톡시드가 먼저 첨가되고 90 분 후에 0.6 당량의 칼륨 메톡시드가 첨가된다. 이 두-단계 첨가는 1.6 당량의 칼륨 메톡시드를 한 번에 첨가하는 것에 비하여 상대적으로 평형에 도달하는 시간을 단축시킨다.
평형이 디케톤의 낮은 농도에서 히드록시에스테르의 생성에 보다 유리하기 때문에, 반응은 보다 큰 희석률, 예컨대 나트륨 메톡시드를 이용한 반응의 경우 40:1 정도의 높은 희석률에서 작동되는 것이 바람직하다. 상당히 더 높은 생산성이 나트륨 메톡시드보다는 칼륨 메톡시드를 사용함으로써 이루어질 수 있는데, 왜냐하면 약 20:1 범위의 희석이 일반적으로 칼륨 메톡시드가 시약인 경우 역 시안화의 정도를 최소화하기에 충분하기 때문이다.
본 발명에 따르면, 역 시안화 반응이 반응 조운으로부터 부산물인 시안화물 이온을 제거하기 위하여 적절한 화학약품 또는 물리적인 척도를 취함으로써 억제될 수 있는 것으로 발견되었다. 그러므로, 발명의 다른 구체예에서, 디케톤과 알칼리 금속 알콕시드와의 반응은 시안화물 이온에 대한 침전 유발 제제, 예컨대 불용성 시안화물 화합물을 형성하는 양이온을 포함하고 있는 염의 존재하에 수행될 수 있다. 그러한 염으로는 예를 들면, 요오드화 아연, 황산 철, 또는 본질적으로는 모든 할로겐화물, 황산염 또는 다른 알칼리 토금속 또는 해당하는 시안화물보다 더 가용성인 전이 금속의 염을 들 수 있다. 만약 요오드화 아연이 디케톤 기질의 당량당 약 1 당량의 비율로 존재한다면, 반응의 생산성은 알칼리 금속 할로겐화물의 부재시에 수행되는 방법에 비교하여 실질적으로 증가되는 것으로 관찰되었다.
침전 유발제가 시안화물 이온의 제거를 위하여 사용되는 경우에도, 꽤 높은 희석률에서 방법을 수행하는 것이 여전히 바람직하지만, 침전 유발제를 사용함으로써 디케톤 기질에 대한 용매의 몰비는 그러한 제제가 없을 때의 반응과 비교하여 상당히 감소될 것이다. 식 V 의 히드록시에스테르의 회수는 하기에 설명되는 추출적 또는 비-추출적 과정의 어느 하나에 따라 수행될 수 있다.
반응의 평형은 또한 식 V 의 히드록시에스테르의 생성을 이 히드록시에스테르가 합성된 후에 반응 혼합물로부터 제거함으로써 선호하도록 조절될 수 있다. 히드록시에스테르의 제거는 단계식으로 또는 지속적으로 여과와 같은 수단을 통하여 진행될 수 있다. 히드록시에스테르의 제거는 단독으로 또는 화학약품과 조합되어 또는 반응 혼합물로부터 시안화물을 물리적으로 제거하는 것과 함께 평형을 조절하기 위하여 사용될 수 있다. 그런 다음 그 결과의 여과물을 가열하는 것은 반응 평형이 식 VI 의 남아있는 디케톤을 식 V 의 히드록시에스테르로 더 많이 우선적으로 전환되도록 유발한다.
식 VI 의 디케톤의 식 V 의 히드록시에스테르로의 전환에서, 5-시아노 히드록시에스테르는 미정제 생성물에 소량으로, 전형적으로는 약 5 중량 % 이하로 존재하는 것이 관찰되었다. 5-시아노 히드록시에스테르는 식 VI 의 디케톤과 식 V 의 히드록시에스테르 사이의 평형 중간체일 것으로 여겨진다. 또한 이 평형 중간체가 5,7-옥소기에 대한 메톡시드 공격과 엔올레이트의 양성자화를 통하여 디케톤으로부터, 및 부산물인 시안화물 이온의 히드록시에스테르의 3-케토-△4,5 기능으로의 첨가를 통하여 히드록시에스테르로부터 형성되는 것으로 여겨진다.
또한, 식 V 의 히드록시에스테르의 5-시아노-7-산 및 17-알콕시드가 미정제 생성물의 크로마토그래피에서 관찰되었다. 5-시아노 히드록시에스테르 중간체는 부산물인 시안화물 이온 (△4,5 이중 결합을 도입하는 탈시안화의 결과로서 존재함)과 반응하여 5-시아노-7-산이 생성되는 것으로 추정된다. 시안화물 이온의 작용은 5-시아노 히드록시에스테르의 7-에스테르기를 탈알킬화함으로써 5-시아노-7-산 및 해당하는 알킬니트릴이 생성되는 것으로 가정된다.
또한 일시적인 17-알콕시드의 중간체가 히드록시에스테르의 17-스피로락톤에 대한 메톡시드의 공격으로부터 형성되는 것으로 (또는 앞의 중간체가 계속해서 히드록시에스테르로 전환되는 것으로) 여겨진다. 17-알콕시드는 산으로 처리될 때 쉽게 히드록시에스테르로 전환된다. 그러므로, 그것은 일반적으로 생성물 매트릭스에서는 관찰되지 않는다.
5-시아노 히드록시에스테르, 5-시아노-7-산, 및 17-알콕시드는 히드록시에스테르의 제조에서 크로마토그래피상의 마아커 및 중간체로서 유용한 신규한 화합물이다. 그것들은 방법 1 의 합성의 이 단계에서 미정제 생성물로부터 단리될 수 있다. 또는 달리, 그것들은 마아커로서 또는 중간체로서 사용되기 위해 직접 합성될 수 있다. 5-시아노 히드록시에스테르는 식 VI 의 단리된 디케톤의 용액을 염기, 예컨대 알콕시드 또는 아민과 반응시키고, 그 결과 형성되는 침전을 단리시킴으로써 합성될 수 있다. 바람직하게 제조되는 화합물은 7-메틸 하이드로겐 5β-시아노-11α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레그난-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤이다.
5-시아노-7-카르복실산은 식 VI 의 디케톤을 약한 수성 염기, 예컨대 아세트산 나트륨 또는 중탄산 나트륨과 반응시킨 후, 그 결과 생성되는 침전을 단리함으로써 직접 합성될 수 있다. 바람직하게 제조되는 화합물은 5-β-시아노-11-α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레그난-7α,21-디카르복실산, γ-락톤이다.
17-알콕시드는 식 V 의 히드록시에스테르 용액을 알콕시드와 반응시켜 17-알콕시드와 상응하는 히드록시에스테르의 혼합물이 생성됨으로써 직접 합성될 수 있다. 바람직하게 제조되는 화합물은 디메틸 11α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤이다.
바람직하게도, 식 VI 의 디케톤 기질은 다음 식 VIA 에 해당하고:
(화학식 VIA)
히드록시에스테르 생성물은 다음 식 VA 에 해당한다:
(화학식 VA)
상기 식들에서, -A-A-, -B-B-, R3, Y1, Y2 및 X 는 식 XIIIA 에 대해 정의된 바와 같고, R1 은 식 V 에서 정의된 바와 같다. R3 이 수소인 것이 바람직하다.
식 V 의 생성물은 식 I 의 화합물, 특히 식 IA 의 화합물의 제조에 대한 중간체로서 실질적인 가치를 가지고 있는 신규한 화합물이다. 바람직하게도, 식 V 의 화합물은 -A-A- 및 -B-B- 가 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소, 저급 알킬 또는 저급 알콕시이며, R8 및 R9 가 함께 하기 식의 20-스피록산 고리를 구성하는 식 VA 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
가장 바람직한 식 V 의 화합물은 메틸 하이드로겐 11α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤이다.
식 V 의 화합물은 여과에 의하여 또는 예컨대 광산, 예를 들면 수성 HCl 또는 황산으로 반응 용액을 산성화하고, 주변 온도로 냉각시킨 후, 염화 메틸렌 또는 에틸 아세테이트와 같은 유기 용매로 생성물을 추출함으로써 단리될 수 있다. 추출물은 수성 알칼리 세척 용액으로 세척되고, 건조 및 여과된 후, 용매가 제거된다. 또는 달리, 식 V 의 생성물을 함유하고 있는 반응 용액은 농축된 산으로 억제될 수 있다. 생성물 용액은 농축되고, 0 ℃ 내지 약 25 ℃ 로 냉각된 후, 생성물 고체가 여과에 의해 단리된다.
바람직한 구체예에서, 메탄올과 HCN 은 반응 기간이 끝난 후, 증류전에 첨가되는 광산 (예컨대 염산 또는 황산) 및 증류후 첨가되는 물로 증류됨으로써 제거된다. 광산은 단일 단계로, 다단계로 또는 지속적으로 첨가될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 광산은 약 10 내지 약 40 분, 보다 바람직하게는 약 15 내지 약 30 분의 기간에 걸쳐 지속적으로 첨가된다. 마찬가지로, 물이 단일 단계로, 다단계로 또는 지속적으로 증류기 바닥에 첨가될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 농축된 반응 혼합물은 물이 첨가되기 전에 환류 온도로부터 냉각된다. 바람직하게도, 혼합물은 물이 첨가되기 전에 약 50 내지 약 70 ℃, 보다 바람직하게는 약 60 내지 약 70 ℃, 가장 바람직하게는 약 65 ℃ 의 온도로 냉각된다. 그런 다음 물이, 바람직하게는 지속적으로 약 15 분 내지 약 3 시간의 기간, 보다 바람직하게는 약 60 분 내지 약 90 분의 기간에 걸쳐서 첨가되며, 그 동안에 온도는 거의 일정하게 유지된다. 식 V 의 생성물은 물이 첨가됨에 따라 증류기 바닥으로부터 결정화되기 시작한다. 물이 혼합물에 다 첨가된 후, 희석된 반응 혼합물은 약 1 시간동안 거의 동일한 온도에서 유지된 후, 추가로 약 4 내지 5 시간에 걸쳐 약 15 ℃ 로 냉각된다. 혼합물은 약 15 ℃ 에서 약 1 내지 2 시간동안 유지된다. 15 ℃ 에서 더 긴 시간동안 방치하면 혼합물중의 시아노에스테르의 수율이 증가된다. 이런 회수 방식으로 추출 조작없이 고품질의 결정성 생성물이 제공된다.
식 V 의 생성물을 회수하는 다른 바람직한 방식에 따르면, 메탄올과 HCN 은 반응 기간이 끝난 후, 증류전 또는 중에 첨가되는 물과 산을 사용하여 증류에 의해 제거된다. 증류전에 물을 첨가하는 것은 작동을 간단하게 해주지만, 증류전에 점진적으로 첨가하는 것이 증류기안의 부피가 실질적으로 일정하게 유지되는 것을 가능하게 한다. 식 V 의 생성물은 증류가 진행됨에 따라 증류기 바닥으로부터 결정화된다. 이런 회수 방식으로 추출 조작없이도 고품질의 결정 생성물이 제공된다.
추가의 다른 방법에 따르면, 식 V 의 생성물을 함유하고 있는 반응 용액은 광산, 예를 들면 4N HCl 로 억제될 수 있고, 그런 다음 용매가 증류에 의해 제거된다. 용매의 제거는 또한 반응 생성물로부터 잔류하는 HCN 을 제거하는데 효과적이다. 식 V 의 화합물이 본원에서 설명된 바와 같이 에폭시멕스레논의 제조를 위한 방법에서 중간체로서 사용되는 경우에, 식 V 의 화합물의 정제를 위하여 여러번에 걸쳐 용매를 추출하는 것이 필요하지 않은 것으로 발견되었다. 실제로, 그러한 추출은 때로 완전히 수행되지 않을 수 있다. 용매 추출이 생성물 정제를 위하여 사용되는 경우, 용매 세척을 식염수 및 가성 세척으로 보충하는 것이 바람직하다. 그러나 용매 추출이 수행되지 않는 경우에는, 식염수 및 가성 세척도 필요하지 않게 된다. 추출 및 세척 과정이 제거됨으로써 수율 또는 생성물 질에 영향을 미치지 않으면서 방법의 생산성이 상당히 증가될 수 있으며, 또한 세척된 용액을 황산 나트륨과 같은 건조제로 건조시킬 필요가 없어진다.
미정제 11α-히드록시-7α-알콕시카르보닐 생성물은 방법의 다음 반응 단계, 즉 11 위치에 있는 이탈기로 11-히드록시기가 전환됨으로써 하기 식 IV 의 화합물이 생성되는 단계를 위해 용매에 넣어진다:
(화학식 IV)
상기 식에서, -A-A-, R3, -B-B-, R8 및 R9 는 식 XIII 에서 정의된 바와 같고, R1 은 식 V 에서 정의된 바와 같으며, R2 는 저급 아릴술포닐옥시, 알킬술포닐옥시,아실옥시 또는 할로겐화물이다. 바람직한 것은 11α-히드록시가 식 V 의 중간체 생성물을 함유하고 있는 용액에 첨가되는 저급 알킬술포닐 할로겐화물, 아실 할로겐화물 또는 산 무수물과의 반응에 의하여 에스테르화되는 것이다. 아세트산 무수물과 같은 저급 산 무수물 및 트리할로겐화된 산 무수물, 예컨대 트리플루오로아세트산 무수물이 적당한 아실옥시 이탈기를 제조하는데 사용될 수 있다. 그러나 저급 알킬술포닐 할로겐화물, 특히 염화 메탄술포닐이 바람직하다. 또는 달리, 11-α 히드록시기는 적당한 시약, 예컨대 브롬화 티오닐, 염화 티오닐, 염화 술푸릴 또는 염화 옥살릴의 반응에 의하여 할로겐화물로 전환될 수 있다. 11α-술폰산 에스테르를 형성하기 위한 다른 시약으로는 염화 토실, 염화 벤젠술포닐 및 트리플루오로메탄술폰산 무수물이 있다. 반응은 트리에틸아민 또는 피리딘과 같은 수소 할라이드 스캐빈져를 함유하고 있는 용매중에서 수행된다. 탄산 칼륨 또는 탄산 나트륨과 같은 무기 염기도 또한 사용될 수 있다. 식 V 의 히드록시에스테르의 초기 농도는 바람직하게는 약 5 중량 % 내지 약 50 중량 % 이다. 에스테르화 시약은 약간 과잉량으로 존재하는 것이 바람직하다. 염화 메틸렌이 반응에 대해 특히 적당한 용매이지만, 다른 용매, 예컨대 디클로로에탄, 피리딘, 클로로포름, 메틸 에틸 케톤, 디메톡시에탄, 메틸 이소부틸 케톤, 아세톤, 다른 케톤, 에테르, 아세토니트릴, 톨루엔 및 테트라히드로푸란이 또한 사용될 수 있다. 반응 온도는 주로 용매의 휘발성에 의해 결정된다. 염화 메틸렌에서는, 반응 온도는 약 -10 ℃ 내지 약 10 ℃ 의 범위내에 있는 것이 바람직하다.
바람직하게도, 식 V 의 히드록시에스테르 기질은 하기 식 VA 에 해당하고:
(화학식 VA)
생성물은 하기 식 IVA 에 해당한다:
(화학식 IVA)
상기 식들에서, -A-A-, -B-B-, R3, Y1, Y2 및 X 는 식 XIIIA 에서 정의된 바와 같고, R1 은 저급 알콕시카르보닐 또는 히드록시카르보닐이며, R2 는 식 IV 에서 정의된 바와 같다. R3 은 수소인 것이 바람직하다.
식 IV 의 생성물은 식 I 의 화합물, 특히 식 IA 의 화합물의 제조를 위한 중간체로서 실질적인 가치를 가지고 있는 신규한 화합물이다. 바람직하게도, 식 IVA 의 화합물은 -A-A- 및 -B-B- 가 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소, 저급 알킬 또는 저급 알콕시이며, R8 및 R9 가 함께 하기 식의 20-스피록산 고리를 구성하는 식 VA 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
가장 바람직한 식 IV 의 화합물은 메틸 하이드로겐 17α-히드록시-11α-(메틸술포닐)옥시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤이다. 아실옥시 이탈기가 요구되는 경우, 식 IV 의 화합물은 7-메틸 하이드로겐 17-히드록시-3-옥소-11α-(2,2,2-트리플루오로-1-옥소에톡시)-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤; 또는 7-메틸 11α-(아세틸옥시)-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤인 것이 바람직하다.
필요에 따라 식 IV 의 화합물은 용매를 제거함으로써 단리될 수 있다. 바람직하게도, 반응 용액이 먼저 수성 알칼리 세척 용액, 예컨대 0.5 내지 2 N 의 NaOH 로, 이어서 산성 세척액, 예컨대 0.5 내지 2 N 의 HCl 로 세척된다. 반응 용매가 제거된 후, 생성물은 예컨대 생성물을 염화 메틸렌중에 취하고 이어서 식 IV 의 생성물의 용해도를 저하시키는 에틸 에테르와 같은 다른 용매를 첨가하여 식 IV 의 생성물이 결정 형태로 침전되는 것을 유발함으로써 재결정된다.
식 IV 의 생성물의 회수에서, 또는 하기에서 추가로 설명되는 바와 같은 식 IV 의 중간체의 식 II 의 중간체로의 전환을 위한 반응 용액의 제조에서, 모든 추출 및/또는 세척 단계들은 만약 용액이 산성 및 염기성 불순물을 제거하기 위하여 이온 교환 수지로 대신 처리되는 경우에 수행되지 않을수 있다. 용액은 먼저 음이온 교환 수지로 처리된 후, 양이온 교환 수지로 처리된다. 또는 달리, 반응 용액은 먼저 무기 흡착제, 예컨대 염기성 알루미나 또는 염기성 실리카로 처리된 후, 계속해서 희석된 산 세척액으로 처리될 수 있다. 염기성 실리카 또는 염기성 알루미나는 전형적으로 생성물의 kg 당 약 5 와 약 50 g 사이의 비율로, 바람직하게는 생성물 kg 당 약 15 내지 약 20 g 의 비율로 반응 용액과 혼합될 수 있다. 이온 교환 수지 또는 무기 흡착제가 사용되는 경우, 처리는 단순히 수지 또는 무기 흡착제를 주변 온도에서 교반하는 조건하에 반응 용액으로 슬러리를 만든 후, 수지 또는 무기 흡착제를 여과에 의해 제거함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 식 IV 의 생성물 화합물은 용매 부분의 제거에 의하여 농축된 용액으로서 미정제 형태로 회수된다. 이 농축된 용액은 직접 방법의 다음 단계에서 사용되는데, 다음 단계는 식 IV 의 화합물로부터 11α-이탈기가 제거됨으로써 하기 식 II 의 엔에스테르가 제조되는 단계이다:
(화학식 II)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 상기 식 XIII 에서 정의된 바와 같고, R1 은 식 V 에서 정의된 바와 같다. 이 반응의 목적에 대하여, 식 IV 의 화합물의 R2 치환기는 어떠한 이탈기든지 될 수 있으며, 그것의 분리는 9- 와 11-탄소 사이의 이중 결합을 만드는데 효과적이다. 바람직하게도, 이탈기는 저급 알킬술포닐옥시 또는 아실옥시 치환기이며, 그것은 산 및 알칼리 금속 염과의 반응에 의하여 제거된다. 광산이 사용될 수도 있지만, 저급 알칸산이 바람직하다. 유익하게도, 반응을 위한 시약은 추가로 사용되는 알칸산의 알칼리 금속 염을 포함한다. 특히 이탈기가 메실옥시를 포함하고 반응 시약은 포름산 또는 아세트산 및 이들 산 또는 다른 저급 알칸산중 하나의 알칼리 금속염을 포함하는 것이 바람직하다. 이탈기가 메실옥시이고 제거용 시약이 아세트산과 아세트산 나트륨이거나 또는 포름산과 포름산 칼륨인 경우에, 상대적으로 높은 비율의 9,11-올레핀 대 11,12-올레핀이 관찰된다. 만약 이탈기가 제거되는 중에 자유수가 존재한다면, 불순물은 특히 하기 식의 7,9-락톤을 형성하는 경향이 있고, 이 화합물은 최종 생성물로부터 제거하기가 어렵다:
상기 식에서, -A-A-, R3, -B-B-, R8 및 R9 는 식 XIII 에서 정의된 바와 같다. 그러므로, 아세트산 무수물 또는 다른 건조제가 포름산중에 존재하는 물을 제거하기 위하여 사용된다. 반응 전의 반응 혼합물의 자유수 함량은 물에 대한 카알 피셔 (Karl Fisher) 분석에 의해 측정되는 바, 총 반응 용액을 토대로 하여 약 0.5 중량 % 이하, 바람직하게는 0.1 중량 % 아래의 수준으로 유지되어야 한다. 비록 반응 혼합물이 반응을 실행할 수 있을 정도로 건조하게 유지되는 것이 바람직하긴 하지만, 만족할만한 결과는 0.3 중량 % 의 물로 이루어졌다. 바람직하게는, 반응 충전 혼합물에 알칸산 중의 약 4 중량 % 와 약 50 중량 % 사이의 식 IV 기질이 함유되어 있는 것이다. 약 4 와 약 20 중량 % 사이의 산의 알칼리 금속 염이 포함되는 것이 바람직하다. 아세트산 무수물이 건조제로서 사용되는 경우에, 그것은 알칸산의 몰당 약 0.05 몰 내지 약 0.2 몰의 비율로 존재하는 것이 바람직하다.
반응 혼합물중의 부산물 7,9-락톤과 11,12-락톤의 비율은 제거 시약에 트리플루오로아세트산, 트리플루오로아세트산 무수물 및 이탈기의 제거와 엔에스테르의 형성 (9,11-올레핀)을 위한 시약으로서 아세트산 칼륨의 조합물이 포함되어 있는 경우에 상대적으로 낮다. 트리플루오로아세트산 무수물은 건조제로서 작용하며, 트리플루오로아세트산과 제거 시약을 토대로 하여, 최소한 약 3 중량 %, 보다 바람직하게는 최소한 약 15 중량 %, 가장 바람직하게는 약 20 중량 % 의 비율로 존재하여야 한다.
7,9-락톤 외에 합성의 중간체 및 크로마토그래피상의 마아커로서 유용한 다른 불순물 및 부산물이 방법 1 합성의 이 단계에서 관찰되었다. 식 II 의 엔에스테르의 신규한 4,9,13-트리엔 (예를 들면, 7-메틸 하이드로겐 17-메틸-3-옥소-18-노르프레그나-4,9(11),13-트리엔-7α,21-디카르복실레이트)이 생성물 용액으로부터 크로마토그래피에 의하여 단리되었다. 생성된 이 화합물의 양은 합성의 이 단계에 대한 반응 시간의 증가와 함께 증가하는 것으로 나타난다. 화합물은 락톤이 양성자화되고 그 결과의 C17 카보늄 이온이 각을 이루는 메틸기가 C13 위치로부터 이동되는 것을 용이하게 하는 경우 형성되는 것으로 여겨진다. 이 중간체의 탈양성자화로 4,9,13-트리엔이 생성된다.
식 II 의 엔에스테르의 신규한 5-시아노-△11,12 (예를 들면 7-메틸 하이드로겐 5β-시아노-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-11-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤) 및 식 II 의 엔에스테르의 신규한 5-시아노 (예를 들면 7-메틸 하이드로겐 5-시아노-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-11-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤)가 또한 미정제 생성물로부터 크로마토그래피에 의하여 단리되었다. 이들 화합물들은 각각 잔류하는 5-시아노-7-산 및 5-시아노 히드록시에스테르의 탈수를 통하여 형성되며, 미정제 생성물 용액중에 방법 1 합성의 세 번째 단계의 결과로서 존재하는 것으로 여겨진다.
식 II 의 엔에스테르의 신규한 C17 에피머 (예를 들면 7-메틸 하이드로겐 17-히드록시-3-옥소-17α-프레그나-4,9(11)-디엔-7,21-디카르복실레이트, γ-락톤)도 또한 미정제 생성물로부터 크로마토그래피에 의하여 단리되었다. 제거 반응의 산성 조건이 C17 키랄 중심의 라세미화를 유발할 수 있어서 엔에스테르의 17-에피머가 생성되는 것으로 여겨진다. 17-에피머는 포름산 칼륨, 포름산 및 아세트산 무수물의 용액과 식 IV 의 화합물을 반응시키고, 생성되는 17-에피머를 단리함으로써 직접 합성될 수 있다.
비록 미정제 생성물 용액에서 불순물로서 관찰되지는 않았지만, 식 V 의 히드록시에스테르의 11-케톤이 해당하는 히드록시에스테르의 11-히드록시를 적당한 산화제, 예컨대 죤스 시약과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 바람직하게 제조되는 11-케톤은 7-메틸 하이드로겐 17-히드록시-3,11-디옥소-17α-프레그나-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤이다.
또는 달리, 식 IV 의 화합물로부터 11α-이탈기가 제거되고 식 IV 의 용액이 유기 용매, 예컨대 DMSO, DMF 또는 DMA 중에서 가열됨으로써 식 II 의 엔에스테르가 생성될 수도 있다.
또한 본 발명에 따르면, 식 IV 의 화합물이 초기에 산, 예컨대 술폰산 톨루엔 또는 무수 광산, 예컨대 황산의 존재하에 알케닐 알카노에이트, 에컨대 아세트산 이소프로페닐과 반응하여 하기와 같은 식 IV 의 화합물의 3-에놀 에스테르가 형성된다:
(화학식 IV(Z))
또는 달리, 3-에놀 에스테르는 식 IV 의 화합물이 산 무수물 및 염기, 예컨대 아세트산 및 아세트산 나트륨으로 처리되어 형성될 수 있다. 또한 다른 방법으로는, 식 IV 의 화합물이 산의 존재하에 케톤으로 처리되어 식 IV(Z) 의 화합물이 제조되는 방법이 있다. 식 IV(Z) 의 중간체는 그런 다음 포름산 또는 아세트산의 존재하에 알칼리 금속 포름산염 또는 아세트산염과 반응되어 하기 식 IV(Y):
(화학식 IV(Y))
의 △9,11 에놀 아세테이트가 생성된 후, 이 화합물은 유기 용매, 바람직하게는 메탄올과 같은 알코올 중에서 에놀 아세테이트의 열적 분해 또는 이 화합물과 알칼리 금속 알콕시드와의 반응에 의하여 식 II 의 엔에스테르로 전환될 수 있다. 제거 반응은 식 II 의 엔에스테르에 대하여 매우 선택적인데, 11,12-올레핀 및 7,9-락톤에 대하여 우선적이며, 이러한 선택성은 에놀 아세테이트의 엔온으로 전환되는 과정 내내 보존된다.
바람직하게도, 식 IV 의 기질은 하기 식 IVA 에 해당하고, 엔에스테르는 하기 식 IIA 에 해당한다:
(화학식 IVA)
(화학식 IIA)
상기 식들에서, -A-A-, -B-B-, R3, Y1, Y2, 및 X 는 식 XIIIA 에서 정의된 바와 같으며, R1 은 식 V 에서 정의된 바와 같다. R3 은 수소인 것이 바람직하다.
필요에 따라, 식 II 의 화합물은 용매를 제거하고, 고체 생성물을 저온수중에 넣은 후, 에틸 아세테이트와 같은 유기용매로 추출함으로써 단리될 수 있다. 적절한 세척 및 건조 단계후에, 생성물은 추출 용매를 제거함으로써 회수된다. 그런 다음 엔에스테르가 식 I 의 생성물로의 전환에 적당한 용매에 용해된다. 또는 다르게, 엔에스테르는 농축된 생성물 용액에 물을 첨가하고 고체 생성물을 여과하고, 그로써 우선적으로 7,9-락톤을 제거함으로써 단리될 수 있다. 식 II 의 기질의 식 IA 의 생성물로의 전환은 미국 특허 제 4,559,332 호에 개시된 방식으로, 또는 보다 바람직하게는 하기 설명되는 바와 같이 할로아세트아미드를 사용하는 신규한 반응에 의하여 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 식 V 의 히드록시에스테르는 식 IV 의 중간 화합물의 단리 없이 식 II 의 엔에스테르로 전환될 수 있다. 이 방법에서, 히드록시에스테르는 염화 메틸렌과 같은 유기 용매에 넣어지고, 아실화제, 예컨대 염화 메탄술포닐 또는 할로겐화제, 예컨대 염화 술푸릴중 어느 하나가 이 용액에 첨가된다. 그런 다음 이 혼합물이 교반되고, 할로겐화가 포함되는 경우에는 HCl 스캐빈져, 예컨대 이미다졸이 첨가된다. 이 반응은 매우 발열성이 크며, 따라서 전체를 냉각시키면서 조절된 속도로 수행되어야 한다. 염기가 첨가된 후, 그 결과의 혼합물은 적절한 온도, 예컨대 0 ℃ 내지 실온 또는 실온보다 약간 더 높은 온도로 가온되고, 전형적으로 1 시간 내지 약 4 시간동안 반응된다. 반응이 완료된 후, 용매가 바람직하게는 약 -10 ℃ 내지 약 +15 ℃, 보다 바람직하게는 0 ℃ 내지 약 5 ℃ 에서 고진공 조건 (예컨대 약 24" 내지 약 28 " Hg)하에서 제거되어 용액이 농축되고 과잉의 염기가 제거된다. 그런 다음 기질은 엔에스테르로의 전환을 위해 유기 용매, 바람직하게는 염화 메틸렌과 같은 할로겐화된 용매중에 재용해된다.
이탈기 제거 시약은 바람직하게는 유기산, 유기산염 및 건조제, 바람직하게는 각각 포름산, 알칼리 금속 포름산염 및 아세트산 무수물을 건식 반응기에서 혼합함으로써 제조된다. 아세트산 무수물의 첨가는 발열반응이고, 그 결과 CO 가 방출되므로, 따라서 첨가 속도가 조절되어야 한다. 물의 제거를 촉진하기 위해서는, 이 반응의 온도는 바람직하게는 약 60 ℃ 내지 약 90 ℃, 보다 바람직하게는 약 65 ℃ 내지 약 75 ℃ 의 범위에서 유지된다. 그런 다음 이 시약은 식 IV 의 화합물의 생성물 용액에 첨가되어 제거 반응이 이루어진다. 약 4 시간 내지 8 시간 후에 반응 혼합물은 바람직하게는 최소한 약 85 ℃ 의 온도, 그러나 약 95 ℃ 이하의 온도로 모든 휘발성 증류물이 제거될 때까지, 그런 다음 추가로 반응이 완료될 수 있는 기간동안, 전형적으로 약 1 내지 약 4 시간동안 가열된다. 반응 혼합물이 냉각되고, 표준 추출 기법에 의해 회수된 후 엔에스테르는 용매를 증발시킴으로써 원하는 대로 회수될 수 있다.
추가로 식 II 의 엔에스테르는 제거 반응에 뒤따르는 추출 단계에 대한 필요가 없는 대체 과정에 의하여 반응 용액으로부터 회수될 수 있고, 그로써 비용이 절감되며, 수율이 개선되고 및/또는 생산성이 개선된다. 이 방법에서, 엔에스테르 생성물은 반응 혼합물을 포름산 제거후 물로 반응 혼합물을 희석함으로써 침전된다. 그런 다음 생성물이 여과에 의해 단리된다. 추출은 필요하지 않다.
식 V 의 히드록시에스테르를 식 IV 의 화합물을 단리하지 않고서도 식 II 의 엔에스테르로 전환시키기 위한 또 다른 방법에 따르면, 식 V 의 히드록시에스테르의 11α-히드록시기가 할로겐으로 치환된 후, 식 II 의 엔에스테르가 열에 의한 탈히드로할로겐화에 의하여 제자리 형성된다. 히드록시기가 할로겐으로 대체되는 것은, 이미다졸과 같은 할로겐화 수소 스캐빈져의 존재하에 저온에서 할로겐화 술푸릴, 바람직하게는 염화 술푸릴과의 반응에 의하여 이루어진다. 히드록시에스테르는 테트라히드로푸란과 같은 용매에 용해되고 0 ℃ 내지 약 -70 ℃ 로 냉각된다. 술푸릴 할로겐화물이 첨가되고 반응 혼합물은 적당한 온도, 예컨대 실온으로, 제거 반응이 완료되기에 충분한 시간동안, 전형적으로 약 1 내지 4 시간동안 가온된다. 이 구체예의 방법은 두 단계를 하나로 조합할 뿐만 아니라, 할로겐화된 반응 용액; 산 (예컨대 아세트산); 및 건조 시약 (예컨대 아세트산 무수물 또는 황산 나트륨)의 사용을 불필요하게 해준다. 더욱이, 반응은 환류를 필요로 하지 않으며, 아세트산이 건조제로서 사용되는 경우 생성되는 부산물인 CO 의 생성을 피할수 있도록 해준다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 식 VI 의 디케톤 화합물은 어떠한 중간체도 정제된 형태로 단리될 필요없이 에폭시멕스레논 또는 식 I 의 다른 화합물로 전환될 수 있다. 이 바람직한 방법에 따르면, 히드록시에스테르를 함유하고 있는 반응 용액은 강산 용액으로 억제되고, 주변 온도로 냉각된 후, 적절한 추출 용매로 추출된다. 유익하게도, 무기염의 수용액, 예컨대 약 10 중량 % 의 식염수용액이 추출전에 반응 혼합물에 첨가된다. 추출물은 세척되고 케톤 분열 반응으로부터 남아있는 메탄올 용매를 제거하기 위하여 공비 증류에 의하여 건조된다.
그 결과의 약 5 중량 % 와 약 50 중량 % 사이의 식 V 의 화합물이 함유되어 있는 농축된 용액은 저온에서 아실화제 또는 알킬술포닐화제와 접촉되어 술폰산 에스테르 또는 디카르복실산 에스테르가 형성된다. 알킬술폰화 또는 카르복실화 반응이 완료된 후, 반응 용액은 산성 교환 수지 칼럼을 통과하고, 이어서 염기성 교환 수지 칼럼위를 통과하여 염기성 및 산성 불순물이 제거된다. 각각의 칼럼 통과 후에, 칼럼은 적절한 용매, 예컨대 염화 메틸렌으로 세척되어 잔류하는 술폰산 또는 디카르복실산 에스테르가 용액으로부터 회수된다. 조합된 용출액 및 세척액 분획들은 조합되고 바람직하게는 진공하에 환원되어 식 IV 의 술폰산 에스테르 또는 디카르복실산 에스테르가 함유되어 있는 농축된 용액이 제조된다. 이 농축된 용액은 그런 다음 11α-에스테르 이탈기의 제거 및 수소의 분리를 위해 효과적인 제제가 포함되어 있는 건조 시약과 접촉되어 9,11-이중 결합이 형성된다. 바람직하게는, 이탈기의 제거를 위한 시약은 상술된 포름산/알칼리 금속 포름산염/아세트산 무수물 건조 시약 용액을 포함하고 있는 것이 좋다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물은 냉각되고, 포름산 및/또는 다른 휘발성 성분들이 진공하에 제거된다. 잔류물은 주변 온도로 냉각되고, 적절한 세척 단계를 거친 후에 건조되어, 식 II 의 엔에스테르가 함유되어 있는 농축된 용액이 얻어진다. 이 엔에스테르는 그런 다음 본원에 설명되어 있는 방법, 또는 미국 특허 제 4,559,332 호에 설명되어 있는 방법을 사용하여 에폭시멕스레논 또는 식 I 의 다른 화합물로 전환될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 용매는 진공하에 반응 용액으로부터 제거되고, 식 IV 의 생성물은 물과 적절한 유기 용매, 에컨대 에틸 아세테이트 사이에 분배된다. 그런 다음 수성 층이 유기 용매로 백 (back) 추출되고 백 추출물은 알칼리 용액, 바람직하게는 알칼리 금속 할로겐화물이 함유되어 있는 알칼리 금속 수산화물로 세척된다. 유기 상은 바람직하게는 진공하에 농축되어 식 II 의 엔에스테르 생성물이 생성된다. 그런 다음 식 II 의 생성물은 유기 용매, 예컨대 염화 메틸렌중에 넣어져서 추가로 미국 특허 제 4,559,332 호에 설명된 방식으로 반응되어 식 I 의 생성물이 제조된다.
트리할로아세토니트릴이 에폭시드화 반응에 사용되는 경우, 용매의 선택이 중요하며, 용매는 할로겐화된 용매가 매우 바람직하고, 염화 메틸렌이 특히 바람직한 것으로 밝혀졌다. 디클로로에탄 및 클로로벤젠과 같은 용매들이 타당하게 만족할만한 수율을 제공하지만, 수율은 일반적으로 염화 메틸렌 반응 매질에서 더 좋다. 아세토니트릴 및 에틸 아세테이트와 같은 용매들은 일반적으로 낮은 수율을 제공하는 한편, 메탄올 또는 물/테트라히드로푸란과 같은 용매중에서의 반응으로는 원하는 생성물을 아주 조금 얻을 수 있다.
또한 본 발명에 따르면, 에폭시멕스레논의 합성에서 많은 개선점들이 에폭시화 반응을 위한 과산화물 활성화제로서 트리할로아세토니트릴 보다는 트리할로아세트아미드를 사용함으로써 이루어질 수 있는 것으로 발견되었다. 특히 바람직한 방법에 따르면, 에폭시드화는 트리클로로아세트아미드와 적절한 완충제의 존재하에 식 IIA 의 기질과 과산화수소와의 반응에 의하여 수행된다. 바람직하게도, 반응은 약 3 내지 약 7, 보다 바람직하게는 약 5 내지 약 7 의 범위의 pH 에서 수행된다. 그러나, 이들 고려에도 불구하고, 성공적인 반응은 바람직한 pH 범위 밖에서 이루어졌다.
특히 좋은 결과는 디포타슘 하이드로겐 포스페이트를 포함하고 있는 완충액으로 및/또는 디포타슘 하이드로겐 포스페이트와 포타슘 하이드로겐 포스페아트가 약 1:4 와 약 2:1 사이의 비율로, 가장 바람직하게는 약 2:3 의 비율로 조합되어 있는 완충액으로 얻어진다. 붕산염 완충액도 사용될 수 있지만, 일반적으로 디포타슘 포스페이트 또는 K2HPO4/KH2PO4 혼합물을 사용할 때보다 전환 속도가 더 느리다. 완충액 구성이 어떻든 간에, 완충액은 상기에서 나타낸 범위의 pH 를 제공하여야 한다. 완충액의 전체적인 조성 또는 그것이 부여할 수 있는 정확한 pH 외에, 반응은 만약 최소한 일부분의 완충액이 이염기성 하이드로겐포스페이트 이온으로 구성된다면 훨씬 더 효과적으로 진행된다는 것이 관찰되었다. 이 이온은 본질적으로 첨가물 또는 촉진제와 과산화물 이온을 포함하는 착화합물의 형성에서 균질한 촉매로서 작용할 수 있으며, 그것의 생성은 또한 전체적인 에폭시드화 반응 메카니즘에 필수적인 것이 될 것이다. 그러므로, 이염기성 하이드로포스페이트 (바람직하게는 K2HPO4 로부터 유도됨)에 대한 정량적인 요구량은 단지 적은 촉매적 농도일 것이다. 일반적으로, K2HPO4 는 기질 당량당 최소한 약 0.1 당량, 예컨대 약 0.1 과 0.3 사이의 당량으로 존재하는 것이 바람직하다.
반응은 적당한 용매, 바람직하게는 염화메틸렌중에서 수행되지만, 또는 달리 다른 할로겐화된 용매, 예컨대 클로로벤젠 또는 디클로로에탄도 사용될 수 있다. 톨루엔 및 톨루엔과 아세토니트릴의 혼합물도 또한 만족스러운 것으로 발견되었다. 특별한 이론에 구속됨이 없이, 반응은 과산화물 중간체가 형성되고 물 함량이 낮은 유기상에 분배된 후, 유기상에서 기질과 반응하게 되는 2-상 시스템에서 가장 효과적으로 진행되는 것으로 여겨진다. 그러므로, 바람직한 용매는 물 용해도가 낮은 용매들이다. 톨루엔으로부터의 효과적인 회수는 아세토니트릴과 같은 다른 용매의 포함에 의해 촉진된다.
식 II 의 기질의 식 I 의 생성물로의 전환에서, 톨루엔은 기질이 톨루엔중에 자유롭게 녹고 생성물은 그렇지 않기 때문에 방법에 장점을 제공한다. 그러므로 생성물은 전환이 40 내지 50 % 에 이르면 반응중에 침전되어 세 개의 상의 혼합물이 되고, 그것으로부터 여과에 의하여 생성물이 편리하게 분리될 수 있다. 메탄올, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴 단독, THF 및 THF/물은 방법의 이 단계의 전환을 수행함에 있어서 할로겐화된 용매 또는 톨루엔만큼 효과적인 것으로 증명되지는 않았다.
트리클로로아세트아미드가 매우 바람직한 시약인 한편, 다른 트리할로아세트아미드, 예를 들면 트리플루오로아세트아미드 및 클로로디플루오로아세트아미드도 또한 사용될 수 있다. 트리할로메틸벤젠아미드, 및 전자를 철회하는 트리할로메틸기와 아미드의 카르보닐기 사이에 아릴렌, 알케닐 또는 알키닐 부분 (또는 전자 철회기의 철회된 전자가 아미드 카르보닐에 운반되는 것을 가능하게 하는 다른 기)을 가지고 있는 다른 화합물들이 또한 유용할 수 있다. 헵타플루오로부틸아미드도 또한 사용될 수 있지만, 그 결과는 덜 만족스럽다. 일반적으로, 과산화물 활성화제는 하기 식에 해당할 수 있다:
R0 C(O)NH2
상기 식에서, R0 는 최소한 모노클로로메틸 기의 그것과 같이 높은 전자 철회 강도 (시그마 상수에 의해 측정되는 바)를 가지고 있는 기이다. 전자 철회기는 바람직하게는 최대의 효과를 위하여 아미드 카르보닐에 직접 부착된다. 보다 구체적으로, 과산화물 활성화제는 하기 식에 해당할 수 있다:
*상기 식에서, RP 는 전자 철회기의 전자 철회 효과의 아미드 카르보닐로의 전달을 가능하게 하는 기로, 바람직하게는 아릴렌, 알케닐, 알키닐 및 -( CX4X5)n - 부분중에서 선택되며; X1, X2, X3, X4 및 X5 는 독립적으로 할로, 수소, 알킬, 할로알킬 및 시아노 및 시아노알킬로부터 선택되고; n 은 0, 1 또는 2 이며; 단 n 이 0 일 때는 X1, X2, 및 X3 중 최소한 하나가 할로이고; RP 가 -(CX 4X5)n- 이고 n 이 1 또는 2 일 때, X4 와 X5 중 최소한 하나는 할로이다. X1, X2, X3, X4 또는 X5 중 어느 하나가 할로가 아니면, 그것은 바람직하게는 할로알킬, 가장 바람직하게는 퍼할로알킬이다. 특히 바람직한 활성화제로는 n 이 0 이고 X1, X2 및 X3 중 최소한 두 개가 할로인 것들; 또는 RP 가 -(CX4X5)n- 이고 n 이 1 또는 2 이며 X4 와 X5 중 최소한 하나가 할로이고, 다른 것은 할로 또는 퍼할로알킬이며, X1, X2, 및 X3 은 할로 또는 퍼할로알킬인 것들이다. X1, X2, X3, X4 및 X5 의 각각은 Cl 또는 F 인 것이 바람직하며, 가장 바람직한 것은 Cl 이다. 비록 퍼할로알킬 또는 퍼브로모알킬과 같은 혼합된 할로겐화물 및 그것들의 조합물도 적당할 수 있지만, 그 경우 아미드 카르보닐에 직접 부착된 탄소는 최소한 하나의 할로기로 치환되어야 한다.
바람직하게는, 과산화물 활성화제는 초기에 존재하는 기질의 당량당 최소한 1 당량, 보다 바람직하게는 약 1.5 와 약 2 당량 사이의 비율로 존재한다. 과산화수소는 최소한 중간 정도의 과잉량으로 반응에 충전되거나, 또는 에폭시화 반응이 진행됨에 따라 점진적으로 첨가되어야 한다. 비록 반응이 기질의 1 몰당 단지 1 내지 2 당량의 과산화수소를 소모한다 하더라도, 과산화수소는 초기에 존재하는 기질 및 활성화제에 비하여 실질적으로 과잉으로 충전되는 것이 바람직하다. 본 발명을 특정한 이론으로 한정하는 일 없이, 반응 메카니즘에는 활성화제와 과산화수소 음이온의 첨가물의 형성이 포함되고, 이런 반응의 형성은 역반응이 잘 일어나게 하는 평형으로 가역적이며, 그러므로 반응을 앞방향으로 끌어가기 위해서는 초기에 실질적으로 과잉량의 과산화수소가 필요한 것으로 여겨진다. 반응 온도는 협의로는 중요하지 않으며, 0 내지 약 100 ℃ 범위내에서 효과적으로 수행될 수 있다. 최적 온도는 용매의 선택에 좌우된다. 일반적으로, 바람직한 온도는 약 20 ℃ 내지 약 30 ℃ 지만, 어떤 용매, 예컨대 톨루엔에서는 반응이 약 60 ℃ 내지 약 70 ℃ 의 범위에서 유리하게 수행될 수 있다. 약 25 ℃ 에서는, 반응은 전형적으로 약 10 시간이내에, 보통 약 3 시간 내지 약 6 시간 이내에 진행된다. 필요에 따라, 추가의 활성화제 및 과산화수소가 기질의 완전한 전환을 이루기 위하여 반응 사이클이 끝날 때에 첨가될 수 있다.
반응 사이클이 끝날 때, 수성 상이 제거되며, 유기 반응 용액이 수용성 불순물을 제거하기 위하여 바람직하게 세척된 후, 그런 다음 생성물이 용매의 제거에 의하여 회수될 수 있다. 용매가 제거되기 전에, 반응 용액은 최소한 약한 내지 중간 정도의 알칼리성 세척액, 예컨대 탄산 나트륨으로 세척되어야 한다. 바람직하게는, 반응 혼합물은 생성물 손실을 최소화하기 위하여 계속해서 물중의 약한 (예컨대 약 3 중량 %) 아황산 나트륨 용액과 같은 순한 환원 용액; 알칼리성 용액, 에컨대 NaOH 또는 KOH (바람직하게는 약 0.5 N); HCl 과 같은 산 용액 (바람직하게는 약 1 N); 및 물 또는 식염수가 포함되어 있는 최종 중성 세척액, 바람직하게는 포화된 식염수로 세척되어야 한다. 반응 용매가 제거되기 전에, 유기 용매같은 다른 용매, 바람직하게는 에탄올이 첨가되는 것이 유리하며, 그로써 생성물은 더 많은 휘발성 반응 용매를 제거하기 위한 증류후에 결정화에 의하여 회수될 수 있다.
트리클로로아세트아미드 또는 다른 신규한 과산화물 활성화제를 활용하는 신규한 에폭시화 방법이 에폭시멕스레논을 제조하기 위한 다양한 방법보다 잘 적용되며, 실제로 액체상에서 반응되기 쉬운 광범위한 기질에서 올레핀성 이중 결합을 가로지르는 에폭시드의 형성에 사용될 수 있음이 이해되어져야 한다. 반응은 올레핀이 사중치환되고 삼중치환된 경우, 즉 RaRbC=CRcRd (식에서 Ra 내지 Rd 는 수소 이외의 치환기를 나타낸다) 인 불포화 화합물에서 특히 효과적이다. 반응은 기질이 삼중치환된 이중 결합을 포함하고 있는 고리형 화합물이거나, 또는 사중치환된 이중 결합을 포함하고 있는 고리형 또는 비고리형 화합물인 경우에 가장 빠르고 완전하게 진행된다. 에폭시화 반응에 예시적인 그러한 기질로는 △9,11-칸레논, 및 다음과 같은 기질들이 있다:
반응이 삼중치환된 이중 결합 및 사중치환된 이중 결합으로 보다 빠르고 완전하게 진행되기 때문에, 올레핀성 탄소가 단일치환되었거나 또는 때로는 이중치환된 경우에 다른 이중 결합을 포함할 수 있는 화합물에서 그러한 (삼중치환된 또는 사중치환된) 이중 결합을 가로지르는 선택적인 에폭시화에 특히 효과적이다.
일반적인 에폭시드화 반응을 예시하는 다른 비-제한적 실예로는 다음과 같은 에폭시드화 반응이 있다:
또한 반응은 단일치환되었거나 또는 이중치환된 이중 결합, 예컨대 다양한 스테로이드 기질에서 11,12-올레핀의 에폭시드화에서도 유리하게 사용될 수 있음이 이해되어져야 한다. 그러나, 더 고도로 치환된 이중 결합, 예컨대 9,11-올레핀이 아주 선택적으로 우선적으로 에폭시드화되기 때문에, 본 발명의 방법은 본원에서 설명되는 다양한 반응 방법의 에폭시드화 단계에서 고수율 및 고생산성을 이루는데 특히 효과적이다.
개선된 방법은 하기 식:
의 에폭시드화에 의하여 하기 식 IB 를 제조하고:
(화학식 IB)
하기 식:
의 에폭시드화에 의하여 하기 식 IC:
(화학식 IC)
를 제조하는데 특히 유리하게 적용될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
에폭시드화 반응에 대한 산소 전달 시약으로서 트리클로로아세토니트릴 대신에 트리클로로아세트아미드가 사용되는 본 발명의 방법에 대해 많은 장점들이 있음이 증명되었다. 트리클로로아세트아미드 시약 시스템은 α,β-불포화 케톤과 같은 전자적으로 결핍된 올레핀에 대해 낮은 친화성을 가지고 있다. 이것으로 두가지 유형의 이중 결합을 가지고 있는 기질의 비-결합된 올레핀의 선택적인 에폭시드화가 가능해진다. 부수적으로, 스테로이드와 같은 복잡한 기질에서 이중치환된 올레핀과 삼중치환된 올레핀이 반응에 의하여 구별될 수 있다. 그러므로, 양호한 선택성이 이성질체 △-9,11 및 △-11,12 화합물의 에폭시드화에서 관찰된다. 이 경우에, 9,11 에폭시드는 △-11,12 이중 결합을 함유하고 있는 이성질체의 최소한의 반응으로 형성된다. 따라서, 반응 수율, 생성물 프로필, 및 최종 순도는 트리할로아세토니트릴이 사용되는 반응에 비교하여 실질적으로 증강된다. 나아가, 트리할로아세토니트릴을 사용함으로써 관찰된 실질적으로 과잉의 산소 생성은 트리클로로아세트아미드를 사용하여 최소화되고, 이것은 산화과정에 대하여 개선된 안전성을 부여하는 것으로 발견되었다. 또한, 트리클로로아세토니트릴로 촉진된 반응과는 대조적으로, 트리클로로아세트아미드 반응은 발열 효과를 최소로 억제함으로써, 반응의 열적 프로필의 조절을 용이하게 한다. 교반 효과는 최소이고 반응기 성능은 보다 더 일정한 것으로 관찰되며, 또한 트리클로로아세토니트릴 방법을 능가하는 장점을 가지고 있다. 반응은 트리클로로아세토니트릴로 촉진된 반응보다 더 규모가 커지기 쉽다. 생성물 분리와 정제는 간단하다. m-클로로퍼옥시벤조산 또는 다른 과산을 사용하였을 때 경험하는 것과 같은 카르보닐 기능의 베이어-빌라거 산화 (케톤의 에스테르로의 과산화물 촉진된 전환)를 관찰할 수 없다. 시약은 값싸며, 쉽게 구할 수 있고, 조작이 쉽다.
또한, 다음의 화합물들이 식 II 의 엔에스테르가 식 I 의 화합물로 전환되는 방법 1 합성의 단계로부터 미정제 생성물중의 크로마토그래피에 의하여 관찰되었다:
(1) 식 II 의 엔에스테르의 신규한 11α,12α 에폭시드, 예를 들면 7-메틸 하이드로겐 11α,12α-에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤;
(2) 식 II 의 엔에스테르의 신규한 4,5:9,11-디에폭시드, 예를 들면 7-메틸 하이드로겐 4α,5α:9α,11α-디에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레그난-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤;
(3) 식 II 의 엔에스테르의 신규한 12-케톤, 예를 들면 7-메틸 하이드로겐 17-히드록시-3,12-디옥소-17α-프레그나-4,9(11)-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤;
(4) 식 II 의 엔에스테르의 신규한 9,11-디히드록시, 예를 들면 7-메틸 하이드로겐 9α,11β,17-트리히드록시-3-옥소-17α-프레그나-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤;
(5) 식 II 의 엔에스테르의 신규한 12-히드록시 유사체, 예를 들면 7-메틸 하이드로겐 12α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레그나-4,9(11)-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤; 및
(6) 식 I 의 화합물의 신규한 7-산, 예를 들면 9,11α-에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤.
이들 화합물은 식 I 의 화합물, 특히 에폭시멕스레논의 제조에서 합성 중간체 및/또는 크로마토그래피 상의 마아커로서 활용된다.
식 II 의 엔에스테르의 11α,12α-에폭시드는 식 IV 의 화합물이 식 II 의 엔에스테르로 전환되는 선행 단계중에 생성되는 불순물을 통하여 형성되는 것으로 여겨진다. 이 불순물은 크로마토그래피에 의하여 단리되었고, △11,12 엔에스테르이다. 그것은 전형적으로 △9,11 엔에스테르를 사용하여, 비록 비율이 변하긴 하지만, 약 90:10 의 비율(△9,11 엔에스테르:△11,12 엔에스테르)로 제조된다. 식 II 의 엔에스테르의 식 I 의 화합물로의 전환중에 △11,12 엔에스테르는 산화되어 11α,12α -에폭시드가 생성된다.
식 I 의 엔에스테르의 4,5:9,11-디에폭시드는 크로마토그래피에 의하여 단리된다. 그것은 엔에스테르의 과잉-에폭시드화로부터 초래되는 것으로 여겨진다. 그것은 전형적으로 미정제 생성물에서, 비록 그 양이 변할 수는 있지만, 최소한 약 5 중량 % 또는 그 이하의 수준에서관찰된다.
식 II 의 엔에스테르의 12-케톤은 크로마토그래피에 의하여 단리되었다. 그것은 엔에스테르의 알릴성 산화에 의하여 초래되는 것으로 여겨진다. 그것은 전형적으로 미정제 생성물에서 비록 그 양은 변할 수 있지만 약 5 중량 % 또는 그 이하의 수준에서 관찰된다. 트리클로로아세토니트릴이 과산화수소 활성화제로서 사용된 경우 미정제 생성물에서 검출되는 12-케톤의 수준은, 트리클로로아세트아미드가 활성화제로서 사용된 경우 검출된 수준보다 더 높았다.
식 II 의 엔에스테르의 9,11-디히드록시는 크로마토그래피에 의하여 단리되었다. 그것은 전형적으로 미정제 생성물에서 비록 그 양이 변할 수는 있지만, 약 5 중량 % 또는 그 이하의 수준에서 관찰된다. 그것은 식 I 의 에폭시드의 가수분해로부터 초래되는 것으로 여겨진다.
식 II 의 엔에스테르의 12-히드록시는 크로마토그래피에 의하여 단리되었다. 그것은 전형적으로 미정제 생성물에서, 비록 그 양이 변할 수는 있지만, 5 중량 % 또는 그 이하의 수준에서 관찰된다. 그것은 계속해서 11β-히드록시가 제거되는 11,12-에폭시드의 가수분해로부터 초래되는 것으로 여겨진다.
또한, 본 발명에 따라 제조된 식 I 의 화합물은 에폭시멕스레논의 투여 및/또는 효력을 촉진시키는 개선된 성질(예컨대 개선된 용해도 및 흡수성)을 가지는 대사산물, 유도체, 선구약물 등을 제공하기 위하여 추가로 변형될 수 있다. 식 I 의 화합물의 6-히드록시 (예를 들면, 7-메틸 하이드로겐 6β,17-디히드록시-9,11α-에폭시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤)는 쥐에서 가능한 대사산물로서 확인된 신규한 화합물이다. 6-히드록시 대사산물은 해당하는 에틸 에놀 에테르 (예를 들면 7-메틸 하이드로겐 9,11α-에폭시-3-에톡시-17-히드록시-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤)로부터 제조될 수 있다. 식 I 의 화합물의 에틸 에놀 에테르는 문헌에 기재되어 있는 과정에 따라 제조될 수 있다 [R.M. Weier and L.M. Hofmann, J. Med. Chem. 1977, 1304]. 그런 다음 에틸 에놀 에테르는 m-클로로퍼벤조산과 반응되어 식 I 의 화합물의 해당하는 6-히드록시가 생성된다.
또한 에폭시멕스레논의 모노카르복실산 염, 특히 칼륨 및 나트륨 염은 알도스테론 길항제의 투여가 지시된 개체에게 식 I 의 화합물의 투여를 촉진하는 대용물로서 적당한 것으로 여겨진다. 순한 염기성 조건하에서는, C7 에스테르 치환기를 가수분해하는 일 없이 식 I 의 화합물의 스피로락톤을 선택적으로 열어서 해당하는 17β-히드록시-17α-(3-프로피온산) 유사체가 얻어진다. 이들 열린 사슬 유사체는 그것들의 락톤 대응물보다 극성이며, 역상 HPLC 에 의해 분석되었을 때 더 짧은 보유 시간을 나타냈다. 산성 조건은 일반적으로 락톤 고리의 재생성을 유발한다.
보다 엄격한 조건하에서는, 스피로락톤은 열려지고 C7 에스테르가 가수분해되어 해당하는 부산물, 식 I 의 17β-히드록시-17α-(3-프로피온산)-7-산 유사체가 얻어진다. 이들 디카르복실산은 역상 HPLC 에 의해 분석되었을 때 모노카르복실산보다 더 짧은 보유 시간을 나타낸다. 산성 조건 (예컨대 0.1 내지 4 M 의 염산과 같은 희석 산으로의 처리)으로는 일반적으로 디카르복실산의 락톤 고리의 재생성이 유발된다.
본 발명의 신규한 에폭시드화 방법은 방법 1 의 합성의 결정적인 단계로서 매우 유용하다. 특히 바람직한 구체예에서, 방법 1 의 전체적인 방법은 다음과 같이 진
행된다:
방법 2
본 발명의 두 번째 신규한 반응 방법 (방법 2)는 칸레논 또는 하기 식 XIII 에 해당하는 다른 기질로 출발한다:
(화학식 XIII)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 상기 식 XIII 에서 정의된 바와 같다. 이 방법의 첫 번째 단계에서, 식 XIII 의 기질은 식 VIII 의 기질의 식 VII 의 중간체로의 전환에 대해 상술된 바와 실질적으로 동일한 시안화 반응 방법를 이용하여 하기 식 XII 의 생성물로 전환된다:
(화학식 XII)
바람직한 식 XIII 의 기질은 하기 식 XIIIA 에 해당하고, 엔아민 생성물은 하기 식 XIIA 에 해당한다:
(화학식 XIIIA)
(화학식 XIIA)
상기 식들에서, -A-A-, -B-B-, R3, Y1, Y2, 및 X 는 식 XIIIA 에서 정의된 바와 같다. R3 은 수소인 것이 바람직하다.
방법 2 의 두 번째 단계에서, 식 XII 의 엔아민은 식 VIII 의 기질의 식 VII 의 중간체로의 전환에 대하여 상술된 바와 실질적으로 동일한 반응 방법를 이용하여, 하기 식 XI 의 중간체 디케톤 생성물로 가수분해된다:
(화학식 XI)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 XIII 에서 정의된 바와 같다.
바람직하게도, 식 XII 의 기질은 하기 식 XIIA 에 해당하고, 디케톤 생성물은 하기 식 XIA 에 해당한다:
(화학식 XIIA)
(화학식 XIA)
상기 식들에서, -A-A-, -B-B-, R3, Y1, Y2, 및 X 는 식 XIIIA 에서 정의된 바와 같다. R3 은 수소인 것이 바람직하다.
또한 반응 방법 2 에 따르면, 식 XI 의 디케톤은 알칼리 금속 알콕시드와 반응되어 멕스레논 또는 하기 식 X 에 해당하는 다른 생성물이 형성된다:
(화학식 X)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 XIII 에서 정의된 바와 같고, R1 은 식 V 에서 정의된 바와 같다. 방법은 식 VI 의 화합물의 식 V 의 화합물로의 전환에 대하여 상술된 것과 실질적으로 동일한 반응 방법를 사용하여 수행된다. 바람직하게는, 식 XI 의 기질은 식 XIA 에 해당하고, 중간체 생성물은 식 XA 에 해당한다:
(화학식 XIA)
(화학식 XA)
상기 식들에서, -A-A-, -B-B-, R3, Y1, Y2, 및 X 는 식 XIIIA 에서 정의된 바와 같고, R1 은 식 V 에서 정의된 바와 같다. R3 은 수소인 것이 바람직하다.
멕스레논 및 식 X 의 다른 화합물들은 다음에 신규한 생체내전환 방법에 의하여 9α-히드록실화되어 하기 식 IX 의 생성물이 생성된다:
(화학식 IX)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 XIII 에서 정의된 바와 같고, R1 은 식 V 에서 정의된 바와 같다. 이 히드록실화 단계에서 사용될 수 있는 유기체중에는 다음과 같은 것들이 있다: 노카르디아 코니크루리아 (Nocardia conicruria) ATCC 31548, 노카르디아 아우렌티아 (N. aurentia) ATCC 12674, 코리네스포라 카씨이콜라 (Corynespora cassiicola) ATCC 16718, 스트렙토마이세스 히드로스코피쿠스 (Streptomyces hydroscopicus) ATCC 27438, 모르티에렐라 이사벨리나 (Mortierella isabellina) ATCC 42613, 뷰브리아 바씨아나 (Beauvria bassiana) ATCC 7519, 페니실륨 푸르푸로게눔 (Penicillum purpurogenum) ATCC 46581, 히포마이세스 크리소스퍼무스 (Hypomyces chrysospermus) IMI 109891, 탐노스틸룸 피리포르메 (Thamnostylum piriforme) ATCC 8992, 쿤닝가멜라 블라케스레에아나 (Cunninghamella blakesleeana) ATCC 8688a, 쿤닝가멜라 에키눌라타 (C. echinulata) ATCC 3655, 쿤닝가멜라 엘레간스 (C. elegans) ATCC 9245, 트리코테시움 로세움 (Trichothecium roseum) ATCC 12543, 에피코쿰 휴미콜라 (Epicoccum humicola) ATCC 12722, 사카로폴리스포라 에이트래 (Saccharopolyspora eythrae) ATCC 11635, 뷰브리아 바씨아나 ATCC 13144, 아트로박터 심플렉스 (Arthrobacter simplex), 박테리움 시클로옥시단스 (Bacterium cyclooxydans) ATCC 12673, 실린드로카르폰 라디시콜라 (Cylindrocarpon radicicola) ATCC 11011, 노카르디아 아우렌티아 (N. aurentia) ATCC 12674, 노르카르디아 레스트릭투스 (N. restrictus) ATCC 14887, 슈도모나스 테스토스테로니 (Pseudomonas testosteroni) ATCC 11996, 로도코커스 에퀴 (Rhodococcus equi) ATCC 21329, 미코박테리움 포르투이툼 (Mycobacterium fortuitum) NRRL B8119, 및 로도코커스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous) ATCC 19150. 반응은 실질적으로 도 1 및 2 와 관련하여 상술된 방식으로 수행된다. 도 1 의 방법이 특히 바람직하다.
생체내 전환에 유용한 성장 배지에는 바람직하게는 약 0.05 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 활용가능한 질소; 약 0.5 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 글루코오스; 약 0.25 중량 % 와 약 2.5 중량 % 사이의 효모 유도체; 및 약 0.05 중량 % 와 약 0.5 중량 % 사이의 활용가능한 인이 함유되어 있다. 특히 바람직한 성장 배지에는 다음의 것들이 포함되어 있다:
소이빈 밀 (soybean meal): 약 0.5 중량 % 와 약 3 중량 % 사이의 글루코오스; 약 0.1 중량 % 와 약 1 중량 % 사이의 소이빈 밀; 약 0.05 중량 % 와 약 0.5 중량 % 사이의 알칼리 금속 할로겐화물; 약 0.05 중량 % 와 약 0.5 중량 % 사이의 효모 유도체, 예컨대 자가용해된 효모 또는 효모 추출물; 약 0.05 중량 % 와 약 0.5 중량 % 사이의 인산염, 예컨대 K2HPO4; pH = 7;
펩톤-효모 추출물-글루코오스: 약 0.2 중량 % 와 약 2 중량 % 사이의 펩톤; 약 0.05 중량 % 와 약 0.5 중량 % 사이의 효모 추출물; 및 약 2 중량 % 와 약 5 중량 % 사이의 글루코오스;
뮐러-힌톤: 약 10 중량 % 와 약 40 중량 % 사이의 소고기 주입액; 약 0.35 중량 % 와 약 8.75 중량 % 사이의 카사미노산; 약 0.15 중량 % 와 약 0.7 중량 % 사이의 전분.
진균류는 소이빈 밀 또는 펩톤 영양분중에서 성장할 수 있는 한편, 악티노마이세트와 유박테리아는 소이빈 밀 (생체내 전환을 위해서는 0.5 중량 % 내지 1 중량 % 의 카르복실산 염, 예컨대 포름산 나트륨이 첨가됨) 또는 뮐러-힌톤 육즙에서 성장할 수 있다.
발효에 의하여 멕스레논으로부터 11β-히드록시멕스레논을 제조하는 것은 하기 실시예 19B 에서 논의된다. 유사한 생체전환 방법이 다른 출발 물질 및 중간체를 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 실시예 19A 에서는 안드로스텐디온의 11β-히드록시안드로스텐디온으로의 생체전환에 대하여 설명된다. 실시예 19C 에서는 멕스레논의 11α-히드록시멕스레논, △1,2-멕스레논, 6β-히드록시멕스레논, 12β-히드록시멕스레논, 및 9α-히드록시멕스레논으로의 생체전환에 대하여 설명된다. 실시예 19D 에는 칸레논의 △9,11-멕스레논으로의 생체전환에 대한 설명이 있다.
식 IX 의 생성물은 신규한 화합물로, 여과에 의하여 분리될 수 있고, 적당한 유기 용매, 예컨대 에틸 아세테이트로 세척될 수 있으며, 동일한 또는 유사한 용매로부터 재결정될 수 있다. 그것들은 식 I, 특히 식 IA 의 화합물의 제조에 대한 중간체로서 실질적인 가치를 가지고 있다. 바람직하게도, 식 IX 의 화합물은 -A-A- 및 -B-B- 가 -CH2-CH2- 이고, R3 이 수소, 저급 알킬 또는 저급 알콕시이며, R8 및 R9 가 함께 하기 식의 20-스피록산 고리를 구성하는 식 IXA 에 해당한다:
(화학식 XXXIII)
방법 2 합성의 다음 단계에서, 식 IX 의 생성물은 탈수 시약 (PhSOCl 또는 ClSO3H 와 같은 적당한 탈수 시약은 당업자에게 공지이다)과 반응되어 하기 식 II 의 화합물이 생성된다:
(화학식 II)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 XIII 에서 정의된 바와 같고, R1 은 식 V 에서 정의된 바와 같다.
바람직하게도, 식 IX 의 기질은 하기 식 IXA 에 해당하고, 중간체 생성물은 하기 식 IIA 에 해당한다:
(화학식 IXA)
(화학식 IIA)
상기 식들에서, -A-A-, -B-B-, R3, Y1, Y2, 및 X 는 식 XIIIA 에서 정의된 바와 같고, R1 은 식 V 에서 정의된 바와 같다. R3 은 수소인 것이 바람직하다.
이 합성 방법의 최종 단계에서, 식 II 의 생성물은 미국 특허 제 4,559,332 호에 개시된 방법에 따르는 에폭시드화에 의해; 또는 바람직하게는 본원에 설명된 바와 같은 본 발명의 신규한 에폭시드화 방법에 의하여 식 I 의 생성물로 전환된다.
특히 바람직한 구체예에서, 방법 2 의 전체적인 방법은 다음과 같이 진행된다:
방법 3
이 경우 합성은 하기 식 XX 에 해당하는 기질로 시작된다:
(화학식 XX)
*상기 식에서, -A-A- 및 R3 은 식 XIII 에서 정의된 바와 같으며, -B-B- 는 식 XIII 에서 정의된 바와 같되, 단 R6 또는 R7 중 어느 것도 16,17 위치에서 D 고리에 융합된 고리의 부분이 아니며, R26 은 저급 알킬, 바람직하게는 메틸이다. R3 은 수소인 것이 바람직하다.
식 XX 의 기질과 술포늄 일라이드와의 반응으로 하기 식 XIX 에 해당하는 에폭시드 중간체가 생성된다:
(화학식 XIX)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3 및 R26 은 식 XX 에서 정의된 바와 같다. R3 은 수소인 것이 바람직하다.
합성 방법 3 의 다음 단계에서, 식 XIX 의 중간체는 추가로 하기 식 XVIII 의 중간체로 전환된다:
(화학식 XVIII)
상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 XX 에서 정의된 바와 같다. R3 은 수소인 것이 바람직하다. 이 단계에서, 식 XIX 의 기질은 염기의 존재하에 용매중에서 NaCH(COOEt)2 와의 반응에 의하여 식 XVIII 의 중간체로 전환된다.
식 XVIII 의 화합물은 열, 물 및 알칼리 금속 할라이드에 노출되어 하기 식 XVII 에 해당하는 탈카르복실레이트된 중간체 화합물이 생성된다:
(화학식 XVII)
상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 XX 에서 정의된 바와 같다. R3 은 수소인 것이 바람직하다. 식 XX 의 화합물의 식 XVII 의 화합물로의 전환 방법은 본질적으로 미국 특허 제 3,897,417 호, 3,413,288 호 및 3,300,489 호에서 설명된 방법에 해당한다. 기질은 상이하지만, 17-스피로락톤 부분의 도입을 위한 시약, 메카니즘 및 조건은 본질적으로 동일하다.
식 XVII 의 중간체와 탈수 시약과의 반응으로 하기 식 XVI 의 중간체가 얻어진다:
(화학식 XVI)
상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 XX 에서 정의된 바와 같다. R3 은 수소인 것이 바람직하다.
전형적으로 유용한 탈수 시약으로는 디클로로디시아노벤조퀴논 (DDQ) 및 클로라닐 (2,3,5,6-테트라클로로-p-벤조퀴논)이다. 또는 달리, 탈수는 6-위치 탄소에서의 순차적인 할로겐화 및 이어서 탈히드로할로겐화 반응에 의하여 이루어질 수 있다.
식 XVI 의 중간체는 다음에 하기 식 XVB 의 엔아민으로 전환된다:
(화학식 XVB)
상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 XX 에서 정의된 바와 같다. R3 은 수소인 것이 바람직하다. 전환은 본질적으로 식 VIII 의 11α-히드록시 화합물의 식 VII 의 엔아민으로의 전환에 대하여 상술된 방식으로 시안화에 의해 이루어진다. 전형적으로, 시안화물 이온 공급원은 알칼리 금속 시안화물일 수 있다. 염기는 바람직하게는 피롤리돈 및/또는 테트라메틸구아니딘이다. 메탄올 용매도 사용될 수 있다.
식 XVB 의 생성물은 신규한 화합물로, 크로마토그래피에 의하여 단리될 수 있다. 식 XV 의 이들 및 다른 신규한 화합물들은 식 I, 특히 식 IA 의 화합물들의 제조를 위한 중간체로서 실질적인 가치를 가지고 있다. 식 XV 의 화합물들은 다음 구조식에 해당한다:
(화학식 XV)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 XIII에서 정의된 바와 같다. 가장 바람직한 식 XV 및 XVB 의 화합물들에서 -A-A- 및 -B-B- 는 -CH2-CH2- 이고, R3 은 수소이다.
식 VI 의 디케톤 화합물을 제조하기 위하여 상술된 가수분해에 따르면, 식 XVB 의 엔아민은 하기 식 XIVB 의 디케톤으로 전환될 수 있다:
(화학식 XIVB)
상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 XX 에서 정의된 바와 같다. R3 은 수소인 것이 바람직하다. 에폭시멕스레논의 합성에 대해 특히 바람직한 것은 하기에서 설명되는 바와 같은 식 XIVB 의 범주내에 속해 있는 식 XIV 의 화합물들이다.
식 XIVB 의 생성물은 신규한 화합물로, 침전에 의해 단리될 수 있다. 이들 및 다른 신규한 식 XIV 의 화합물들은 식 I, 특히 식 IA 의 화합물들의 제조를 위한 중간체로서 실질적인 가치를 가지고 있다. 식 XIV 의 화합물들은 다음 구조식 XIV 에 해당한다:
(화학식 XIV)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 XIII에서 정의된 바와 같다. 가장 바람직한 식 XIV 및 XIVB 의 화합물에서 -A-A- 및 -B-B- 는 -CH2-CH2- 이고, R3 은 수소이다.
식 XIVB 의 화합물들은 본질적으로 식 VI 의 디케톤을 식 V 의 히드록시에스테르로 전환시키기 위하여 상술된 방법을 사용하여 식 XXXI 의 화합물들로 전환된다. 이 경우, 하기 식 XXXII 의 생성물로 계속해서 전환되기 전에 하기식 XXXI 의 중간체가 단리되는 것이 필요하다:
(화학식 XXXII)
(화학식 XXXI)
상기 식들에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 XX 에서 정의된 바와 같고, R1 은 식 V 에서 정의된 바와 같다. R3 은 수소인 것이 바람직하다. 바람직한 식 XXXI 의 화합물은 식 IIA 내에 속하는 것들이다. 식 XXXI 의 화합물들은 본원에서 설명되는 방법 또는 미국 특허 제 4,559,332 호의 방법을 사용하여 식 XXXII 의 화합물들로 전환된다.
바람직한 식 XIV 의 화합물은 4'S(4'α),7'α-1',2',3',4,4',5,5',6',7',8',
10',12',13',14',15',16'-헥사데카히드로-10β-,13'β-디메틸-3',5,20'-트리옥소스피로[푸란-2(3H),17'β-[4,7]메타노[17H]-시클로펜타[a]페난트렌]5'-카르보니트릴이고; 식 XV 의 바람직한 화합물은 5'R(5'α),7'β-20'-아미노-1',2',3',4,5,6',7',8',10',12',13',14',15',16'-테트라데카히드로-10'α,13'α-디메틸-3',5-디옥소스피로[푸란-2(3H),17'α(5'H)-[7,4]메테노[4H]-시클로펜타[a]페난트렌]-5'-카르보니트릴이다. 특히 바람직한 구체예에서, 방법 3 의 전체적인 방법은 다음과 같이 진행된다:
방법 4
방법 4 의 처음 세 단계는 방법 3 의 처음 세 단계와 동일하다. 즉, 식 XVII 의 중간체의 제조는 식 XX 에 해당하는 화합물로 출발한다.
그런 다음, 식 XVII 의 중간체는 예를 들면 미국 특허 제 4,559,332 호의 방법을 사용하여 에폭시드화되어 하기 식 XXIV 의 화합물이 생성된다:
(화학식 XXIV)
상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 XX 에서 정의된 바와 같다. 그러나, 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 식 XVII 의 기질은 식 II 의 엔에스테르를 식 I 의 생성물로 전환시키기 위하여 방법 1 에서 상술된 바와 같은 방법을 따라, 아미드 유형의 과산화물 활성화제, 가장 바람직하게는 트리클로로아세트아미드가 포함되어 있는 산화 시약을 사용하여 9,11-이중 결합을 가로질러 에폭시드화된다. 이 반응에 대한 조건 및 시약의 비율은 실질적으로 식 II 의 엔에스테르의 에폭시멕스레논으로의 전환에 대해 설명된 것과 같다. 특히 바람직한 식 XXIV 의 화합물은 -A-A- 및 -B-B- 가 식 XIII 에서 정의된 바와 같고 R3 이 수소인 것들이다.
식 XVII 의 기질의 에폭시드화는 또한 과산, 예컨대 m-클로로퍼옥시벤조산을 사용하여 매우 양호한 수율로 이루어질 수 있음이 발견되었다. 그러나, 트리클로로아세트아미드 시약은 베이어-빌라거 산화 부산물의 형성을 최소화하는 월등한 결과를 제공한다. 후자의 부산물은 제거될 수 있지만, 그것은 에틸 아세테이트와 같은 용매로부터 적정한 후, 염화 메틸렌과 같은 다른 용매로부터 결정화되는 것을 필요로 한다. 식 XXIV 의 에폭시 화합물은 DDQ 또는 클로라닐과 같은 탈수소화 (산화)제와의 반응에 의하여 탈수소화되어 6-탄소와 7-탄소 사이에 이중 결합이 생성되거나, 또는 브롬화/탈수소브롬화 (또는 다른 할로겐화/탈수소할로겐화) 순서를 사용하여 하기 식 XXIII 의 다른 신규한 중간체가 생성된다:
(화학식 XXIII)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 XX 에서 정의된 바와 같다.
특히 바람직한 식 XXIII 의 화합물들은 -A-A- 및 -B-B- 가 식 XIII 에서 정의된 바와 같고, R3 이 수소인 화합물들이다.
직접적인 산화가 식 XXIII 의 생성물의 형성에 효과적인 한편, 수율은 대체로 낮다. 그러므로, 산화는 두 단계로 수행되는 것이 바람직하며, 첫 번째 단게에서는 식 XXIV 의 기질이 C-6 위치에서 할로겐화되며, 그 다음에 6,7-올레핀으로 탈히드로할로겐화된다. 할로겐화는 바람직하게는 예를 들면 N-브로모숙신아미드와 같은 N-할로 유기 시약을 사용하여 이루어진다. 브롬화는 적당한 용매, 예컨대 아세토니트릴중에서, 할로겐화 촉진제, 예를 들면 과산화 벤조일의 존재하에 수행된다. 반응은 약 50 ℃ 내지 약 100 ℃ 범위의 온도, 편리하게는 주변 환류 온도에서 예컨대 사염화탄소, 아세토니트릴 또는 그것들의 혼합물과 같은 용매중에서 효과적으로 진행된다. 그러나, 전형적으로 4 내지 10 시간동안의 반응이 반응의 완료를 위하여 필요하다. 반응 용매가 제거되고, 잔류물은 물과 섞이지 않는 용매, 예컨대 에틸 아세테이트중에 넣어진다. 그 결과의 용액은 생성물 손실을 최소화하기 위하여 순한 알칼리성 용액 (예컨대 알칼리 금속 중탄산염) 및 물로, 또는 바람직하게는 포화된 염수로 순차적으로 세척된후, 용매가 제거되고 잔류물은 탈히드로할로겐화 반응에 적당한 다른 용매 (예컨대 디메틸포름아미드)에 넣어진다.
적당한 탈히드로할로겐화 시약, 예컨대 1,4-디아자비시클로[2,2,2]옥탄 (DABCO) 이 LiBr 과 같은 알칼리 금속 할라이드와 함께 용액에 첨가되고, 용액은 적당한 반응 온도, 예컨대 60 ℃ 내지 80 ℃ 로 가열되고, 여러 시간, 전형적으로 4 시간 내지 15 시간동안 탈히드로할로겐화 반응이 완료될 때까지 반응이 계속된다. 추가의 탈히드로할로겐화 시약이 필요에 따라, 반응의 완료를 유도하기 위하여 반응 사이클중에 첨가될 수 있다. 그런 다음 식 XXIII 의 생성물은 예를 들면 물을 침전에 첨가하여 생성물을 여과에 의해 분리하고 바람직하게는 추가량의 물로 세척함에 의해 회수될 수 있다. 생성물은 바람직하게는 예를 들면 디메틸포름아미드로부터 재결정된다.
식 XXIII 의 생성물, 예컨대 9,11-에폭시칸레논은 신규한 화합물로, 추출/결정화에 의하여 단리될 수 있다. 이 생성물은 식 I, 특히 식 IA 의 화합물을 제조하기 위한 중간체로서 실질적인 가치를 가지고 있다. 예를 들면 그것들은 식 XXII 의 화합물의 제조를 위한 기질로서 사용될 수 있다.
실질적으로 식 VII 의 화합물의 제조를 위하여 상술된 방법을 사용하여, 식 XXIII 의 화합물은 시안화물 이온과 반응되어 하기식 XXII 에 해당하는 신규한 에폭시엔아민 화합물이 생성된다:
(화학식 XXII)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 XX 에서 정의된 바와 같다. 특히 바람직한 식 XXII 의 화합물들은 -A-A- 및 -B-B- 가 식 XIII 에서 정의된 바와 같고, R3 이 수소인 것들이다.
식 XXII 의 생성물은 신규한 화합물로, 침전 및 여과에 의하여 단리될 수 있다. 그것들은 식 I, 특히 식 IA 의 화합물을 제조하기 위한 중간체로서 실질적인 가치를 가지고 있다. 가장 바람직한 식 XXII 의 화합물들에서 -A-A- 및 -B-B- 는 -CH2-CH2- 이고, R3 은 수소이다.
실질적으로 식 VI 의 화합물들을 제조하기 위하여 상술된 방법을 사용하여, 식 XXII 의 에폭시엔아민 화합물들은 하기 식 XXI 의 신규한 에폭시디케톤 화합물들로 전환된다:
(화학식 XXI)
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9 는 식 XIII 에서 정의된 바와 같다. 가장 바람직한 식 XXI 의 화합물들에서, -A-A- 및 -B-B- 는 -CH2-CH2- 이고, R3 은 수소이다.
식 XXI 의 생성물은 신규한 화합물로, 침전 및 여과에 의하여 단리될 수 있다. 그것들은 식 I, 특히 식 IA 의 화합물을 제조하기 위한 중간체로서 실질적인 가치를 가지고 있다. 특히 바람직한 식 XXI 의 화합물들은 -A-A- 및 -B-B- 가 식 XIII 에서 정의된 바와 같은 것들이다. 가장 바람직한 식 XXI 의 화합물들에서 -A-A- 및 -B-B- 는 -CH2-CH2- 이고, R3 은 수소이다.
실질적으로 식 VI 의 디케톤 화합물로부터 식 V 의 히드록시에스테르 화합물들을 제조하기 위하여 상술된 방법을 사용하여, 식 XXI 의 에폭시디케톤 화합물들은 하기 식 XXXII 의 화합물들로 전환된다:
(화학식 XXXII)
상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 XX 에서 정의된 바와 같고, R1 은 식 V 에서 정의된 바와 같다.
식 V 의 디케톤의 식 VI 의 히드록시에스테르로의 전환에서와 같이, 5-β-시아노-7-에스테르 중간체는 또한 식 XXI 의 에폭시디케톤의 식 XXXII 의 화합물로의 전환에서도 형성된다. 두가지 시리즈에서 5-β-시아노-7-에스테르 중간체는 해당하는 디케톤을 메탄올과 같은 알코올로 트리에틸아민과 같은 염기의 존재하에 처리함으로써 단리될 수 있다. 바람직하게도, 중간체는 디케톤의 몰당 약 0.1 내지 2 당량의 트리에틸아민이 함유되어 있는 메탄올과 같은 알코올중에서 디케톤의 혼합물을 약 4 시간 내지 약 16 시간동안 환류함으로써 제조된다. 생성물은 혼합물을 약 25 ℃ 로 냉각한 후 여과함으로써 순수한 형태로 단리된다. 단리된 중간체는 용매, 바람직하게는 메탄올과 같은 알코올중에서 알칼리 금속 알콕시드와 같은 염기로 처리될 때 식 XXXII 의 화합물들로 전환될 수 있다. 알코올중에서 알콕시드를 사용함으로써 식 XXI 의 해당하는 디케톤이 동일한 조건하에서 처리되는 때 형성되는 것과 유사한 평형 혼합물이 이루어진다.
또한, 식 XXXII 의 화합물의 7β-에스테르 (예를 들면 7-메틸 하이드로겐 9,11α-에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7β,21-디카르복실레이트, γ-락톤)가 방법 4 의 최종 단계의 미정제 생성물의 크로마토그래피에 의해 관찰되었다. 용액중의 알콕시드 및/또는 시안화물은 반응되어 7α-에스테르를 7α-에스테르와 7β-에스테르 에피머의 에피머 혼합물로 전환시킨다. 순수한 7β-에스테르는 선택적인 결정화에 의하여 에피머 혼합물로부터 단리될 수 있다.
바람직하게도, 식 XXI 의 화합물은 4'S(4'α),7'α-9',11α-에폭시헥사데카히드로-10β-,13'β-디메틸-3',5,20'-트리옥소스피로[푸란-2(3H),17'β-[4,7]메타노[17H]-시클로펜타[a]페난트렌-5'-카르보니트릴이고; 식 XXII 의 화합물은 5'R(5'α),7'β-20'-아미노-9,11β-에폭시헥사데카히드로-10',13'-디메틸-3',5-디옥소스피로[푸란-2(3H),17'a(5'H)-[7,4]메텐[4H]시클로펜타[a]페난트렌-5'-카르보니트릴이며; 식 XXIII 의 화합물은 9,11α-에폭시-17α-히드록시-3-옥소프레그나-4,6-디엔-21-카르복실산, γ-락톤이다.
특히 바람직한 구체예에서, 방법 4 의 전체적인 방법은 다음과 같이 진행된다:
방법 5
방법 5 의 방법은 하기 식 XXIX 에 해당하는 기질로 출발한다:
(화학식 XXIX)
상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 XX 에서 정의된 바와 같다. 다음의 미생물들이 실시예 19B 에서 설명되는 것과 유사한 조건하에서, 하기 식 XXXV 의 화합물 (예컨대 안드로스텐디온)의 식 XXIX 의 화합물로의 9α-히드록실화를 수행할 수 있다:
(화학식 XXXV)
(상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 XIII 에서 정의된 바와 같다)
아스페리길루스 니거 (Asperigilus niger) ATCC 16888 및 26693, 코리네스포라 카씨이콜라 (Corynespora cassiicola) ATCC 16718, 쿠르불라리아 클라바타 (Curvularia clavata) ATCC 22921, 미코박테리움 포르투이툼 (Mycobacterium fortuitum) NRRL B8119, 노카르디아 카니크루리아 (Nocardia canicruria) ATCC 31548, 피크노스포리움 (Pycnosporium) spp. ATCC 12231, 스티사누스 마이크로스포루스 (Stysanus microsporus) ATCC 2833, 신케팔라스트룸 라세모숨 (Syncephalastrum racemosum) ATCC 18192, 및 탐노스틸룸 피리포르메 (Thamnostylum piriforme) ATCC 8992.
식 XXIX 에 해당하는 기질은 트리메틸오르토포름산염과 반응되어 하기 식 XXVIII 의 생성물로 전환된다:
(화학식 XXVIII)
상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 XX 에서 정의된 바와 같다. 식 XXVIII 의 화합물의 형성에 이어서, 이 화합물은 식 XX 의 기질의 식 XVII 로의 전환에 대하여 상술된 방법을 사용하여 식 XXVII 의 화합물로 전환된다:
(화학식 XXVII)
상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 XX 에서 정의된 바와 같고, Rx 는 통상적인 히드록시 보호기중 하나이다. 또는 달리, C9 α-히드록시기는 이 합성 방법의 선행 단계에서, 만약 그 단계에서의 보호가 요구된다면 보호될 수 있다, 즉 식 XXVIII 의 화합물의 C9 히드록시 또는 식 XXIX 의 화합물의 C9 히드록시는 통상적인 히드록시 보호기들중 어느 하나에 의하여 보호될 수 있다.
식 XVI 의 화합물들의 제조에 대해 상술된 방법을 사용하여, 식 XXVII 의 화합물들은 산화되어 하기 식 XXVI 에 해당하는 신규한 화합물들이 생성된다:
(화학식 XXVI)
상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 XX 에서 정의된 바와 같다. 특히 바람직한 식 XXIX, XXVIII, XXVII 및 XXVI 의 화합물들은 -A-A- 및 -B-B- 가 식 XIII 에서 정의된 바와 같고, R3 은 수소인 화합물들이다.
식 XXVI 의 생성물들은 신규한 화합물들로, 침전/여과에 의하여 단리될 수 있다. 그것들은 식 I, 특히 식 IA 의 화합물들의 제조를 위한 중간체로서 실질적인 가치를 가지고 있다. 특히 바람직한 식 XXVI 의 화합물들은 -A-A- 및 -B-B- 가 식 XIII 에서 정의된 바와 같고, R3 은 수소인 화합물들이다. 가장 바람직한 식 XXVI 의 화합물들에서, -A-A- 및 -B-B- 는 -CH2-CH2- 이고, R3 은 수소이다.
식 VIII 의 화합물들의 시안화에 대해 상기 규정된 방법을 사용하여, 식 XXVI 의 신규한 중간체는 하기 식 XXV 의 신규한 9-히드록시엔아민 중간체로 전환된다:
(화학식 XXV)
상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 XX 에서 정의된 바와 같다.
식 XXV 의 생성물들은 신규한 화합물들로, 침전/여과에 의하여 단리될 수 있다. 그것들은 식 I, 특히 식 IA 의 화합물들의 제조를 위한 중간체로서 실질적인 가치를 가지고 있다. 특히 바람직한 식 XXV 의 화합물들은 -A-A- 및 -B-B- 가 식 XIII 에서 정의된 바와 같고, R3 은 수소인 화합물들이다. 가장 바람직한 식 XXV 의 화합물들에서, -A-A- 및 -B-B- 는 -CH2-CH2- 이고, R3 은 수소이다.
본질적으로 식 VI 의 디케톤 화합물들의 제조에 대하여 상술된 조건을 사용하여, 식 XXV 의 9-히드록시엔아민 중간체는 식 XIVB 의 디케톤 화합물로 전환된다. 이 경우 반응은 9,11 이중 결합을 도입하기 위한 9,11 위치에서의 탈수와 엔아민 구조의 동시의 가수분해에 대해 효과적임을 주지하여야 한다. 그런 다음 식 XIV 의 화합물은 식 XXXI 의 화합물로 전환되고, 다시 방법 3 에서 상술된 것과 동일한 단계들을 사용하여 식 XIII 의 화합물로 전환된다.
바람직한 식 XIV 의 화합물은 4'S(4'α),7'α-1',2',3',4,4',5,5',6',7',8',
10',12',13',14',15',16'-헥사데카히드로-10β-,13'β-디메틸-3',5,20'-트리옥소스피로[푸란-2(3H),17'β-[4,7]메타노[17H]-시클로펜타[a]페난트렌]5'-카르보니트릴이고; 바람직한 식 XXV 의 화합물은 5'R(5'α),7'β-20'-아미노헥사데카히드로-9'β-히드록시-10'a,13'α-디메틸-3',5-디옥소스피로[푸란-2(3H),17'α(5'H)-[7,4]메테노[4H]시클로펜타[a]페난트렌]-5'-카르보니트릴이며; 바람직한 식 XXVI 의 화합물은 9α,17α-디히드록시-3-옥소프레그나-4,6-디엔-21-카르복실산, γ-락톤이고; 바람직한 식 XXVII 의 화합물은 9α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-21-카르복실산, γ-락톤이다.
특히 바람직한 구체예에서, 방법 5 의 전체적인 방법은 다음과 같이 진행된다:
방법 6
방법 6 은 안드로스텐디온 또는 하기 식 XXXV 의 다른 화합물의 11α 또는 11β-히드록실화로부터 출발하여 하기 식 XXXVI 에 해당하는 중간체 또는 그것의 해당하는 11β-히드록시 이성질체가 생성되는, 에폭시멕스레논 및 식 I 에 해당하는 다른 화합물들을 제조하기 위한 유익한 방법을 제공한다:
(화학식 XXXV)
(화학식 XXXVI)
상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 XIII 에서 정의된 바와 같다.
기질에 대한 선택성은 제외하고, 11α-히드록실화를 수행하는 방법은 본질적으로 방법 1 에 대해 상술된 것과 본질적으로 같다. 다음의 미생물들이 식 XXXV 의 안드로스텐디온 또는 다른 화합물의 11α-히드록실화를 수행할 수 있다:
압시디아 글라우카 (Absidia glauca) ATCC 22752, 아스페르길루스 플라비페스 (Aspergillus flavipes) ATCC 1030, 아스페르길루스 푀티두스 (A. foetidus) ATCC 10254, 아스페르길루스 푸미가투스 (A. fumigatus) ATCC 26934, 아스페르길루스 오크라세우스 (A. ochraceus) NRRL 405 (ATCC 18500), 아스페르길루스 니거 (A. niger) ATCC 11394, 아스페르길루스 니듈란스 (A. nidulans) ATCC 11267, 뷰베리아 바씨아나 (Beauveria bassiana) ATCC 7159, 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum) ATCC 7601, 푸사리움 옥시스포룸 세파에 (F. oxysporum cepae) ATCC 11171, 푸사리움 리니 (F. lini) ATCC IFO 7156, 지베렐라 푸지코리 (Gibberella fujikori) ATCC 14842, 하이포미세스 크리소스페르무스 (Hypomyces chyrsospermus) IMI 109891, 미코박테리움 포르투이툼 (Mycobacterium fortuitum) NRRL B8119, 페니실륨 파투룸 (Penicillum patulum) ATCC 24550, 피크노스포리움 종(Pycnosporium spp.) ATCC 12231, 리조푸스 아리주스 (Rhizopus arrhizus) ATCC 11145, 사카로폴리스포라 에리트라에아 (Saccharopolyspora erythraea) ATCC 11635, 탐노스틸룸 피리포르메 (Thamnostylum pirifprme) ATCC 8992, 리조푸스 오리자에 (R. oryzae) ATCC 11145, 리조푸스 스톨로니퍼 (R. stolonifer) ATCC 6227b, 및 트리코테시움 로세움 (Tricothecium roseum) ATCC 12519 및 ATCC 8685.
안드로스텐데온 또는 식 XXXV 의 다른 화합물의 11β-히드록실화를 수행할 수 있는 미생물은 다음과 같다:
아스페르길루스 푸미가투스 (A. fumigatus) ATCC 26934, 아스페르길루스 니거 (A. niger) ATCC 16888 및 ATCC 26693, 에피코쿰 오리자에 (Epicoccum oryzae) ATCC 7156, 쿠르불라리아 루나타 (Curvularia lunata) ATCC 12017, 쿤닝가멜라 블라케스레에아나 (Cunninghamella blakesleeana) ATCC 8688a, 및 피토마이세스 아트로-올리바세오우스 (Pithomyces atro-olivaceous) IFO 6651.
11α-히드록시안드로스트-4-엔-3,17-디온, 또는 식 XXXVI 의 다른 화합물은 다음으로, 산 촉매의 존재하에 트리알킬 오르토포름산염과 같은 에테르화 시약과의 반응에 의하여 하기 식 (101)의 11α-히드록시-3,4-에놀 에테르로 전환된다:
(화학식 101)
상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 식 XIII 에서 정의된 바와 같고, R11 은 메틸 또는 다른 저급 알킬 (C1 내지 C4)이다. 이 전환 반응을 수행하기 위해서는, 11α-히드록시 기질은 산, 예컨대 벤젠 술폰산 수화물 또는 톨루엔 술폰산 수화물과 혼합되고, 저급 알코올 용매, 바람직하게는 에탄올에 용해됨으로써 산성화된다. 트리알킬 오르토포름산염, 바람직하게는 오르토포름산 트리에틸은 혼합물을 저온으로, 바람직하게는 0 ℃ 내지 약 15 ℃ 로 유지시키면서 5 내지 40 분에 걸쳐 점진적으로 도입된다. 그런 다음 혼합물은 가온되고 반응은 20 ℃ 와 약 60 ℃ 사이에서 수행된다. 바람직하게 반응은 30 ℃ 내지 50 ℃ 에서 1 내지 3 시간동안 수행된 후, 추가의 기간동안, 전형적으로는 2 내지 6 시간동안 환류로 가열되어 반응이 완료된다. 반응 혼합물은 바람직하게는 0 내지 15 ℃ 로, 보다 바람직하게는 약 5 ℃ 로 냉각되고, 용매가 진공하에 제거된다.
상기에서 식 XX 의 화합물의 식 XVII 의 화합물로의 전환에 대하여 방법 3 에서 설명된 것과 동일한 반응 방법를 사용하여, 식 XXXIII 의 17-스피로락톤 부분은 식 101 의 화합물안에 도입된다. 예를 들면, 식 101 기질은 알칼리 금속 수산화물과 같은 염기의 존재하에 DMSO 와 같은 적당한 용매중에서 술포늄 일라이드와 반응되어 하기 식 102 에 해당하는 중간체가 생성될 수 있다:
(화학식 102)
상기 식에서, -A-A-, R3, R11 및 -B-B- 는 식 101 에서 정의된 바와 같다. 식 102 의 중간체는 다음 단계로 알칼리 금속 알콕시드의 존재하에 말론산 디에스테르와 반응되어 5-원 구성의 스피로락톤 고리가 형성되고 하기 식 103 의 중간체가 생성된다:
(화학식 103)
상기 식에서, -A-A-, R3, R11 및 -B-B- 는 식 102 에서 정의된 바와 같으며, R12 는 C1 내지 C4 알킬, 바람직하게는 에틸이다. 최종적으로, 적당한 용매, 예컨대 디메틸포름아미드중의 식 103 의 화합물은 알칼리 금속 할로겐화물의 존재하에 가열되고, 알콕시카르보닐 부분이 분리되어 하기 식 104 의 중간체가 생성된다:
(화학식 104)
상기 식에서, -A-A-, R3, R11 및 -B-B- 는 식 102 에서 정의된 바와 같다.
다음에, 식 104 의 3,4-에놀 에테르 화합물은 식 XXIII 의 화합물, 즉 R8 및 R9 가 함께 식 XXXIII 부분을 형성하는 식 VIII 의 화합물로 전환된다. 이 산화 단계는 본질적으로, 방법 4 의 합성에서 식 XXIV 의 화합물의 식 XXIII 의 중간체로의 전환을 위한 산화 단계와 동일한 방식으로 수행된다. 직접적인 산화는 예컨대 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논 (DDQ) 또는 테트라클로로벤조퀴논 (클로라닐)과 같은 시약을 사용하여 이루어질 수 있으며, 또는 바람직하게는 두 단계의 산화가 첫 번째에는 예컨대 N-브로모숙신아미드 (NBS) 또는 1,3-디브로모-5,5-디메틸 하이단토인 (DBDMH)과 같은 N-할로 브롬화제로 브롬화된 후, LiBr 의 존재 및 가열하에 염기, 예를 들면 DABCO 로 탈히드로브롬화됨으로써 이루어진다. NBS 가 브롬화를 위해 사용되는 경우, 또한 3-에놀 에테르를 엔온으로 전환시키기 위하여 산이 반드시 사용되어야 한다. 자유 라디칼 브롬화 시약이라기보다는 이온성인 DBDMH 는 그 자체로서 브롬화 및 에놀 에테르의 엔온으로의 전환에 효과적이다.
그런 다음 식 VIII 의 화합물은 방법 1 에 대하여 상술된 단계들에 의하여 에폭시멕스레논 또는 식 I 의 다른 화합물로 전환된다.
식 101, 102, 103 및 104 의 중간체들 각각은 식 IA 및 I 의 에폭시멕스레논 또는 다른 화합물들에 대한 중간체로서 실질적인 가치를 가지고 있는 신규한 화합물이다. 식 101, 102, 103 및 104 의 화합물들 각각에서, -A-A- 및 -B-B- 는 바람직하게는 -CH2-CH2- 이고 R3 은 수소, 저급 알킬 또는 저급 알콕시이다. R3 은 수소인 것이 바람직하다. 가장 바람직한 식 101 의 화합물은 3-에톡시-11α-히드록시안드로스트-3,5-디엔-17-온이고; 바람직한 식 102 의 화합물은 3-에톡시스피로[안드로스트-3,5-디엔-17β,2'-옥시란]-11α-올이며; 바람직한 식 103 의 화합물은 에틸 하이드로겐 3-에톡시-11α-17α-디히드록시프레그나-3,5-디엔-21,21-디카르복실레이트, 감마-락톤이고; 바람직한 식 104 의 화합물은 3-에톡시-11α-17α-디히드록시프레그나-3,5-디엔-21-카르복실산, 감마-락톤이다.
특히 바람직한 구체예에서, 방법 6 의 전체적인 방법은 다음과 같이 진행된다:
에폭시멕스레논 및 식 I 에 해당하는 다른 화합물들도 마찬가지로 11β-히드록실화된 11β-히드록시안드로스텐디온 또는 식 XXXV 의 다른 화합물들로부터 제조될 수 있는 것으로 여겨진다. 다르게 표현하면, 에폭시멕스레논 및 식 I 에 해당하는 다른 화합물들은 방법 6 에 설명된 일반적인 방법을 따라 식 XXXV 의 α-히드록실화된 기질 또는 해당하는 β-히드록실화된 기질을 사용하여 제조될 수 있다.
방법 7
방법 7 은 β-시토스테롤, 콜레스테롤, 스티그마스테롤 또는 하기 식 XXXVII 의 다른 화합물을 포함하고 있는 출발 기질을 사용하여 에폭시멕스레논 및 식 I 의 다른 화합물의 합성 방법을 제공한다:
(화학식 XXXVII)
상기 식에서, -A-A-, R3, 및 -B-B- 는 식 XIII 에서 정의된 바와 같고; D-D 는 -CH2-CH2- 또는 -CH=CH- 이며; R13, R14, R15 및 R16 의 각각은 독립적으로 수소 또는 C1 내지 C4 알킬중에서 선택된다. R3 은 수소인 것이 바람직하다.
합성의 첫 번째 단계에서, 11α-히드록시안드로스텐디온 또는 식 XXXVI 의 다른 화합물은 식 XXXVII 의 화합물의 생체전환에 의해 제조된다. 생체전환 방법은 실질적으로 칸레논 (또는 식 XIII 의 다른 기질)의 11α-히드록실화에 대하여 상술된 방법에 따라 수행된다.
11α-히드록시안드로스텐디온의 합성에서, 4-안드로스텐-3,17-디온은 초기에 식 XXXVII 의 화합물의 생체전환에 의해 제조된다. 이 초기의 생체전환은 미국 특허 제 3,759,791 호에 설명된 방식으로 수행될 수 있다. 그런 다음, 4-안드로스텐-3,17-디온은 실질적으로 칸레논 (또는 식 XIII 의 다른 기질)의 11α-히드록실화에 대해 상술된 방법을 따라 11α-히드록시안드로스텐디온으로 전환된다.
방법 7 의 합성의 나머지 부분은 방법 6 과 동일하다. 특히 바람직한 구체예에서 방법 7 의 전체적인 방법은 다음과 같이 진행된다:
에폭시멕스레논 및 식 I 에 해당하는 다른 화합물들은 β-시토스테롤 또는 식 XXXVIII 의 다른 화합물들의 생체전환의 생성물이 11β-히드록시안드로스텐디온 또는 β-히드록실화되어 있는 식 XXXV 의 다른 화합물들인 경우 방법 7 에 설명된 일반적인 방법을 따라 제조될 수 있는 것으로 여겨진다. 달리 표현하면, 에폭시멕스레논 및 식 I 에 해당하는 다른 화합물들은, β-시토스테롤 또는 식 XXXVIII 의 다른 화합물들의 생체전환이 식 XXXV 의 α-히드록실화된 기질 또는 해당하는 β-히드록실화된 기질의 어느 하나의 생성을 유발하는 경우 방법 7 에 설명된 일반적인 방법을 따라 제조될 수 있다.
방법 8
에폭시멕스레논 및 관련 화합물들의 합성에서 상당히 복잡한 문제는 스테로이드 구조의 다른 부위에 원하지 않는 변형을 일으키지 않으면서 7-탄소에서 α-알콕시카르보닐 치환기를 입체선택적으로 도입시킬 필요가 있다는 것이다. 본 발명에 따르면, 7α-알콕시카르보닐 치환기를 도입시키기 위한 효과적인 합성 경로에는 다음 단계들이 포함되는 것으로 발견되었다: (i) 스테로이드의 7-탄소에서의 초기 시안화, (ii) 7-시아노 스테로이드의 가수분해로 인한 7α-카르복실산과 7β-카르복실산의 혼합물의 형성, (iii) 7α-카르복실산 스테로이드로부터 5,7-락톤 스테로이드의 형성, 및 (iv) 5,7-락톤 스테로이드로부터 7β-카르복실산의 분리. 알킬화제를 사용하는 5,7-락톤 스테로이드의 염기-중재된 개방 반응으로 원하는 7α-알콕시카르보닐 스테로이드가 생성된다.
따라서, 방법 8 의 방법은 일반적으로 염기의 존재하에 3-케토-4,5-디히드로-5,7-락톤 스테로이드 기질과 알킬화제를 반응시키는 것을 포함하는, 3-케토-7α-알콕시카르보닐 치환된 △4,5-스테로이드의 제조 방법에 관한 것이다. 락톤 기질은 3-탄소에서 케토로 치환되고, 추가로 다음의 부분을 포함한다:
(화학식 XXX)
상기 식에서, C(5) 는 기질의 스테로이드 구조의 5-탄소를 나타내고, C(7) 은 7-탄소를 나타낸다. 5,7-락톤의 7α-알콕시카르보닐로의 전환은 바람직하게는 염기의 존재하에 알킬 할로겐화물과의 반응에 의하여 이루어진다. 알킬 할로겐화물 시약은 바람직하게는 요오드화물, 가장 바람직하게는 요오드화 메틸이다.
본 발명에 따르면, 상술된 4,5-디히드로-5,7-락톤 스테로이드 화합물의 제조를 위한 유익한 방법이 또한 발견되었다. 이 방법에서, 3-케토-△4,5-7α-시아노 치환된 스테로이드 기질은 7-카르복실산으로 전환되고, 이 산은 계속해서 산성화된 저급 알코올 용매중에서 트리알킬 오르토포름산염과 반응되어 5,7-락톤이 생성된다. 오르토포름산 에스테르와의 반응으로 또한 3-케토기가 3-비고리형 또는 고리형 케탈 5,7-락톤으로 전환된다 (락톤이 처음에 형성되는 것으로 이해된다). 바람직하게도 3-케탈 5,7-락톤은 3-디알킬 케탈 5,7-락톤이다. 보다 바람직한 것은 알코올 용매의 알킬 부분이 오르토포름산염 알콕시기의 알킬 부분과 동일한 것이다 (가장 바람직하게는 모두 메틸이다): 왜냐하면 케탈의 알콕시 부분은 오르토포름산염 또는 알코올로부터 유도될 수 있고; 혼합된 케탈은 바람직하지 않으며; 3-디메톡시가 바람직하기 때문이다. 케탈이 에틸렌 케탈인 경우, 알코올 용매의 알킬 부분은 오르토포름산염 알콕시기의 알킬 부분과 반드시 동일할 필요는 없다. 3-케탈-5,7-락톤은 쉽게 정제될 수 있는 결정성 화합물인 3-케토-5,7-락톤으로 쉽게 가수분해된다. 단지 7α-카르복실산만이 락톤화 반응을 진행시킬 수 있기 때문에, 완전한 입체특이성이 이루어진다. 그런 다음 7β-산이 반응 혼합물로부터 그것의 염 형태로, 예컨대 7β-산을 중탄산 나트륨과 같은 순한 염기로 처리함으로써 제거될 수 있다.
5,7-락톤의 형성을 위한 7-시아노 기질은 공지 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 7-탄소에서 치환되지 않은 기질은 약간 과잉의, 바람직하게는 기질의 당량당 약 1.05 내지 약 1.25 당량의 시안화물 이온과, 물/DMSO 용매 혼합물이 포함되어 있는 약산성 용액중에서 반응될 수 있다. 바람직하게도, 반응 혼합물에는 카르복실산, 예컨대 기질의 당량당 약 1 당량의 아세트산이 포함되어 있다. 7α- 및 7β-CN 이성질체 두가지가 모두 형성되며, 주로 7α-이성질체가 형성된다. 7α-시아노 스테로이드는 종래 방식으로 회수될 수 있다. 당업계에 공지되어 있는 다른 방법들도 이 보조 제조에 유용하다.
일반적으로 방법 8 에 따르면, 5,7-락톤은 17-위치에서 케토, R8 또는 R9 로 치환되고 (R8 및 R9 는 상술된 바와 같다), 지방족, 올레핀, 에폭시드 또는 히드록시 치환된 형태를 C-9 및 C-11 에 가지고 있는 7-카르복시 중간체 (이 화합물 자체는 7-시아노 중간체를 가수분해함으로써 제조됨)로부터 형성될 수 있다, 즉 다음과 같다:
상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 상기에서 정의된 바와 같고, R80 및 R90 은 R8 및 R9 와 같거나, 또는 R80 및 R90 은 함께 케토기를 구성하고, R18 은 방법 9 에 대하여 하기에서 설명되는 바와 같으며, -E-E- 는 다음의 기들중에서 선택된다:
(화학식 XLIII)
(화학식 XLIV)
(화학식 XLV)
(화학식 XLVI)
(화학식 XLVII)
그런 다음 식 XLII 의 화합물이 7α-알콕시-카르보닐로 전환된다:
상기 식 XL, XLI, XLII 및 XLVIII 의 각각에서, R80 및 R90 은 함께 바람직하게는 케토 또는 하기 식 XXXIV 를 구성하며, 가장 바람직하게는 R80 및 R90 은 함께 하기 식 XXXIII 을 구성한다:
(화학식 XXXIV)
(상기 식에서, Y1, Y2, X 및 C(17) 은 상기에서 정의된 바와 같다)
(화학식 XXXIII)
R3 은 바람직하게는 수소이며, R1 은 바람직하게는 메톡시카르보닐이고, -A-A- 및 -B-B- 는 각각 바람직하게는 -CH2-CH2- 이다. 반응은 또한 3-케토기를 에테르 또는 케랄로 전환시키고 그것을 에테르 또는 케탈의 어느 하나의 형태로 반응의 전 순서를 통하여 유지시킴으로써 보호된 3-케토기를 사용하여 수행될 수 있다. 방법 8 의 다른 방법은 상기에서 언급된 바와 같은 식 XLI 및 XLII 의 범주내에 있는 다양한 중간체들을 사용하는 것을 포함한다.
방법 8 에서 3-케토-△4,5-7-카르복실산으로부터 5,7-락톤을 형성하기 위한 시약은 트리알킬 오르토포름산염이고, 이것은 방법 6 에서 11α-히드록시안드로스텐디온의 3-에놀 에테르-3,5-디엔-11α-히드록시 중간체 101로의 전환에 사용된 것과 동일한 시약이며, 방법 8 의 반응의 경로는 C-7 에 있는 치환기에 좌우되는 것으로 여겨진다는 것이 주지되어야 한다. H+ 의 존재하에 오르토포름산염과의 반응으로 C-7 에 카르복실을 가지고 있고 C-3 과 C-5 사이에 평형상태의 양성 전하를 가지고 있는 중간체 카르보늄 이온이 형성된다. 양성자를 잃을 때에, C-3 카르보늄 이온으로는 식 101 의 화합물이 생성되는 한편, C-5 카르보늄 이온으로는 락톤이 생성된다. C-7 에 있는 수소로는, 3,5-디엔-3-알콕시(에놀 에테르)가 이중 결합 포합 때문에 선호된다. C-7 에 있는 7α-CO2 치환기를 사용하면, C-5 카르보늄 이온은 카르복시에 의해 포획되고 5,7-락톤이 형성된다. 이 시점에서 3-케토기는 바람직하게는 케탈로 전환되고, 그로써 반응이 완료된다.
바람직한 방법 8 의 구체예들은 방법 9 및 10 에서 설명된다.
방법 9
방법 9 는 방법 4 에서와 동일한 기질, 즉 식 XX 의 화합물로 시작된다. 이 기질은 먼저 하기 식 B 의 화합물로 산화된다:
(화학식 B)
상기 식에서, -A-A-, R3 및 -B-B- 는 식 XIII 에서 정의된 바와 같다.
산화 반응은 방법 4 의 합성에서 식 XXIV 의 화합물의 식 XXIII 의 중간체로의 전환에 대하여 상술된 반응 방법중 어느 하나에 따라 수행된다. 방법 8 의 방법을 사용하면, 식 B 의 화합물은 하기 식 C 의 7-시아노 중간체로 전환된다:
(화학식 C)
상기 식에서, -A-A-, R3 및 -B-B- 는 식 XIII 에서 정의된 바와 같다.
다음으로, 식 C 의 화합물은 앞서 방법 6 에서 사용된 트리알킬 오르토포름산염 시약을 사용하여 하기 식 D 의 5,7-락톤으로 전환된다:
(화학식 D)
상기 식에서, -A-A-, R3 및 -B-B- 는 식 XIII 에서 정의된 바와 같고, R17 은 C1-C4 알킬이다. 식 D 의 5,7-락톤은 예컨대 중탄산염을 사용한 세척을 통해 산을 제거하고, 그로써 원하는 C-7 입체화학을 수립하고 염기성 조건하에서 수행되는 후속적인 반응에서 에피머화를 방해함으로써 미반응된 7-β-COOH 로부터 쉽게 분리된다. 방법 8 에서 설명된 바와 같이, 알킬 할로겐화물과의 반응에 따르는 락톤의 에스테르화로 식 II 의 엔에스테르 중간체가 생성된다.
방법 9 의 합성을 계속하면, 식 D 의 화합물은 식 II 의 화합물로 전환된다. 케탈로 전환됨으로써 보호된 3-케토 기를 사용하여 식 XXXIII 의 20-스피록산 고리는 방법 3 및 6 에 대해 설명된 반응 방법을 따라 17-위치에 선택적으로 도입되고, 그로써 하기 식 E 의 화합물이 생성된다:
(화학식 E)
3-케톤이 보호되기 때문에, 3-위치에서의 반응을 통한 부산물의 형성과 무관하게 17-케톤을 공격하기 위한 최적의 가수분해 조건이 선택될 수 있다. 식 E 의 3-케탈 화합물이 하기 식 F:
(화학식 F)
의 3-케토기 구조로 가수분해된 후, 후자의 중간체는 방법 8 의 조건에 따라, 염기의 존재하에 알킬 요오드화물과 반응되어 식 II 의 엔에스테르 중간체가 생성된다. 최종적으로, 후자의 중간체는 방법 1 에 대하여 상술된 방법들중 어느 한가지를 사용하여 에폭시멕스레논 또는 식 I 의 다른 화합물로 전환된다.
방법 9 의 장점은 5,7-락톤 중간체에 의해 제공된 입체화학을 조절할 수 있다는 것 뿐만 아니라, 17-스피로락톤의 간섭없이 더 광범위한 가수분해 조건이 가능해진다는 추가의 장점이 있다는 것이다.
본 발명의 다른 합성 방법에 대한 반응과 마찬가지로, 방법 9 의 반응들은 구체적으로 상술된 것들 이외의 기질의 전환에 사용될 수 있다. 그러므로 예를 들면, 3-케토- 또는 3-케탈-7-시아노 스테로이드의 3-케토- 또는 3-케탈-5,7-락톤으로의 전환, 또는 3-케토- 또는 3-케탈-5,7-락톤의 7α-알콕시카르보닐로의 전환은 17-탄소에서 상기 규정된 R8 및 R9 에 의해, 또는 보다 구체적으로는 하기 식의 치환체에 의해 치환된 화합물에 대해 수행될 수 있다:
(화학식 XXXIV)
상기 식에서, X, Y1 및 Y2 는 상기 정의된 바와 같고 C(17) 은 17-탄소를 나타낸다. 그러나, 중요한 장점은, 특히 방법의 경제학에서, 17-케토 기질을 사용하고 이어서 17-스피로락톤과 7α-알콕시카르보닐의 3-케토-△9,11 스테로이드로의 도입을 위해 상술된 특이한 반응 방법을 사용하는 특이한 반응 순서를 사용함으로써 이루어진다.
식 D, E 및 F 의 락톤은 방법 9 의 합성에 따라 에폭시멕스레논 및 식 I 및 식 IA 의 다른 화합물들의 제조에 유용한 신규한 화합물들이다. 이들 화합물에서, -A-A- 및 -B-B- 는 바람직하게는 -CH2-CH2- 이고 R3 은 수소, 저급 알킬 또는 저급 알콕시이다. 가장 바람직한 식 D 의 화합물은 R17 이 메톡시인 것이다.
특히 바람직한 구체예에서, 방법 9 의 전체적인 방법은 다음과 같이 진행된다:
방법 10
방법 10 은 식 C 의 7-시아노 중간체의 형성을 통하여 방법 9 와 동일하다. 방법 10 의 다음 단계에서, 7-시아노 스테로이드는 알칸올 용매중의 트리알킬 오르토포름산염, 바람직하게는 메탄올중의 트리메틸 오르토포름산염과 반응되어 3-케토기는 에놀 에테르로, 17-케토기는 케탈로 전환됨으로써 3-케토와 17-키토기가 동시에 보호된다. 그런 다음 7-시아노기가 7-포르밀로, 예컨대 디알킬 알루미늄 수소화물, 바람직하게는 디이소부틸 알루미늄 수소화물과의 반응에 의하여 환원됨으로써 하기 식 203 의 화합물이 생성된다:
(화학식 203)
상기 식에서, -A-A-, R3, 및 -B-B- 는 식 XIII 에서 정의된 바와 같고, R18 은 C1-C4 알킬이다. 상술된 바와 같은 케토기의 선행되는 보호는 디알킬 알루미늄 수소화물에 의한 케토기의 환원을 방해한다. 식 203 의 중간체는 다음에 희석된 수성산과 반응되어 과잉의 알코올 (R19OH)의 존재하에 17-케탈이 선택적으로 가수분해됨으로써 하기 식 204 의 중간체가 생성된다:
상기 식에서, R19 는 저급 알킬 (바람직하게는 C1 내지 C4)중에서 선택되거나, 또는 3-위치에 있는 R19 기는 3-위치에서 고리형 O,O-옥시알킬렌옥시 치환체를 형성한다. 헤미아세탈 [204]는 추가로 비-수성산의 존재하에 알칸올 (R20OH)을 사용한 처리에 의하여 보호되어 하기 식 205 의 중간체가 생성된다:
상기 식에서, -A-A-, -B-B-, R3 및 R19 는 상기 정의된 바와 같으며, R20 은 C1 내지 C4 알킬이다. 그런 다음 17-스피로락톤 부분이 방법 3 및 6 에 대해 상술된 반응 단계들을 따라 도입됨으로써 하기의 반응식을 따라 진행된다:
상기 식들에서, -A-A-, -B-B-, R3, R19 및 R20 은 상기에서 정의된 바와 같고, R25 는 C1 내지 C4 알킬이다.
그런 다음 3-위치는 종래의 가수분해에 의하여 탈보호되어 3-케토기 및 5,7-헤미아세탈이 재도입됨으로써 하기 식 209 에 해당하는 추가의 중간체가 생성된다:
상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 상기에서 정의된 바와 같다. 다음에, 9,11 에폭시드 부분은 식 II 의 화합물의 식 I 의 화합물로의 전환에 대하여 상술된 방법중 어느 한가지에 따라 도입된다. 에폭시드화 반응의 산화 조건하에서, 헤미아세탈은 부분적으로 5,7-락톤으로 전환됨으로써 하기 식 211 에 해당하는 추가의 중간체가 생성된다:
상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 상기에서 정의된 바와 같다.
하기 식 210 의 모든 남아있는 9,11-에폭시-5,7-헤미아세탈 중간체 반응 생성물:
(상기 식에서, -A-A-, -B-B- 및 R3 은 상기에서 정의된 바와 같다)
은 식 211 의 화합물로 종래 수단에 의하여 쉽게 산화된다. 최종적으로, 식 211 의 중간체는 5,7-락톤의 7α-알콕시카르보닐 화합물로의 전환에 대하여 방법 8 에서 설명된 방법을 사용하여 에폭시멕스레논 또는 식 I 의 다른 화합물로 전환된다. 그러므로, 전체적인 방법 10 의 방법은 다음과 같이 진행되며, 최소한 다음 단계들이 중간체의 회수없이 제자리에서 수행될 수 있는 것으로 여겨진다. 전체적인 방법 10 의 방법은 다음과 같이 진행된다:
방법 9 의 경우에서와 같이, 방법 10 에 대해 상기 설명된 반응들은, 특히 방법의 경제학에 관련하여 중요한 장점을 제공한다; 그러나 방법 10 의 신규한 반응들은 또한 구체적으로 설명된 것들 이외의 기질에 대해서도 더 일반적으로 적용된다. 예를 들면, 7-포르밀기의 3-에놀 에테르 스테로이드로의 도입, 그 결과의 7-포르밀-△-5,6-3,4-에놀 에테르의 보호, 5,7-헤미아세탈로의 가수분해, 및 후속되는 탈보호는 17-위치에서 상기 규정된 바와 같은 R8 및 R9 에 의해, 또는 보다 구체적으로는 하기 식의 치환체에 의해 치환된 스테로이드에 대해 수행될 수 있다:
(화학식 XXXIV)
상기 식에서, X, Y1, Y2 및 C(17) 은 상기에서 정의된 바와 같다.
방법 10 의 대체 방법은 각각 상기에서 설명된 바와 같은 식 A203 내지 A210 의 범주내에 있는 다양한 중간체들을 사용하는 것을 포함한다. 식 A203 내지 A211 의 중간체들의 각각은 방법 10 의 합성법을 따라 에폭시멕스레논 및 식 I 및 식 IA 의 다른 화합물들의 제조에 유용한 신규한 화합물이다.
특히 바람직한 구체예에서, 방법 10 의 전체적인 방법은 다음과 같이 진행된다:
상기에서 예시된 여러개의 방법로부터, 본 발명의 방법들에 사용하기 위하여 선택된 반응 단계들이 에폭시멕스레논 및 관련 화합물들의 제조에 실질적인 융통성을 제공하는 것이 인지될 것이다. 중요한 특징은 무엇보다도 다음과 같은 것들이다: (a) 칸레논, 안드로스텐디온, 또는 β-시토스테롤의 11α- 또는 9α-히드록시 유도체로의 생체전환 (β-시토스테롤의 17-케토 구조로의 자발적인 전환이 포함됨); (b) 11α- 또는 9α-히드록시기중 어느 하나를 포함하고 있는 화합물의 탈수에 의한 9,11 이중 결합의 도입, 및 이어서 9,11 이중 결합의 산화에 의한 에폭시기의 도입; (c) 엔아민의 형성에 의한 7α-알콕시카르보닐의 부착, 엔아민의 디케톤으로의 가수분해, 및 디케톤의 알칼리 금속 알콕시드와의 반응; (d) 17 위치에서의 20-스피록산 고리의 형성; (e) 5,7-락톤의 형성, 및 락톤의 7-알콕시카르보닐로의 에스테르화; (f) 다른 위치에서 다양한 전환 (17-위치에서 20-스피록산 고리의 형성이 포함됨)이 일어나는 중에 3-에놀 에테르 또는 3-케탈로의 전환에 의한 3-케톤의 보호. 몇가지 제한을 두자면, 이들 네가지 성분 방법 엘레먼트인 (b) 내지 (d) 가 거의 어떤 순서로든지 수행될 수 있다는 것이다. 방법의 엘레먼트 (e) 및 (f) 는 비교할만한 융통성을 제공한다. 이 단계들은 미국 특허 제 4,559,332 호의 방법에 비교하여 훨씬 더 간단한, 에폭시멕스레논 및 식 I 의 다른 화합물들에 대한 경로를 제공한다. 더욱이, 이 단계들은 생산성 및 수율면에서 중요한 장점을 제공한다.
상술된 바와 같은 반응 방법의 설명에서, 반응 생성물의 회수, 단리 및 정제는 일반적으로 당업자에게 잘 알려져 있는 방법들에 의하여 수행될 수 있다. 다른 언급이 없는 한, 조건, 용매, 및 시약들은 종래의 것들이거나, 협의로는 중요하지 않거나, 또는 둘다이다. 그러나, 구체적으로 상술된 특이한 과정들중 어떤 것은, 다양한 방법의 단계들 및 방법 방법의 우수한 전체적인 수율 및/또는 생산성, 및/또는 중간체 및 궁극적으로는 9,11-에폭시스테로이드 생성물들의 고품질에 기여한다.
본 발명에 따라 제조된 20-스피록산 화합물들의 활용성은 그롭 (Grob)의 미국 특허 제 4,559,332 호에서 설명된다.
본 발명에 따라 제조된 20-스피록산 화합물들은 우수한 생물학적 성질에 의해 구별되고, 따라서 가치있는 약학적 활성 성분들이다. 예를 들면, 그것들은 그것들이 알도스테론에 의해 유발된 과도하게 높은 나트륨 보유량과 칼륨 분비를 감소시키고 정상화시킨다는 점에서 강한 알도스테론-길항 작용을 가지고 있다. 그러므로 그것들은 칼륨-절약 이뇨제로서, 예컨대 고혈압, 심장의 부적절함 또는 간경변의 치료에 중요한 치료용도로 적용된다.
알도스테론-길항 작용을 가지고 있는 20-스피록산 유도체는 공지이다 [예컨대 Fieser and Fieser: Steroids; p 708, Reinhold Publ. Corp., New York, 1959; 영국 특허 명세서 제 1,041,534 호]. 또한 유사한 활성을 나타내는 17β-히드록시-21-카르복실산 및 그것들의 염도 공지이다 (예컨대 미국 특허 제 3,849,404 호). 그러나, 지금까지 치료에 사용되어 왔던 이런 종류의 화합물들은 그것들이 항상 관례적인 장기간 치료시에 곧 또는 나중에 문제성 결과를 초래하는 특정한 성-특이적 활성을 보유하고 있다는 점에서 상당한 단점을 갖는다. 특히 바람직하지 않은 것은 공지의 항-알도스테론 제제의 항-안드로게닉 활성에 있다고 생각되는 문제성 효과들이다.
본 발명의 방법, 과정 및 조성과 거기에서 사용된 조건 및 시약들은 하기의 실시예에서 추가로 설명된다.
(실시예)
실시예 1
표 1에 보인 성장배지로 사면을 제조했다.
제 1세대 배양균을 생산하기 위하여, 아스퍼길루스 오크라세우스 (Aspergillus ochraceus)의 콜로니를 시험관내의 증류수(2ml)에 현탁했고; 이 현탁액 0.15 ml씩을 상기대로 제조된 각각의 사면에 접종했다. 사면을 25℃에서 7일간 배양한후에, 배양균 표면의 외관은 하얀 솜털의 균사체의 외관이었다. 후면은 하부가 오렌지색으로, 상부는 노란-오렌지색으로 착색되었다.
제 1세대 사면 배양균을 Tween 80 비이온성 계면 활성제(3중량%)를 함유하는 멸균용액(4ml)중에 현탁했고, 이 현탁액 0.15 ml씩을 사용하여 표 2에 보인 성장배지로 제조된 제 2세대 사면에 접종했다.
제 2 세대 사면를 25℃에서 10일동안 인큐베이션했고, 금색포자를 다량 생산했고; 후면은 브라운 오렌지로 착색되었다.
표 3에 보인 조성을 갖는 보호배지를 제조했다.
제 2 세대 사면중 5개로부터의 배양균을 100 ml 플라스크내의 보호 용액(15ml)중에 현탁했다. 동결건조를 위해 현탁액을 100 x 10 mm 관들 중에 각각 0.5 ml씩 분배했다. 이것을 아세톤/드라이아이스욕중 -70℃ 내지 -80℃에서 20분간 미리 얼렸고, 곧바로 -40℃ 내지 -50℃로 미리 냉각된 건조실로 옮겼다. 미리 얼려진 분배물들을 50μHg의 잔여압력 및 ≤-30℃에서 동결건조했다. 동결건조를 끝내고, 멸균실리카 겔 2개 내지 3개의 과립을 습도 표시계 및 프레임 실(Flame seal)과 함께 각 관에 가했다. 산업적 규모의 발효에 적당한 모 배양균 사면를 얻기 위해, 상기한 방식으로 제조한 동결건조된 배양균중 한 분획을 증류수(1 ml)에 현탁시키고 현탁액을 0.15 ml씩 사용하여 표 2에 보인 조성물을 갖는 성장배지를 제공하는 사면에 접종했다. 모 사면를 25℃에서 7일간 인큐베이션했다. 인큐베이션을 끝내고, 사면에서 증식한 배양균을 4℃에서 보존했다.
통상의 사면 배양균을 제조하기 위하여, 모 사면으로부터의 배양균을 Tween 80 (3 중량%)을 함유하는 멸균용액(4ml)중에 현탁했고, 생성된 현탁액을 표 2에 기술한 성장배지로 덮힌 사면들에 0.15ml씩 배분했다. 통상의 사면 배양균을 사용하여 연구 또는 산업적 발효를 위한 1차 접종 플라스크에 접종할수 있다.
1차 접종 플라스크 배양균을 제조하기 위하여, 상기한대로 제조된 통상의 사면로부터의 배양균을 제거하고 Tween 80(3 중량%)을 함유하는 용액중에 현탁했다. 생성된 현탁액 0.1씩을 표 4에서 보인 조성을 갖는 성장배지를 함유하는 500 ml 배플 플라스크로 주입했다.
접종 플라스크를 28℃에서 24시간동안 회전 진탕기(200 rpm, 5 cm 변위)에서 인큐베이션했고, 이것에 의하여 직경 3 내지 4 mm를 갖는 펠렛과 유사한 균사체형태로 배양균을 생성했다. 현미경 관찰에 의하여, 종 배양균은 집속균사적 성장하며, 잘 꼬여진 큰 균사를 갖는 순수한 배양균임이 밝혀졌다. 현탁액의 pH는 5.4 내지 5.6 이었다. PMV는 원심분리(3000 rpm x 5 min)로 결정하여 5 내지 8%이었다.
형질전환 플라스크 배양균을 종 배양 플라스크로부터 두번째 500 ml 진탕기 플라스크중의 표 4에서 보인 조성물을 갖는 성장배지(100ml)에 생물량( 1ml)을 접종시켜서 제조했다. 생성된 혼합물을 28℃에서 18시간동안 회전 진탕기(200 rpm, 5 cm 변위)에서 인큐베이션했다. 배양균을 검사하여 3-4 mm 직경을 갖는 펠렛과 유사한 균사체를 포함하는 것을 발견했다. 현미경 검사에 의하여, 배양균을 신생세포가 세포질에 가득차고 늙은세포는 거의 공포화 되지 않은 집속균사적이며 섬질의 성장을 갖는 순수한 배양균이라고 결정했다. 배양균 현탁액의 pH는 5 내지 5.2 이었고, PMV는 원심분리에 의하여 결정하여 10 % 와 15 % 사이였다. 따라서, 배양균을 칸레논에서 11α-수산화칸레논으로의 형질전환에 적당하다고 간주했다.
칸레논(1g)을 약 5μ로 미분쇄했고, 멸균수(20ml)에 현탁했다. 40%(w/v) 멸균 글루코스 용액; 16% (w/v) 자가용해된 효모의 멸균 용액; 및 멸균 항생용액; 표 5의 반응시간중 0시간에 대해 표시된 비율로 이들 모두를 현탁액에 가했다. 항생 용액을 황산 가나마이신(40 mg), 염산 테트라사이클린(40 mg) 및 세팔렉신(200mg)을 물(100ml)중에 용해하여 제조했다. 스테로이드 현탁액, 글루코스 용액 및 자가용해된 효모 용액을 진탕 플라스크중에 함유된 배양균에 점진적으로 가했다.
반응이 진행됨에 따라, 반응 혼합물을 정기적으로 분석하여 글루코스 함량을 결정했고, 박막 크래마토그래피에 의하여 11α-수산화칸레논으로의 전환을 결정했다. 반응중에 추가의 칸레논 기질 및 영양물을 글루코스 함량이 약 0.1중량%의 범위로 유지하도록 조정된 속도로 발효 반응 혼합물에 가했다. 스테로이드 현탁액, 글루코스 용액, 자가용해된 효모 용액 및 항생제 용액에 대한 첨가 방법을 표 5에 보였다. 형질전환반응을 회전진탕기(200 rpm 및 5cm 변위)상에서 25℃, 96시간동안 계속했다. 발효도중 pH는 4.5와 6사이의 범위였다. PMV가 60%로 오르거나 그 이상이 되면, 육즙배양의 10 ml 부분을 제거하고 10 ml의 증류수로 대체했다. 칸레논의 소실과 11α-수산화칸레논의 출현을 발효사이클의 시작후 4, 7, 23, 31, 47, 55, 71, 80 및 96시간의 간격으로 육즙을 샘플링함으로서 반응중 추적했고, 샘플을 TLC에 의하여 분석했다. 이 샘플로부터 결정된 반응의 진행을 표 6에 보였다.
실시예 2
주 접종플라스크 배양균을 실시예 1에 기술된 방식으로 제조했다. 표 7에 보인 조성물을 갖는 영양 혼합물을 제조했다.
이 영양 혼합물(4L)의 초기량을 10L 기하학적 부피의 형질전환 발효조로 주입했다. 발효조는 2.58의 높이 대 직경의 비를 갖는 원통형의 외형이었다. 이것은 각각 6개의 블레이드가 있는 2개의 No.2 디스크 휠을 갖는 400rpm 터빈 교반기를 구비한다. 임펠러의 바깥 지름은 80mm이고, 각각의 블레이드는 방사 차원으로 25 mm 및 30 mm 높이, 상부의 휠은 용기 상부로부터 280 mm아래에 위치하고, 하부의 휠은 용기상부로부터 365mm아래에 위치하며, 용기의 격막은 210 mm높이이고 용기의 안쪽 수직 벽으로부터 안쪽으로 25mm 방사상으로 나와있다.
종 배양균(40 ml)을 발효조중의 영양물 양과 혼합하고, 28℃에서 22시간동안 인큐베이션 및 0.5 kg/cm2의 압력에서 분당 0.5l/l의 통기속도로 형질전환 배지균을 정착시켰다. 22시간에서, 배양균의 PMV는 20-25% 이었고, pH는 5내지 5.2 이었다. 멸균수(400ml)중 칸레논(80g)을 포함하는 현탁액을 제조했고, 10 ml 부분을 형질전환 발효조중의 혼합물에 가했다. 동시에 40%(w/v) 멸균 글루코스 용액, 16%(w/v) 자가용해된 효모의 멸균용액 및 멸균 항생용액을 표 8의 반응시간 0시간에 나타난 비율로 가했다. 항생용액을 실시예 1에 기술된 방식으로 제조했다.
반응이 진행되면서, 반응혼합물을 주기적으로 분석하여 글루코스 함량을 결정했고, 박막 크래마토그래피에 의하여 11α-수산화칸레논으로의 전환을 결정했다. 이하에 기술된 반응육즙샘플의 TLC분석에 기초하여, 추가의 칸레논을 칸레논 기질이 소모됨에 따라 반응혼합물에 가했다. 글루코스 레벨을 또한 추적했고, 글루코스 농도가 약 0.05중량%로 떨어지거나 그 미만이 되면, 보충의 글루코스 용액을 가하여 그 농도를 0.25 중량%로 올렸다. 또한 영양물과 항생물질을 반응사이클동안 불연속적으로 가했다. 스테로이드 현탁액, 글루코스 용액, 자가 용해된 효모 용액 및 항생용액에 대한 첨가 방법을 표 8에 보였다. 형질전환 반응은 0.3 kg/cm2의 초기양압에서 분당 액체부피당 공기 0.5부피(vvm)의 통기속도에서 90시간동안 계속되었다. 온도를 PVM이 45%에 도달할때까지 28℃로 유지했고, 그후 26℃로 내려서 이 온도에서 PVM이 45내지 60%로 될때까지 유지했고, 그 후에 24℃로 조절했다. 초기 교반 속도는 400rpm이었고, 40시간후에 700rpm으로 증가시켰다. 표시된 대로 2M 오르토포스포릭 산 또는 2M NaOH의 첨가에 의해 pH를 4.7 내지 5.3으로 유지했다. 거품이 발생하면 소포제 SAG 471을 몇 방울 가함으로써 거품을 제어했다. 칸레논의 소실과 11α-수산화칸레논의 출현을 육즙샘플의 TLC분석에 의하여 반응중 4시간 간격으로 추적했다.
모든 칸레논의 첨가를 마친후, TLC분석이 11α-수산화칸레논에 대한 칸레논 기질의 농도가 약 5%로 떨어진것을 보였을때 반응을 종결했다.
반응 사이클의 종말점에서, 액체 육즙으로부터 균사체의 분리를 위하여 발효육즙을 무명천으로 여과했다. 균사체분획을 반응과정동안 소모된 칸레논 그램당 약 65부피(5.2 리터)를 이용하여 초산에틸중에서 재 현탁시켰다. 초산에틸중의 균사체의 현탁액을 교반하면서 1시간동안 재용해시켰고, 약 20℃로 냉각했고,부크너상에서 여과했다. 균사체 케이트를 순서대로 초산에틸(칸레논 소모g당 5부피; 0.4 L), 탈이온수 (500 ml)로 세척하여 케이크로부터 초산에틸 추출물을 치환했다. 여과 케이크를 버렸다. 풍부한 추출물, 용제 세척액 및 물세척액을 분리기에 모으고, 상분리를 위하여 2시간동안 방치했다.
이어서, 수상을 버리고, 유기상을 진공하에서 농축하여 350 ml의 잔여 부피로 했다. 바닥을 15℃로 냉각시키고, 교반하면서 약 1시간동안 유지했다. 생성된 현탁액을 여과하여 결정성물질을 제거했고, 여과 케이크를 초산에틸(40ml)로 세척했다. 건조후에, 11α-수산화칸레논의 수득을 60 g으로 결정했다.
실시예 3
포자 현탁액을 실시예 1에 기술된 방식대로 통상의 사면으로부터 제조했다. 2000 ml 배플 둥근바닥 플라스크(3격막, 각각 50 mm x 30mm)중에, 포자 현탁액 0.5 ml씩을 표 4에 보인 조성을 갖는 영양물 용액(500ml)으로 주입했다. 생성된 혼합물을 분리 진탕기(분당 120 스트로크.; 5cm변위)상에서 25℃, 24시간동안 플라스크에서 인큐베이션했고, 이에 의하여 현미경 검사상 잘 꼬여진 균사를 갖는 순수한 배양균으로 보이는 것으로 관찰된 배양균을 생성했다. 이 배양균의 pH는 약 5.3과 5.5사이였고, PMV(5분간 3000 rpm으로 원심분리 하여 결정)는 8 내지 10 %이었다.
이렇게 제조한 배양균을 사용하여, 종 배양균을 160 L의 기하학적 부피 및 2.31의 가로세로의 비(높이=985mm; 지름=425mm)를 갖는 수직 원통형의 스테인레스 강철 발효조중에서 제조했다. 발효조는 2개의 휠을 갖는 디스크 터빈형태의 교반기를 구비하는데, 각각의 휠은 외측지름이 240 mm이며 6개의 블레이드를 갖고, 각각의 블레이드는 80 mm 라디알 차원과, 50 mm의 높이를 갖는다. 상부휠은 발효조의 상부로부터 780 mm, 그 다음것은 995 mm의 깊이에 위치한다. 890 mm의 높이를 갖는 수직배플은 발효조의 수직내벽으로부터 안쪽으로 40 mm뻗어 있다. 교반기는 170 rpm으로 작동했다. 표 9에서 보인 조성을 갖는 영양혼합물(100L)을 발효조내로 넣고, 이어서 상기한대로 제조한 5.7의 pH를 갖는 프리이노쿨룸(1L)의 일부를 넣었다.
접종된 혼합물을 0.5 Kg/cm2 의 초기압력에서 0.5 L/L-min 의 통기속도로 22시간동안 인큐베이션했다. PMV가 25%에 도달할때까지 온도를 28℃로 조절했고, 그후 25℃로 낯추었다. pH는 5.1 내지 5.3의 범위로 조절했다. 균사체 부피의 성장을 종배양반응의 용해된 산소 프로파일과 pH에 따라 표 10에 보였다.
이렇게 생산된 접종 배양균을 사용해서, 형질전환 발효 작업을 지름 1.02 m, 높이 1.5m 및 1.4 m3의 기하학적 부피를 갖는 수직 원통형 스테인레스 강철 발효조내에서 수행했다. 발효조는 두개의 임펠러를 갖는 터빈 교반기를 구비하는데, 하나는 반응기의 상부 아래 867cm에 위치하고, 다른하나는 상부로 부터 1435 cm에 위치한다. 각 휠은 각 라디알 차원이 95cm이며 높이가 75cm인 6개의 블레이드를 구비한다. 1440 cm높이의 수직 배플은 반응기의 수직내벽으로 부터 100cm 안쪽으로 방사상으로 뻗어있다. 표 11에서 보인 조성세트를 갖는 영양 혼합물을 제조했다.
영양 혼합물(pH=5.7)의 초기량(700L)을 발효조에 넣고, 이어서 상기한 대로 제조된 본 실시예(7 L)의 접종물을 넣었다.
접종물을 함유하는 영양혼합물을 0.5 Kg/cm2 의 초기압력에서 0.5 L/L-min 의 통기속도로 24시간동안 인큐베이션했다. 온도를 28℃로 조절했고, 교반속도는 110 rpm이었다. 균사체 부피성장을 종배양 반응의 용해된 산소 프로파일 및 pH에 따라, 표 12에 보였다.
인큐베이션을 마쳤을때, 균사체의 펠렛이 관측되었으나, 이 펠렛은 일반적으로 작고 상대적으로 느슨하게 뭉쳐있었다. 흩어진 균사체를 육즙에 현탁했다. 최종 pH 는 5.1 내지 5.3 이었다.
이렇게 생성된 형질전환배양균에 멸균수(5L)중 칸레논(1.250Kg; 5μ로 미분쇄된것)의 현탁액을 가했다. 멸균 첨가액과 항생용액을 표 14에 보인 반응시간 0에서 표시된 비율대로 가했다. 첨가액의 조성을 표 13에 보였다.
0.5 Kg/cm2 의 초기압력, 0.5 L/L-min 의 통기속도 및 필요에 따라 7.5 M NaOH 또는 4 M H3PO4의 첨가에 의해 조절된 4.7 내지 5.3 범위의 pH에서 생전환을 수행했다. 교반속도는 초기에 100 rpm, 40시간에서 165 rpm 및 64시간에서 250rpm이었다. 초기 온도는 28℃이었고, PMV가 45%에 도달했을때 26℃로 낮추었고, PMV가 60%로 올랐을때 24℃로 낮추었다. 기포생성을 조절하기 위하여 필요에 따라 미적(微滴)상의 SAG 471을 가했다. 발효중 글루코스 레벨을 4시간 간격으로 추적하였으며, 글루코스농도가 1 gpl 이하로 떨어질 때마다, 멸균첨가액(10L)의 증량을 배치에 가했다. 또한, 칸레논의 소실과 11α-수산화칸레논의 출현을 반응중에 HPLC로 추적했다. 초기 칸레논 양의 최소한 90%가 11α-수산화 칸레논으로 전환되었을때, 1.250 Kg 칸레논의 증량을 가했다. 이 증량한 칸레논의 90%가 전환됐다고 보일때, 또다른 1.250 Kg 증량을 주입했다. 동일한 기준을 이용하여, 더 많은 증량(1회에 1.250 Kg)을 전 반응량(20 Kg)이 주입될때까지 가했다. 칸레논 전량을 반응기로 넣은후, 미반응 칸레논의 농도가 생성된 11α-수산화칸레논의 양에 대해 5%였을때 반응을 종결했다. 칸레논, 멸균첨가액 및 항생용액의 첨가에 대한 방법을 표 14에 보였다.
생전환이 완료됐을때, 배스킷(baskit) 원심분리기로 원심분리함으로서 육즙과 균사체를 분리했다. HPLC에 의하여 여과액은 수거 육즙중 11α-수산화칸레논 전량의 2%만을 함유한다고 결정했고, 따라서 이를 버렸다. 균사체를 2 m3 용량의 추출탱크중 초산에틸(1000L)에 현탁했다. 이 현탁액을 교반 및 초산에틸 재용해 조건하에서 1 시간동안 가열했고, 그후 냉각하고, 배스킷 원심분리기중에서 원심분리 했다. 균사체 케이크를 초산에틸(200L)로 세척하고, 그후에 방출했다. 스테로이드가 풍부한 용매 추출물을 수상의 분리를 위하여 1시간 동안 방치했다. 수상을 초산에틸 용매(200L)의 추가량으로 추출한 후에 버렸다. 혼합된 용매상을 원심분리에 의하여 분류했고, 농축기(500L 기하학적 부피)에 넣어 진공하에서 농축하여 100 L의 잔여부피로 했다. 증발을 수행하는 중에, 혼합된 추출액 및 세척액의 농축기에 대한 초기량은 100 L이었고, 이 부피를 용매가 증발됨에 따라 혼합된 용액의 주기적 또는 연속적인 첨가에 의해 일정하게 유지했다. 증발 단계가 완료된 후, 바닥을 20℃로 냉각시키고, 2시간동안 젓고, 부크너 여과기에서 여과했다. 농축기 단지를 초산 에틸(20L)로 세척하고 이 세척액을 사용하여 여과기 상에 있는 케이크를 세척했다. 생성물을 50℃에서 16시간동안 진공하에서 건조했다. 11α-수산화칸레논의 수득은 14Kg 이었다.
실시예 4
아스퍼길루스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus) NRRL 405의 건조동결된 포자를 표 15에 보인 조성을 갖는 콘 스팁액 성장 배지에 현탁했다.
생성된 현탁액을 한천 평판상에서 포자의 번식을 위해 접종원으로 사용했다. 10개의 한천평판을 제조했고, 각각 표 16에 보인 조성을 갖는 고형의 글루코스/효모 추출물/인산/한천 성장배지를 함유한다.
현탁액 0.2 ml씩을 각 평판의 표면으로 옮겼다. 평판을 25℃에서 10일간 인큐베이션하고, 그후에 모든 평판으로부터의 포자를 수거하여 표 17에 보인 조성을 갖는 멸균 냉동 보호배지로 옮겼다.
생성된 현탁액을 각 바이알마다 1 ml씩 옮겨서, 20개의 바이알로 나누었다. 이 바이알은 칸레논의 11α-수산화칸레논의 생전환을 위한 접종원의 발생에 사용하기 위한 작동 셀(cell)밴크를 생산하기 위하여 의존될수 있는 마스터 셀(cell)밴크을 구성한다. 마스터 셀(cell)밴크를 포함하는 바이알을 -130℃에서 액체질소 냉각기의 증기상에서 보관했다.
작동 셀(cell)밴크의 제조를 시작하기 위해서, 하나의 마스터 셀(cell) 밴크 바이알로부터의 포자를 표 15에서 보인 조성을 갖는 멸균성장 배지(1 ml)중에 재현탁시켰다. 이 현탁액을 10개의 0.2 ml의 분획으로 나누어, 각 분획을 표 16에 보인 조성을 갖는 고형 성장 배지를 함유하는 한천 평판에 접종하는데 사용했다. 이 평판을 25℃에서 10일 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션의 3일째 날, 성장배지의 아래부분이 갈색-오렌지색이었다. 인큐베이션의 마지막에는 금색포자의 대량생산이 있었다. 각 평판으로부터 포자를 마스터 셀(cell) 밴크의 제조를 위해 여기에 기술한 방법에의해 수거했다. 전부 100개의 바이알을 제조했고, 각각 1mg 의 현탁액을 함유한다. 이 바이알들은 작동 셀(cell) 밴크를 구성한다. 또한 작동 셀(cell) 밴크바이알들을 -130℃에서 액체질소 냉각기의 증기상중에서 보존함으로서 저장했다.
표 15에서 보인 조성을 갖는 성장배지(50ml)를 250 ml엘렌마이어 플라스크에 채웠다. 작동 셀(cell)현탁액의 분획(0.5 ml)을 플라스크로 넣고, 성장배지와 혼합했다. 접종된 혼합물을 25℃에서 24시간동안 인큐베이션하여 대략 45%의 퍼센트 뭉쳐진 균사체 부피를 갖는 1 차 종 배양균을 생산했다. 시각적 검사에 의하여, 배양균은 1 내지 2 mm의 지름의 펠렛-유사한 균사체를 포함하는 것을 발견했고, 현미경 관측에 의하여, 순수배양균으로 보였다.
2차 종 배양균의 배양을 표 15에 보인 조성을 갖는 성장배지를 2.8 L 페렌바하 플라스크에 주입하고, 본 실시예의 1 차 종 배양균의 일부분(10ml)을 배지에 접종함으로서 개시하였으며, 이것의 제조는 상기되었다. 접종된 혼합물을 회전 진탕기(200 rpm, 5 cm 변위)상에서 25℃에서 24시간동안 인큐베이션했다. 인큐베이션의 마지막에, 배양균은 1 차 종 배양균에 대해 상기된 것과 동일한 성질을 보였고, 칸레논이 11α-수산화칸레논으로 생전환되는 형질전환발효의 사용에 적당했다.
형질전환을 다음과 같이 배열된 브라운 E 바이오스타트 발효조내에서 행했다.
용량; 둥근바닥을 갖는 15 L
높이; 53 cm
지름; 20 cm
H/D; 2.65
임펠러; 7.46 cm지름, 각 2.2 x 1.4 cm의 6개의 패달
임펠러공간; 탱크의 바닥으로부터 65.5, 14.5 및 25.5 cm
배플; 4개의 1.9 x 48 cm
스파거(sparger); 지름 10.1 cm, ∼1 mm 지름의 21 홀
온도 조절; 외부 용기 덮개에 의해 제공됨
20 g/L 농도의 칸레논을 탈이온수(4L)에 현탁시켰고, 표 18에 보인 조성을 갖는 성장배지의 일부(2 L)를 발효조내의 혼합물을 300 rpm으로 교반하는 중에 가했다.
생성된 현탁액을 15분간 젓고, 그후에 추가의 탈이온수로 부피를 7.5 L로 올렸다. 이때 현탁액의 pH를 20 중량% NaOH 용액의 첨가에 의하여 5.2 내지 6.5로 조절했고, 그후 현탁액을 브라운 E 발효조에서 121℃에서 30 분간 가열에 의하여 멸균했다. 멸균후의 pH는 6.3 ± 0.2 였고, 최종 부피는 7.0 L였다. 멸균된 현탁액에 상기한 대로 제조된 본 실시예의 2차 종 배양균의 일부를 접종했고, 부피를 50% 멸균 글루코스용액의 추가에 의하여 8.0 L로 올렸다. PMV가 50 %에 도달할때까지 28℃에서 발효를 수행했고, 그후 26℃로 낮추고, PMV가 약 60%의 미만의 일정한 PMV를 유지하기 위하여 PMV가 50%를 초과할때 24℃로 더 낮췄다. 초기 액체 부피에 기초하여 0.5vvm의 속도로 스파거를 통하여 공기를 주입했고, 발효조내의 압력을 700 밀리바 가우지(gauge)로 유지했다. 교반을 600rpm에서 시작했고, 30부피%이상의 용해산소 함량을 유지하기 위하여 필요할 때마다 단계적으로 1000 rpm으로 증가시켰다. 글루코스 농도를 추적했다. 초기의 높은 글루코스 농도가 발효반응에 의한 소비에 의해서 1%미만으로 떨어진 후에, 나머지 배치 사이클을 통하여 0.05 내지 1% 범위의 농도범위를 유지하기 위하여 50중량% 멸균 글루코스 용액으로 보충의 글루코스를 제공했다. 접종전의 pH는 6.3 ± 0.2 였다. 초기 발효기간동안 pH가 약 5.3으로 떨어진 후에, 수산화 암모늄의 첨가에 의해 나머지 사이클동안 5.5 ± 0.2 범위로 유지했다. OSI Specialties, Inc에 의하여 상표명칭 SAG 471하에서 판매되는 폴리에틸렌 글리콜 소포제의 첨가에 의하여 거품발생을 조절했다.
배양균의 성장이 주로 사이클의 처음 24시간동안 일어났고, 이때 PMV는 약 40%이었고, pH는 약 5.6, 용해된 산소함량은 약 50부피%이었다. 칸레논 전환은 배양균이 성장됨에 따라서 시작되었다. 카렌논 및 11α-수산화칸레논의 농도를 샘플을 매일 분석함에 의하여 생전환동안 추적했다. 샘플을 뜨거운 초산에틸로 추출하고, 얻은 샘플용액을 TLC 및 HPLC에 의해서 분석했다. 남은 칸레논의 농도가 초기 농도의 약 10%가 됐을때, 생전환이 완료된 것으로 간주했다. 대략의 전환시간은 110 내지 130 시간이었다.
생전환이 완료되었을 때, 균사체의 생물량을 원심분리에 의하여 육즙으로 부터 분리했다. 상청액을 동일한 부피의 초산에틸로 추출하고, 수층을 버렸다. 균사체 파편을 발효반응기로 충전된 칸레논 g당 대략 16부피를 사용해서 초산 에틸중에 재현탁했다. 균사체 현탁액을 교반하에서 1시간동안 재용해시키고, 약 20℃로 냉각하고, 부크너 펀넬에서 여과했다. 균사체의 여과 케이크를 발효조에 있는 칸레논의 g 당 5부피의 초산에틸로 2번 세척하고, 탈이온수( 1L)로 세척하여 잔여 초산 에틸을 치환했다. 수성 추출물, 풍부한 용매, 용매 세척액 및 물 세척액을 혼합했다. 남아있는 추출된 균사체 케이크는 그중에 있는 잔여 스테로이드에 대한 분석에 따라 버리거나 또는 다시 추출했다. 혼합된 액체상을 2시간동안 고정했다. 그후에, 수상을 분리하여 버리고, 잔여부피가 대략 500ml이 될때까지 유기상을 농축했다. 그후 바닥부분을 1시간동안 느린 교반과 함께 약 15℃로 냉각했다. 결정성 생성물을 여과에 의해 다시 걸러냈고, 냉초산 에틸(100 ml)로 세척했다. 증발에 의하여 결정으로 부터 용매를 제거하고, 결정성 물질을 50℃에서 진공하에서 건조했다.
실시예 5
아스퍼길루스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus) ATCC 18500의 동결건조 포자를 실시예 4에 기술된 콘 스팁액 성장배지(2ml)중에 현탁했다. 또한 실시예 4의 방식대로 10개의 한천 평판을 제조했다. 실시예 4에 기술한 대로 평판을 인큐베이션하고 수거하여 마스터 셀(cell) 밴크를 얻었다. 마스터 셀(cell) 밴크를 포함하는 바이알을 -130℃의 액체질소 냉각기의 증기상에서 저장했다.
마스터 셀(cell) 밴크의 바이알로부터, 실시예 4에 기술된대로 작동셀(cell) 밴크를 제조하여 -130℃의 질소 냉각기 중에 저장했다.
표 19에 보인 조성을 갖는 성장배지(300ml)를 2L 배플 플라스크에 넣었다. 작동 셀(cell) 현탁액을 3mL씩 플라스크로 주입했다. 접종된 혼합물을 회전 진탕기( 200rpm, 5 cm 치환)상에서 28℃에서 20 내지 24시간 동안 인큐베이션해서 대략 45%의 퍼센트 뭉쳐진 균사체 부피를 갖는 주 종 배양균을 생산했다. 시각적 검사에 의하여 배양균은 펠렛과 유사한 지름 1 내지 2mm의 균사체를 포함하는 것이 발견됐고; 현미경 관측에 의하여 순수한 배양균으로 보였다.
표 19에 보인 조성을 갖는 8L성장배지를 14L 유리 발효조에 주입함으로써 2차 종 배양균의 배양을 개시했다. 본 실시예의 1 차 종 배양균 160ml 내지 200ml을 발효조에 접종했다. 이것의 제조는 상기한 바와 같다. 접종된 혼합물을 28℃에서 18-20시간동안 배양하고, 200rpm 교반, 통기속도는 0.5vvm이었다. 증식의 말엽에, 배양균은 1 차 접종에 대해 상기한 것과 동일한 성질을 나타냈다.
성장배지가 표 20에 보인 조성을 갖고, 2차 종 배양균의 초기량이 350 ml내지 700 ml이라는 것만 제외하고는 실질적으로 실시예 4에 기술된 방식으로 형질전환을 60L 발효조에서 행했다. 교반속도는 초기에 200rpm이었고, 용해된 산소를 10부피%이상으로 유지하기 위하여 필요에 따라 500rpm으로 증가시켰다. 20 g/L 칸레논에 대한 대략의 생전환 시간은 80 내지 160 시간이었다.
실시예 6
실시예 4에 기술된 방식에 따라 생성된 작동셀(cell) 밴크로부터의 포자 현탁액을 사용하여, 역시 실질적으로 실시예 4에 기술된 방식대로 1차 및 2차 종 배양균을 제조했다. 이 방식대로 생성된 2차 종 배양균을 사용하여, 2개의 생전환 작업을 도 1에 도시된 형태의 변형된 방법에 따라 행했고, 도 2에 도시된 방법에 따라 2개의 작업을 행했다. 이 작업을 위한 형질전환배지, 칸레논 첨가 방법, 수거 시간 및 전환의 정도를 표 21에 보였다. 작업 R2A는 실시예 3과 동일한 원리에 기초하여 칸레논 첨가 방법을 사용한 반면, 작업 R2C는 단지 2번의 칸레논 첨가만을, 한번은 배치의 처음에, 한번은 24시간 후에 행함으로서 실시예 3의 방법을 변형했다. 작업 R2B 및 R2C에서, 칸레논 전량을 배치의 초기에 주입했고, 칸레논을 발효조에 넣기 전에 분리된 용기에서 멸균한 것과 글루코스를 배치가 진행됨에 따라 첨가했다는 점이외에는 실시예 4에 기술된 방식대로 반응을 수행했다. 워링 혼합기를 사용하여 멸균중에 생성된 큰덩어리를 분해했다. 작업 R2A 및 R2B에서, 칸레논을 메탄올 용액중의 배치로 주입했고, 이 점에서 작업은 실시예 3 및 4의 작업과 더욱 다르다.
작업 R2A 및 R2B에서, 발효맥주중 메탄올 농도를 약 6.0%로 농축했고, 이것은 배양균성장 및 생전환을 억제한다고 밝혀졌다. 그러나, 이 작업의 결과에 기초하여 에탄올 또는 다른 물-혼화성 용매가 낮은 농도에서 효과적으로 칸레논양을 증가시키는것을 돕고, 반응이 잘 일어나도록 칸레논의 공급을 위하여 큰 표면적을 제공하는 미세 입자 침강물로서 제공하는 것을 돕는다고 결론지었다. 칸레논은 멸균온도(121℃)에서 안정하다고 밝혀졌으나, 덩어리로 회합한다. 워링 혼합기을 사용하여 덩어리를 미세입자로 부수었고, 이것은 성공적으로 생산물로 전환되었다.
실시예 7
실시예 4에 기술된 방법에 따라 생성된 작동셀(cell) 밴크로부터의 포자 현탁액을 사용해서, 역시 실질적으로 실시예 4에 기술된 방식으로 1차 및 2차 종 배양균을 제조했다. 실시예 7의 설명과 결과를 표 22에 보였다. 이 방식으로 생성된 2차 종 배양균을 사용해서, 실질적으로 실시예 3 에 기술된 대로 하나의 생전환(R3C)를 수행했고, 3개의 생전환을 실시예 5에 일반적으로 기술된 방법에 따라 수행했다. 후자의 3작업에서(R3A, R3B 및 R3D), 칸레논을 포터블 탱크에서 글루코스를 제외한 성장배지와 함께 멸균했다. 글루코스를 무균적으로 다른 탱크로부터 공급했다. 멸균한 칸레논 현탁액을 접종하기 전 또는 생전환의 초기 단계중에 발효조내로 주입했다. 작업 R3B에서, 보충의 멸균 칸레논과 성장배지를 46.5시간에 주입했다. 멸균중에 생성된 칸레논의 덩어리를 워링 혼합기를 통하여 분쇄했고, 이렇게 하여 발효조내로 들어갈 미세한 입자 현탁액을 만들었다. 이 작업에 대한 형질전환 성장 배지, 칸레논 첨가 방법, 영양 첨가 방법, 수거 시간 및 전환도를 표 22 및 23에 보였다.
섬질의 성장에 기인하여, 높은 점성의 발효조육즙이 본 실시예의 4개의 작업 모두에서 보였다. 높은 점성이 통기, 혼합, pH 조절 및 온도 조절과 관련하여 만드는 장애를 극복하기 위하여, 통기 속도와 교반속도를 작업중 증가시켰다. 생전환은 가혹한 조건하에서도 만족스럽게 진행되었으나, 액체육즙표면위에 농후한 케이크가 형성되었다. 약간의 미반응 칸레논이 이 케이크에 의해 육즙외로 빠져나갔다.
실시예 8
실시예 8의 설명과 결과를 표 24에 요약했다. 11α-수산화칸레논이 칸레논의 생전환에 의해 만들어지는 4개의 발효조 작업을 행했다. 이 작업중 2군에에서(R4A 및 R4D), 실시예 6의 R3A 및 R3D작업과 실질적으로 동일한 방식으로 생전환을 행했다. R4C에서는, 실시예 3에 기술된 방식으로 칸레논을 11α-수산화칸레논으로 전환했다. R4B작업에서는, 실시예 4에 기술된 방법, 즉, 접종 바로전에 발효조 중의 성장배지 및 칸레논의 멸균,으로 수행하였는데 전 질소와 인산 영양소를 배치의 초기에 주입하고, 글루코스만을 함유하는 보충의 용액을 배치가 진행됨에 따라 글루코스 레벨을 유지하기 위하여 발효조내로 주입했다. 후자 방법에서(작업R4B), 글루코스 농도를 6시간마다 추적하고, 글루코스 레벨을 0.5 내지 1%범위로 조절하기 위하여 지시된 대로 가했다. 이 작업에 대한 칸레논 첨가 방법을 표 25에 보였다.
발효 맥주는 접종하지 마자 즉시 또는 하루 내에 높은 점성으로 되기 때문에 모든 발효조를 대부분의 발효사이클중 높은 교반과 통기하에서 실행했다.
실시예 9
본 실시예의 작엽에 대한 형질전환 성장배지, 칸레논 첨가 방법, 수거 시간 및 전환도를 표 26에 보였다.
아래에 기술한 것을 제외하고는, 실질적으로 실시예 8의 작업 R4B에 기술된 방법으로 4개의 생전환 작업을 수행했다. 작업 R5B에서는 다른 작업의 교반에 사용됐던 탑 터빈 디스크 임펠러(top turbine disk impeller)를 다운워드 펌핑 마린 임펠러(downward pumping marine impeller)로 교체했다.
축으로 아래로 펌핑하는 동작은 육즙을 발효조의 중앙으로 붇고, 케이크형성을 방지한다. 메탄올(200ml)을 작업 R5D에 접종 직후 가했다. 칸레논을 발효조에서 멸균했기 때문에, 글루코스를 제외한 모든 영앙소를 배치의 처음에 가했고, 질소공급원, 인 또는 항생물질의 공급원의 연쇄 공급필요성을 제거했다.
액체 표면위로 자라는 고체상의 침수를 유지하기 위하여, 성장배지(2 L)를 배치가 시작되고 96시간 후에 각 발효조에 가했다. 혼합상의 문제가 성장배지의 첨가 또는 다운워드 펌핑 임펠러(작업 R5B)의 사용에 의하여 전적으로 극복되지는 않았으나, 작업의 결과는 방법의 가능성과 유리한 점을 나타냈고, 종래의 실행방법에 따라 만족할만한 혼합이 제공될수 있다는 것을 보였다.
실시예 10
실질적으로 실시예 9에 기술된 방식에 따라 3개의 생전환작업을 수행했다. 본 실시예의 작업에 대한 형질전환 성장배지, 칸레논 첨가 방법, 수거 시간 및 전환도를 표 27에 보였다.
성장배지(1.3 L)와 멸균수(0.8L)를 액체육즙의 표면 위로 성장한 균사체 케이크를 침수시키기 위하여 작업 R6A에서 71시간 후에 가했다. 같은 목적을 위하여, 성장 배지(0.5L)와 멸균수(0.5 L)를 작업 R6B에서 95시간 후에 가했다. 물질 발란스 데이타는 액체 표면위에 쌓인 케이크가 최소화됐을때 보다 좋은 매스 발란스가 결정될수 있다는 것을 보였다.
실시예 11
칸레논의 사전멸균과 형질전환 발효조내의 성장배지 및 칸레논의 멸균을 비교하기 위하여 발효작업을 행했다. 작업 R7A에서, 작업 R2C, R2D, R3A, R3B, R3D, R4A, 및 R4D의 조건과 비교할수 있는 조건하에서 도 2에 도시된 대로 반응공정을 수행했다. 작업 R7B를 실시예 4, 9 및 10, 그리고 작업 R4B의 조건과 비교할수 있는 조건하에서 도 3에 도시된 대로 수행했다. 본 실시예의 작업에 대한 형질전환 성장배지, 칸레논 첨가 방법, 수거 시간 및 전환도를 표 28에 보였다.
작업 R7B으로부터 취한 최종 샘플에 기초한 매스발란스는 89.5% 였고, 생전환중 의미있는 기질의 손실이나 분해는 없었다는 것을 나타낸다. 혼합을 양 작업에 적절하도록 결정했다.
잔여 글루코스 농도는 초기 80시간동안 리터 조절범위당 원하는 5-10 g이상이었다. 작업성능은 양 발효조의 위쪽 공간에 축적된 약간의 케이크에 의해서 분명히 영향받지 않았다.
실시예 12
추출효율을 표 29에 요약한 일련의 1L추출 작업에서 결정했다. 각 작업에서, 초산 에틸(1 L/L 발효 부피)을 사용해서 균사체로 부터 스테로이드를 추출했다. 각 작업마다 연속으로 2번의 추출을 행했다. RP-HPLC에 기초하여, 전체 스테로이드의 약 80%를 처음 추출에서 회수했고; 회수율을 제 2차추출에 의하여 95%로 증가시켰다. 3차 추출에서는 나머지 3%의 스테로이드를 회수했다. 나머지 2%는 상청액인 수상에서 소실되었다. 추출물을 진공을 사용해서 건조했으나 어떤 추가의 용매로 세척하지는 않았다. 공정 경제에 의해서 정당화될수 있다면 용매로 배출하는 것이 초기 추출로부터 회수율을 개선할 것이다.
1L육즙 규모에서 11α-수산화칸레논에 대한 추출/결정화 용매로서 메틸 이소부틸 케톤(MIBK) 및 톨루엔을 평가했다. 여기에 기술된 추출 프로토콜을 사용하여, MIBK 및 톨루엔을 추출효율 및 결정화 성능의 양면에서 초산에틸과 비교할수 있었다.
실시예 13
도 2 및 3의 공정의 평가의 일부로서, 각 공정중 발효 사이클의 초기에 제공된 칸레논기질에 대하여 입자경 연구를 행했다. 상기한 대로, 도 1의 공정으로 공급된 칸레논을 발효조 내로 주입하기 전에 미분쇄했다. 이 공정에서, 칸레논은 멸균하지 않았고, 원하지 않는 미생물의 성장은 항생물질의 첨가로 조절했다. 도 2 및 3의 공정에서는 반응전에 칸레논을 멸균했다. 도 2의 공정에서, 이것은 칸레논을 발효조내로 주입하기 전에 혼합기 내에서 달성된다. 도 3의 공정에서, 성장배지중 칸레논의 현탁액을 배치의 초기에 발효조 중에서 멸균했다. 여기에 논의된 것처럼, 멸균은 칸레논 입자의 응집을 유발하는 경향이 있다. 수성 성장배지중의 칸레논의 한정된 용해도 때문에, 공정의 생산도는 고체상으로부터의 물질 이동에 의존하며, 따라서 입자경 분포에 상호간 의존하는 고체입자기질에 의하여 제시된 계면적에 의존한다고 예상할수 있다. 이러한 고려는 초기에 도 2 및 3의 공정에 장애로서 작용했다.
그러나 도2의 블렌더 및 도 3의 발효탱크내에서의 교반이 도 2의 배치의 이동에 사용된 전단 펌프와 함께 응집물을 도 1의 공정에 공급되는 비멸균되고 미분쇄된 칸레논의 크기에 적당한 입자경범위로 분해한다는것을 발견했다. 이것은 각 세개의 공정중 반응사이클의 처음에 칸레논의 입자경 분포에 의해서 유용하다고 설명된다(표 30 및 도 4, 5참조).
표 30의 데이타로부터, 교반과 전단펌프가 멸균된 칸레논의 평균입자경을 비멸균된기질과 동일한 크기 순서로 감소하는데 효과적이었으나, 유의성 있는 크기의 차이가 비멸균된 기질의 측에 남아있다는 것을 알수 있을 것이다. 이 차이에도 불구하고, 반응성능 데이타는 사전멸균성능이 최소한 도 1의 공정과 같은 생산적임을 보였다. 더욱 유리한점이 입자경을 더 감소시키고 조절하기 위한 특정단계,예를 들면, 멸균된 칸레논의 습윤 분쇄 및/또는 멸균보다는 저온멸균에 의한것,에 의해 도 2의 공정에서 인식되었다.
실시예 14
종 배양균을 실시예 5에 기술된 방식으로 제조했다. 20시간에서, 접종물발효조내의 균사체는 40% PMV에서 과육질이었다. 이것의 pH는 5.4내지 14.8gpl 이고, 글루코스는 사용되지 않은채 남았다.
표 20에 보인 조성을 갖는 형질전환 성장배지(35L)를 제조했다. 공급배지의 제조중에, 글루코스와 효모 추출물을 따로 멸균하고, 30중량%글루코스와 10 중량%효모 추출물의 초기 농도로 단일 공급으로서 혼합했다.이 공급의 pH를 5.7로 맞추었다.
이 배지를 사용하여(표20), 2개의 생전환 작업을 칸레논의 11α-수산화칸레논의 전환에 대하여 행했다. 각 작업을 하나의 루시톤(Rushton)터빈 임펠러와 두개의 라이트닝(Lightnin') A315 임펠러를 포함하는 교반기를 구비한 60 L 발효조내에서 행했다.
발효조에 대한 성장배지의 초기량은 35L였다. 미분쇄 및 비멸균한 칸레논을 0.5 %의 초기농도로 가했다. 발효조내의 배지에 실시예 5에 기술된 방식대로 제조된 종 배양균에 2.5%의 초기 접종 비율로 접종했다. 온도 28℃, 200내지 500rpm의 교반속도, 0.5vvm의 통기속도 및 최소한 20부피%의 용해된 산소 레벨을 유지하기에 충분한 후압력에서 발효를 실행했다. 생산 작업중에 증식된 형질전환 배양균은 매우 작은 난형의 펠렛의 형태였다(약 1-2 mm). 칸레논 및 보충의 영양소를 실시예 1에 기술된 방식으로 발효조로 공급했다. 영양소 첨가를 매 4시간 마다 발효조중 육즙 리터당 3.4g 글루쿠스와 0.6g 효모 추출물의 비율로 행했다.
배치중에 글루코스 첨가를 행한 것 뿐 아니라, 본실시예의 각 작업중 정기적으로 통기속도, 교반 속도, 용해된 산소, PMV 및 pH를 표 31에 보였다. 표 32는 칸레논 전환 프로파일을 보인다. 작업 R11A는 46시간후에 종료됐고, 작업 R11B는 96시간동안 계속됐다. 후자의 작업에서, 93%의 전환이 81시간에 달성됐고; 더 한번의 공급첨가를 84시간에 행했고; 공급을 중단했다. 점도중 중요한 변화가 공급이 중단된 시간과 작업의 종료사이에 발생했다는 것을 유념하라.
실시예 15
다양한 배양균을 칸레논의 11α-수산화칸레논으로 생전환의 유효성에 대하여 일반적으로 상기한 방법에 따라 테스트했다.
아스퍼길루스 니거(Aspergillus niger) ATCC 11394, 리조푸스 아리주스(Rhizopus arrhizus) ATCC 11145 및 리조푸스 스토로니퍼(Rhizopus stolonifer) ATCC 6227b를 실시예 5에 기술된 방식으로 제조했다. 표 18에서 보인 조성을 갖는 성장배지(50ml)에 작동셀(cell)밴크로부터 포자현탁액을 접종시키고, 인큐베이터에 놓았다. 종 배양균을 26℃에서 20시간동안 발효에 의하여 인큐베이터 내에서 제조했다. 인큐베이터를 200rpm의 속도로 교반했다.
각 미생물의 종 배양균 2ml씩을 사용하여 표 18의 성장배지를 함유하는 형질전환플라스크에 접종했다. 각 배양균을 2개의 플라스크의 접종, 전부 6개를 위하여 사용했다. 칸레논(200mg)을 36℃에서 메탄올(4ml)에 녹이고, 이 용액의 0.5ml씩을 각 플라스크로 주입했다. 매일 50중량% 글루코스 용액의 첨가와 실시예 5에 기술된 조건하에서 생전환을 수행했다. 최초 72시간 경과후 각 형질전한 발효플라스크에서에서 균사체의 증식에 대한 다음의 관측이 행했다:
ATCC 11394 - 양호한 균질의 성장
ATCC 11145 - 처음 48시간에 양호한 성장,그러나 균사체가 덩어리로 뭉쳤고; 마지막 24시간에는 어떤 성장도 없었다.
ATCC 6227b - 양호한 성장;균사체 양 형성이 덩어리로 응집했다.
육즙의 샘플을 취하여 생전환의 정도에 대해 분석했다. 3일 경과후, ATCC 11394를 사용한 발효는 80 내지 90%의 11α-수산화칸레논으로의 전환을 제공했고; ATCC 11145는 50%의 전환; 및 ATCC 6227b은 80 내지 90%의 전환을 제공했다.
실시예 16
실시예 15에 기술된 방법을 사용하여,추가의 미생물을 칸레논의 11α-수산화칸레논으로 전환에 있어서 유효성을 테스트했다. 테스트된 미생물과 테스트 결과를 표 33에 보였다:
실시예 17
다양한 미생물을 9α-수산화칸레논으로 칸레논의 전환에 있어서 유효성에 대하여 테스트했다. 이 실시예의 작업을 위한 발효배지를 표 34에 보인대로 제조했다.
곰팡이를 대두가루배지와 케톤 효모 추출물 글루코스내에서 성장시켰고, 아티노마이세테스(atinomycetes) 및 유박테리아(eubacteria)를 대두가루(더하기 생체 형질전환을 위해 처방된 0.9중량% 포름산 나트륨) 및 뮬러-힌톤 육즙에서 성장시켰다.
출발배양균을 냉각 포자 군체(250 엘렌메이어 플라스크중 20 ml 대두가루)에 접종시켰다. 플라스크를 우유 여과지(milk filter) 및 바이오실드(bioshield)로 씌웠다. 출발 배양균(24 혹은 48시간 경과)을 사용해서 -10%내지 15% 단면적으로- 대사 배지에 접종했고(역시 250ml엘렌마이어 플라스크중20 ml), 후자를 형질전환반응을 위한 스테로이드 기질의 첨가전에 24 내지 48시간동안 인큐베이션했다.
칸레논을 메탄올(20 mg/ml)에 용해/현탁시키고, 멸균여과하고, 배양균에 0.1mg/ml의 최종농도로 가했다. 모든 형질전환 발효 플라스크를 실온, 26℃ 및 60%의 습도에서 250rpm으로 교반했다.
생체형질전환결과물을 기질의 첨가후 5시간 및 48시간 또는 24시간에 수거했다. 수거는 발효조 플라스크에 염화 메틸렌 또는 초산 에틸(23ml)의 첨가와 함께 시작했다. 그후 플라스크를 2분간 교반하고,각 플라스크의 내용물을 50 ml원뿔형의 관에 부었다. 상을 분리하기 위하여, 관를 실온에서 20분간 4000rpm으로 원심분리 했다. 각 관로부터 유기상을 20ml 보로실리케이트 유리 바이알로 옮겨서 빠른 vac에서 증발시켰다. 바이알을 밀봉하고 -20℃에서 저장했다.
구조 결정을 위한 물질을 얻기 위하여, 교반 플라스크 발효의 수를 25로 증가시켜서 생체전환을 500ml까지 올렸다. 수거의 시간에(기질의 첨가후 24 또는 48시간), 초산에틸을 각 플라스크에 개별적으로 가하고, 플라스크를 밀봉하여 다시 교반기에 20분간 두었다. 플라스크의 내용물을 폴리프로필렌 병에 부어 원심분리하여 상을 분리하거나, 또는 중력에 의하여 상이 분리되는 분리 펀넬에 부었다. 유기상을 건조하고, 반응혼합물에 함유된 스테로이드의 조 추출물을 생산했다.
반응생산물을 우선 형광 입혀진 평판(254nm)의 실리카 겔(250μm)상에서 박막 크래마토그래피에 의해 분석했다. 초산 에틸(500μL)를 반응 혼합물로부터의 건조된 초산에틸 추출물을 함유하는 각 바이알에 가했다. 추가의 분석을 고성능 액체 크로마토그래피 및 질량 분광법에 의하여 행했다. TLC 판을 95:5 v/v 클로로포름/메탄올 용매혼합물내에서 전개시켰다.
추가의 분석을 고성능 액체 크로마토그래피 및 질량 분광법에 의하여 행했다. 밀리니움 소프트웨어, 광다이오드 배열 검출기 및 자동 시료채취기를 구비한 워터스(waters) HPLC를 사용했다. 역상 HPLC는 워터스 NOVAPAK C-18( 4μm 입자경) RadialPak 4 mm 카트리지를 사용했다. 25분의 선형 용매구배가 물:아세토니트릴(75:25)에서 개시되어 물:아세토니트릴(25:75)에서 종결된 칼럼과 함께 시작했다. 그후에 초기 조건으로 칼럼을 재생하기 전에 100%아세토니트릴에서 3 분구배 및 이소크래틱으로 4 분동안 세척했다.
LC/MS에 대하여, 초산암모늄을 2 nM의 농도로 아세토니트릴상과 수상 양자에 가했다.크래마토그래피는 유의성있게 영향받지 않았다. 칼럼으로부터의 용리액을 22:1로 분리하고 물질의 주류를 PDA 검출기로 도입하였다.
물질의 나머지 4.5%는 Sciex API III 질량분광기의 전기스프레이 이온화 챔버로 도입하였다. 질량 분광법을 양성 모드에서 완수했다. HPLC상 PDA검출기로부터의 아날로그 데이타 라인이 단파장 크로마토그램을 UV 및 MS데이타의 공동분석을 위한 질량 분광기로 옮겼다.
질량 분광 파쇄 형태는 수산화된 기질중으로부터 분류하는데 유용하다는 것으로 판명되었다. 2가지 기대되는 수산화된 칸레논, 11α-수산화 및 9α-수산화,은 진단에 사용될수 있는 일정한 방식으로 다른 주파수에서 물을 배출했다. 또한, 9α-수산화칸레논은 11α-수산화칸레논보다 암모늄 부가물을 더 쉽게 형성한다. 칸레논 발효에 대한 TLC, HPLC/UV 및 LC/MS데이타의 요약을 표 35에 나타냈고, 테스트된 미생물의 데이타가 칸레논의 9α-수산화칸레논의 생전환에서 효과적임을 보였다. 이것들 중, 바람직한 미생물은 코리네스포라 카시콜라(Corynespora cassiicola)ATCC 16718이다.
실시예 18
다양한 배양균을 상기한 방법에 따라 안드로스텐디온의 11α-수산화안드로스텐디온으로의 생전환에서의 유효성에 대해 테스트했다.
아스퍼길루스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus) NRRL 405 (ATCC 18500); 아스퍼길루스 니거(Aspergillus niger) ATCC 11394; 아스퍼길루스 니두란스 (Aspergillus nidulans)ATCC 11267; 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae) ATCC 11145; 리조푸스 스토로니퍼(Rhizopus stolonifer) ATCC 6227b; 트리코테시움 로제움(Trichothecium roseum)ATCC 12519 및 ATCC 8685의 각각의 작동셀(cell) 밴크를 실시예 4에 기술된 방식으로 제조했다. 표 18에서 보인 조성을 갖는 성장배지(50ml)에 작동셀(cell)밴크로부터의 포자의 현탁액을 접종시키고 인큐베이터에 놓았다. 종 배양균을 26℃에서 약 20시간동안 발효에 의하여 인큐베이터내에서 제조했다. 인큐베이터를 200 rpm의 속도로 교반했다.
각 미생물의 종 배양균의 2ml씩을 사용해서 표 15의 성장배지 (30ml)를 함유하는 형질전환플라스크에 접종했다. 각 배양균을 2개의 플라스크에 접종, 전부 16개를 위하여 사용했다. 안드로스텐디온(300mg)을 36℃에서 메탄올(6ml)에 용해시키고, 이 용액 0.5ml씩을 각 플라스크로 주입했다. 생전환을 48시간동안 실시예 6에 기술된 조건하에서 수행했다. 48시간 후에 육즙의 샘플을 모아서 실시예 17과 마찬가지로 초산에틸로 추출했다. 초산 에틸을 증발에 의하여 농축시키고, 샘플을 박막 크래마토그래피에 의하여 분석하여 11α-수산화-안드로스텐디온 표준물질 (Sigma Chimical Co., St. Louis)과 유사한 크로마토그래피 유동성을 갖는 물질이 존재하는지 결정했다. 그 결과를 표 36에 보였다. 양성결과를 "+"로 표시했다.
표 36의 데이타는 열거된 각 배양균이 11α-수산화안드로스텐디온 표준물질과 동일한 Rf값을 갖는 안드로스텐디온으로부터 화합물을 생산하는 능력이 있었다는 것을 나타낸다.
아스퍼길루스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus) NRRL 405(ATCC 18500)상기된 것과 동일한 방법으로 다시 테스트했고, 배양균을 분리하고, 용매로 메탄올을 사용하여 정상 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제했다. 단편을 박막 크래마토그래피에 의하여 분석했다. TLC 평판은 와트만 K6F 실리카 겔 60Å, 10 x 20 크기, 250μ두께였다. 용매혼합물은 클로로포름:메탄올, 95:5, v/v였다. 결정화된 물질 및 11α-수산화안드로스텐디온 표준물질을 모두 LC-MS 및 NMR 분광법에 의해 분석했다. 양 화합물은 유사한 프로파일과 분자량을 산출했다.
실시예 19A
다양한 미생물을 실시예 17 및 18에 상기한 방법에 의하여 안드로스텐디온의 11β-수산화안드로스텐디온으로의 생전환에서의 유효성에 대하여 테스트 했다.
아스퍼길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) ATCC 26934, 아스퍼길루스 니거(Aspergillus niger) ATCC 16888 및 ATCC 26693, 에피코쿰 오리자에(Epicoccum oryzae) ATCC 7156, 쿠바라리아 루나타(Curvularia lunata) ATCC 12017, 쿠닝하멜라 블라케스리아나(Cunninghamella blakesleeana) ATCC 8688a, 및 피토마이세스 아트로-올리바세우스(Pithomyces atro-olivaceus) IFO 6651의 각각의 배양균을 실시예 17에 기술된 방식으로 성장시켰다. 성장 및 발효배지(30ml)는 표 34에 보인 조성을 갖는다.
상기 열거된 미생물에 의한 안드로스텐디온의 11β-수산화를 실시예 17 및 18에 기술된 동일한 물질확인의 방법을 사용하여 분석했다. 그 결과를 표 19 A-1에 보였다.
(표 19A-1)
표 19A-1에서, "+"는 양성결과, 즉 박막 크로마토그래피에서 예상되는 Rf 및 LC/MS상에 의존한 대략의 정확한 분자량을 나타낸다.
이 결과는 열거된 미생물들이 안드로스텐디온의 11β-수산화를 수행할수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 19B
다양한 미생물들을 멕스레논의 11β-수산화멕스레논으로의 전환에서 유효성에 대해 테스트했다. 본 실시예를 위한 발효배지를 표 34에 기술된대로 제조했다.
발효 조건 및 분석방법은 실시예 17의 그것과 동일했다. TLC 판 및 용매계는 실시예 18에 기술된 것과 같다. 크래마토그래피 분석의 원리는 다음과 같다:
11α-수산화멕스레논 및 11α-수산화칸레논은 같은 크래마토그래피 유동성을 갖는다. 11α-수산화칸레논 및 9α-수산화칸레논은 11α-수산화안드로스텐디온 및 11β-수산화안드로스텐디온과 동일한 유동성 형태를 보인다. 따라서, 11α-수산화멕스레논은 9α-수산화칸레논과 동일한 유동성을 가져야 한다. 따라서, 성장배지로부터 추출된 화합물은 표준물질로서 9α-수산화칸레논에 대하여 전개한다. 그 결과를 표 36에 보였다.
이 데이타는 이 표에 열거된 대다수의 생물들이 멕스레논으로부터 11β-수산화멕스레론과 같은 또는 유사한 생산물을 생산한다는 것을 제안한다.
실시예 19C
다양한 미생물들을 멕스레논의 11α-수산화멕스레논, Δ1,2멕스레논, 6β-수산화멕스레논, 12β-수산화멕스레논 및 9α-수산화멕스레논으로의 전환에 있어서 유효성에 대하여 테스트하였다. 멕스레논은 본 명세서에 참고로 합체된 Weier의 미국 특허 No. 3,787,396 및 R.M.Weier등의 J.Med.Chem.,Vol.18,pp.817-821(1975)에 나타난 방식대로 제조할수 있다. 발효배지를 멕스레논이 포함되었다는 것만 제외하고는 실시예 17에 기술된대로 제조했다. 발효조건은 실시예 17에 있는 그것과 실질적으로 동일했고; 분석방법도 또한 실시예 17 및 18에 기술된 것과 같았다. TLC 판 및 용매계는 실시예 17 및 18에 기술된 대로 였다.
테스트된 미생물 및 얻은 결과를 표 19C-1에 보였다.
(표 19C-1)
표 19C-1에서, "+"는 양성결과, 즉 박막 크래마토그래피에서 예상된 Rf 및 HPLC에서 예상된 보유시간을 나타낸다. m/z 417:399은 417 분자(수산화멕스레논)와 399 분자(멕스레논)의 최고 길이비를 나타낸다. 표준물질은 m/z 417 대 m/z 399 에 대한 최고 길이의 비 10:1을 갖는다. 베아우베리아 바시아나(Beauveria bassiana) ATCC 13144로부터 얻은 생산물을 인큐베이션 혼합물로부터 분리하여 NMR로 분석하고, 그것에 의한 구조 프로파일이 11α-수산화멕스레논임을 확인했다. 유추하여, 표 19C-1에 열거된 다른 미생물로부터 얻은 생산물도 역시 11α-수산화멕스레논이라고 추정했다.
(표 19C-2)
표 19C-2에서, "+"는 양성결과, 즉 박막 크래마토그래피에서 예상된 Rf 및 HPLC에서 예상된 보유시간을 나타낸다.
박테리움 시클로-옥시단스(Bacterium cyclo-oxydans)ATCC 12673으로부터 얻은 물질을 인큐베이션 혼합물로부터 분리해서 NMR에 의하여 분리했고, 그것에 의한 구조 프로파일이 Δ1,2멕스레논임을 확인했다. 유추하여, 표 19C-2에 열거된 다른 미생물로부터 얻은 생산물도 역시 Δ1,2멕스레논이라고 추정했다.
6β- 및 12β-수산화멕스레논의 생산
모르티엘라 이사벨라(Mortierella isabella) ATCC 42613을 멕스레논의 존재하에서 실시예 17과 동일하게 성장시켰다. 발효 생산물을 단리하고 섬광 크로마토그래피에 의하여 정제했다. 정제한 생산물을 실시예 17 및 18과 동일한 LC/MS, 프로톤 NMR 및 13C NMR에 의해 분석했다. 데이타는 생산물이 6β- 및 12β-수산화멕스레논을 포함한다는 것을 나타낸다.
(표 19C-3)
표 19C-3에 열거된 미생물을 멕스레논의 존재중에서 실시예 17과 같은 조건하에서 성장시켰다. 발효물을 실시예 17 및 18과 같이 TLC 및 LC/MS에 의해 분석했다. "+"는 양성결과, 즉, 박막 크래마토그래피에서 기대된 Rf 및 HPLC에서 기대된 보류시간을 나타낸다. 데이타는 생산물이 9α-수산화멕스레논을 포함한다고 제안한다.
실시예 19D
칸레논의 Δ9,11-칸레논의 전환에 있어 유효성에 대하여 다양한 미생물들을 테스트했다. 발효 배지 및 성장 조건은 칸레논이 배지에 포함된것만 제외하면 실시예 17과 본질적으로 같았다. 분석방법은 실시예 17 및 18에 기술된 것과 같았다. 미생물과 결과를 아래 표 19D-1에 보였다.
(표 19D-1)
발효물을 실시예 17 및 18과 같이 TLC 및 LC/MS에 의해 분석했다. "+"는 양성결과, 즉, 박막크래마토그래피에서 예상되는 Rf 및 HPLC에서 예상되는 보유시간을 나타낸다.
코모모나스 테스토스테로니(Comomonas testosteroni) ATCC 11996로부터 얻은 생산물을 성장배지로부터 단리하고, UV 분광법에 의하여 분석했다. 분광 프로파일은 Δ9,11-칸레논의 존재를 확인한다. 유추하여, 표 19D-1에 열거된 다른 미생물로부터 얻은 생산물도 역시 Δ9,11-칸레논이라고 추정했다.
실시예 20A
반응식 1: 단계 1: 방법 A: 5'R(5'α), 7'β-20'-아미노헥사데카히드로-11'β-히드록시-10'a,13'α-디메틸-3'.5-디옥소스피로[푸란-2(3H),17'α(5'H)-[7,4]메테노[4H[시클로펜타[a]페난트렌]-5'-카보니트릴의 제조.
61.2L(57.8kg)의 DMF와 그 다음으로 23.5kg의 11-히드록시칸레논 1을 교반하면서 50겔론의 글라스-라인 반응기에 채웠다. 7.1kg의 염화리튬을 이 혼합물에 첨가하였다. 20분간 교반하고 16.9kg의 아세톤시아노히드린과 그 다음으로 5.1kg의 트리에틸아민을 혼합물에 채웠다. 85℃로 가열하고 이 온도에서 13-18시간동안 유지시켰다. 반응 후 353L의 물과 그 다음으로 5.6kg의 중탄산나트륨을 첨가하였다. 0℃로 냉각하고 200겔론의 글라스-라인 반응기로 옮겨 130kg의 6.7% 차아염소염 나트륨으로 천천히 식혔다. 산물을 여과하고 3×40L의 물로 세척하여 21.4kg의 에나민 산물을 얻었다.
H1 NMR (DMSO-d6): 7.6 (2H, bd), 4.53 (1H, d, J=5.9), 3.71 (1H, m), 3.0-1.3 (17H, m), 1.20 (5H, m), 0.86 (3H, s), 0.51 (1H, t, J=10)
실시예 20B
7α-시아노-11α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-21-카르복실산, γ-락톤
의 제조
50.0g의 11-히드록시칸레논 및 150.0mL의 디메틸아세트아미드를 기계적 교반기, 능축기, 열전대 및 가열맨틀이 설치된 깨끗하고 건조한 삼-구 플라스크에 넣고, 16.0mL의 황산용액(50.0mL의 황산(98.7% Baker grade)을 50.0mL의 물과 혼합하여 제조된)을 이 혼합물에 넣었다. 그 후 15.6g의 시안화나트륨과 27.0mL의 물로 이루어진 시안화나트륨 용액을 넣었다.
얻어진 혼합물을 80℃에서 7시간동안 가열하고, 전환도를 TLC 또는 HPLC에 의해 주기적으로 확인하였다. 약 7시간 후, 혼합물의 HPLC는 7-시아노 화합물의 존재를 나타내었다. 혼합물을 밤새 교반하고 실온으로(약 22℃) 냉각하였다. 200mL의 물과 이어서 200mL의 염화메틸렌을 혼합물에 넣고 얻어진 두개의 상의 혼합물을 교반한 후 분리시켰다. 수층은 겔이었다. 100mL의 중탄산나트륨용액을 수층에 넣어 겔을 분열시키려 하였지만 잘 되지 않았다. 그런 다음 수층을 버렸다.
분리된 염화메틸렌 층을 100mL의 물로 세척하고 얻어진 두개의 상의 혼합물을 교반하였다. 다음으로 상을 분리시켜 분리된 염화메틸렌 층을 200g의 실리카 겔(Aldrich 200-400메쉬, 60)을 통하여 여과하였다. 여과물을 물흡인기를 사용하여 감압하에 45℃로 농축시켜 건조한 상태로 만들어 약 53.9g의 원고체산물을 제공하였다. 원고체산물을 50mL의 염화메틸렌에 용해시키고 분별깔때기에서 40mL의 4N 염산으로 처리하여 두개의 상을 분리시켰다. 염화메틸렌층을 50mL의 물로 세척하였다. 조합된 수층을 50mL의 염화메틸렌으로 추출하고 조합된 염화메틸렌층을 황산나트륨으로 건조시켜 11α-히드록시칸레논 및 산물 7α-시아노-11α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-21-카르복실산, γ-락톤의 혼합물인 45g의 고체를 제공하였다.
산물의 샘플을 HPLC(컬럼:25cm×4.6mm, 5μ알티마 C18LL); 용매 구배: 용매 A=물/트리플루오로아세트산=99.9/0.1, 용매 B=아세토니트릴/트리플루오로아세트산 = 99.9/0.1, 유속=1.00mL/분, 구배=65:30(v/v)(A:B--초기), 35:65(v/v)(A:B--20분 후), 10:90 (v/v)(A:B--25분 후); 238nm의 λmax를 나타내는 다이오드 어레이 디텍터에 의해 분석하였다.
반응혼합물을 다음과 같은 조건으로 HPLC-NMR에 의해 분석하였다:1mL/분의 유량으로 25분에 걸쳐 75% D2O, 25% 아세토니트릴에서 25% D2O, 75% 아세토니트릴까지의 용매구배를 이용하여 HPLC--컬럼:Zorbax RX-C8 (25cm×4.6mm, 5μ);1H NMR(WET 용매 서프레션을 사용하여 얻어진): 5.84(s,1H), 4.01(m,1H), 3.2(m,1H), 2.9-1.4 (m, 아세토니트릴의 용매 서프레션으로 인함을 의미하지 않는 정수), 0.93-0.86(s, 오버랩핑 3H, 및 t,2H).
실시예 20C
5β,7α-디시아노-17-히드록시-3-옥소-17α-프레그난-21-카르복실산, γ-락톤
의 제조
102g(0.3몰)의 17-히드록시-3-옥소-17α-프레그나-4,6-디엔-21-카르복실산, γ-락톤(칸레논)을 3리터, 삼구,원형바닥 플라스크에서 46.8g(0.72몰)의 시안화칼륨, 78,6mL(1.356몰)의 아세트산, 및 600mL의 메탄올로 슬러리시켰다. 64.8mL(0.78몰)의 피롤리딘을 혼합물에 넣고 조합된 슬러리물을 환류가열키고(64℃), 약 1.5시간동안 유지시켰다. 슬러리물의 온도를 10분에 걸쳐 냉각조로 25℃ 내지 30℃로 낮추었다. 120mL의 농염산을 냉각동안 서서히 첨가하여 황갈색 고체를 침전시켰다.
혼합물을 25℃ 내지 30℃ 에서 1.5시간동안 교반한 후, 30분내에 추가로 500mL의 물을 넣었다. 혼합물을 얼음조에서 5℃로 냉각하고 100mL의 수용성 9.5M 수산화나트륨(0.95몰)을 넣어 pH를 3 내지 5.5(pH스트립을 사용하여 모니터한다)로 조절하였다. 과잉 시아니드를 가정용 표백제를 넣어 제거하였다. 음성 요오드화전분 시험을 달성하기 위해 25mL(0.020몰)를 첨가하였다. 냉각 혼합물(10℃)을 여과하고 헹굼물이 중성pH를 나타낼 때까지(pH 스트립)고체물을 물로 세척하였다. 고체물을 60℃로 건조시켜 항량 111.4g을 얻었다.
분리된 고체는 Fisher Johns 블럭상에 244℃ 내지 246℃온도에서 녹았다. 고체를 함유하는 메탄올용액은 210 내지 240nm의 UV 영역에서 어떤 흡광도를 나타내지 않았다. IR (CHCl3)cm-12222(시아니드), 1775(락톤), 1732(3-케토). 1H NMR(피리딘 d5) ppm 0.94(s,3H), 1.23(s,3H).
실시예 21A
반응식 1: 단계 2: 4'S(4'α),7'α-헥사데카히드로-11'α-히드록시-10'β, 13'β-디메틸-3',5,20'-트리옥소스피로[푸란-2(3H),17'β-[4,7]메타노[17H]시클로펜타[a]페난트렌]-5'β(2'H)-카보니트릴의 제조
50kg의 에나민 2, 약 445L의 0.8N 묽은염산 및 75L의 메탄올을 200겔론 글라스-라인 반응기 속에 채웠다. 혼합물을 5시간동안 80℃로 가열하고, 2시간동안 0℃로 냉각하였다. 고체산물을 여과하여 36.5kg 의 건조산물 디케톤을 얻었다.
H1 NMR (DMSO-d6): 4.53 (1H, d, J=6), 3.74 (2H, m), 2.73 (1H, dd, J=14, 7) 2.65-2.14 (8H, m), 2.05 (1H, t, J=11), 1.98-1.71 (4H, m), 1.64 (1H, m), 1.55 (1H, dd, J=13, 5), 1.45-1.20 (7H, m), 0.86 (3H, s).
실시예 21B
반응식 1: 단계 1 및 2: 11α-히드록시칸레논으로 부터 4'S(4'α),7'α-헥사데카히드로-11'α-히드록시-10'β,13'β-디메틸-3',5,20'-트리옥소스피로[푸란-2(3H),17'β-[4,7]메타노[17H]시클로펜타[a]페난트렌]-5'β(2'H)-카보니트릴의 인 시츄 제조
냉각 능축기, 기계적 교반기, 가열맨틀 및 콘트롤러, 및 깔때기가 설치된 반응기 속으로 실시예 1의 방법과 같이 제조된 100g(280.54mmol)의 11-히드록시칸레논에 이어서 300mL의 디메틸아세트아미드(Aldrich)를 채웠다. 혼합물을 11-히드록시칸레논이 용해될 때까지 교반하였다. 얻어진 혼합물의 온도를 10℃ 내지 15℃로 상승시키는 31.5mL의 50% 황산(Fisher)을 이 혼합물에 첨가하였다. 그런 다음 54mL의 탈이온수에 31.18g(617.20mmol)(Aldrich)의 시안화나트륨을 용해시켜 제조한 시안화나트륨용액을 2 내지 3분에 걸쳐 11α-히드록시칸레논 혼합물에 첨가하였다. 얻어진 혼합물의 온도는 시안화나트륨용액의 첨가 후 약 20℃ 내지 25℃로 상승하였다.
혼합물을 80℃로 가열시키고 이 온도에서 2-3시간동안 유지시켰다. 일단 11α-히드록시칸레논의 에나민으로의 전환반응을 나타내는 HPLC 분석은 대체로 완료됨을 나타내었고(98% 전환 이상), 열원을 제거하였다. 혼합물에 포함된 에나민을 분리하지 않고, 148mL의 50% 황산을 추가로 3-5분에 걸쳐 첨가하였다. 그 다음 10분에 걸쳐 497mL의 탈이온수를 혼합물에 넣었다.
혼합물을 102℃로 가열시키고 혼합물로부터 약 500g의 증류물이 제거될 때까지 그 온도에서 유지시켰다. 반응/증류 동안, 500mL의 탈이온수를 네 개로 분리된 125mL 부분으로 혼합물에 넣었다. 각 부분은 당량의 증류물(약 125mL)이 제거된 후에 혼합물에 넣었다. HPLC 분석이 에나민에서 디케톤으로의 가수분해 반응이 대체로 끝났음(약 98% 이상)을 나타낼 때, 혼합물을 20분에 걸쳐 약 80℃로 냉각하였다.
혼합물을 유리깔때기를 통하여 여과하였다. 남은 산물을 제거하기 위하여 반응기를 1.2L의 탈이온수로 헹구었다. 여과기 위의 고체를 거의 당량(약 0.4L)의 헹굼물을 사용하여 3회 세척하였다. 1L의 메탄올과 탈이온수(1:1 v/v) 용액을 반응기내에서 제조하고 여과물을 500mL의 이 용액으로 세척하였다. 그런 다음, 여과물을 남아있는 500mL의 메탄올/물 용액으로 두 번째 세척하였다. 진공을 깔때기에 걸어 여과물을 이송을 위해 충분히 건조시켰다. 여과물을 진공하에 16시간동안 건조시킬 드라이 오븐에 옮겨 84g의 건조산물 디케톤,4'S(4'α),7'α-헥사데카히드로-11'α-히드록시-10'β,13'β-디메틸-3',5,20'-트리옥소스피로[푸란-2(3H),17'β-[4,7]메타노[17H]시클로펜타[a]페난트렌]-5'β(2'H)-카보니트릴을 얻었다. HPLC 정량은 목적한 디케톤의 94%를 나타내었다.
실시예 22
반응식 1: 단계 3A: 방법 A: 메틸 히드로겐 11α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 제조.
4-구 5L 바닥 플라스크에 기계적 교반기, 질소유입튜브를 갖는 균압 첨가 깔때기, 온도계 그리고 버블러를 갖는 능축기를 설치하였다. 버블러를 티곤튜빙을 통해 두 개의 2-L 트랩으로 연결시키고, 그 처음의 것을 두번째 트랩(1L의 농차아염소산나트륨)내 물질이 반응베슬속으로 역유입되는 것을 막기 위하여 비워 두었다. 디케톤 3 (79.50g; [무게는 순도로 보정되지 않았으며, 순도는 85%])을 3L 메탄올의 플라스크에 넣었다. 25%의 메탄올성 나트륨메톡시드 용액(64.83g)을 깔때기에 두고 10분에 걸쳐 질소하에 교반하면서 적하하였다. 적하를 마친 후, 오랜지색에 가까운 노란색의 반응혼합물을 20시간동안 환류가열하였다. 이 기간 후, 167mL의 4N HCl을(주의: 여기서 HCN 발생!) 첨가깔때기를 통해 적하하여 정지된 환류 반응 혼합물을 얻는다. 반응 혼합물은 바랜 금색 오랜지색으로 가벼워졌다. 그 다음 능축기를 테이크-오프헤드로 대체시키고 1.5L의 메탄올을 증류로 제거시키고 증류속도에 맞추어 1.5L의 물을 깔때기를 통해 플라스크에 동시에 가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각하고 2.25L의 염화메틸렌 분취량으로 2회 추출하였다. 조합된 추출물을 750mL의 차가운 포화 NaCl 용액, 1N NaOH 그리고 다시 포화 NaCl의 분취량으로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 밤새 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하여 진공속에서 부피 ~250mL까지 줄인다. 톨루엔(300mL)을 첨가하고 남아있는 염화 메틸렌을 백색고체인 산물이 플라스크의 벽에 형성되기 시작할 시간동안 감압하에 스트립하였다. 플라스크의 내용물을 밤새 냉각시키고 고체를 여과에 의해 제거하였다. 250mL의 톨루엔으로 세척하고 250mL의 에테르 분취량으로 2회 세척하고 진공깔때기 상에서 건조시켜 58.49g의 백색의 고체를 얻었고 이는 HPLC에 의하면 순도 97.3% 이었다. 모액을 농축시켜 부가의 6.76g의 순도 77.1% 산물을 얻었다. 순도로 조절한 총 수율은 78% 이었다.
H1 NMR(CDCl3):5.70(1H,s), 4.08(1H,s), 3.67(3H,s), 2.9-1.6(19H,m), 1.5-1.2(5H,m), 1.03(3H,s).
실시예 23
반응식 1: 단계 3B: 메틸수소 11α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α, 21-디카르복실레이트, γ-락톤의 메틸수소 17α-히드록시-11α-(메틸술포닐)옥시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤으로의 전환.
5-L 4구 플라스크를 상기 예와 같이 설치하되 단, 버블러 이외는 어떤 트랩핑 시스템도 설치되지 않는다는 것이 다르다. 정량 138.70g의 히드록시에스테르를 이어 1425mL의 염화메틸렌을 질소하에 교반하면서 플라스크에 첨가하였다. 반응 혼합물을 염/얼음조를 사용하여 -5℃로 냉각하였다. 메탄술포닐클로리드(51.15g, 0.447몰)을 빠르게 가하고, 이어 첨가로 225mL 염화메틸렌중 트리에틸아민(54.37g)을 천천히 적하하였다. ~30분을 요구하는 적하과정을 반응온도가 약 5℃로 상승하지 않도록 조절하였다. 적하 후 교반을 1시간 동안 계속하였고 반응 내용물을 12-L의 분별깔때기에 옮기고, 이에 2100mL의 염화메틸렌을 첨가하였다. 용액을 차가운 1N HCl, 1N NaOH, 및 수용성 포화 NaCl용액의 각 분취량 700mL로 연속적으로 세척하였다. 수용성세척제를 조합하고 3500mL 염화메틸렌으로 역추출하였다. 모든 유기세척제를 9-L 저그에 조합하고 이에 500g의 중성 알루미나, 활성급II, 및 500g의 무수황산나트륨을 첨가하였다. 저그의 내용물을 30분간 잘 섞은 후 여과시켰다. 여과물을 진공건조시켜 점착성의 노란 발포체를 얻었다. 이를 350mL의 염화메틸렌에 용해시키고 1800mL의 에테르를 교반하면서 적하하였다. 적하속도를 에테르의 약 1/2를 30분에 걸쳐 첨가하도록 조절하였다. 약 750mL를 첨가한 후, 산물은 결정성 고체로 분리되기 시작하였다. 남아있는 에테르를 10분내에 첨가하였다. 고체를 여과에 의해 제거하고 필터케익을 2L의 에테르로 세척하고 밤새 50℃로 진공오븐에서 건조시켜 144.61g(88%)의 거의 백색고체, m.p. 149℃-150℃를 얻었다. 이런 방식으로 제조된 물질은 전형적으로 HPLC(영역%)에 의해 순도 98-99% 이다. 한번 실행으로 녹는점 153℃-153.5℃, HPLC 영역으로 결정된 순도 99.5%를 갖는 물질을 얻었다.
H1 NMR(CDCl3):5.76(1H,s), 5.18(1H,dt), 3.68(3H,s), 3.06(3H,s),2.85(1H,m) 2.75-1.6(19H,m), 1.43(3H,s), 1.07(3H,,s).
실시예 24
반응식 1: 단계 3C: 방법 A: 7-메틸 수소 17α-히드록시-3-옥소프레그나-4,9(11)-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 제조.
1-L 4구 플라스크를 두번째 실시예와 같이 설치하였다. 포름산(250mL) 및 무수아세트산(62mL)을 질소하에 교반하면서 플라스크에 첨가하였다. 포름산칼륨 (6.17g)을 첨가하고 반응혼합물을 기름조에서 내부온도 40℃(후에 보다 좋은 결과로 이 과정을 70℃에서 반복하였다)가 될 때까지 16시간 동안 가열하였다. 16시간 후, 메실레이트를 첨가하여 내부온도를 100℃로 증가시켰다. 가열 및 교반을 2시간동안 계속하고, 그 후 용매를 진공에서 로타밥으로 제거하였다. 나머지를 15분동안 500mL의 얼음물로 교반한 후, 500mL 분취량의 에틸아세테이트로 2회 추출하였다. 유기상을 조합하여 포화 염화나트륨용액(2회), 1N 수산화나트륨용액, 및 다시 포화염화나트륨의 차가운 250mL 분취량으로 연속적으로 세척하였다. 그 다음 유기상을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 진공건조시켜 노란색에 가까운 백색의 발포체를 얻었고 이는 스파툴라로 가볍게 두드렸을 때 유리질 물질로 미분쇄되었다. 형성된 분말 14.65g은 82.1% 7-메틸수소 17α-히드록시-3-옥소프레그나-4,9(11)-디엔 -7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤; 7.4% 7-메틸수소 17α-히드록시-3-옥소프레그나-4, 11-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤; 및 5.7% 9α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실산, 비스(γ-락톤) 의 혼합물로 분석되었다(HPLC 영역 %에 의해).
H1 NMR(CDCl3):5.74(1H,s), 5.67(1H,m), 3.61(3H,s), 3.00(1H,m) 2.84(1H, ddd, J=2,6,15), 2.65-2.42(6H,m), 2.3-2.12(5H,m), 2.05-1.72(4H,m), 1.55-1.45 (2H,m), 1.42(3H,s), 0.97(3H,s).
실시예 25
반응식 1: 단계 3C : 방법 B: 메틸수소 17α-히드록시-3-옥소프레그나-4,9 (11)-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 제조.
5L 4구 플라스크를 상기 예와 같이 설치하고 228.26g 아세트산 및 41.37g 아세트산나트륨을 질소하에 교반하면서 첨가하였다. 기름조를 사용하여, 혼합물을 내부온도 100℃가 될 때까지 가열하였다. 메실레이트(123.65g)를 첨가하고, 가열을 30분동안 계속하였다. 이 시간이 다할 때, 가열을 멈추고 200mL의 얼음물을 첨가하였다. 온도는 40℃로 떨어졌고 교반을 1시간동안 계속하고, 그 후 반응혼합물을 5L의 교반 플라스크내의 1.5L 의 냉수속으로 서서히 부었다. 산물은 점착성 기름으로 분리되었다. 그 기름을 각각 차가운 1L 에틸아세테이트에 용해시키고 각각 1L의 포화염화나트륨 용액, 1N 수산화나트륨, 및 마지막으로 다시 포화염화나트륨으로 세척하였다. 유기상을 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 여과물을 진공건조시켜 점착성 기름으로 쇠약해지는 발포체를 얻었다. 이를 에테르로 얼마간 연마시키고 결과적으로 고체화하였다. 고체를 여과하고 여분의 에테르로 세척하여 79.59g의 노란색에 가까운 백색고체를 얻었다. 이는 70.4%의 목적한 Δ9,11 엔에스테르 6, 12.3%의 Δ11,12 엔에스테르 8, 10.8%의 7-α,9-α-락톤 9 및 5.7% 미반응 5 로 구성되어 있다.
실시예 26
반응식 1: 단계 3D: 방법 A: 메틸수소 9,11α-에폭시-17α-히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 합성.
4구의 자켓이 있는 500mL 반응기에 기계적 교반기, 능축기/버블러, 온도계 와 질소유입튜브를 갖는 첨가깔때기를 설치하였다. 반응기를 질소하에 교반하면서 83mL 염화메틸렌중 8.32g의 원엔에스테르로 채웠다. 이에 4.02g 이염기성 인산칼륨에 이어 12mL의 트리클로로아세토니트릴을 첨가하였다. 외부의 냉각수를 반응기 자켓을 통해 흘려보내어 반응혼합물을 8℃로 냉각하였다. 첨가깔때기에 36mL의 30% 수산화수소를 10분에 걸쳐 첨가하였다. 초기의 바랜 노란색의 반응혼합물은 첨가 후 거의 무색으로 변하였다. 반응 혼합물은 첨가 및 밤새 계속된 교반동안(총 23시간) 9±1℃로 남아있었다. 염화메틸렌(150mL)을 반응혼합물에 넣고 모든 내용물을 ~250mL의 얼음물에 넣었다. 이를 150mL의 염화메틸렌 분취량으로 3회 추출하였다. 조합된 염화메틸렌 추출물을 400mL 차가운 3% 아황산나트륨 용액으로 세척하여 어떤 남아있는 과산화수소도 분해하였다. 이어서 330mL 차가운 1N 수산화나트륨 세척, 400mL 차가운 1N 염산 세척, 마지막으로 400mL의 브린으로 세척 하였다. 유기상을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 필터케익을 80mL의 염화메틸렌으로 세척하였다. 용매를 진공에서 제거하여 9.10g 바랜 노란색의 고체인 원산물을 얻었다. 이를 ~25mL 2-부타논으로 재결정시켜 5.52g의 거의 백색결정을 얻었다. 아세톤 ~50mL으로 마지막 재결정하여 mp 241-243℃, 3.16g의 긴, 바늘같은 결정을 얻었다.
H1 NMR(CDCl3): 5.92(1H,s), 3.67(3H,s), 3.13(1H,d,J=5), 2.89(1H,m), 2.81-2.69(15H,m), 1.72(1H, dd,J=5,15), 1.52-1.22(5H,m), 1.04(3H,s).
실시예 27
반응식 1: 단계 3: 선택 1: 4'S(4'α),7'α-헥사데카히드로-11'α-히드록시-10'β,13'β-디메틸-3',5,20'-트리옥소스피로[푸란-2(3H),17'β-[4,7]메타노[17H]시클로펜타[a]페난트렌]-5'β(2'H)-카보니트릴 로부터 메틸수소 9,11α-에폭시-17α-히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤 으로.
디케톤(20g)을 깨끗하고 마른 반응기에 채우고 이어 820mL의 MeOH 및 17.6mL의 25% NaOMe/MeOH 용액을 첨가하였다. 반응혼합물을 16-20시간동안 환류조건(~67℃)까지 가열하였다. 산물을 40mL의 4N HCl로 급냉하였다. 용매를 대기압에서 증류에 의해 제거하였다. 100mL의 톨루엔을 첨가하여 나머지 메탄올을 톨루엔으로 공비증류에 의해 제거하였다. 농축 후, 원히드록시에스테르 4를 206mL의 염화메틸렌에 용해시키고 0℃로 냉각하였다. 염화메탄술포닐(5mL)과 이어 10.8mL의 트리에틸아민을 서서히 첨가하였다. 산물을 45분간 교반하고 용매를 진공증류로 제거하여 원메실레이트 5을 얻었다.
분리건조반응기에 5.93g의 포름산칼륨, 240mL의 포름산 및 이어 118mL의 무수아세트산을 넣었다. 혼합물을 4시간동안 70℃로 가열하였다.
포름산혼합물을 상기 제조된 농메실레이트용액 5에 넣었다. 혼합물을 2시간동안 95-105℃로 가열하였다. 얻어진 혼합물을 50℃로 냉각시키고 휘발성 성분을 50℃에서 진공증류에 의해 제거하였다. 산물을 275ml의 에틸아세테이트와 275ml의 물에 분할하였다. 수층을 다시 137ml의 에틸아세테이트로 추출하고 240ml의 차가운 1N 수산화나트륨 용액 및 그 다음 120ml의 포화 NaCl로 세척하였다. 상 분리후, 유기층을 진공증류하에 농축시켜 원엔에스테르를 얻었다.
산물을 180mL의 염화메틸렌에 용해시켜 0 내지 15℃로 냉각하였다. 8.68g의 인산수소이칼륨에 이어 2.9mL의 트리클로로아세토니트릴을 첨가하였다. 30% 과산화수소의 78mL 용액을 3분에 걸쳐 혼합물에 가하였다. 반응 혼합물을 6-24시간동안 0-15℃에서 교반하였다. 반응 후, 두 상의 혼합물을 분리하였다. 유기층을 126mL의 3% 아황산나트륨용액, 126mL의 0.5N 수산화나트륨용액, 126mL의 1N 염산 및 126mL의 10% 브린으로 세척하였다. 산물을 무수황산마그네슘으로 건조시키거나 Celite로 여과시키고 용매 염화메틸렌을 대기압에서 증류에 의해 제거하였다. 산물을 메틸에틸케톤으로 2회 재결정하여 7.2g의 에폭시멕스레논을 얻었다.
실시예 28
반응식 1: 단계 3: 선택 2: 1'S(4'α),7'α-헥사데카히드로-11'α-히드록시-10'β,13'β-디메틸-3',5,20'-트리옥소스피로[푸란-2(3H),17'β-[4,7]메타노[17H]시클로펜타[a]페난트렌]-5'β(2'H)-카보니트릴의 메틸수소 9,11α-에폭시-17α-히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트,γ-락톤으로의 중간분리없는 전환.
4구 5-L 원형바닥플라스크에 기계적교반기, 질소유입튜브를 갖는 첨가깔때기, 온도계 그리고 차아염소산나트륨 스크러버에 부착된 버블러를 갖는 능축기를 설치하였다. 디케톤(83.20g)을 3.05L 메탄올이 있는 플라스크에 넣었다. 첨가깔때기를 메탄올 중 25% (w:w) 나트륨메톡시드용액 67.85g으로 채웠다. 질소하에 교반하면서 메톡시드를 15분에 걸쳐 플라스크에 적하하였다. 어두운 오랜지색/노란색 슬러리가 생겨났다. 반응혼합물을 20시간동안 환류까지 가열하고 175mL 4N 염산을 환류가 진행되는 동안 적하하였다(주의, 이 조작시 HCN 발생!). 환류능축기를 테이크-오프 헤드로 대체시키고 1.6L의 10% 수용성 염화나트륨용액을 증류속도와 일치되는 속도로 깔때기를 통해 적하하는 동안 1.6L의 메탄올을 증류에 의해 제거하였다. 혼합물을 주위의 온도로 냉각하고 2.25L의 염화메틸렌 분취량으로 2회 추출하였다. 조합된 추출물을 차가운 750mL 1N 수산화나트륨 및 포화염화나트륨 용액으로 세척하였다. 유기층을 1기압에서 메탄올을 공비증류에 의해 건조시켜 결국 1L(전체의 0.5%는 분석용으로 제거하였다)의 부피를 얻었다.
농축된 유기용액(히드록시에스테르)을 전과 같이 설치된 원래의 반응 플라스크에 역으로 가하였으나 HCN 트랩은 없었다. 플라스크를 0℃로 냉각시키고 30.7g 염화메탄술포닐을 질소하에 교반하면서 가하였다. 첨가깔때기를 32.65g 트리메틸아민으로 15분에 걸쳐 적하하여 채우고 온도를 5℃로 유지시켰다. 교반을 2시간동안 진행하고, 반응 혼합물을 주위온도로 데웠다. 250g Dowex 50W × 8-100 산 이온교환수지로 구성되는 컬럼을 제조하고 사용전에 250mL 물, 250mL 메탄올 및 500mL 염화메틸렌으로 세척하였다. 반응혼합물을 이 컬럼에 흘려보내고 회수하였다. 깨끗한 컬럼을 제조하여 상기과정을 반복하였다. Dowex 1 × 8-200 염기 이온교환수지로 구성되는 세번째 250g 컬럼을 제조하고 상기 기술된 산수지처리와 같이 선처리하였다. 반응혼합물을 이 컬럼에 흘려보내고 회수하였다. 각 컬럼 패스를 컬럼아래 250mL 염화메틸렌 세척을 2회 하였고, 각 패스는 ~10분이 걸렸다. 용매세척을 반응혼합물과 조합하고 부피를 진공에서 ~500mL로 줄이고 이의 2%를 qc용으로 제거하였다. 남은것을 더욱 줄여 결국 150mL(원메실레이트용액)의 부피를 얻었다.
원래의 5-L 반응 설치에 960mL 포름산, 472mL 무수아세트산 및 23.70g 포름산칼륨을 넣었다. 이 혼합물을 16시간동안 70℃로 질소하에 교반하면서 가열하였다. 온도를 그 후 100℃로 증가시키고 원메실레이트용액을 첨가깔때기를 통해 30분에 걸쳐 첨가하였다. 온도는 염화메틸렌이 반응혼합물 밖으로 증류되는 동안 85℃로 떨어졌다. 모든 염화메틸렌이 제거된 후, 온도는 다시 100℃로 상승하였으며 2.5시간동안 유지되었다. 반응혼합물을 40℃로 냉각시키고 포름산을 최소교반부피 (~150mL)에 도달할 때까지 압력하에 제거하였다. 나머지를 주위의 온도로 냉각시키고 375mL 염화메틸렌을 첨가하였다. 희석된 나머지를 차가운 1N 포화염화나트륨 용액의 일부, 1N 탄산나트륨 및 다시 염화나트륨용액으로 세척하였다. 유기상을 황산마그네슘(150g)으로 건조시키고 여과하여 어두운 붉은색에 가까운 갈색 용액(원엔에스테르 용액)을 얻었다.
4구의 자켓을 갖춘 1L 반응기에 기계적 교반기, 능축기/버블러, 온도계 그리고 질소유입튜브를 갖는 첨가깔때기를 설치하였다. 반응기를 600mL 염화메틸렌중 원엔에스테르 용액(60g으로 측정된)으로 질소하에 교반하면서 채웠다. 이에 24.0g 이염기성 인산칼륨에 이어 87mL 트리클로로아세토니트릴을 첨가하였다. 외부의 냉수를 반응기 자켓을 통하여 흘려보내어 반응혼합물을 10℃로 냉각하였다. 첨가깔때기에 147mL 30% 과산화수소를 30분에 걸쳐 혼합물에 첨가하였다. 초기의 어두운 붉은색에 가까운 갈색의 반응혼합물은 첨가 완료후 바랜 노란색으로 변하였다. 반응혼합물은 첨가 및 밤새 계속된 교반동안(총 23시간) 10±1℃로 남아있었다. 상을 분리하고 수용성 부분을 120mL 염화메틸렌 일부로 2회 추출하였다. 조합된 유기상을 그 후, 210mL 3% 아황산나트륨용액으로 세척하고 이를 두 번 반복한 후, 유기 및 수용성 부분 모두가 전분/요오드 시험종이에 의하면 과산화물에 대해 음성이었다. 유기상을 연속적으로 차가운 1N 수산화나트륨의 210mL 분취량, 1N 염산으로 세척하고 마지막으로 브린으로 2회 세척하였다. 유기상을 공비적으로 건조시켜 ~100mL의 부피를 만들고, 깨끗한 용매를 250mL 첨가하고 공비적으로 증류시켜 같은 100mL를 만들고, 남아있는 용매를 진공에서 제거하여 점착성의 노란 발포체인 57.05g 원산물을 얻었다. 일부(51.01g)를 더욱 건조시켜 항량 44.3g을 얻고 HPLC로 정량분석하였다. 27.1% 에폭시멕스레논으로 정량되었다.
실시예 29 - 11α-히드록시안드로스텐디온 으로부터 3-에폭시-11α-히드록시 -안드로스타-3,5-디엔-17-온의 형성
11α-히드록시안드로스텐디온(429.5g) 및 톨루엔술폰산수화물(7.1)을 질소하에 반응플라스크에 채웠다. 에탄올(2.58L)을 반응기에 넣고 얻어진 용액을 5℃로 냉각하였다. 트리에틸오르토포름산(334.5g)을 용액에 15분에 걸쳐 0℃ 내지 15℃에서 첨가하였다. 트리에틸오르토프름산의 첨가 후 반응혼합물을 40℃로 데우고 그 온도에서 2시간동안 반응시킨 후 온도를 환류까지 상승시키고 추가 3시간동안 환류하에 반응을 계속하였다. 반응혼합물을 진공하에 냉각시키고 용매를 진공하에 제거하여 3-에톡시-11α-히드록시-안드로스타-3,5-디엔-17-온을 얻었다.
실시예 30 - 11α-히드록시칸레논 으로부터 에나민의 형성
반응식 1: 단계 1: 방법 B: 5R'(5'α),7'β-20'-아미노헥사데카히드로-11'β -히드록시-10'a,13'α-디메틸-3',5-디옥소스피로[푸란-2(3H),17'α(5'H)-[7,4]메테노[4H]시클로펜타[a]페난트렌]-5'-카보니트릴의 제조.
시안화나트륨(1.72g)을 기계 교반기가 갖추어진 25mL 3구 플라스크에 넣었다. 물(2.1mL)을 첨가하고 혼합물을 고체가 용해될 때까지 가열하면서 교반하였다. 디메틸포름아미드(15mL)에 이어 11α-히드록시칸레논(5.0g)을 첨가하였다. 물 (0.4mL)과 황산(1.49g)의 혼합물을 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 HPLC 분석이 산물로의 완전한 전환을 나타내는 2.5시간동안 85℃로 가열하였다. 반응혼합물을 실온으로 냉각하였다. 황산(0.83g)을 첨가하고 혼합물을 반시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 60mL 물에 넣고 얼음조에서 냉각시켰다. 플라스크를 3mL DMF 및 5mL 물로 세척하였다. 슬러리를 40분간 교반하고 여과시켰다. 필터케익을 40mL 물로 2회 세척하고 진공오븐에서 밤새 60℃에서 건조시켜 11α-히드록시에나민, 등 5R'(5'α),7'β-20'-아미노헥사데카히드로-11'β-히드록시-10'a,13'α-디메틸-3',5-디옥소스피로[푸란-2(3H),17'α(5'H)-[7,4]메테노[4H]시클로펜타[a]페난트렌]-5'-카보니트릴(4.9g)을 얻었다.
실시예 31 - 11α-히드록시칸레논의 디케톤으로의 일-폿트 전환
시안화나트륨(1.03g)을 기계적 교반기가 갖추어진 50mL 3구 플라스크에 넣었다. 물(1.26mL)을 첨가하고 고체를 용해시키기 위해 플라스크를 약간 가열하였다. 디메틸아세트아미드[또는 디메틸포름아미드](9mL)에 이어 11α-히드록시칸레논 (3.0g)을 첨가하였다. 황산(0.47mL) 및 물(0.25mL)의 혼합물을 교반동안 반응플라스크에 첨가하였다. 추가의 물(25mL) 및 황산(0.90mL)을 주입하고 반응혼합물을 16시간동안 교반하였다. 그 다음 혼합물을 얼음조에서 5-10℃로 냉각하였다. 고체를 소결유리거르기로 여과하고 이어 물(20mL)로 2회 세척하여 분리하였다. 고체 디케톤등 4'S(4'α),7'α-헥사데카히드로-11'α-히드록시-10'β,13'β-디메틸-3',5,20'-트리옥소스피로[푸란-2(3H),17'β-[4,7]메타노[17H]시클로-펜타[a]페난트렌]-5'β(2'H)-카보니트릴을 진공오븐에서 건조시켜 3.0g의 고체를 얻었다.
실시예 32A-1
반응식 1: 단계 3A: 방법 B: 메틸수소 11α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 제조.
실시예 31에서 시재된 방법으로 생성된 메탄올 (100ml) 중의 디케톤 5.0 g의 현탁액을 가열하여 다시 녹이고, 메탄올 (5.8 ml) 중의 칼슘 메톡사이드 25 % 용액을 1 분에 걸쳐 가했다. 15 분 뒤에 침전이 발생했다. 혼합물을 가열하여 녹였고, 약 4 시간 후에 다시 균질로 되었다. 가열하여 녹이는 것을 전부 23.5 시간 동안 계속했고, 4.0N HCl (10 ml)을 가했다. 메탄올중 수소 시아나이드 용액 60 ml 전부를 증류에 의하여 제거했다. 물 (57 ml)을 증류 잔여물에 15 분에 걸쳐 가했다. 물을 가할 때 용액의 온도를 81.5 ℃로 올렸고, 추가의 수소 시아나이드/메탄올 용액 4 ml을 증류에 의하여 제거했다. 물 첨가가 끝났을 때, 혼합물이 뿌였게 됐고, 열 공급을 제거했다. 혼합물을 3.5 시간 동안 저어서 천천히 결정을 생산했다. 현탁액을 여과했고, 수거한 고체를 물로 세척하고, 깔대기 상에서 공기의 흐름으로 건조했고, 16 시간 동안 92 ℃에서 건조하여 회색의 고체 2.98 g을 얻었다. 고체는 91.4 중량 %의 히드록시에스테르, 즉 메틸 하이드로겐 11α,17α-디히드록시-3-옥소프렌-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤이었다. 수율은 56.1 % 였다.
실시예 31A-2
메틸수소 11α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 제조.
실시예 31에서 설명된 방법으로 제조된 디케톤(40g)을 바닥 배수구, 능축기, RTD 프로브 및 분획 회수 리시버가 설치된 깨끗하고, 건조한, 자켓이 있는 1L반응기에 넣는다. 메탄올(800mL)을 그 다음 반응기에 넣고 그 혼합물을 교반시킨다. 얻어진 슬러리를 약 60℃ 내지 65℃로 가열하고 25% 칼륨메톡시드 용액(27.8mL)을 첨가한다. 혼합물은 균질화 된다.
혼합물을 환류에서 가열한다. 환류에서 가열한지 약 1.5시간 후에 16.7mL의 25% 칼륨메톡시드용액을 환류상태로 유지되는 동안 혼합물에 넣는다. 혼합물을 추가 6시간동안 환류에서 유지한다. 디케톤의 히드록시에스테르로의 전환여부는 HPLC로 분석한다. 일단 HPLC가 히드록시에스테르에 대한 디케톤의 비율이 약 10%이하로 나타나면, 77mL 의 4M HCl( 1.5M 내지 3M 황산의 상당양으로 염산을 대체할 수 있다)를 환류가 지속되는 동안 약 15분에 걸쳐 혼합물에 첨가한다.
혼합물을 증류시키고 약 520mL의 메탄올/HCN 증류물을 회수하고 버린다. 농축된 혼합물을 약 65℃로 냉각시킨다. 약 520mL의 물을 약 90분동안 혼합물에 넣고 온도를 첨가하는 동안 약 65℃로 유지시킨다. 혼합물을 약 4시간에 걸쳐 약 15℃로 점차 냉각시킨 후 교반하고 추가 2시간동안 약 15℃에서 유지시킨다. 혼합물을 여과하고 여과된 산물을 각각 약 200mL의 물로 2회 세척한다. 여과된 산물을 진공에서 건조시킨다(90℃, 25mmHg). 주로 메틸수소 11α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤으로 이루어진 약 25 내지 27g 의 탈-백색 고체를 얻는다.
실시예 32B-1
7-메틸 수소 5β-시아노-11α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레그난-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤
의 제조
반응플라스크를 실시예 31에서 설명한 방법으로 제조된 4.1g의 디케톤, 75mL의 메탄올 및 1mL의 1L 메탄올성 수산화나트륨으로 채웠다. 현탁액을 실온에서 교반하였다. 균질용액을 몇분내에 얻었고 약 20분 후에 침전물이 관찰되었다. 교반을 실온에서 70분간 계속하고 끝날 시점에 고체를 여과하고 메탄올로 세척하였다. 고체를 스팀케비넷에서 건조시켜 3.6g의 7-메틸수소 5β-시아노-11α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레그난-7α,21-디카르복실산, γ-락톤을 얻었다.
1H NMR (CDCl3) ppm 0.95(s,3H),1.4(s,3H), 3.03(d,1H,J15), 3.69(s,3H), 4.1(m,1H).
13C NMR (CDCl3) ppm 14.6, 19.8, 22.6, 29.0, 31.0, 33.9, 35.17, 35.20, 36.3, 37.7, 38.0, 38.9, 40.8, 42.8, 43.1, 45.3, 45.7, 47.5, 52.0, 68.0, 95.0, 121.6, 174.5, 176.4, 207.0.
실시예 32B-2
7-메틸수소 5β-시아노-9,11α-에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레그난-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤
의 제조.
30mL의 무수메탄올에 현탁시킨 화학식 21의 2.0g(4.88 mmol)의 9,11-에폭시디케톤에 0.34mL(2.4mmol)의 트리에틸아민을 첨가하였다. 현탁물을 환류로 가열시키고 4.5시간 후 HPLC(Zorbax SB-C8 150×4.6mm, 2ml/min., 15분에 걸쳐 선형구배 35:65 A:B 내지 45:55 A:B, A=아세토니트릴/메탄올 1:1, B=물/0.1% 트리플루오로아세트산, 210nm에서 디텍션)로 판단한 바 어떤 원료물질도 남아있지 않았다. 혼합물을 냉각시켜 약 16시간동안 25도에서 유지시켰다. 얻어진 현탁물을 여과하여 1.3g의 백색고체인 7-메틸수소 5β-시아노-9,11α-에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α -프레그난-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 얻었다. 여과물을 로터리 이페포레이터로 농축시켜 건조한 상태로 만들고 나머지를 3-5mL의 메탄올로 적정하였다. 여과를 통해 추가 260mg의 7-메틸수소 5β-시아노-9,11α-에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레그난-7α, 21-디카르복실레이트, γ-락톤을 얻었다. 그 수율은 74.3%이었다.
1H-nmr (400MHz, 듀테로클로로포름) d 1.00(s,3H), 1.45(m,1H), 1.50(s,3H), 1.65(m, 2H), 2.10(m, 1H), 2.15-2.65(m,8H), 2.80(m,1H), 2.96(m,1H), 3.12(d,J=13, 1H), 3.35, (d, J=7, 1H), 3.67(s,3H).
실시예 32C
5β-시아노-11-α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레그난-7α,21-디카르복실산, γ-락톤
의 제조
반응 플라스크를 6.8g의 디케톤(실시예 31에서 설명한 방법대로 제조된), 68mL의 아세토니트릴, 6.0g의 아세트산나트륨 및 60mL의 물로 채웠다. 혼합물을 데우고 환류에서 교반하였다. 약 1.5시간 후 반응물은 거의 균질화 되었다. 50mL의 아세토니트릴이 증류되는 3시간 후 100mL의 물을 넣었다. 혼합물을 냉각시키고 침전된 고체(1.7g)을 여과를 통해 제거하였다. 여과물(pH=5.5)을 염산으로 처리하여 pH를 약 4.5로 낮추고 고체를 침전시켰다. 고체를 분리하고 물로 세척하고 건조시켜 4.5g의 5β-시아노-11-α,7-디히드록시-3-옥소-17α-프레그난-7α,21-디카르복실산, γ-락톤을 얻었다.
1H NMR (DMSO) ppm 0.8 (s,3H), 1.28(s,3H), 3.82(m,1H).
13C NMR (DMSO) ppm 14.5, 19.5, 22.0, 28.6, 30.2, 33.0, 34.1, 34.4, 36.0, 37.5, 37.7, 38.5, 42.4, 42.6, 45.08, 45.14, 47.6, 94.6, 122.3, 176.08, 176.24, 207.5.
실시예 33
반응식 1: 단계 3A: 방법 C: 메틸수소 11α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 제조.
실시예 31에서 설명한 방법대로 제조된 디케톤(30g)을 온도계, Dean Stark 트랩 및 기계적 교반기가 설치된 깨끗하고 건조한 3-구 반응플라스크에 채웠다. 메탄올(24mL)을 실온(22℃)에서 반응기에 채우고 얻어진 슬러리를 5분간 교반하였다. 메탄올(52.8mL)중 25중량%의 나트륨메톡시드 용액을 반응기에 채우고 혼합물이 밝은 갈색의 맑은 용액으로 변하고 약간의 발열이 관찰될동안(2-3℃) 혼합물을 실온에서 10분간 교반하였다. 첨가속도는 폿트온도가 30℃를 초과하지 않도록 조절하였다. 그 후, 혼합물을 환류조건(약 67℃)으로 가열하고 16시간동안 환류하에 지속시켰다. 샘플을 그 후 회수하고 HPLC로서 전환여부를 분석하였다. 남아있는 디케톤이 디케톤 차지(charge)의 3% 이하가 될 때까지 반응을 환류하에 지속시켰다. 환류 4N HCl(120mL)을 반응포트에 채우는 동안 스크러버에서 급냉각된 HCN이 생겨났다.
반응 결과, 90-95%의 메탄올 용매를 대기압에서 반응혼합물 밖으로 증류시켰다. 증류동안 헤드온도는 67-75℃로 변하였고 HCN을 포함하는 증류물을 처분전 부식제 및 표백제로 처리하였다. 메탄올의 제거후 반응혼합물을 실온으로 냉각시키고 혼합물이 40-45℃범위 내로 냉각될 때 고체산물이 침전되기 시작하였다. 25℃에서 임의로 5중량% 중탄산나트륨(1200mL)을 포함하는 수용성용액을 냉각된 슬러리에 넣고 그 다음 얻어진 혼합물을 약 1시간 내 0℃로 냉각하였다. 중탄산나트륨 처리는 반응혼합물로부터 잔존하는 미반응 디케톤을 제거하는데 효과적이었다. 고체 산물 메틸수소 11α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 여과로 회수하고 필터케익을 물(100mL)로 세척한 후 침전 및 재결정을 완료하기 위해 슬러리를 2시간동안 0℃에서 교반하였다. 산물을 26"수은진공하에 80-90℃에서 건조하여 항량을 얻었다. 건조 후 물함량은 0.25중량% 미만이고 조절된 몰 수율은 약 77-80중량% 이었다.
실시예 34
반응식 1: 단계 3A: 방법 D: 메틸수소 11α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실산, γ-락톤의 제조.
실시예 31(1 eq.)와 같이 제조된 디케톤을 요오드화아연(1 eq.)의 존재하에 메탄올 용매중 나트륨메톡시드(4.8 eqs)와 반응시켰다. 반응산물의 마무리는 여기 설명된 추출과정과 관련하여 또는 염화메틸렌 추출, 브린 및 부식제 세척, 및 황산나트륨 건조단계가 제거된 비-추출 과정에 의해 행하여질 수 있다. 또한 비-추출 과정에서, 톨루엔을 5중량% 중탄산나트륨 용액으로 대신하였다. 메틸수소 11α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 산물로서 분리하였다.
실시예 35
반응식 1: 단계 3C: 방법 C: 메틸수소 17α-히드록시-3-옥소프레그나-4,9 (11)-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 제조.
실시예 34에 의해서와 같이 제조된 히드록시에스테르(1.97g)를 테트라히드로푸란(20mL)과 조합하고 얻어진 혼합물을 -70℃로 냉각하였다. 염화술퓨릴(0.8mL)을 첨가하고 혼합물을 30분간 교반한 후, 이미다졸(1.3g)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 데우고 추가 2시간동안 교반하였다. 그 다음 혼합물을 염화메틸렌으로 희석하고 물로 추출하였다. 유기층을 농축하여 원산물 메틸수소 17α-히드록시-3-옥소프레그나-4,9 (11)-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤(1.97g)을 얻었다. 원산물의 소량의 샘플을 HPLC로 분석하였다. 분석결과는 9,11-올레핀:11,12-올레핀:7,9 -락톤의 비율은 75.5:7.2:17.3 이었다. 타조건은 상기 설명과 같이하고 0℃에서 수행하였을 때, 반응은 9,11-올레핀:11,12-올레핀:7,9-락톤의 분포가 77.6:6.7: 15.7인 산물을 가져왔다. 이 과정은 엔에스테르의 9,11-올레핀 구조의 도입을 위한 이탈기의 도입 및 그들의 제거인 한 단계와 조합한다 즉, 염화술퓨릴과의 반응은 화학식 V의 히드록시 에스테르의 11α-히드록시기를 가져오고 이것은 할로겐수소이탈반응으로 이어져 Δ9,11구조로 된다. 또한 엔에스테르의 형성은 강산(포름산과 같은) 또는 무수아세트산과 같은 건조제의 사용없이도 효과적이다. 또한 카본모녹시드를 생성하는 대체과정인 환류단계도 제거된다.
실시예 36A
반응식 1: 단계 3C: 방법 D: 메틸수소 17α-히드록시-3-옥소프레그나-4,9 (11)-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 제조.
실시예 34에 의해서와 같이 제조된 히드록시에스테르(20g), 및 염화메틸렌 (400mL)을 기계적 교반기, 첨가깔때기 및 열전대가 갖추어진 깨끗하고 건조한 3-구 원형바닥 플라스크에 넣었다. 얻어진 혼합물을 완전한 용액이 얻어질 때까지 주위온도에서 교반하였다. 용액을 얼음조를 사용하여 5℃로 냉각하였다. 염화메탄술포닐(5mL)을 히드록시에스테르를 포함하는 CH2Cl2 용액에 첨가하고, 급속히 트리에틸아민(10.8mL)을 서서히 적하하였다. 첨가속도는 반응물의 온도가 5℃를 초과하지 않도록 조절하였다. 반응은 매우 발열적이었다; 따라서 냉각이 필요하였다. 반응혼합물을 1시간동안 약 5℃에서 교반하였다. 반응이 완료되었을 때(HPLC 및 TLC 분석), 혼합물이 걸쭉한 슬러리가 될때까지 혼합물을 수은진공 26하에 약 0℃에서 농축하였다. 얻어진 슬러리를 CH2Cl2 (160mL)로 희석하고 혼합물을 수은진공 26하에 약 0℃에서 농축하여 농축액을 얻었다. 농축물의 순도(R3=H 이고 -A-A- 및 -B-B-는 모두 -CH2-CH2-인 화학식 IV의 메실레이트 산물, 즉, 메틸수소 11α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤에서 메틸수소 17α-히드록시-11α-(메틸술포닐)옥시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤)는 82%(HPLC 영역 %)로 나타났다. 이 물질을 분리하지 않고 다음 반응에서 사용하였다.
포름산칼륨(4.7g), 포름산(16mL) 및 무수아세트산(8mL, 0.084mol)을 기계적 교반기, 능축기, 열전대 및 가열맨틀이 설치된 깨끗하고 건조한 반응기에 넣었다. 얻어진 용액을 70℃로 가열하고 약 4-8시간동안 교반하였다. 무수아세트산의 첨가는 발열이고 기체(CO)를 발생시키므로 첨가속도를 온도 및 기체 발생(압력)을 제어하도록 조절하여야 했다. 활성 제거제를 제조하기 위한 반응시간은 반응물(각각 3-5% 물을 포함하는 포름산 및 포름산칼륨)내의 함수량에 따라 결정하였다. 제거반응은 함수량에 민감하다; >0.1% 물(KF)이 존재하면, 7,9-락톤의 불순도 수준은 증가될 것이다. 이 부산물을 최종산물로부터 제거하기는 어렵다. KF가 <0.1% 물을 나타내면, 활성제거제를 이전단계에서 제조한 메실레이트(0.070몰)의 농축물에 옮겼다. 얻어진 용액을 95℃로 가열하고 휘발성의 물질을 증류로 없애어 Dean Strak 트랩에서 회수하였다. 휘발성 물질의 발생이 멈추면, Dean Strak 트랩을 능축기로 대체하고 반응 혼합물을 추가 1시간동안 95℃에서 가열하였다. 완료하자마자(TLC 및 HPLC 분석; <0.1%, 원료), 내용물을 50℃로 냉각하고 진공증류(수은 26/50℃)를 시작하였다. 혼합물을 걸쭉한 슬러리로 농축시키고 다음 주위의 온도로 냉각하였다. 얻어진 슬러리를 에틸아세테이트(137mL)로 희석하고 용액을 15분간 교반하고 물(137mL)로 희석하였다. 층을 분리하고, 수용성의 보다 낮은 층을 에틸아세테이트(70mL)로 재추출하였다. 조합된 에틸아세테이트 용액을 브린용액(120mL)으로 한번 세척하고 얼음의 차가운 1N NaOH 용액(각각 120mL)으로 2회 세척하였다. 소모된 세척액체의 pH가 <8 일때, 수용층의 pH를 측정하고 유기층을 재세척하였다. 소모된 세척액체의 pH가 >8 일때, 에틸아세테이트 층을 브린용액(120mL)으로 한번 세척하고 50℃ 수조를 사용하여 로터리 이베포레이션으로 농축시켜 건조물을 만들었다. 얻어진 고체산물의 엔에스테르, 즉, 메틸수소 17α-히드록시-3-옥소프레그나-4,9(11)-디엔-7α ,21- 디카르복실레이트, γ-락톤은 92g(77몰% 수율)의 무게가 나갔다.
실시예 36B
메틸수소 17α-히드록시-3-옥소프레그나-4,9(11)-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 제조.
*기계적 교반기, 첨가깔때기 및 열전대가 갖추어진 깨끗하고 건조한 250mL 3-구 원형바닥 플라스크에 실시예 34에 의해서와 같이 25g(53.12 mmol)의 히드록시 에스테르 메틸수소 11α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤에 이어 150mL의 염화메틸렌(Burdick & Johnson)을 넣었다. 얻어진 혼합물을 적은 슬러리가 얻어질 때까지 주위온도로 교반하였다. 용액을 얼음조를 사용하여 -5℃로 냉각하였다. 염화메탄술포닐(7.92g, 69.06 mmol)(Aldrich)을 히드록시에스테르를 포함하는 염화메틸렌의 용액에 첨가하고, 급속히 트리에틸아민(7.53g)을 서서히 적하하였다. 첨가속도를 반응물의 온도가 0℃를 넘지 않도록 조절하였다. 반응은 매우 발열적이었다; 따라서 냉각이 필요하였다. 첨가시간은 35분이었다. 반응 혼합물을 약 0℃에서 추가 45분동안 교반하였다. 반응이 완료되었을 때(HPLC 및 TLC분석에서 남은 히드록시에스테르가 1% 미만으로 나타날 때), 혼합물을 대기압에서 약 100mL 내지 125mL의 염화메틸렌용매를 스트립함으로써 농축하였다. 반응기 온도는 스트립과정동안 약 40℃ 내지 45℃에 도달하였다. 반응이 추가 45분 후에 완료되지 않으면, 추가 0.1 당량의 염화메탄술포닐 및 추가 0.1 당량의 트리에틸아민을 반응기에 넣을 수 있고 반응완료를 확인하였다. 얻어진 혼합물을 원산물 메틸수소 17α-히드록시-11α-(메틸술포닐)옥시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 함유하였다. 이 물질을 분리하지 않고 다음 반응에 사용하였다.
무수아세트산나트륨(8.7g)(Mallinkrodt), 결정아세트산(42.5mL)(Fisher) 및 무수아세트산(0.5mL) (Fisher)을 기계적 교반기, 능축기, 열전대 및 가열맨틀이 설치된 두번째의 250mL의 깨끗하고 건조한 반응기에 넣었다. 얻어진 용액을 90℃로 가열하고 약 30분동안 교반하였다. 무수아세트산의 첨가는 발열이고, 첨가속도는 온도 및 압력 모두를 제어하도록 조절하여야 했다. 무수아세트산을 허용가능한 수준(약 0.1% 이하)까지 용액의 함수량을 줄이기 위해 첨가하였다. KF가 <0.1%를 나타낼 경우, 아세트산 용액을 본 예의 첫 단락에서 논의된 것과 같이 제조된 메실레이트 농축액으로 옮겼다. 얻어진 혼합물의 온도는 옮긴 후 약 55℃ 내지 60℃이었다. 실시예 36A에서와 같이 포름산 및 포름산칼륨 대신에 아세트산 및 아세트산나트륨을 사용함으로써 기체발생을 줄였다.
혼합물을 135℃로 가열하고 휘발성물질의 발생이 멈출 때까지 약 60 내지 90분 동안 그 온도에서 유지시켰다. 혼합물로부터 증류된 휘발성물질을 Dean Stark 트랩에서 회수하였다. 완료되자 마자(TLC 및 HPLC 분석; <0.1%의 원료) 열원을 제거하였다. 혼합물의 온도가 80℃에 도달하였을 때, 150mL의 물울 60 내지 90분에 걸쳐 혼합물에 서서히 첨가하였다. 물 첨가가 끝나갈 때, 혼합물을 약 35℃ 내지 45℃의 온도로 냉각하고 슬러리는 형성되기 시작하였다. 혼합물을 15℃로 더욱 냉각하고 약 30 내지 60분동안 그 온도에서 유지시켰다.
혼합물을 유리깔때기를 통해 여과하였다. 여과물을 100mL의 물로 헹구었다. 그 다음 여과물을 추가의 100mL의 물로 두번째 세척하였다. 얻어진 여과물을 진공에서 70℃로 건조시켜 25.0g의 건조 산물 엔에스테르, 메틸수소 17α-히드록시-3-옥소프레그나-4,9 (11)-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 얻었다. HPLC정량은 목적한 9,11-올레핀의 70%, 15%의 11,12-올레핀, 및 5%의 7,0-락톤을 나타내었다.
이 방법은 i)용매부피를 줄이고, ii)히드록시에스테르로부터 엔에스테르를 제조하기 위해 필요한 분리된 조작 단계의 수를 줄이고, iii)필요한 세척제를 줄이고, iv)최종산물을 분리하는데 있어서 추출을 물침전으로 대체하고, v)포름산을 아세트산 대신으로 사용할 때 혼합된 무수화물 형성 및 기체발생과 관련하여 미리 안전염려를 제거하는 이로운 결과(유사한 과정에 비해서)를 지니고 있다.
실시예 37A
반응식 1: 단계 3C: 방법 E: 메틸수소 17α-히드록시-3-옥소프레그나-4,9 (11)-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 제조.
실시예 34에 의해서와 같이 제조된 히드록시에스테르(100g; 0.22mol)를 기계적 교반기, 첨가깔때기, 및 열전대가 설치된 2L 3-구 원형바닥플라스크에 넣었다. 회전 냉각조를 자동온도조절기와 함께 사용하였다. 물에 대한 염화메탄술포닐의 민감성 때문에 플라스크를 반응 전에 건조시켰다.
염화메틸렌(1L)을 플라스크에 넣고 히드록시에스테르를 교반하에 그 안에서 용해시켰다. 용액을 0℃로 냉각시키고 염화메탄술포닐(25mL; 0.32몰)을 첨가깔때기를 통해 플라스크에 넣었다. 트리에틸아민(50mL; 0.59몰)을 첨가깔때기를 통해 반응기에 넣고 깔때기를 추가의 염화메틸렌(34mL)으로 세척하였다. 트리에틸아민의 첨가는 매우 발열이었다. 첨가시간은 교반 및 냉각하에 약 10분이었다. 차지혼합물을 0℃로 냉각하고 플라스크의 윗공간이 질소로 붉게되는 추가 45분동안 교반하에 그 온도에서 정치하였다. 반응혼합물의 샘플을 그 다음 반응완료의 여부를 확인하기 위해 얇은층크로마토그래피 및 고성능액체크로마토그래피로 분석하였다. 혼합물을 그 후 추가 30분동안 0℃에서 교반하고 다시 반응완료여부를 확인하였다. 분석결과 반응이 이 시점에서 실질적으로 완료되었으며; 용매 염화메틸렌을 26" 수은 진공하에 0℃에서 스트립하였다. 증류물의 기체크로마토그래피 분석은 염화메탄술포닐 및 트리에틸아민의 둘 모두의 존재를 나타내었다. 염화메틸렌(800mL)을 그 후 반응기에 넣고 얻어진 혼합물을 5분동안 0-15℃의 범위에서 교반하였다. 용매를 다시 26" 수은 진공하에 0-5℃에서 스트립하여 R3=H, -A-A- 및 -B-B-는 -CH2-CH 2-이고 R1은 메톡시 카르보닐인 화학식 IV의 메실레이트를 얻었다. 산물의 순도는 약 90-95 영역%이다.
제거제를 제조하기 위해, 포름산칼륨(23.5g; 0.28몰), 무수아세트산(40mL)을 분리된 건조한 반응기에 혼합하였다. 포름산 및 무수아세트산을 반응기에 주입하고 온도를 무수아세트산의 첨가동안 40℃이하로 유지하였다. 제거제 혼합물을 70℃로 가열하여 반응시스템으로부터 수분을 청소하였다. 이 반응을 수분함량이 Karl Fisher 분석으로 측정하여 0.3중량% 미만이 될 때까지 계속하였다. 제저제 용액을 그 다음 상기 설명대로 제조된 농축된 원메실레이트용액을 포함하는 반응기에 옮겼다. 얻어진 혼합물을 95℃의 최대온도까지 가열하고 더 이상의 증류물이 발생하지 않을 때까지 휘발성 증류물을 회수하였다. 증류는 약 90℃에서 멈추었다. 증류가 완료된 후, 반응 혼합물을 추가 2시간동안 95℃에서 교반하고 반응의 완료여부를 얇은층크로마토그래피로 확인하였다. 반응이 완료된 후, 반응기를 50℃로 냉각시키고 포름산 및 용매를 26"수은 진공하에 반응혼합물로부터 제거하였다. 농축물을 실온으로 냉각시키고 그 후 에틸아세트산(688mL)을 주입하고 에틸아세트산 및 농축물의 혼합물을 15분동안 교반하였다. 이 시점에서 12% 브린용액(688mL)을 유기상으로부터 수용성 불순물을 제거하는 것을 돕기위해 주입하였다. 수용성층을 추가의 에틸아세테이트(350mL)가 채워진 다른 용기에 옮겼다. 수용성층의 이러한 역추출을 상들이 자리잡고 에틸아세트산층이 조합된 후 30분동안 수행하였다. 조합된 에틸아세테이트층에 포화 염화나트륨용액(600mL)을 넣고 30분동안 교반하였다. 그 다음 상들을 자리잡도록 하고 수용성층을 제거하였다. 추가의 염화나트륨(600mL)세척을 수행하였다. 유기상을 두번째로 쓰여진 세척알콜로부터 분리하였다. 유기층을 30분동안 교반하에 1N 수산화나트륨(600mL)으로 세척하였다. 그 상들을 수용성층을 제거하기 위해 30분동안 놓았다. 수용성층의 pH를 확인하고 >7으로 나타났다. 15분동안 포화 염화나트륨(600mL)으로 더욱 세척하였다. 유기상을 50℃에서 26" 수은 진공하에 마지막으로 농축하고 산물을 여과에 의해 회수하였다. 최종산물은 건조시 발포체형의 갈색고체였다. 24시간동안 감압하에 45℃에서 더욱 건조시켜 68.8%로 정량된 95.4g의 엔에스테르 산물 메틸수소 17α-히드록시-3-옥소프레그나-4,9 (11)-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 얻었다. 몰수율은 원료 히드록시에스테르 및 최종 엔에스테르 둘 모두에 대해 74.4% 보정되었다.
실시예 37B
7-메틸수소 17-메틸-3-옥소-18-노르프레그나-4,9(11),13-트리엔-7α,21-디카르복실레이트
의 제조
반응플라스크를 실시예 23의 방법으로 제조된 메실레이트 5.5g, 55mL의 94.3% 포름산 및 1.38g의 포름산칼륨으로 채웠다. 그 혼합물을 2시간동안 환류 (104℃)에서 가열 및 교반하였다. 두시간이 다 되었을 때 포름산을 감압하에 증류하였다. 나머지를 에틸아세테이트에 용해시키고 10% 탄산칼륨(50mL)으로 세척하였다. 회수된 수용성 일부는 노란색이었다. 에틸아세테이트를 5% 수산화나트륨(50mL)으로 세척하였다. 수용성의 일부를 조합하고 묽은 염산으로 산성화하고 에틸아세테이트로부터 추출된 불용성물질을 추출하였다. 에틸아세테이트를 감압하에 증류시켜 건조물로 하여 1.0g의 잔여물, 7-메틸수소 17-메틸-3-옥소-18-노르프레그나-4,9 (11),13-트리엔-7α,21-디카르복실레이트를 얻었다.
1H NMR (CDCl3) ppm 1.5 (s,3H), 1.4(s,3H), 1.4(s,3H), 3.53(s,3H), 5.72 (m,1H).
13C NMR (CDCl3) ppm 25.1 및 25.4(18 CH3 및 19 CH3 ), 40.9(10 C), 48.5(17 C), 51.4(OCH3), 118.4(11CH), 125.4(4 CH), 132.4 (9 C), 138.5 및 139.7 (13 C 및 14 C), 168.2(5 C), 172.4(7 CO), 179.6(22 CO), 198.9(3 CO).
실시예 37C
7-메틸수소 5β-시아노-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-11-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤
의 제조.
반응플라스크를 실시예 23의 방법대로 제조된 메실레이트 5.5g, 55mL의 94.3% 포름산 및 1.38g의 포름산칼륨으로 채웠다. 혼합물을 2시간동안 환류(104℃)에서 가열 및 교반하였다. 두시간이 다 되었을 때 포름산을 감압하에 증류시켰다. 나머지를 에틸아세테이트에 용해시키고 10% 탄산칼륨(50mL)으로 세척하였다. 회수된 수용성일부는 노란색이었다. 에틸아세테이트를 5% 수산화나트륨(50mL)으로 세척하였다. 에틸아세테이트를 감압하에 증류시켜 건조하여 3.7g 잔여물을 얻었다. 잔여물의 일부 3.4g을 267g의 Merck 실리카 겔(40-63μ)상에서 크로마토그래피 하였다. 산물을 에틸아세테이트 및 톨루엔 37:63(v/v)의 추출기술로 회수하였다. 이 산물을 건조한 후에 0.0698g의 잔여물, 7-메틸수소 5β-시아노-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-11-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 얻었다.
1H NMR (CDCl3) ppm 1.03 (s,3H), 1.22(s,3H), 3.70(s,3H), 5.60(d,1H,J10), 5.98 (d,1H,J10).
MIR ㎝-1 2229(CN), 1768(락톤), 1710(에스테르).
실시예 37D
9α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실산, 비스(γ-락톤)
의 분리
9α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실산, 비스(γ-락톤)은 11-메실레이트 제거의 부산물이다. 순수한 샘플을 제조용 액체크로마토그래피에 이어 역상제조용 HPLC를 통해 실시예 37A의 반응혼합물로부터 분리하였다. 또한 73g 잔여물을 에틸아세테이트 및 톨루엔(20:80, 30:70, 40:60, 60:40, v/v)의 구배추출기술로 2.41g의 Merck 실리카 겔(40-63μ)상에서 크로마토그래피 하였다. 에나민의 풍부해진 혼합물(10.5g) 및 7,9-락톤을 60:40 분획으로 얻었다. 정제과정을 60:40(v/v) 에틸아세테이트, 톨루엔 추출물로 EMF 플레이트상의 TLC로 찍고 황산, SWUV를 통해 눈으로 확인하였다. 혼합물의 일부(10.4g)를 Kromasil C8(7μ) 및 30:70(v/v) 밀리큐 물과 아세토니트릴 이동상 위에서 역상 HPLC를 통해 더욱 정제하였다. 7,9-락톤(2.27g)을 이동상으로부터 결정체로 분리하였다.
MIR ㎝-1 1762(7,9-락톤 및 17-락톤),1677,1622(3-케토-Δ4,5)
1H NMR (CDCl3) ppm 1.00 (s,3H), 1.4(s,3H), 2.05(d, 1H), 2.78(d, 1H), 5.87 (s,1H).
13C NMR (CDCl3) ppm 13.2, 19.0, 22.2, 23.2, 26.8, 28.8, 29.5, 30.8, 33.1, 34.4, 35.1, 42.5, 43.6, 43.9, 45.0, 45.3, 89.9, 94.7, 129.1, 161.5, 176.0, 176.4, 196.9.
이론상 C, 71.85 및 H, 7.34 ; C, 71.68 및 H, 7.30으로 나타남.
실시예 37E
7-메틸수소 5-시아노-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-11-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤
의 분리
화합물 7-메틸수소 5-시아노-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-11-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 11-메실옥시(실시예 24)의 제거후 얻어진 반응 혼합물에 대한 다수의 제조용 액체크로마토그래피 후에 분리하였다. 이는 30:70(v/v) 에틸아세테이트 및 염화메틸렌 추출시스템을 갖는 EMF 플레이트 상의 TLC를 통해 찍고 황산, SMUV를 통해 눈으로 확인한 결과 극성이 덜한 불순물 덩어리의 일부였다. 일반적으로, 이들 극성이 덜한 불순물을 제조용 액체크로마토그래피를 통해 원에나민으로부터 분리하였다. 구체적으로, 9.6g의 원에나민용액을 에틸아세테이트와 톨루엔 구배 추출기술(20:80, 30:70, 40:60, 60:40, v/v)을 사용하여 534g의 Merck 실리카 겔(40-63μ)상에서 크로마토그래피 하였다. 극성이 덜한 불순물을 30:70 분획에서 농축하였다. 극성이 덜한 불순물의 12.5g 푸울을 이러한 방법으로 회수하였다. 이 물질을 에틸아세테이트 및 염화메틸렌 구배 추출기술(5:95, 10:90, 20:80, 30:70, v/v)을 사용하여 550g의 Merck 실리카 겔(40-63μ)을 통해 더욱 크로마토그래피하였다. 20:80 분획의 풍부한 일부는 1.2g의 잔여물을 가져왔다. 아세톤 및 염화메틸렌 구배(3:97, 6:94, 10:90, 15:85, v/v)를 사용하여 53g의 Merck 실리카 겔(40-63μ)을 통한 1.2g 잔여물의 크로마토그래피는 0.27g의 7-메틸수소 5-시아노-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-11-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 10:90 분획의 풍부한 일부로부터 가져왔다.
MS M+425, C25H31NO5(425.52).
MIR 2222 ㎝-1 (니트릴), 1767 ㎝-1 (락톤), 1727 ㎝-1 (에스테르 및 3-케톤).
1H NMR (CDCl3) ppm 0.92(s, 3H), 1.47(s, 3H), 2.95(m, 1H), 3.65(s, 3H), 5.90(m, 1H).
13C NMR (CDCl3) ppm 14.0 (18 CH3), 23.5(15 CH2), 27.0(19 CH3), 37.8, 38.5 및 40.9(7,8 및 14 CH), 52.0(OCH3), 95.0(17C), 121.5(23CN), 123.5(11CH), 135.3(9C), 174.2 및 176.2(22 및 24 C0), 206(3CO).
실시예 37F
7-메틸수소 17-히드록시-3-옥소-11α-(2,2,2-트리플루오로-1-옥소에톡시)-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트
의 제조.
실시예 34의 방법으로 제조된 히드록시에스테르(2.0g, 4.8 mmols)를 기계적 교반기가 설치된 깨끗하고 건조한 3-구 원형바닥 플라스크내의 40mL의 염화메틸렌에 첨가하였다. 다음 트리에틸아민(0.61g, 6.10mmols) 및 무수트리플루오르아세트산(1.47g, 7.0mmols)을 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 주위온도에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 추가 40mL의 염화메틸렌으로 희석하였다. 혼합물을 그 다음 40mL 물, 40mL의 1N HCl, 및 40mL의 1N NaOH 용액으로 연속적으로 세척하였다. 얻어진 용액을 황산 마그네슘으로 건조하고 농축시켜 건조물로하여 3.2g의 밝은 갈색의 고체, 7-메틸수소 17-히드록시-3-옥소-11α-(2,2,2-트리플루오로-1-옥소에톡시)-17α -프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트를 얻었다.
잔여물을 크로마토그래피로 더욱 분석하고 정제하였다. HPLC 조건: 컬럼--물 시메트리 C18(150mm×4.6mm i.d., 5-미크론 입자 크기); 컬럼온도--주위온도; 이동상--아세토니트릴/물, 30/70 부피), ; 유속--1.0mL/분; 주입부피--20마이크로리터; 샘플농도--1.0mg/mL; 디텍션--210nm에서 UV; 압력-- 1500psi; 및 실행시간--45분). TLC 조건: 흡수제--Merck 실리카 겔 60 F254; 용매시스템--에틸아세테이트/톨루엔, 65/35 부피; 시각화기술--단파; 및 응용량--100마이크로그램.
실시예 37G
7-메틸수소 11α-(아세틸옥시)-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7, 21-디카르복실레이트, γ-락톤
의 제조.
실시예 34의 방법으로 제조된 히드록시에스테르(2.86g, 6.87mmole)를 기계 식 교반기가 설치된 깨끗하고 건조한 3-구, 원형바닥 플라스크내의 15mL의 염화메틸렌에 첨가하였다. 그 다음 트리에틸아민(1.39g, 13.7mmol), 디메틸아미노피리딘 (0.08g, 0.6 mmol) 및 무수아세트산(1.05g, 10.3mmol)을 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 밤새 주위온도에서 교반하였다.
혼합물을 150mL의 에틸아세테이트 및 25mL의 물로 희석하였다. 이 에틸아세트산 용액을 25mL의 시트르산 용액으로 세척하였다. 용액을 황산마그네슘으로 건조시키고 농축건조하여 3.33g의 밝은 갈색의 고체 7-메틸수소 11α-(아세틸옥시)-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7, 21-디카르복실레이트, γ-락톤을 얻었다.
잔여물을 크로마토그래피로 더욱 분석하고 정제하였다. HPLC 조건: 컬럼--물 시메트리 C18(150mm×4.6mm i.d., 5-미크론 입자 크기); 컬럼온도--주위온도; 이동상--아세토니트릴/물, 30/70 부피), ; 유속--1.0mL/분; 주입부피--20마이크로리터; 샘플농도--1.0mg/mL; 디텍션--210nm에서 UV; 압력-- 1500psi; 및 실행시간--45분). TLC 조건: 흡수제--Merck 실리카 겔 60 F254; 용매시스템--염화메틸렌/메탄올, 95/5 부피; 시각화기술--단파; 및 응용량--100마이크로그램.
실시예 37H
반응식 1: 단계 3C: 방법F: 7-메틸수소 17-히드록시-3-옥소-17α-프레그나-4,9(11)-디엔-7,21-디카르복실레이트, γ-락톤
의 제조.
포름산칼륨(1.5g, 0.018몰), 포름산(60mL, 1.6mol) 및 무수아세트산(29.5mL, 0.31mol)을 기계적 교반기, 능축기, 열전대 및 가열맨틀이 설치된 깨끗하고 건조한 250mL 반응기에 넣었다. 용액을 70℃에서 4시간동안 교반한 후 화학식IV의 메실레이트를 본 예의 산물로의 전환에 유용한 제거제를 공급하기 위해 주위온도로 냉각하였다.
수행된 TFA/TFA 무수화물 제거제를 실시예 23의 방법으로 제조된 70.0g (0.142몰)의 메실레이트에 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 2.5시간동안 95℃ 내지 105℃로 가열하고 전환도를 TLC 또는 HPLC에 의해 주기적으로 확인하였다. 얻어진 잔여물을 50℃로 냉각하고 얼음물(1.4L)로 희석하고 1시간동안 교반하였다. 혼합물을 주위온도에서 밤새 방치하였다. 층을 분리하고 수용상을 에틸아세테이트(75mL)로 재-추출하였다. 그 다음 에틸아세트산용액을 물/브린 혼합물(70mL), 또 다른 물/브린 혼합물(60mL), 1N 수산화나트륨(60mL), 및 세번째의 물/브린 혼합물(60mL)로 연속적으로 세척하였다. 브린 강도는 12중량%였다. 에틸아세테이트용액을 황산나트륨으로 건조하고 여과하고 로터리 이베포레이터로 농축시켜 건조물로 하여 4.5g의 목적산물 및 알려지지 않은 불순물의 혼합물을 얻었다. HPLC 영역에 의한 불순물/산물의 비율은 각각 약 50/15이다. 이 반응으로부터 주산물은 7-메틸수소 17-히드록시-3-옥소-17α-프레그나-4,9(11)-디엔-7,21-디카르복실레이트, γ-락톤으로 확인된 불순물이었다.
혼합물을 컬럼크로마토그래피로 정제하여 1.9g의 분석적으로 순수한 7-메틸수소 17-히드록시-3-옥소-17α-프레그나-4,9(11)-디엔-7,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 얻었다.
잔여물을 크로마토그래피로 더욱 분석 및 정제하였다. HPLC 조건: 컬럼--물 시메트리 C18(150mm×4.6mm i.d., 5-미크론 입자 크기); 컬럼온도--주위온도; 이동상--아세토니트릴/물, 30/70 부피), ; 유속--1.0mL/분; 주입부피--20마이크로리터; 샘플농도--1.0mg/mL; 디텍션--210nm에서 UV; 압력-- 1500psi; 및 실행시간--45분). TLC 조건: 흡수제--Merck 실리카 겔 60 F254; 용매시스템--클로로포름/메틸 t-부틸 에테르/이소프로판올, 70/28/2 부피; 시각화기술--50부피% 수용성 H2SO4/LWUV 및 50부피% H2SO4/인몰리브딘산; 및 응용량--100마이크로그램.
실시예 37I
7-메틸수소 17-히드록시-3,11-디옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤
의 제조.
Jones제를 6mL의 농황산내에 6.7g의 무수크롬산(CrO3)을 용해시키고 그 혼합물을 증류수로 조심스럽게 희석하여 50mL를 형성함으로써 제조된다. 이 제제의 1mL는 2mmol의 2차 알콜을 케톤으로 산화시키는데 충분하다.
실시예 34의 방법으로 제조된 히드록시에스테르(10.0g, 24.0mmol)를 1200mL의 아세톤에서 용해/정지시켰다. 이 혼합물에 Jones제 8.992mL를 첨가하고 조합된 혼합물을 10분간 교반하였다. 물로 처리하고 염화메틸렌으로 추출한 후 반응혼합물의 분취량을 HPLC(컬럼: Beckman Ultrasphere ODS C18, 4.6mm×250mm, 5미크론; 용매구배:아세토니트릴/물=1.5mL/분의 유속에서 20분 내에 1/99 내지 100/0; 디텍터: UV 210nm). 반응혼합물에서 원료의 실질양의 부족에 의한 증명으로 반응은 완료되었다. 원료(히드록스에스테르)에 대한 HPLC 머무름시간은 13.37분이고 산물케톤에 대해서는 14.56분이었다.
반응을 200mL의 물 및 300mL의 염화메틸렌을 첨가함으로써 마무리하였다. 유기층을 수용층으로부터 분리하고 다시 200mL의 물로 세척하였다. 유기층을 수용층으로부터 분리하고 황산마그네슘으로 건조하였다. 용매를 증류시켜 9.52g의 탈백색 고체(95.6% 원수율) 7-메틸수소 17-히드록시-3,11-디옥소-17α-프레근-4-엔-7α, 21-디카르복실레이트, γ-락톤을 제공하였다.
구조연구는 매스스펙트럼(m/e 414), HNMR(DMF-d7) 및 CNMR(DMF-d7)에 기초하였다. HNMR에서, 히드록스에스테르에서 나타나는 11-H(4.51ppm, 더블릿, j=5.8Hz)의 특징적 피크는 없었다. CNMR에서는 11-케토 탄소로 예상되는 피크가 208.97nm에서 나타났다.
CNMR(400MHz, DMF-d7) 208.97(11-케토), 197.70(3-케토), 176.00(22-락톤), 173.34(7-COOMe), 167.21(C5), 125.33(C4), 93.63(C17)및 15 내지 57ppm의 영역에서의 기타피크.
실시예 37J
디메틸 11α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21 -디카르복실레이트, γ-락톤
의 제조.
42mL의 메탄올내에 실시예 34의 방법대로 제조된 3.5g(8.4mmol)의 히드록시에스테르용액을 4mL의 메탄올성 4N 수산화칼륨(8mmols)와 혼합하였다. 슬러리를 실온에서 밤새 교반하고 한 시간동안 환류온도로 가열하였다. 메탄올을 진공하에 증발시키고 나머지를 50mL의 에틸아세테이트와 혼합하였다. 에틸아세테이트를 진공하에 증발시키고 나머지를 50mL의 에틸아세테이트와 혼합하였다. 건조한 고체를 50mL의 아세톤 및 2mL의 요오드화메틸(32.1 mmols)과 조합하였다. 혼합물을 18시간동안 실온에서 교반하였다. 이 시간동안 대부분의 고체는 용해되었다. 혼합물을 여과하고 여과물을 진공하에 증발건조하였다. 나머지를 에틸아세테이트로 분해하고 고체를 여과를 통해 제거하고 용매를 진공증류하에 제거하였다. 잔여물을 H1 NMR을 통해 디메틸 11α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤 및 원료 히드록시에스테르의 78:22(v/v) 혼합물임을 결정하였다. 이 혼합물은 또다른 정제없이 HPLC 마커로서의 용도에 적합하다.
1H NMR (CDCl3)는 다음의 숫자를 나타냈다:ppm 0.93(s, 3H), 1.37(s, 3H), 3.64(s, 3H), 3.69(s, 3H).
실시예 37K
11α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤
의 제조
실시예 34의 방법으로 제조된 히드록시에스테르 11.86g(28.5mmol)에 50mL의 메탄올과 20mL의 2.5M NaOH를 첨가하였다. 25분 후, HPLC(Zorbax SB-C8 150× 4.6mm, 2ml/분., 15분에 걸친 선형구배 35:65 A:B 내지 45:55 A:B, A=아세토니트릴 /메탄올 1:1, B=물/0.1% 트리플루오로아세트산, 210nm에서 디텍션)로서 판단하여 원료 에스테르의 일부는 미반응 상태로 남아있고 10mL의 10M NaOH를 첨가하였다. 1.5시간 후, HPLC로 판단하여 에스테르의 흔적이 미반응상태로 남아있었다. 반응혼합물을 64시간동안 약 25도에서 정치하였다.
혼합물을 100mL의 물로 희석하고 20mL의 농염산으로 강산으로 만들었다. 얻어진 점착성 침전물을 침전물이 현탁액으로 될 때까지 교반하였다. 고체를 여과에 의해 분리하고, 메탄올에서 재정치하고 여과하여 3.75g의 갈색 고체를 얻었다. 이 물질을 8mL의 뜨거운 DMF에서 용해시키고 혼합물을 40mL의 메탄올로 희석하였다. 산을 결정화하고 여과에 의해 분리하여 1.7g의 솜털같은 백색 고체 11α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 얻었다.
1H-nmr (400MHz, 듀테로디메틸 술폭시드) d 0.80(s, 3H), 1.25(s, 3H), 1.2-2.7(m, 20H), 3.8(brs, 1H), 4.45(m, 1H), 5.50(s, 1H). 카르복실 프로톤은 3.4ppm에서 HOD 피크의 존재로 인하여 관찰되지 않았다.
실시예 38
반응식 1: 단계 3C:방법 G: 7-메틸수소 17-히드록시-3-옥소-17α-프레그나-4,9(11)-디엔-7,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 제조.
실시예 37A의 과정을 반복하되 반응용액을 이온교환수지, 염기성 알루미나 또는 염기성 실리카로 처리함으로써 다수의 세척단계를 없애었다. 염기성 알루미나 또는 염기성 실리카로 처리조건은 표 38에 나타난다. 이들 처리의 각각은 7-메틸수소 17-히드록시-3-옥소-17α-프레그나-4,9(11)-디엔-7,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 제조하기 위한 실시예 44의 다수의 세척제 없이 불순물을 제거하는데 효과적으로 발견되었다.
실시예 39
반응식 1: 단계 3C: 방법 H: 7-메틸수소 17-히드록시-3-옥소-17α-프레그나-4,9(11)-디엔-7,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 제조.
아세트산칼륨(4g) 및 트리플루오로아세트산(42.4mL)을 100mL 반응기에서 혼합하였다. 무수트리플루오로아세트산(9.5mL)을 첨가하는동안 30℃미만의 온도로 유지하기 위한 조절속도로 혼합물에 첨가하였다. 용액을 화학식IV의 메실레이트를 화학식II의 엔에스테르로 전환하는데 유용한 제거제를 공급하기 위해 30분동안 30℃로 가열하였다.
미리 형성된 TFA/TFA 무수화물 제거제를 이전 실시예 37A에서와 같이 제조된 화학식IV의 메실레이트 용액에 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 4½시간동안 40℃에서 가열하고 전환도를 주기적으로 TLC 또는 HPLC로 확인하였다. 반응이 완료되었을 때, 혼합물을 1-구 플라스크로 옮기고 실온에서(22℃) 감압하에 농축건조하였다. 물/브린 혼합물(137mL)를 첨가한 후 완전한 고상물질의 용해물을 얻기위해 에틸아세테이트(137mL)를 혼합물에 첨가하고 얻어진 두 상의 혼합물을 10분동안 교반하였다. 그 상들을 20분동안 분리되도록 하였다. 브린강도는 24중량%이었다. 수상을 에틸아세테이트의 첨가량(68mL)과 접촉시키고 제조된 두 상의 혼합물을 상분리를 위해 15분동안 정치한후 10분동안 교반하였다. 두 추출물로부터 에틸아세테이트 층을 조합하고 24중량% 브린(120mL), 또 다른 24중량% 브린의 분취량(60mL), 1N 과산화수소 용액(150mL)및 또 다른 브린의 일부(60mL)로 세척하였다. 각 수용상 첨가후, 혼합물을 10분동안 교반하고 분리를 위해 15분동안 정치하였다. 얻어진 용액을 물 흡인기를 사용하여 45℃에서 감압하에 농축하여 건조물로 만들었다. 고체산물 (8.09g)을 HPLC로 분석하고 83.4영역%의 엔에스테르 7-메틸수소 17-히드록시-3-옥소-17α-프레그나-4,9(11)-디엔-7,21-디카르복실레이트, γ-락톤 ; 2.45영역%의 11,12-올레핀; 1.5%의 7,9-락톤; 및 1.1%의 미반응 메실레이트를 포함하는 것으로 나타났다.
실시예 40
반응식 1: 단계 3C: 방법 I: 7-메틸수소 17-히드록시-3-옥소-17α-프레그나 -4,9(11)-디엔-7,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 제조.
실시예 23당 제조된 구조를 갖는 메실레이트(1.0g), 이소프로페닐 아세테이트(10g) 및 p-톨루엔술폰산(5mg)을 50ml플라스크에 넣고 교반하면서 90℃로 가열하였다. 5시간 후, 혼합물을 25℃로 냉각하고 수은10mm에서 진공으로 농축하였다. 잔여물을 CH2Cl2(20ml)에서 용해시키고 5%수용성 NaHCO3로 세척하였다. CH 2Cl2층을 진공에서 농축하여 1.47g의 황갈색 기름을 얻었다. 이 물질을 CH2Cl2/Et2O로 부터 재결정하여 0.50g의 화학식IV(Z)의 에놀아세테이트를 얻었다.
이 물질을 이전에 교반하면서 100℃로 가열한 아세트산나트륨(0.12g)과 아세트산(2.0ml)의 혼합물에 첨가하였다. 60분 후 혼합물을 25℃로 냉각하고 CH2Cl2 (20ml)로 희석하였다. 용액을 물(20ml)로 세척하고 MgSO4로 건조시켰다. 건조제를 여과로 제거하고 여과물을 진공에서 농축하여 0.4g의 목적한 9,11-올레핀, 7-메틸수소 17-히드록시-3-옥소-17α-프레그나-4,9(11)-디엔-7,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 얻었다. 원산물은 2%미만의 7,9-락톤 불순도를 가졌다.
실시예 41 - DMSO에서 메실산의 가열제거
반응식 1: 단계 3C: 방법 J: 7-메틸수소 17-히드록시-3-옥소-17α-프레그나 -4,9(11)-디엔-7,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 제조.
플라스크안의 2g의 메실산 및 5ml의 DMSO의 혼합물을 22.4시간동안 80℃에서 가열하였다. 반응혼합물의 HPLC분석은 어떤 원료도 감지되지 않음을 나타냈다. 반응물에 물(10ml)을 첨가하고 침전물을 염화메틸렌으로 3회 추출하였다. 조합된 염화메틸렌층을 물로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조하고 농축하여 엔에스테르 7-메틸수소 17-히드록시-3-옥소-17α-프레그나-4,9(11)-디엔-7,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 얻었다.
실시예 42
반응식 1: 단계 3D :방법 B: 메틸수소 9,11α-에폭시-17α-히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 합성.
50mL 배-모양의 플라스크안에 화학식IIA의 엔에스테르(1,07g 정량의 74.4% 엔에스테르), 트리클로로아세트아미드(0.32g), 고체의 인산수소이칼륨(0.70g)을 염화메틸렌(15.0mL)과 교반하에 혼합하였다. 과산화수소(30중량%; 5.0mL)를 1분에 걸쳐 피펫으로 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 HPLC분석이 반응혼합물에서 엔에스테르에 대한 에폭시멕스레논의 비율이 약 1:1을 나타내는 지점에서 실온으로 6시간동안 교반하였다. 추가 트리클로로아세트아미드(0.32g)을 반응혼합물에 넣고 남은 엔에스테르의 비율이 10%로 낮아짐을 보이는 시간 이후 8시간 더 교반하면서 반응을 계속하였다. 혼합물속의 에폭시멕스레논에 대해 단지 5%의 미반응 엔에스테르가 남아있는 지점에서 추가 트리클로로아세트아미드(0.08g)을 첨가하고 반응혼합물을 밤새 정치하였다.
실시예 43
반응식 1: 단계 3D :방법 C: 메틸수소 9,11α-에폭시-17α-히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 합성.
화학식 IIA(5.4g, 정량의 74.4% 엔에스테르)의 엔에스테르를 100mL 반응기에 넣었다. 트리클로로아세트아미드(4.9g) 및 인산수소이칼륨(3.5g) 모두 고체형태로 엔에스테르에 넣고 이어 염화메틸렌(50mL)을 넣었다. 혼합물을 15℃로 냉각하고 30% 과산화수소(25g)를 10분에 걸쳐 첨가하였다. 반응혼합물을 20℃가 되도록 놓고 6시간동안 그 온도에서 교반하고 그 지점에서 전환여부를 HPLC로 확인하였다. 남은 엔에스테르가 1중량% 미만임을 결정하였다.
반응혼합물을 물(100mL)에 넣고 상을 분리하고 염화메틸렌층을 제거하였다. 수산화나트륨(0.5N; 50mL)을 염화메틸렌층에 첨가하였다. 상을 분리하도록 한 20분 후, 상을 분리하고 유기상을 포화브린(50mL)으로 세척한 후 HCl(0.5N; 50mL)을 염화메틸렌층에 넣었다. 염화메틸렌층을 무수황산마그네슘으로 건조하고 용매를 제거하였다. 백색의 고체(5.7g)을 얻었다. 수용성 수산화나트륨층을 산성화하고 추출하여 추출물을 마무리하여 추가산물 0.2g을 얻었다. 에폭시멕스레논의 수율은 90.2%였다.
실시예 44
반응식 1: 단계 3D:방법 D: 메틸수소 9,11α-에폭시-17α-히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 합성.
화학식IIA의 엔에스테르를 다음과 같은 차이를 두고 실시예 43에서 설명된 방법대로 에폭시멕스레논으로 전환하였다: 초기의 차지(charge)는 엔에스테르(5.4g 정량의 74.4% 엔에스테르), 트리클로로아세트아미드(3.3g), 및 인산수소이칼륨 (3.5g)으로 이루어졌다. 과산화수소용액(12.5mL)을 첨가하였다. HPLC가 엔에스테르의 에폭시멕스레논으로의 전환도가 90%임을 나타낸 후 반응을 20℃에서 밤새 수행하였다. 추가의 트리클로로아세트아미드(3.3g) 및 30% 과산화수소(5.0mL)를 첨가하고 남아있는 엔에스테르가 엔에스테르 차지에 기준하여 단지 2%인 시점에서 반응을 추가 6시간동안 수행하였다. 실시예 43에서 설명한것과 같은 마무리후, 5.71g의 에폭시멕스레논을 얻었다.
실시예 45
반응식 1: 단계 3D: 방법 E: 메틸수소 9,11α-에폭시-17α-히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 합성.
화학식 IIA의 에스테르를 실시예 43에서 일반적으로 설명한 방법대로 에폭시멕스레논으로 전환하였다. 본 실시예의 반응에서 엔스테르 차지는 5.4g(정량 74.4 %), 트리클로로아세트아미드 차지는 4.9g, 과산화수소 차지는 25g, 인산수소이칼륨 차지는 3.5g 이었다. 반응을 18시간동안 20℃에서 실행하였다. 남은 에스테르는 2% 미만이었다. 마무리 후, 5.71g의 에폭시멕스레논을 얻었다.
실시예 46
반응식 1: 단계 3D: 방법 F: 메틸수소 9,11α-에폭시-17α-히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 합성.
화학식 IIA의 엔에스테르를 반응온도가 28℃인 것을 제외하고는 실시예 43에서 설명한 방법대로 에폭시멕스레논으로 전환하였다. 반응기에 채워진 물질은 엔에스테르(2.7g), 트리클로로아세트아미드(2.5g), 인산수소이칼륨(1.7g), 과산화수소 (17.0g) 및 염화메틸렌(50mL)을 포함하였다. 4시간 반응 후, 미반응 엔에스테르는 엔에스테르 차지를 기준으로 단지 2%였다. 실시예 43에서 설명한 마무리 후, 3.0g의 에폭시멕스레논을 얻었다.
실시예 47-1
반응식 1: 단계 3D: 방법 G: 메틸수소 9,11α-에폭시-17α-히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 합성.
화학식IIA의 엔에스테르(40.4g, 정량 68.4% 엔에스테르)를 1000mL, 자켓이 있는 반응기속에 채우고 175mL의 염화메틸렌에서 용해시켰다. 용액을 트리클로로아세트아미드(22.3g)와 인산수소이칼륨(6.0g)을 고체형태로 첨가하면서 교반하였다. 혼합물을 400RPM에서 교반하고 온도는 반응기 자켓을 통해 회전하는 액체를 제어하기 위한 항온조로 27℃로 조절하였다. 과산화수소(30%정량으로 72.8mL)를 3-5분에 걸쳐 첨가하였다. 과산화수소 첨가후, 혼합물을 400RPM 및 27℃에서 교반하였다. HPLC정량은 5시간 내에 반응이 99% 완료됨을 나타내었다. 6시간이 다 될 때쯤 72.8mL의 물을 첨가하였다. 수용성 과산화수소를 분리하고 50mL의 염화메틸렌으로 1회 역추출하였다. 조합된 염화메틸렌을 6% 아황산나트륨(62.3mL)으로 세척하여 어떤 포함된 과산화물도 파괴하였다. 염화메틸렌제거는 대기압증류로 시작하여 진공하에 끝냈다. 노란색에 가까운 잔여물(48.7g, 55.4% 정량)을 얻었다. 이는 몰수율로 환산하여 94.8% 정량에 해당된다.
잔여물의 일부(47.8g)를 498mL의 에탄올 3A(5% 메탄올으로 변성된 95% 에탄올)로 조합하였다. 혼합물을 환류까지 가열하고 249mL의 증류물을 대기압력에서 제거하였다. 혼합물을 25℃로 냉각하고 여과하였다. 에탄올 3A 헹굼물(53mL)을 이송을 돕기위해 사용하였다. 건조된 고체는 91%회수에 해당되는 27.6g(87.0% 정량)의 무게가 나갔다. 고체의 일부(27.0g)를 환류온도에서 292mL의 메틸에틸케톤에 용해시켰다. 뜨거운 용액을 이송을 돕기위해 사용된 또 다른 48.6mL의 메틸에틸케톤으로 솔카 플록 패드(분말 셀루로오스)를 통해 여과하였다. 메틸에틸케톤의 일부 146mL를 대기압증류를 통해 제거하였다. 용액을 50℃로 냉각하고 산물을 결정화하기 위한 한 시간동안 교반하였다. 한 시간후 혼합물을 25℃로 냉각하였다. 교반을 한시간동안 계속하고 헹굼물로 사용되는 48.6mL의 메틸에틸케톤으로 여과하였다. 고체를 건조하여 87.2% 재결정 회수율을 나타내는 항량 20.5g을 얻었다. 반응물 수율 및 에탄올, 메틸에틸케톤 회수율은 총 75%로 조합된다.
메틸에틸케톤 모액은 다음에 오는 반응에서 들어오는 염화메틸렌으로 재생하는데 적합하다. 조합된 염화메틸렌 및 메틸에틸케톤 혼합물을 대기압과 진공 증류로 증발시켜 건조물을 만들었다. 잔여물을 에폭시멕스레논 함량 기준으로 19부피의 에탄올 3A와 조합하였다. 25℃로 냉각한 후 고체를 여과하고 건조하였다. 건조고체를 환류온도에서 12부피의 메틸에틸케톤에 용해시켰다. 뜨거운 용액을 헹굼물로서 첨가한 2부피의 메틸에틸케톤으로 솔카 플록 패드를 통해 여과하였다. 여과물을 6부피의 메틸에틸케톤을 대기압 증류로 농축하였다. 용액을 50℃으로 냉각하고 산물을 결정화하는 한시간동안 교반하였다. 한시간 후 혼합물을 25℃로 냉각하였다. 교반을 한시간동안 계속하고 고체를 헹굼물로 사용되는 2부피의 메틸에틸케톤으로 여과하였다. 고체를 건조하여 항량을 얻었다. 메틸에틸케톤 모액의 주입은 총 수율을 80-85%로 상승시켰다. 이 방법은 유출량을 최대화하고 세척제 부피 및 폐물을 최소화하기 때문에 특히 대형화에 적합하다.
실시예 47A
반응식 1: 단계 3D: 방법 H: 메틸수소 9,11α-에폭시-17α-히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 합성.
화학식 IIA의 엔에스테르(17g, 정량 72% 엔에스테르)를 트리클로로아세트아미드(14.9g)를 느린 교반하에 첨가한 후 염화메틸렌(150mL)에 용해시켰다. 혼합물의 온도를 25℃로 조절하고 물(10.6mL)중 인산수소이칼륨(10.6g) 용액을 400rpm 교반하에 엔에스테르 기질용액속으로 흔들면서 가하였다. 과산화수소(30중량% 용액; 69.4mL)를 기질/인산/트리클로로아세트아미드 혼합물에 3-5분에 걸쳐 첨가하였다. 어떤 발열 또는 산소 발생도 관찰되지 않았다. 반응혼합물을 400rpm 및 25℃에서 18.5시간동안 교반하였다. 어떤 산소발생도 반응과정 전반에 걸쳐 관찰되지 않았으나 과산화수소 소비 분석은 약간의 산소가 반응동안 형성되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 물(69.4mL)로 희석하고 혼합물을 약 250rpm에서 15분동안 교반하였다. 어떤 온도 조절도 이 조작에 필요하지 않고 필수적으로 실온에서 수행하였다(5-25℃의 범위내의 어떤 온도도 허용가능). 수용 및 유기층을 분리되도록 하고 보다 낮은 염화메틸렌층을 제거하였다.
수용층을 250rpm의 교반하에 15분간 염화메틸렌으로(69.4mL) 역추출하였다. 층을 분리하도록 하고 보다 낮은 염화메틸렌 층을 제거하였다. 수용층(177g; pH=7)을 과산화수소량을 결정하도록 하였다. 결과(12.2%)는 0.0434몰의 과산화수소가 0.0307의 올레핀 반응동안 소비되었음을 나타내었다. 과잉의 과산화수소 소비는 반응에서 산소발생의 척도가 되었다. 소량의 염화메틸렌 부피로 역추출은 수용층에서 에폭시멕스레논의 어떤 손실도 없음을 확인하는데 충분하였다. 이 결과는 트리클로로아세트아미드만이 회수된 두번째 다량의 염화메틸렌 추출의 응용으로 확인되었다.
상기 설명된 추출물로부터 조합된 염화메틸렌용액을 조합하고 적어도 15분간 약 250rpm에서 3중량%의 아황산나트륨용액(122mL)으로 세척하였다. 음성의 요오드화전분 시험(KI 종이; 어떤 색도 띠지 않음; 양성 시험에서 보라색 착색은 과산화물의 존재를 나타낸다)은 교반이 끝나갈 때 관찰되었다.
수용 및 유기층을 분리하도록 하고 보다 낮은 염화메틸렌 층을 제거하였다. 수용층(pH=6)을 버렸다. 아황산 용액의 첨가는 약간의 발열이므로 그러한 첨가는 온도조절하에 수행되어야 함을 주의.
염화메틸렌상을 약 250rpm에서 15-25℃(pH=12-13)의 범위내의 온도로 45분간 0.5N 수산화나트륨(61mL)로 세척하였다. 트리클로로아세트아미드로 부터 유도된 불순물을 이 과정에서 제거하였다. 알칼리성 수성 분획의 산화에 이어 염화메틸렌의 추출은 극히 적은 에폭시멕스레논이 이 조작에서 소실되었음을 확인하였다.
염화메틸렌상을 약 250rpm에서 15-25℃의 범위내의 온도로 15분간 0.1N 염산 (61mL)으로 한번 세척하였다. 층을 분리하도록 하고 보다 낮은 염화메틸렌층을 제거하고 다시 약 250rpm에서 15-25℃의 범위내의 온도로 15분간 10중량% 수용성 염화나트륨(61mL)으로 다시 세척하였다. 다시 층을 분리하도록 하고 유기층을 제거하였다. 유기층을 솔카 플록 패드를 통해 여과하고 나서 감압하에 증발하여 건조물을 만들었다. 건조는 65℃의 수조온도로 완료하였다. 탈-백색 고체(17.95g)을 얻어 HPLC 정량하도록 하였다. 에폭시멕스레논 정량은 66.05%였다. 반응의 환산 몰수율은 93/1%이었다.
산물을 뜨거운 메틸에틸케톤(189mL)에 용해시키고 얻어진 용액을 95mL의 케톤 용매가 제거될 때까지 대기압에서 증류하였다. 온도를 산물이 결정화되도록 50℃로 낮추었다. 온도를 다시 20-25℃로 낮추고 2시간동안 교반을 계속하였다. 고체를 여과하고 MEK(24mL)로 헹구고 건조하여 항량 9.98g을 얻었으며, 이는 HPLC 정량에 따르면 93.63% 에폭시멕스레논을 함유한다. 이 산물을 뜨거운 MEK(106mL)에 재용해시키고 뜨거운 용액을 압력하에 10미크론 라인필터를 통해 여과하였다. 또 다른 18mL의 MEK를 헹굼물로 적용하여 53mL의 용매가 제거될 때까지 여과된 MEK 용액을 대기압에서 증류하였다. 온도를 20-25℃로 낮추고 교반을 또다른 2시간동안 계속하는 동안 그 온도에서 정치하였다. 고체산물을 여과하고 MEK(18mL)로 헹구었다. 고체산물을 건조하여 정량의 HPLC정량당 99.6% 에폭시멕스레논을 포함하는 8.32g의 항량을 얻었다. 건조시 최종손실은 1.0% 미만이었다. 본 예의 반응 및 마무리와 관련하여 에폭시멕스레논의 총 수율은 65.8%이다. 이 총 수율은 93%의 반응수율, 78.9%의 초기결정화 회수, 89.5%의 재결정 회수를 반영하였다.
실시예 47B
7-메틸수소 11α,12α-에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤
의 제조.
엔에스테르의 Δ11,12올레핀은 11-메실레이트 제거의 부산물이다. 순수한 샘플을 실시예 37A의 방법으로 제조한 반응혼합물로부터 반복적 제조용 액체크로마토그래피를 통하여 분리하였다. 또한, 73g 잔여물(실시예 37A의 방법대로 제조된)을 에틸아세테이트, 톨루엔 구배 추출기술(20:80, 30:70, 40:60, 60:40, v/v)로 2.41kg의 Merck 실리카겔 (40-63μ)상에서 크로마토그래피하였다. 풍부한 Δ11,12올레핀 일부를 선택된 30:70 분획으로부터 조합하였다. 황산 SWUV 확인과 함께 에틸아세테이트/톨루엔 60:40(v/v)을 사용하여 EMF 플레이트 상의 TLC는 적합한 분획을 선택하는데 가이드 역할을 하였다. 용매의 제거후에 얻어진 7.9g의 원 Δ11,12올레핀 (HPLC에서 80영역%)을 에틸아세테이트/염화메틸 구배 추출기술(10:90, 20:80, 35: 65, v/v)로 531g의 Merck 실리카겔 (40-63μ)상에서 크로마토그래피하였다. 순수한 7-메틸수소 17-히드록시-3-옥소-17α-프레그나-4,11-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤(3.72g)을 선택된 20:80 분획으로부터 얻었다. 분획의 선택은 이전의 상황에서처럼 TLC발생에 기준한다.
MIR ㎝-1 1767(락톤), 1727(에스테르), 1668 및 1616(3-케토-Δ4,5).
1H NMR (CDCl3) ppm 1.05(s, 3H), 1.15(s, 3H), 3.66(s, 3H), 5.58(dd, 1H), 5.80(s, 1H), 5.88(dd, 1H).
13C NMR (CDCl3) ppm 17.41, 18.58, 21.73, 28.61, 32.28, 33.63, 34.91, 35.64, 35.90, 38.79, 42.07, 44.12, 48.99, 49.18, 51.52, 93.81, 126.43, 126.69, 133.76, 166.24, 172.91, 176.64, 198.56.
16mL의 염화메틸렌 안에 1.6g(3.9 mmols)의 7-메틸수소 17-히드록시-3-옥소-17α-프레그나-4,11-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤 용액을 2.2mL의 트리클로로아세토니트릴(22.4mmols)과 0.75g의 인산이칼륨(4.3mmols)과 혼합하였다. 혼합물을 교반하고 6.7mL의 30% 과산화수소(66mmols)과 조합하였다. 교반을 45시간동안 25℃에서 계속하였다. 이 시간이 다 되었을 때 28mL의 염화메틸렌 및 39mL의 물을 넣었다. 유기부분을 분리하고 a)74mL의 3% 아황산나트륨, b)62mL의 1N 수산화나트륨, c)74mL의 1N 염산, 및 d)31mL의 10% 브린으로 연속적으로 세척하였다. 유기부분을 다시 분리하고, 황산마그네슘으로 건조하고 진공하에 증류하여 건조화 하였다. 1.25g 잔여물을 메틸-t-부틸에테르 및 톨루엔 구배 시스템(40:60, 60:40, 75: 25, v/v)을 사용하여 138.2g의 Merck 실리카겔 (40-63μ)상에서 크로마토그래피하였다. 60:40 및 75:25 분획의 적합한 비율을 TLC 발생 후 조합하여 0.66g의 순수 7-메틸수소 11α,12α-에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 얻었다. TLC 시스템은 눈으로 확인하기 위한 황산과 SWUV와 함께 EMF플레이트와 75:25,(v/v) 메틸-t-부틸에테르 및 톨루엔 추출기술을 사용하였다.
1H NMR (CDCl3) ppm 1.09(s, 3H), 1.30(s, 3H), 3.05(AB11,12 2H 를 위한), 3.67(s, 3H), 5.80(s, 1H).
13C NMR (CDCl3) ppm 14.2, 18.0, 21.2, 28.8, 31.9, 33.5, 34.6, 34.7, 35.1, 35.5, 37.4, 38.3, 41.8, 46.0, 47.2, 50.4, 51.7, 56.7, 94.0, 126.7, 165.2, 172.5, 176.7, 198.1.
이론상: C, 69.54 및 H, 7.30 ; C, 69.29 및 H, 7.17로 나타남.
실시예 47C
7-메틸수소 4α,5α:9α,11α-디에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레그난-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤
의 분리.
200g의 엔에스테르로부터 실시예 26의 방법으로 제조된 원 에폭시멕스레논 (157g)을 4.4kg의 Merck 실리카겔(40-63μ)에 대해 크로마토그래피하도록 하였다. 88.1g 일부를 아세토니트릴 및 톨루엔 10:90(v/v) 추출기술로 회수하였다. 분리된 고체를 880mL의 뜨거운 메틸에틸케톤에 용해시키고 솔카 플록 패드를 통해 여과하였다. 또 다른 88mL의 메틸에틸케톤을 헹굼물로 적용하였다. 여과물을 643mL의 용매를 제거를 통해 농축하고 혼합물을 실온으로 냉각하였다. 고체를 여과하고 메틸에틸케톤으로 헹구었다. 건조후, HPLC를 통해 96.8%로 정량한 60.2g의 에폭시멕스레논을 얻었다. 여과물을 감압하에 농축건조하였다. 9.3g 잔여물을 99mL의 메틸에틸케톤으로부터 재결정하여 2.4g의 건조고체를 얻었다. 그 고체의 일부 400mg을 YMC ODS AQ 컬럼위에 역상제조용 HPLC를 하도록 하였다. 순수한 7-메틸수소 4α,5α:9α,11α-디에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레그난-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤(103mg)을 아세토니트릴(24%), 메탄올(4%) 및 물(72%)의 추출기술로 분리하였다.
1H NMR (CDCl3) ppm 0.98(s, 3H), 1.32(s, 3H), 2.89(m, 1H), 3.07(s,d, 2H), 3.73(s, 3H).
MS, M+430, C24H39O7(430.50)로 계산.
실시예 47D
7-메틸수소 17-히드록시-3,12-디옥소-17α-프레그나-4,9(11)-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤
의 분리.
실시예 26의 방법으로 얻어진 메틸에틸케톤 모액을 감압하에 증류하여 건조화하였다. 나머지의 4.4g 일부를 58.4g의 BTR Zorbax LP(40μ)위에서 크로마토그래피하도록 하였다. 메틸에틸케톤 및 염화메틸렌의 구배(25:75 내지 50:50, v/v)의 추출은 1.38g의 물질을 가져왔다. 이 물질의 1.3g 일부를 이동상으로 아세토니트릴 (30%), 메탄올(5%) 및 물(65%) 그리고 YMC ODS AQ 컬럼(10μ)을 사용한 역상제조 HPLC 통해 더욱 정제하였다. 산물을 염화메틸렌추출을 통해 풍부해진 분획으로부터 얻었다. 염화메틸렌을 증발건조하고 175mg 잔여물을 이동상으로 아세토니트릴 (24%), 메탄올(4%) 및 물(72%) 그리고 YMC ODS AQ 컬럼을 사용한 역상제조용 HPLC를 통해 재정제하였다. 풍부한 분획의 염화메틸렌추출은 30.6mg의 순수 7-메틸수소 17-히드록시-3,12-디옥소-17α-프레그나-4,9(11)-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 가져왔다.
1H NMR (CDCl3) ppm 1.17(s, 3H), 1.49(s, 3H), 3.13(m, 1H), 3.62(s, 3H), 5.77(s, 1H), 5.96(s, 1H).
13C NMR (CDCl3) ppm 13.1, 21.0, 28.0, 29.4, 33.1, 33.4, 33.9, 35.5, 36.7, 40.3, 41.5, 43.0, 43.4, 52.0, 55.0, 91.0, 123.7, 126.7, 163.2, 167.9, 171.8, 176.8, 197.4, 201.0.
실시예 47E
9,11α-에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실산, 디하이드레이트, 이칼륨염
의 제조.
실시예 43의 방법으로 제조된 2.0g(4.8 mmol)의 에폭시멕스레논, 10mL의 물, 3mL의 디옥산 및 9.3mL의 1.04N 수용성 수산화칼륨(9.7mmol)을 포함하는 현탁액을 제조하였다. 혼합물을 25℃에서 3시간동안 교반하였다. 노란, 균질성용액을 처음 두 시간동안 형성하였다. 온도를 70℃로 올리고 추가 3시간동안 교반을 계속하였다. 용매를 진공증류를 통해 없애고 나머지를 추출용매로 물을 사용하여 90g의 C18실리카겔에 대해 역상크로마토그래피를 통해 정제하였다. 목적한 분획을 추출용매로 염화메틸렌, 메탄올(7:3)을 사용하여 EMF 플레이트 상의 TLC로 찍고 SWUV를 사용하여 눈으로 확인한 후 조합하였다. 조합된 분획을 진공하에 농축하여 건조화하고 역상 정제화 하도록 한 잔여물을 반복해서 이전 설명과 같이 하였다. 목적한 분획을 감압하에 농축하여 건조화하고 잔여물을 에탄올에서 용해시켰다. 에틸아세테이트를 흐림점에 넣고, 침전을 완료하기 위하여 헵탄을 첨가하였다. 0.55g의 산물, 9,11α-에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실산, 디하이드레이트, 이칼륨염을 노란고체로 분리하였다. 탄소분석은 수산화 구조물 C23H28O 7K2·1.75 H2O과 관련하였다: 이론상 C, 무수화물 형태에 대해 52.50 대 55.85 ; C, 52.49로 나타남. 추출용매로 염화메틸렌, 메탄올, 물(6:3:0.5, v/v)로 EMF 플레이트 위의 TLC 후 SWUV를 통해 눈으로 확인한 결과, 0.29의 Rf가 관찰되었다.
실시예 47F
9,11α-에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실산, 디하이드레이트, 이나트륨염
의 제조.
실시예 43의 방법으로 제조된 약 5mg(0.01몰)의 에폭시멕스레논을 4mL 바이알내 약 200μL의 메탄올에서 현탁시키고 약 200μL의 2.5N NaOH로 희석하였다. 얻어진 혼합물은 노란색의 균질이었다. 혼합물을 기름조에서 70℃로 가열하였다. 10분 후 혼합물로부터 1㎛샘플을, 각각 히드록산(오픈 락톤) 및 오픈 락톤 7-카르복실산과 일치하는 4.86과 2.93분 머무름 시간에서 두 물질을 나타내는 HPLC(Zorbax SB-C8 150×4.6nn, 2mL/분, 구배=35:65(v/v) A:B, A=아세토니트릴/메탄올(1:1), B=물/0.1% 트리플루오로아세트산, 210nm에서 디텍션)로 분석하였다. 30분후 두번째 (0.05mL)샘플을 제거하여 약 0.05mL의 3N HCl로 산화시키고 이어서 약 0.5mL의 중탄산나트륨으로 중성화하였다. 상기와 같은 HPLC 분석은 6.59 및 10.71분의 머무름시간을 갖는 예상된 고리-닫힌 스테로이드를 나타내었다. 상응하는 7-카르복실산에 대한 7-메틸수소 9,11α-에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실산, γ-락톤(10.71분)의 비율은 7:89이었다.
락톤의 선택적 가수분해는 온화한 조건하에 가능하였다. 두번째 4mL 바이알은 상기와 같이 준비하되 가열하지는 않았다. 혼합물을 5분동안 초음파하였다. 0.05mL의 샘플을 0.5mL의 1:1(v/v) 메탄올/아세토니트릴 혼합물에서 희석하고 이전 산화과정없이 HPLC로 분석하였다. 얻어진 오픈 락톤 카르복실산 7-에스테르는 상기 관찰된 것과 같이 4.85분의 머무름 시간을 갖고 7-카르복실산에 의해 오염되지 않았다.
실시예 47G
7-메틸수소 9α,11β,17-트리히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤
및 7-메틸수소 12α,17- 디히드록시- 3-옥소-17α-프레그나- 4,9(11)-디엔-7α,21- 디카르복실레이트, γ-락톤
의 분리
7-메틸수소 9α,11β,17-트리히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤 및 7-메틸수소 12α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레그나-4,9(11)-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 실시예 26(트리클로로아세토니트릴 프로토콜)에서 설명한대로 엔에스테르의 에폭시화로 회수된 2-부탄 모액의 제조용액체크로마토그래피 후 분리하였다. 또한, 처음의 결정화를 지시대로 2-부타논을 사용하여 실행하였다. 그러나, 재결정은 아세톤 대신 2-부타논(g당 10부피)을 이용하였다. 2.8g 잔여물을 이 방법으로 얻고 역상 제조 HPLC를 통해 정제하였다. 크로마실 C8(10μ)을 70:30(v/v)의 비로 밀리Q 물과 아세토니트릴로 구성된 이동상과 함께 정지상으로 사용하였다. 결정화를 풍부한 분획 중 하나에서 관찰하였다. 고체 (46.7mg)을 분리하고 7-메틸수소 9α,11β,17-트리히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤임을 확인하였다. 모액을 감압하에 증발시켜 건조화하고 나머지(123mg)를 7-메틸수소 12α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레그나-4,9(11)-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤임을 확인하였다.
7-메틸수소 9α,11β,17-트리히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤:
C24H32O5 (432.51)로 계산하여 MS M+432.
1H NMR (CDCl3) ppm 1.23(s, 3H), 1.54(s, 3H), 3.00(m, 1H), 3.14(m, 1H), 3.74(m, 1H), 5.14(s, 1H, 서서히 교환할 수 있는), 5.79(s, 1H).
13C NMR (CDCl3) ppm 16.8, 22.7, 24.8, 29.0, 29.3, 32.1, 34.1, 34.7, 35.2, 35.7, 36.8, 40.7, 43.0, 45.0, 45.9, 52.9, 72.8, 77.4, 95.9, 127.4, 163.7, 176.7, 177.3, 199.4.
7-메틸수소 12α,17-디히드록시-3-옥소-17α-프레그나-4,9(11)-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤:
C24H30O6 (414.50)로 계산하여 MS M+441.
1H NMR (CDCl3) ppm 0.87(s, 1H), 1.40(s, 1H), 3.05(m, 1H), 3.63(s, 3H), 3.99(m, 1H), 5.72(s, 1H), 5.96(m, 1H).
13C NMR (CDCl3) ppm 14.8, 24.0, 26.1, 29.7, 33.6, 33.8, 34.0, 36.3, 37.0, 37.4, 40.7, 40.9, 43.8, 48.1, 51.9, 69.1, 95.5, 122.7, 126.3, 145.9, 164.5, 173.2, 177.6, 198.2.
실시예 47H
7-메틸수소 9,11α-에폭시-3-애톡시-17-히드록시-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤
및 7-메틸수소 6β,17-디히드록시-9,11α-에폭시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤
의 제조.
7-메틸수소 9,11α-에폭시-3-애톡시-17-히드록시-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 참고문헌으로 포함된 R.M.Weier 및 L.M.Hofmann(J. Med Chem 1977,1304)의 방법에 따라 제조하였다. 실시예 43의 방법으로 제조된 148g(357mmols)의 7-메틸수소 9,11α-에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4- 엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 311mL의 엡솔루트 에탄올과 155mL (932 mmols)의 트리에틸오르토포름산과 조합하였다. 슬러리를 실온에서 교반하고 10.4g (54.7 mmols)의 톨루엔술폰산(모노수산화물)을 촉매로 첨가하였다. 교반을 30분동안 계속하고 반응물을 41.4g(505 mmols)의 분말 아세트산나트륨 및 20.7mL (256 mmols)의 피리딘의 첨가와 함께 급냉하였다. 고체(70.2g)를 여과로 제거하고 여과물을 진공하에 농축시켜 건조물로 하였다. 나머지를 300mL의 에틸아세테이트와 9.8g의 고체를 여과를 통해 제거하였다.
여과물을 농축시켜 건조물로 하고 잔여물을 2mL의 피리딘을 포함하는 100mL의 메탄올로 분해하였다. 29.7g의 고체를 여과로 제거하였다. 추가 침전물을 여과물중 관찰하였다. 따라서, 여과물을 재여과하여 추가의 21.9g 고체를 제거하였다. 여과물을 농축시켜 건조화하고 잔여물을 1mL의 피리딘을 포함하는 50mL의 메탄올로 분해하였다. 33.8g의 고체를 여과를 통해 분리하였다. 정량 HPLC는 이 고체의 마지막 일부가 반응의 다음 단계에서 사용되는 충분히 순수한 (90 영역 퍼센트의 7-메틸수소 9,11α-에폭시-3-애톡시-17-히드록시-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤)임을 나타내었다.
7-메틸수소 9,11α-에폭시-3-애톡시-17-히드록시-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤:
1H NMR (CDCl3) ppm 1.02(s, 3H), 1.27(s, 3H), 1.30(t, 3H), 3.12(m, 1H), 3.28(m, 1H), 3.66(s, 3H), 3.78(m, 2H), 5.20(s, 1H), 5.29(d, 1H).
이전 단계에서 제조된 (7-메틸수소 9,11α-에폭시-3-애톡시-17-히드록시-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤)(18mmols)의 8g일부를 120mL의 1,4-디옥산에 용해시켰다. 용액을 6.8g의 53% m-클로로퍼벤조산(20.9mmols), 18.5mL의 1.0N 수산화나트륨(18.5mmols) 및 46mL의 디옥산/물(9:1)의 혼합물과 조합하였다. 온도를 -3℃에서 유지시키고 혼합물을 2시간동안 교반하였다. 온도를 25℃로 올리고 또 다른 20시간동안 계속해서 교반하였다. 혼합물을 각회당 염화메틸렌의 100mL 일부로 4회 추출하였다. 조합된 염화메틸렌 일부를 황산 마그네슘으로 건조하고 상청액용매를 진공증류하에 제거하였다. 13.9g 나머지를 50mL의 에틸에테르로 연화하여 2.0g의 백색 고체를 얻었다. 고체의 2.4g 일부를 100g의 Merck 실리카겔(60μ)로 크로마토그래피하였다. 1L의 1:1 에틸아세테이트/헵탄으로 초기세척 후, 산물을 7:3 비율의 에틸아세테이트/헵탄으로 추출하였다. 풍부해진 분획을 TLC발생 기준으로 조합하였다(EMF 플레이트;에틸아세테이트/헵탄 7:3(v/v) 추출용매; SWUV 확인). 또한, 0.85g의 풍부한 물질을 얻고 10mL의 이소프로판올로부터 재결정하여 0.7g의 7-메틸수소 6β,17-디히드록시-9,11α-에폭시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 얻었다. 더욱 오염된 분획을 조합하여 0.87g의 원 7-메틸수소 6β,17- 디히드록시- 9,11α-에폭시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실산, γ-락톤을 얻었다. 이 물질을 67.8g의 Merck 실리카겔 (40-63μ)에 대해 크로마토그래피하였다. 산물의 추가 0.69g을 0.5 내지 2.5%의 메탄올을 포함하는 톨루엔으로 회수하였다.
7-메틸수소 6β,17-디히드록시-9,11α-에폭시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α ,21- 디카르복실레이트, γ-락톤:
이론상: C, 66.96 및 H, 7.02 : C, 66.68 및 H, 7.16으로 나타남
1H NMR (CDCl3) ppm 1.06(s, 3H), 1.36(dm, 1H), 1.63(s, 3H), 2.92(m, 1H), 3.02(dd, 1H), 3.12(d, 1H), 3.64(s, 3H), 4.61(d,1H), 5.96(s, 1H).
13C NMR (CDCl3) ppm 16.17, 21.32, 21.79, 24.36, 27.99, 28.94, 30.86, 31.09, 32.75, 33.19, 34.92, 36.77, 39.16, 43.98, 47.74, 51.56, 51.66, 65.36, 72.23, 94.79, 165.10, 171.36, 176.41, 199.59.
실시예 47I
7-메틸수소 9,11α-에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7β,21-디카르복실레이트, γ-락톤
의 제조.
실시예 43의 방법으로 제조된 2g(4.8mmol)의 7-메틸수소 9,11α-에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤에 메탄올 중 3.3mL(14.4 mmol)의 25% 나트륨 메톡시드를 첨가하였다. 얻어진 노란 현탁액을 50℃로 가열하였다. 고체가 용해되지 않았다. 혼합물에 3.3ml의 메탄올(Aldrich 무수화물)을 첨가하였다. 혼합물을 환류조건(65℃)으로 가열하고 균질화 되었다. 30분 후 고체침전물이 교반을 방해하였다.
약 25ml의 무수메탄올을 첨가하고 혼합물을 100mL 플라스크에 옮겼다. 혼합물을 혼합물이 어둡고 균질화 되는 16시간동안 환류조건에서 가열하였다. 혼합물을 25℃로 냉각하고 70ml의 3N HCl을 첨가하였다(발열). 여러 그램의 얼음을 혼합물을 냉각하기 위해 첨가하고 용액을 염화메틸렌의 두 연속적 25mL일부로 추출하였다. 어두워진 용액을 황산나트륨으로 건조하고 2.5㎝ 패드의 실리카겔(E.Merck, 70-230 메쉬 60구멍크기)을 통해 여과하였다. 실리카를 100mL의 염화메틸렌으로 추출하였다. 그런 다음 추출된 염화메틸렌을 진공에서 농축하여 에틸아세테이트를 첨가하자마자 결정화된 1g의 갈색 발포체를 얻었다. 실리카 패드를 100ml의 10% 에틸아세테이트/염화메틸렌으로 두번째 추출하고 추출된 용액을 농축하여 650mg의 갈색 발포체를 얻었다.
얇은층크로마토그래피(E.Merck, 60 F-254 실리카겔 0.25mm, 톨루엔/에틸아세테이트(1:1, v/v))는 샘플 둘 모두에서 7-메틸수소 9,11α-에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤 및 7-메틸수소 9,11α-에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7β,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 존재를 밝혔으나 첫번째 샘플에서는 극히 적은 7α-카르복시에피머가 존재하였다. 첫번째 샘플을 뜨거운 에틸아세테이트(77℃)로 연화하고 25℃로 냉각하도록 하였다. 혼합물을 여과하여 mp 254-258℃, 400mg의 탈백색 고체를 얻었다. H, 13C 및 13C-APT는 지정된 구조와 일치하였다. 소량의 에틸아세테이트가 샘플내에 남아있으나 HPLC(Zorbax SB-C8 150×4.6nn, 2mL/분, 이소크라틱 40:60 (v/v) A:B, A=아세토니트릴/메탄올 (1:1), B=물/0.1% 트리플루오로아세트산, 210nm에서 디텍션)(HPLC가 98.6 영역 퍼센트를 나타냈다), 및 TLC(톨루엔-에틸아세테이트 1:1, v/v)에 의하면 어떤 원료도 존재하지 않았다.
FAB-MS는 415.2에서 M.H로 414의 분자량을 확인하였다.
1H NMR (400MHz, 듀테로클로로포름) σ 0.95(s, 3H), 1.50(s, 3H), 1.45(m, 3H), 1.55-2.7(m, 15H), 2.85(t, J=13, 1H), 3.25(d, J=6, 1H), 3.65(s, 3H), 5.78(s, 1H).
실시예 47J
9,11α-에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-7α,21-디카르복실산, γ-락톤
의 제조.
실시예 43의 방법으로 제조된 그리고 3ml의 아세토니트릴에 현탁된 774mg(1.82mml)의 7-메틸수소 9,11α-에폭시-17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4- 엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 3mL(7.5mmol, 2.0 당량)의 2.5M 수산화나트륨을 첨가하였다. 혼합물은 노란색으로 되고 10분 후 균질화되었다.
반응의 진행을 모니터하기 위해, 혼합물의 분취량(0.1mL)을 .01mL의 3M 황산에서 급냉하고 에틸아세테이트(0.2mL)로 4mL 유리바이알안에서 추출하였다. 보다 낮은 수용상을 피펫으로 제거함으로써 상을 분리하였다. 유기상을 스트립하고 실시예 47H에서 설명한 방법을 사용하여 HPLC로 잔여물을 분석하였다. 50분 후 25℃에서 혼합물의 조성에는 거의 변화가 없었다.
혼합물을 환류조건(약 90℃)으로 50분간 가열하였다. 혼합물의 HPLC 분석은 남은 원료의 6영역 퍼센트를 나타냈다. 혼합물을 65시간동안 25℃에서 교반하였다. 상기 설명과 같이 분취량의 산성화, 추출 및 HPLC 분석은 어떤 원료도 남아있지 않음을 확인하였다.
혼합물을 약 4mL의 3M 황산을 넣어 강하게 산성화하고 및 염화메틸렌의 두 일부(약 10mL)로 추출하였다. 유기상을 조합하고 황산나트륨으로 건조시켰다. 회전 증발기상의 농축은 780g의 고체를 가져왔다. 고체를 디메틸포름아미드/메탄올로부터 재결정하여 503mg(67%)의 황갈색 결정고체를 얻었다. 샘플은 급속히 가열했을때 가스를 내며 260℃ 가까이서 녹았다. 샘플을 천천히 285℃로 가열하였을 때 샘플은 서서히 어두운 색으로 되고 고체로 되었다.
1H NMR (디메틸술포시드 d-6, 400MHz) σ 0.85(s, 3H), 1.4(s, 3H), 1.3-2.9 (m, 19H), 3.15(m, 1H), 5.55(s, 1H), 11.8(br, 1H).
실시예 47K
반응식 1: 단계 3D: 방법 I: 메틸수소 9,11α-에폭시-17α-히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 합성.
염화메틸렌내에 화학식 IIA의 0.2M 엔에스테르 용액을 동량의 물(50% w/w 수용성용액)에 용해시킨 인산이칼륨의 2당량, 3당량의 클로로디플루오로아세트아미드 및 22당량의 과산화수소(30% 수용성용액으로 첨가함)와 조합하였다. 혼합물을 23시간동안 25℃에서 교반하였다. 반응물을 과산화수소 차지와 같은 양의 물로 희석하고 염화메틸렌을 분리하였다. 염화메틸렌 일부를 3% 아황산나트륨용액(과산화수소 차지의 1.75배에 해당하는 부피)으로 1회 세척하였다. 염화메틸렌 일부를 분리하고 황산나트륨으로 건조시켰다. 용액을 70℃의 헤드 온도가 달성될 때까지 대기압증류하에 농축하였다. 잔여물을 HPLC, 1H 및 13C NMR (CDCl3)을 통해 평가하였다. 에폭시멕스레논의 수율은 HPLC를 통해 54.2 영역%로 결정되었다.
실시예 47L
반응식 1: 단계 3D: 방법 J: 메틸수소 9,11α-에폭시-17α-히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 합성.
실시예 47K의 과정을 클로로디플루오로아세트아미드 대신에 헵타플루오로아세트아미드(CF3CF2CF2CONH2)를 사용하여 반복하였다. 에폭시멕스레논의 수율은 HPLC를 통해 58.4 영역%로 결정되었다.
실시예 48-톨루엔을 사용하여 화학식IIA의 엔에스테르의 에폭시화
반응식 1: 단계 3D: 방법 J: 메틸수소 9,11α-에폭시-17α-히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 합성.
화학식IIA의 엔에스테르를 톨루엔을 용매로 사용한 것을 제외하고는 실시예 46에서 일반적으로 설명한 방법으로 에폭시멕스레논으로 전환하였다. 반응기에 채워진 물질은 엔에스테르(2.7g) 트리클로로아세트아미드(2.5g), 인산수소이칼륨 (1.7g), 과산화수소(17.0g) 및 톨루엔(50ml)를 포함한다. 반응을 28℃로 발열반응하도록 하고 4시간이 지나 완료되었다. 얻어진 세개의 상 혼합물을 15℃로 냉각하고, 여과하고, 물로 세척한후 건조시켜 2.5g의 산물을 얻었다.
실시예 49 - 반응식 4:방법 A: 9,11-디에논의 에폭시화
XVIIA로 명명되는 화합물(-A-A- 및 -B-B- 모두 -CH2-CH2-인 화합물)(40.67g)을 일리터 3-구 플라스크안의 염화메틸렌(250mL)에 용해시키고 외부에서 얼음염 혼합물로 냉각하였다. 30% 과산화수소(200g)을 1시간에 걸쳐 서서히 넣은 후 인산이칼륨(22.5g) 및 트리클로로아세토니트릴(83.5g)을 넣고 혼합물을 2℃로 냉각하였다. 반응혼합물을 12℃에서 8시간동안 그리고 실온에서 14시간동안 교반하였다. 소량의 유기층을 회수하여 어떤 원료 에논에 대하여 확인한 결과 <0.5%임을 알 수 있었다. 물(400mL)을 첨가하고 15분동안 교반하고 층을 분리하였다. 유기층을 각회마다 층을 분리하는 200mL의 요오드화칼륨(10%), 200mL의 티오황산나트륨(10%) 및 100mL의 포화중탄산나트륨용액으로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 무수황산마그네슘으로 건조하고 농축하여 원 에폭시드(41g)를 얻었다. 에틸아세테이트:염화메틸렌으로부터 결정화하여 14.9g의 순수물질을 얻었다.
실시예 50-반응식 4: 방법B: m-클로로퍼벤조산을 사용하여 화합물 WVIIA의 에폭시화
화합물 WVIIA(18.0g)을 250mL의 염화메틸렌에 용해시키고 10℃로 냉각하였다. 교반하에 고체 m-클로로퍼벤조산(50-60% 순수, 21.86g)을 15분동안 첨가하였다. 온도에서 어떤 상승도 관찰되지 않았다. 반응혼합물을 3시간동안 교반하고 디에논의 존재를 확인하였다. 반응혼합물을 아황산나트륨용액(10%), 수산화나트륨 용액(0.5N), 염산용액(5%) 및 마지막으로 50mL의 포화브린용액으로 연속적으로 처리하였다. 무수황산마그네슘으로 건조 및 증발과정 후, 17.64g의 에폭시드를 얻고 다음 단계에 직접적으로 사용하였다. 산물은 에틸아세테이트로부터 연화에 이어서 염화메틸렌으로부터 결정화에 의해 제거되어야만 하는 Baeyer-Villiger 산화산물을 포함하는 것으로 나타났다. 500g 크기로, 침전된 m-클로로벤조산을 여과하고 이어서 통상의 마무리를 행하였다.
실시예 51 - 반응식 4: 방법 C: 트리클로로아세트아미드를 사용하여 화합물 WVIIA의 에폭시화.
화합물 WVIIA(2g)을 25mL의 염화메틸렌에 용해시켰다. 트리클로로아세트아미드(2g), 인산이칼륨(2g)을 첨가하였다. 교반하에 실온에서 30% 과산화수소(10mL)를 첨가하고 교반을 18시간동안 계속하여 에폭시드(1.63g)를 얻었다. Baeyer-Villiger 산물은 형성되지 않았다.
실시예 52
수산화칼륨(56.39g; 1005.3mmol; 3.00 eq.)을 2000mL플라스크에 채우고 주위온도에서 디메틸술폭시드(750.0mL)로 현탁하였다. 화학식 XX(R3는 H이고 -A-A- 및 -B-B-는 각각 -CH2CH2-인)(100.00g; 335.01mmol; 1.00eq)에 상응하는 트리에논을 THF(956.0mL)와 함께 플라스크에 채웠다. 트리메틸술포늄 메틸술페이트(126.14g; 670.02 mmol; 2.00 eq.)를 플라스크에 넣고 얻어진 혼합물을 환류, 즉 80 내지 85℃에서 1시간동안 가열하였다. 17-스피로옥시메틸렌으로의 전환을 HPLC로 확인하였다. 물(460mL)을 30분이상에 걸쳐 채운후 반응혼합물을 15℃로 냉각하는 동안 약 THF 1L를 진공하에 반응혼합물로부터 스트립하였다. 얻어진 혼합물을 여과하고 고체 옥시란 산물을 물의 200mL 분취량으로 2회 세척하였다. 산물이 매우 잘 결정화되는 것을 관찰하고 여과를 서슴없이 수행하였다. 그 후 산물을 진공하에 40℃에서 건조시켰다. 104.6g의 3-메틸에놀에테르 Δ-5,6,9,11,-17-옥시란 스테로이드 산물을 분리하였다.
실시예 53
나트륨에톡시드(41.94g; 616.25mmol; 1.90 eq.)를 질소 블랭킷 하에 건조한 500mL 반응기에 채웠다. 에탄올(270.9mL)을 반응기에 채우고 나트륨메톡시드를 에탄올에서 슬러리시켰다. 디에틸말로네이트(103.90g; 648.68mmol; 2.00 eq.)를 실시예 52(104.60g; 324.34mmol; 1.00eq.)에서 설명한 방법으로 제조된 옥시란스테로이드를 첨가한 후 슬러리에 채우고 얻어진 혼합물을 환류 즉, 80 내지 85℃로 가열하였다. 반응의 완료를 HPLC로 확인한 후 가열을 4시간동안 계속하였다. 혼합물이 15℃로 냉각되는 동안 물(337.86mL)을 30분에 걸쳐 반응혼합물에 채웠다. 교반을 30분동안 계속한 후 반응슬러리가 고운 무정형의 분말로 이루어진 필터케익을 제조하면서 여과되었다. 필터케익을 물(200mL)로 2회 세척하고 그런 다음 진공에서 주위온도로 건조시켰다. 133.8g의 3-메틸에놀에테르-Δ5,6,9,11,-17-스피로락톤-21-에톡시카르보닐 중간체를 분리하였다.
실시예 54
3-메틸에놀에테르-Δ5,6,9,11,-17-스피로락톤-21-에톡시카르보닐 중간체(실시예 53에서 제조한 대로 R3가 H이고 -A-A- 및 -B-B-는 각각 -CH2-CH2- 인 화학식 WVIII; 133.80g; 313.68mmol; 1.00eq)를 염화나트륨(27.50g; 470.52mmol;1.50 eq.)과 함께 반응기에 채우고 디메틸포름아미드(709mL) 및 물(5mL)을 교반하에 2000mL 반응기에 넣었다. 얻어진 혼합물을 HPLC로 반응완료를 확인한후 3시간동안 환류, 즉 138 내지 142℃로 가열하였다. 그런 다음 혼합물이 15℃로 냉각되고 있는 동안 물을 혼합물에 30분에 걸쳐 첨가하였다. 반응슬러리를 여과한 후 30분동안 교반을 계속하여 필터케익인 무정형 고체반응산물을 회수하였다. 필터케익을 건조한 후 2회(물의 200mL 분취량) 세척하였다. 산물 3-메틸레놀에테르-17-스피로락톤을 건조하여 91.6g(82.3% 수율; 96영역% 정량)을 얻었다.
실시예 55
실시예 54(91.60g; 258.36 mmol; 1.00 eq.)와 같이 제조된 에놀에테르, 에탄올(250mL), 아세트산(250mL) 및 물(250mL)을 2000mL반응기에 채우고 얻어진 슬러리를 2시간동안 환류로 가열하였다. 반응혼합물이 15℃로 냉각되는 동안 30분에 걸쳐 물(600mL)을 채웠다. 그런 다음 반응물 슬러리를 여과하고 필터케익을 물(200mL 분취량)로 2회 세척하였다. 필터케익을 건조시켰다; 84.4g의 산물 3-케토 Δ4,5, 9,11,-17-스피로락톤을 분리하였다(R3가 H이고 -A-A- 및 -B-B-는 -CH2-CH2- 인 화학식 WVII의 화합물; 95.9% 수율).
실시예 56
화합물 XVIIA(1kg; 2.81몰)을 카본테트라클로리드(3.2L)와 함께 22L 4-구 플라스크에 채웠다. N-브로모-숙시나미드(538g)에 이어서 아세토니트릴(3.2L)을 혼합물에 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 환류로 가열하고 68℃ 환류온도에서 약 3시간 동안 유지하여 선명한 오랜지색의 용액을 제조하였다. 가열한지 5시간 후, 용액은 어둡게 변하였다. 6시간 후 열을 제거하고 반응혼합물을 샘플화하였다. 용매를 진공하에 스트립하고 에틸아세테이트(6L)를 증류기의 바닥에 있는 잔여물에 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 5% 중탄산나트륨용액(4L)을 첨가한 후 교반하고 상이 분리되도록 한 후 15분간 교반하였다. 수용층을 제거하고 포화브린용액(4L)을 15분간 교반한 혼합물에 주입하였다. 상을 다시 분리하고 유기층을 진공하에 스트립하여 걸쭉한 슬러리를 생산하였다. 그런 다음 디메틸포름아미드(4L)를 첨가하고 스트립핑을 55℃의 폿트 온도로 계속하였다. 증류기의 바닥을 밤새 정치시키고 DABCO(330g) 및 브롬화리튬(243g)을 첨가하였다. 그 후 혼합물을 70℃로 가열하였다. 가열한지 한시간 반 후, 액체크로마토그래피 샘플을 회수하여 가열한지 3.50시간 후 추가의 DABCO(40g)을 넣었다. 가열한지 4.5시간 후, 물(4L)를 주입하고 얻어진 혼합물을 15℃로 냉각하였다. 슬러리를 여과하고 케익을 물(3L)로 세척하고 밤새 필터에서 건조하였다. 젖은 케익(978g)을 22L 플라스크에 역으로 채우고 디메틸포름아미드 (7L)를 첨가하였다. 또한 제조된 혼합물을 케익이 용액속으로 완전히 채워지는 지점에서 105℃로 가열하였다. 열원을 제거하고 플라스크안의 혼합물을 교반하고 냉각하였다. 얼음물을 반응기 자켓에 적용하여 반응기내의 혼합물을 14℃로 냉각하고 2시간동안 정치시켰다. 얻어진 슬러리를 여과하고 물의 2.5L 분취량으로 2회 세척하였다. 필터케익을 진공하에 밤새 건조하였다. 밝은 갈색의 고체산물 510g을 얻었다.
실시예 57
2-L 4-구 플라스크에 다음을 채웠다: 실시예 56에서 제조된 9,11-에폭시칸레논(100.00g; 282.1mmol; 1.00 eq), 디메틸포름아미드(650.0 mL), 염화리튬 (30.00g; 707.0mmol; 2.51 eq.) 및 아세톤시아노히드린(72.04g; 77.3mL; 846.4mmol ;3.00 eq.). 얻어진 현탁액을 기계적으로 교반하고 테트라메틸구아니딘(45.49g; 49.6mL; 395.0mmol; 1.40 eq.)으로 처리하였다. 그런 다음 시스템을 HCN의 이탈을 막기위해 물 냉각 능축기 및 드라이 아이스 능축기(아세톤에 드라이 아이스로 채운)로 여과시켰다. 벤트라인은 드라이 아이스 능축기로부터 다량의 과잉 염소표백제로 채워진 스크러버속으로 넘어갔다. 혼합물을 80℃로 가열하였다.
18시간 후, 교반하여 실온으로 냉각된 어둔 붉은색에 가까운-갈색용액을 얻었다. 냉각 과정동안, 질소를 스크러버 안의 표백제 속으로 넘어간 벤트라인과 함께 나머지 HCN을 제거하기 위해 용액속으로 살포하였다. 두 시간후 용액을 아세트산(72g)으로 처리하고 30분동안 교반하였다. 원혼합물을 교반하면서 얼음물(2L)속으로 부었다. 교반된 현탁액을 10% 수용성 HCl로 더욱 처리하고 1시간동안 교반하였다. 그런 다음 혼합물을 여과하여 어둔 벽돌색과 같은 붉은 고체(73g)를 얻었다. 여과물을 4L 분별깔때기에 놓고 염화메틸렌(3×800mL)으로 추출하였다; 유기층을 조합하고 물(2×2L)로 역추출하였다. 염화메틸렌용액을 진공에서 농축하여 61g의 어두운 붉은색 기름을 얻었다.
수성 세척 분획을 밤새 방치한 후, 상당한 침전물이 발생하였다. 이 침전물을 여과에 의해 회수하고 순수한 산물 에나민(14.8g)임을 확인하였다.
건조 후 원래의 붉은 고체(73g)를 HPLC로 분석하고 주성분이 9,11-에폭시에나민임을 결정하였다. HPLC는 또한 에나민이 염화메틸렌 마무리로부터 얻어진 붉은색 기름의 주성분임을 나타내었다. 산출된 에나민의 몰수율은 46%이다.
실시예 58
실시예 57과 같이 제조돈 9,11-에폭시에나민(4.600g; 0.011261 mol; 1.00 eq.)를 1000mL 원형바닥 플라스크안에 주입하였다. 메탄올(300mL) 및 0.5중량% 수용성 HCl(192mL)을 17시간동안 환류로 가열한 혼합물에 첨가하였다. 메탄올을 그 후 진공하에 제거하여 증류기 폿트안의 물질량을 50mL로 감하고 백색 침전물의 형성을 가져왔다. 물(100mL)을 그 후 여과된 슬러리에 첨가하여 물로 세번 세척한 백색 고체케익을 생산하였다. 고체 9,11-에폭시디케톤 산물의 수율은 3.747g(81.3%)이었다.
실시예 59
실시예 58과 같이 제조된 에폭시디케톤(200mg; 0.49mmol)을 메탄올(3mL)에서 현탁시키고 1,8-디아자비시클로[5,4,0]운덱-7-엔(DBU)을 혼합물에 첨가하였다. 24시간동안 환류하에서 가열하자마자 혼합물은 균질화 되었다. 그런다음 회전증발기에서 30℃로 농축하여 건조물로 만들고 나머지를 염화메틸렌 및 3.0N HCl 사이에 분배하였다. 유기상의 농축은 22중량% 에폭시멕스레논으로 결정된 노란색의 고체 (193mg)를 가져왔다. 수율은 20%이었다.
실시예 60
1.5mL의 메탄올에서 현탁시킨 100mg의 디케톤(실시예 58과 같이 제조된)에 메탄올 중 10마이크로리터(0.18 eq)의 25%(w/w) 나트륨메톡시드 용액을 첨가하였다. 용액을 환류온도로 가열하였다. 30분 후 어떤 디케톤도 남아있지 않고 5-시아노에스테르가 존재하였다. 혼합물에 메탄올 중 46마이크로리터의 25%(w/w) 메탄올 나트륨 용액을 첨가하였다. 혼합물을 HPLC로 판단하여 주산물이 에폭시멕스레논인 23시간동안 환류온도에서 가열하였다.
실시예 61
30ml의 건조한 메탄올에 현탁시킨 2g의 디케톤(실시예 48과 같이 제조된)에 0.34mL의 트리에틸아민을 첨가하였다. 현탁액을 4.5시간동안 환류에서 가열하였다. 혼합물을 16시간동안 25℃에서 교반하였다. 얻어진 현탁액을 여과하여 백색 고체인 1.3g의 5-시아노에스테르를 얻었다.
80mL의 메탄올에 현탁시킨 6.6g의 디케톤에 2.8mL의 트리에틸아민을 첨가하였다. 혼합물을 4시간동안 환류온도에서 가열하고 산물이 용액으로부터 결정화되는 88시간동안 25rpm에서 교반하였다. 여과에 이어서 메탄올 세척은 백색분말인 5.8g의 시아노에스테르를 가져왔다. 그 물질을 클로로포름/메탄올로부터 재결정하여 HPLC에 의해 균질화된 3.1g의 결정물질을 얻었다.
상기에서 볼 때, 본 발명의 여러 목적이 달성되고 다른 유익한 결과들이 얻어질 것이 보인다.
여러가지 변화들이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 상기 조성물 및 과정에서 이루어짐에 따라, 상기 설명에 포함되거나 동반된 그림에서 보여지는 모든 문제들은 제한된 의미안에서가 아닌 구체예로 해석될 것이다.
신규 화합물
본 발명은 스피로노락톤 또는 에폭시멕스레논과 같은 바람직한 생활성을 갖는 스테로이드계 화합물의 제조에서 크로마토그래피의 마터로 유용한 추가의 폴리시클릭 유기 모이어티로 더욱 방향을 잡는다.
요약해서, 스테로이드 핵의 13,17 위치에 접합되는 치환 또는 비치환 스테로이드 핵 및 치환 또는 비치환 카보시클릭 고리로 구성되는 어떤 화합물도 스피로노락톤 및 에폭시멕스레논과 같은 스테로이드계 물질의 제조에 내부 또는 크로마토그래피 마커로 사용될 수 있다. 특히, 메틸 화합물 2,3,3a,4,6,7,9,10,11,11a,12, 13-도데카히드로-3aβ,11aβ-디메틸-1,9-디옥소-1H-펜탈레노[1,6a-a]펜난트렌-6α-카르복실산:
(화학식 C-1)
은 크로마토그래피 마커로 유용하다. 본 발명의 이러한 화합물 및 관련 화합물들의 신규 특성중 하나는 스테로이드 핵의 D 고리에 부착된 접합 카보시클릭 고리이다. 스피로노락톤 및 에폭시멕스레논은 이러한 특성이 부족하고 대신 20-스피로락톤 고리를 가지고 있다.
여기에 사용한 것과 같이, 화합물의 스테로이드 핵은 다음의 구조에 해당된다.
(화학식 C-2)
이 구조는 스테로이드 화합물에 대한 통상적 넘버링 및 고리 명명을 반영한다. 스테로이드 핵은 포화, 비포화, 치환 또는 비치환될 수 있다. 바람직하게는, 이는 적어도 하나 내지 네개의 비포화 결합을 포함한다. 더욱 바람직하게는, A, C 및 D 고리는 각각 적어도 하나의 비포화 결합을 포합한다. 스테로이드 핵은 또한 이하 더욱 구체적으로 논의되는 것과 같이 치환될 수 있다. 바람직하게는, 핵은 적어도 C7 에스테르기로 치환된다.
여기 사용된 바와 같이, 스테로이드 핵에 접합된 카보시클릭 고리는 네개, 다섯 또는 여섯개의 카본 시클릭 골격에 해당된다. 이는 포화, 비포화, 치환 또는 비치환될 수 있다. 바람직하게는, 이는 포화되거나 하나의 이중결합을 갖고, 히드록시 또는 케토기로 치환된다. 더욱이, 카보시클릭 고리는 바람직하게 스테로이드 핵과 관련된 α-오리엔테이션을 갖는다.
바람직한 구체예에서, 카보시클릭 고리는 다섯개의 카본 시클릭 골격으로 이루어지고 α-오리엔테이션을 갖고, 화합물은 다음의 화학식에 상응하는 화합물로 구성되는 군으로부터 선택된다:
(화학식 C-3)
여기서 -A-A-는 -CR102R102a-CR103R103a- 또는 -CR102 =CR103- 기를 나타내고, 여기서 -CR102R102a- 및 -CR102 =는 C2 탄소에 해당하고, -CR103R 103a- 및 =CR103- 는 C3 탄소에 해당한다;
-D-D-는 -CHR104-CH- 또는 -CR104=C- 기를 나타내고;
-E-E-는 -CH2-CR110- 또는 -CH=C- 기를 나타내고;
-A-E-는 -CR102R102a-CH2- 또는 -CR102=CH 기를 나타내고, 여기서 -CR102R102a- 및 -CR102= 는 C2 탄소에 해당하고 -CH2- 및 =CH- 는 C1 탄소에 해당한다;
-G-G-는 -CR106R106a-CHR107- 또는 -CR106=CR107- 기를 나타내고, 여기서 -CR106R106a- 및 -CR106= 는 C6 탄소에 해당하고 -CHR107- 및 =CR107- 는 C7 탄소에 해당한다.
-J-J- 는 -CR108-CR109- 또는 -C=C- 기를 나타내고, 여기서 -CR108- 는 C8 탄소에 해당하고 -CR109- 는 C9 탄소에 해당한다;
-L-L- 은 -CR111R111a-CH2- 또는 -CR111=CH- 기를 나타내고, 여기서 -CR111R111a- 및 -CR111= 는 C11 탄소에 해당하고 -CHR2- 및 =CH- 는 C12 탄소에 해당한다;
-J-L- 은 -CR109-CR111R111a- 또는 -C=CR111- 기를 나타내고, 여기서 -CR109- 및 -C=는 C9 탄소에 해당하고, -CR111R111a- 및 -CR111- 는 C11에 해당한다;
-M-M- 은 -CR114-CH2- 또는 -C=CH- 기를 나타내고, 여기서 -CR114- 및 -C= 는 C14 탄소에 해당하고, -CH2- 및 -C=H-는 C15 탄소에 해당한다;
-J-M- 은 -CR108-CR114- 또는 -C=C- 기를 나타내고, 여기서 -CR108- 는 C8 탄소에 해당하며 -CR114- 는 C14 탄소에 해당한다;
-Q-Q- 는 -CR120R120a-CR119R119a- 또는 -CR120=CR 119- 기를 나타내고, 여기서 -CR120R120a- 및 -CR120=CR119- 는 C20 탄소에 해당하고, -CR 119R119a- 및 =CR119- 는 C19 탄소에 해당한다;
-Q-T- 는 -CR119R119a-CHR118- 또는 -CR119=CR118- 기를 나타내고, 여기서 -CR119R119a- 및 -CR119= 는 C19 탄소에 해당하고 -CHR118- 및 =CR118- 는 C18에 해당한다;
R102 는 수소, 알킬, 알케닐, 또는 알키닐;
R102a 는 수소; 또는 -A-A-가 -CR102=CR103- 기를, -A-E-가 -CR102 R102a-CH2-기를 나타낼때 C2 탄소 원자와 C3 탄소 원자 사이의 결합을 나타내고; 또는 -A-E-가 -CR102=CH-기를, -A-A-가 -CR102R102a-CR103R103a-기를 나타낼때 C1 탄소 원자와 C2 탄소 원자사이의 결합을 나타낸다;
R103 는 수소, 히드록시, 보호된 히드록시, R103O-, R103C(O)O-, R103OC(O)0-, 또는 R103a와 함께 옥소를 형성한다; 단, R103가 R103a와 함께 옥소를 형성할 때 -A-A-는 -CR102R102a-CR103R103a- 이다;
R103a는 수소, 또는 R103와 함께 옥소를 형성한다; 단, R103a가 R103 와 함께 옥소를 형성할 때 -A-A-는 -CR102R102a-CR103R103a- 이다;
R104는 수소, 알킬, 알케닐 또는 알키닐이다;
R106는 수소, 히드록시 또는 보호된 히드록시, 또는 R106a와 함께 옥소를 형성한다, 또는 R106a 및 부착된 탄소 원자와 함께 시클로프로필, 시클로부틸 또는 시클로펜틸 고리를 형성한다; 단, R106가 R106a와 함께 옥소를 형성할 때 -G-G-는 -CR106R106a-CR107R107a- 이다.
R106a는 수소, 히드록시 또는 보호된 히드록시, 또는 R106a 와 함께 옥소를 형성하거나, R106 및 부착된 탄소원자와 함께 시클로프로필, 시클로부틸, 또는 시클로펜틸 고리를 형성하거나, 또는 R107및 부착된 탄소원자와 함께한 R106a는 시클로프로필, 시클로부틸, 또는 시클로펜틸 고리를 형성한다;
R107은 수소;히드록시카르보닐; 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 아랄킬; 할로알킬; 히드록시알킬; 알콕시알킬; 저급 알카노일, 알케노일, 알키노일, 아릴오일, 헤테로아릴오일 또는 아랄카노일; 저급 알콕시카르보닐, 알케녹시카르보닐, 알키녹시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 헤테로아릴옥시카르보닐 또는 아랄콕시카르보닐; 저급 알카노일티오, 알케노일티오, 알키노일티오, 아릴오일티오, 헤테라로일티오 또는 아랄카노일티오; 저급 알킬티오, 알케닐티오, 알키닐티오, 아릴티오, 헤테로아릴티오 또는 아랄킬티오; 카바밀; 알콕시카르보닐아미노; 또는 시아노; 또는
R106a와 부착된 탄소와 함께 R107은 시클로프로필, 시클로부틸 또는 시클로펜틸 고리를 형성하고; 또는
C7,C8 및 C14 탄소 원자와 함께 R107 및 R114는 γ-락톤을 형성한다;
R108 은 수소, 히드록시, 보호된 히드록시, 알킬, 알케닐, 알키닐, R140O-, R140C(O)0-, 또는 R1400C(O)0-이고; 또는 -J-J-가 -C=C-기를, -J-M-이 -CR108 -CR114-기를 나타낼 때 C8 탄소원자 및 C9 탄소원자 사이의 결합을 나타내고; 또는 -J-M-이 -C=C- 기를 나타내고 -J-J-가 -CR108-CR114-기를 나타낼 때 C8 탄소원자 및 C14 탄소원자사이의 결합을 나타낸다.
R109 은 수소, 히드록시, 보호된 히드록시, 알킬, 알케닐, 알키닐, R150O-, R150C(O)O-, 또는 R150OC(O)O-; 또는 -J-L- 는 -C=CR111- 기를, -J-J-는 -CR108-CR109- 기를 나타낼때 C9 탄소원자 및 C11 탄소원자 사이의 결합을 나타내고; 또는 -J-J-가 -C=C-기를 -J-L-기가 -CR109-CR111R111a-기를 나타낼때 C9 탄소원자와 C8 탄소원자 사이의 결합을 나타낸다.
R110은 수소 또는 메틸이고;
R111은 수소, 히드록시 또는 보호된 히드록시, 또는 R111a와 함께 옥소를 형성한다, 단, R111a와 함께 옥소를 형성할 때는 -J-L-이 -CR109-CR111R111a -기를, -L-L-이 -CR111R111a-CH2-기를 나타낸다;
R111a는 수소, 또는 R111과 함께 옥소를 형성한다, 단, R111a가 R111 과 함께 옥소를 형성할 때는 -J-L-이 -CR109-CR111R111a-기를, -L-L-이 -CR111 R111a-CH2-기를 나타낸다; 또는 -J-L-이 -C=CR111- 기를, -L-L-이 -CR111R111a-CH2-기를 나타낼 때 C11 탄소원자 및 C9 탄소원자 사이의 결합을 나타내고; 또는 R111a는 -L-L-이 -CR111=CH-기를, -J-L-이 -CR109R109a-CR111R111a-를 나타낼 때 C11 탄소원자 및 C12 탄소원자 사이의 결합을 나타낸다;
R114는 수소, 히드록시, 보호된 히드록시, 알킬, 알케닐, 알키닐, R160O-, R160C(0)0-, R160OC(0)0-이고; 또는 C7, C8 및 C14 탄소와 함께 R114 및 R107 은 γ-락톤을 형성한다; 또는 R114는 -J-M-이 -C=C-기를, -M-M-이 -CR114-CH2-기를 나타낼때 C14 탄소원자와 C8 탄소원자 사이의 결합을 나타낸다; 또는 R114는 -M-M-이 -C=CH-기를, -J-M-이 -CR108-CR114-기를 나타낼 때 C14 탄소원자와 C15 탄소원자 사이의 결합을 나타낸다;
R118은 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬티오, 알케닐티오 또는 시아노이다;
R118a 는 수소이고, 또는 -Q-T-가 -CR118=CR119-기를, -Q-Q-가 -CR119 R119a-CR120 R120a-기를 나타낼 때 C18 탄소원자 및 C19 탄소원자 사이의 결합을 나타낸다;
R119은 수소, 알킬 또는 알케닐이다;
R119a는 수소이고, 또는 -Q-Q-가 -CR120=CR119-기를, -Q-T-가 -CR119 R119a-CR118 R118a-기를 나타낼 때 C19 탄소원자 및 C20 탄소원자 사이의 결합을 나타내고; 또는 -Q-T-가 -CR119=CR118-기를, -Q-Q-가 -CR119R119a- CR120 R120a-기를 나타낼 때 C19 탄소원자와 C18 탄소원자 사이의 결합을 나타낸다;
R120은 수소, 히드록시, 보호된 히드록시 또는 R120a와 함께 옥소를 형성한다; 단, R120이 R120a와 함께 옥소를 형성할 때 -Q-Q-는 -CR119R119a - CR120 R120a-기를 나타낸다;
R120a는 수소 또는 R120과 함께 옥소를 형성한다; 단, R120a이 R120 와 함께 옥소를 형성할 때 -Q-Q-는 -CR119R119a- CR120 R120a-기를 나타낸다; 그리고
R130, R140,R150 및 R160 은 각각 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 헤테로아릴이다.
보다 바람직하게는, 화합물은 R107은 수소, 히드록시카르보닐, 저급 알킬, 저급 알카노일, 저급 알콕시카르보닐, 저급알카노일티오, 저급알킬티오, 카바밀이고 또는 R106a 및 부착된 탄소와 함께 R107는 시클로프로필 고리를 형성하며; R106 은 수소, 히드록시이고 또는 R106a및 부착된 탄소와 함께 시클로프로필 고리를 형성하고; R106a 는 수소, 히드록시이고 또는 R106 및 부착된 탄소와 함께 시클로프로필 고리를 형성하고; 또는 R107 및 부착된 탄소와 함께 R106a은 시클로프로필 고리를 형성하고; R120은 케토인 화학식 C-3의 화합물에 해당한다.
다음의 정의는 본 발명 구체화에 개시된 13,17-접합 고리 화합물과 관련한 논의에 적용된다.
용어 "저급 알킬"은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸 및 헥실과 같은 1 부터 6 까지의 탄소원자를 갖는 알킬라디칼을 의미한다. 라디칼은 직선, 가지달린 사슬, 또는 시클릭 및 치환(특히 아릴로), 비치환 또는 헤테로치환될 수 있다.
용어 "저급 알카노일"은 바람직하게는 1부터 7까지의 탄소원자를 갖는 직선-사슬 알킬에서 유도된 그리고 카르보닐 기를 통해 모분자 모이어티에 부착된 라디칼을 의미한다.
용어 "저급 알콕시카르보닐"은 바람직하게는 1부터 7까지의 탄소원자를 갖는 직선-사슬 알킬에서 유도된 그리고 산소원자에 부착된 라디칼을 의미하고, 상기 산소원자는 카르보닐기를 통해 모분자 모이어티에 부착된다. 특히 바람직하게는 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, 이소프로폭시카르보닐 및 n-헥실옥시카르보닐이다.
용어 "저급 알케닐"은 에테닐, 프로페닐, 이소프로페닐, 부테닐, 이소부테닐, sec-부테닐 및 tert-부테닐, 펜테닐 및 헥세닐과 같은 2부터 6까지의 탄소원자를 갖는 알케닐 라디칼을 의미한다. 라디칼은 직선 또는 가지달린 사슬이고 치환, 비치환 또는 헤테로치환일 수 있다. 용어 " 저급 알케노일" 및 "저급 알케녹시카르보닐" 은 그들이 직선사슬 알킬대신 직선사슬 알케닐로부터 유도된다는 점만 제외하고는 각각 "저급 알카노일" 및 "저급 알콕시카르보닐"와 같은 방법으로 정의된다. 바람직하게는, 어떤 알케녹시카르보닐기의 알케닐 라디칼에 부착된 산소는 적어도 하나의 메틸렌 기에 의해 비포화 탄소로부터 분리된다.
용어 "저급 알키닐"은 에티닐, 프로피닐, 이소프로피닐, 부티닐, 이소부티닐, sec-부티닐 및 tert-부티닐, 펜티닐 및 헥시닐과 같은 2부터 6까지의 원자를 갖는 알키닐 라디칼을 의미한다. 라디칼은 직선 또는 가지달린 사슬이고 치환, 비치환 또는 헤테로치환될 수 있다. 용어 "저급 알키노일" 및 "저급 알키녹시카르보닐"은 그들이 직선사슬 알킬 대신에 직선사슬 알키닐로부터 유도된다는 점만 제외하고는 "저급 알카노일" 및 "저급 알콕시카르보닐"과 같은 방법으로 정의된다. 바람직하게는, 어떤 알키녹시카르보닐기의 알키닐 라디칼에 부착된 산소도 적어도 하나의 메틸렌기에 의한 어떤 비포화 탄소로부터 분리된다.
"아릴" 모이어티는 바람직하게 단독으로 또는 여러 치환체를 가지고 5부터 15까지 원자를 포함하고 페닐을 포함한다.
용어 "저급 알킬티오"는 바람직하게는 1부터 7까지의 탄소원자를 갖는 직선-사슬 알킬로부터 유도된 그리고 황 원자를 통해 모분자 모이어티에 부착된 라디칼을 의미한다. 특히 바람직하게는 메틸티오이다.
용어 "저급 알카노이티오"는 바람직하게는 1부터 7까지의 탄소원자를 갖는 직선-사슬 일킬로부터 유도된 그리고 황 원자를 통해 모분자 모이어티에 부착된 상기 카르보닐기에 부착된 라디칼을 의미한다. 특히 바람직하게는 아세틸티오이다.
용어 "저급 알케닐티오" 및 "저급 알케노일티오"는 그들이 직선사슬 알킬 대신 직선사슬 알케닐로부터 유도된다는 점만 제외하고는 각각 "저급 알킬티오" 및 "저급 알카노일티오"와 같은 방법으로 정의된다. 바람직하게 알케닐티오기의 황 원자는 적어도 하나의 메틸렌기에 의한 어떤 비포화 탄소으로부터 구별된다.
용어 "저급 일키닐티오" 및 "저급 알키노일티오"는 그들이 직선사슬 알킬 대신 직선사슬 알케닐로부터 유도된다는 점만 제외하고는 각각 "저급 알킬티오" 및 "저급 알카노일티오"와 같은 방법으로 정의된다. 바람직하게 알키닐티오기의 황 원자는 적어도 하나의 메틸렌기에 의한 어떤 비포화 탄소으로부터 구별된다.
용어 "카바밀"은 카르보닐 기를 통해 모분자 모이어티에 부착된 -NH2-라디칼을 의미한다. 카바밀기는 모노-치환 또는 디-치환일 수 있으며 치환체는 알킬, 알케닐, 알키닐 및 아릴 라디칼을 포함할 수 있다.
상기에서 정의된 기는 비치환 또는 추가적으로 치환될 수 있다. 그런 추가적인 치환체로는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알콕시, 카르복시알킬, 아실, 아실옥시와 같은 카르복시, 클로로 또는 플루오로와 같은 할로, 할로알콕시, 니트로, 아미노, 아미도 및 케토를 포함할 수 있다. 추가적인 치환체 뿐만 아니라 상기에서 정의된 기는 또한 산소, 황, 인 및/또는 질소를 포함할 수 있다.
여기서 사용한 것과 같이 "Me" 는 메틸을 의미하고; "Et"은 에틸을 의미하며; "Ac"는 아세틸을 의미한다.
보다 더 바람직한 구체예에서 화합물은 다음의 화학식을 갖는 화합물로 구성되는 군로부터 선택된다:
(화학식 C-5)
(화학식 C-6)
(화학식 C-7)
(화학식 C-8)
(화학식 C-9)
(화학식 C-10)
(화학식 C-11)
(화학식 C-12)
(화학식 C-13a)
(화학식 C-13b)
(화학식 C-13c)
(화학식 C-13d)
및
(화학식 C-13e)
여기서 R107, R106, R106a 및 R120 는 상기에서 정의된 바와 같다. 바람직하게, R107은 수소, 히드록시카르보닐, 저급 알킬, 저급 알카노일, 저급 알콕시카르보닐, 저급 알카노일티오, 저급 알킬티오, 카바밀이고 또는 R106a 및 부착된 탄소원자와 함께 시클로프로필 고리를 형성한다; R106 는 수소, 히드록시이고, 또는 R106a 및 부착된 탄소원자와 함께 시클로프로필 고리를 형성한다; R106a는 수소, 히드록시이고, 또는 R106 및 부착된 탄소원자와 함께 시클로프로필 고리를 형성한다; 또는 R107 및 부착된 탄소원자와 함께 시클로프로필 고리를 형성한다; 그리고 R120 은 케토이다. 보다 더 바람직하게, 화합물은 화학식 C-5의 화합물에 더욱 해당된다.
보다 더 바람직한 구체예에서, 화학식 C-3의 화합물은 다음의 화합물로 구성되는 군으로부터 선택된다:
(화학식 C-14) (화학식 C-15)
에틸 3',4',5',17- 프로필 3',4',5',17-테트라히드로-
테트라히드로-17β-메틸- 17β-메틸-3,5'-
53,5'- 디옥소시클로펜타[13R,17]-18-
디옥소시클로펜타[13R,17]- 노르안드로스타-4,8,14-트리엔-7α-
18-노르안드로스타-4,8,14- 카르복실산
트리엔-7α-카르복실산
(화학식 C-16) (화학식 C-17)
부틸 3',4',5',17- 1-메틸에틸 3',4',5',17-
테트라히드로-17β-메틸- 테트라히드로-17β-메틸-3,5'-
3,5'- 디옥소시클로펜타[13R,17]-18-
디옥소시클로펜타[13R,17]- 노르안드로스타-4,8,14-트리엔-7α-
18-노르안드로스타-4,8,14- 카르복실산
트리엔-7α-카르복실산
(화학식 C-18) (화학식 C-19)
2-메틸프로필 1-메틸프로필 3',4',5',17-
3',4',5',17-테트라히드로- 테트라히드로-17β-메틸-3,5'-
17β-메틸-3,5'- 디옥소시클로펜타[13R,17]-18-
디옥소시클로펜타[13R,17]- 노르안드로스타-4,8,14-트리엔-7α-
18-노르안드로스타-4,8,14- 카르복실산
트리엔-7α-카르복실산
(화학식 C-20) (화학식 C-21)
시클로펜틸 3',4',5',17- 헥실 3',4',5',17-테트라히드로-
테트라히드로-17β-메틸- 17β-메틸-3,5'-
3,5'- 디옥소시클로펜타[13R,17]-18-
디옥소시클로펜타[13R,17]- 노르안드로스타-4,8,14-트리엔-7α-
18-노르안드로스타- 카르복실산
1,4,8,14-테트라엔-7α-
카르복실산
(화학식 C-22) (화학식 C-23)
메틸 3',4',4',17- 프로필 3',4',5',17-테트라히드로-
테트라히드로-17β-메틸 17β-메틸-3,5'-
3,5'-디옥소시클로펜타[13R,17]- 디옥소시클로펜타[13R,17]-18-
18-노르안드로스타-1,4,8,14- 노르안드로스타-1,4,8,14-테트라엔-
테트라엔-7α-카르보실산 7α-카르복실산
(화학식 C-24) (화학식 C-25)
에틸 3',4',5',17- 1-메틸에틸 3',4',5',17-
테트라히드로-17β-메틸 테트라히드로-17β-메틸-3,5'-
3,5'-디옥소시클로펜타[13R,17]- 디옥소시클로펜타[13R,17]-18
18-노르안드로스타-1,4,8,14- 노르안드로스타-1,4,8,14-테트라엔-
테트라엔-7α-카르복실산 7α-카르복실산
(화학식 C-26) (화학식 C-27)
부틸 3',4',5',17- 1-메틸프로필 3',4',5',17-
테트라히드로-17β-메틸 테트라히드로-17β-메틸-3,5'-
3,5'- 디옥소시클로펜타[13R,17]-18-
디옥소시클로펜타[13R,17]- 노르안드로스타-1,4,8,14-테트라엔-
18-노르안드로스타-1,4,8,14- 7α-카르복실산
테트라엔-7α-카르복실산
(화학식 C-28) (화학식 C-29)
2-메틸프로필 헥실 3',4',5',17-테트라히드로-
3',4',5',17-테트라히드로- 17β-메틸 3,5'-디옥소시클로펜타
17β-메틸 3,5'-디옥소시클로펜타 [13R,17]-18-노르안드로스타-1,4,8,
[13R,17]-18-노르안드로스타-1,4,8, 14-테트라엔-7α-카르복실산
14-테트라엔-7α-카르복실산
(화학식 C-30) (화학식 C-31)
1,2,4bR(4bR*),5,5aS*,7, 4bR(4bR*),5,5aS*,7,7aR*,8,9,11,
7aR*,8,9,11,12bS*-도데카히드로- 12,12bS*-데카히드로-7A,12b-디메
7a,12b-디메틸-10aR*-시클로-프로팔[1] 틸-10R*-시클로프로팔(1)펜탈레노
펜탈레노[1,6a-a]페난트렌-3,10-디온 [1,6a-a]펜난트렌-3,10-디온
(화학식 C-32) (화학식 C-33)
1,2,4bs(4bR*),5,5aS*,8,9,11,12, 2',3',3'aα,4',6',11'aα,12',
12bR*-도데카히드로-7a,12b-디메틸 13'-옥타히드로-3'aR,3'a,11'a-
-10aS*-시클로프로팔[1]펜탈레노[1, 디메틸-13'aR*-스피로[시클로프로
6a-a]페난트렌-3,10-디온 판-1,7'(9'H)-[1H]펜탈레노[1,6,a
-a]페난트렌]-1',9'-디온
(화학식 C-34) (화학식 C-35)
2',3',3'aα4',6',10',11',11'aα, 7α-(아세틸티오)-3',4'-디히드로-
12',13'-데카히드로-3'aR,3'a,11'a 17-메틸-시클로펜타[13,17]-
-디메틸-13'aR*-스피로[시클로프로 18-노르안드로스타-4,8,14-트리엔-
판-1,7'(9'H)-[1H]펜탈레노[1,6a-a] 3,5'(2'H)-디온
펜난트렌]-1',9'-디온
(화학식 C-36) (화학식 C-37)
3',4'-디히드로-17-메틸- 3',4',5,5',6,17-헥사히드로-17β
7α-(메틸티오)-시클로펜타[13, -메틸시클로펜타[13R,17]-18-노르
17]-18-노르안드로스타-4,8,14- 안드로스타-4,8,14-트리엔-3,5'
트리엔-3,5'(2'H)-디온 (2'H)-디온
(화학식 C-38) (화학식 C-39)
3',4',5',17-테트라히드로-6α-히드 메틸 3',4',5',17-테트라히드로-
록시-17β-메틸-3,5'-디옥소시클로 6α-히드록시-17β-메틸-3,5'-디
펜타[13R,17]-18-노르안드로스타-4,8, 옥소시클로펜타[13R,17]-18-노르
14-트리엔-7α-카르복실산 안드로스타-4,8,14-트리엔-7α-
카르복실산
(화학식 C-40) (화학식 C-41)
에틸 3',4',5',17-테트라히드로- 프로필 3',4',5',17-테트라히드로
6α-히드록시-17β-메틸-3,5'-디옥소 -6α-히드록시-17β-메틸-3,5'-디
시클로펜타[13R,17]-18-노르안드로스타 옥소시클로펜타[13R,17]-18-노르
4,8,14-트리엔-7α-카르복실산 안드로스타-4,8,14-트리엔-7α-
카르복실산
(화학식 C-42) (화학식 C-43)
1-메틸에틸 부틸 3',4',5',17-테트라히드로-
3',4',5',17-테트라히드로- 6α-히드록시-17β-메틸-3,5'-
6α-히드록시-17β-메틸- 디옥소시클로펜타[13R,17]-18-
3,5'-디옥소시클로펜타[13R, 노르안드로스타-4,8,14-트리엔-
17]-18-노르안드로스타-4,8,14 7α-카르복실산
-트리엔-7α-카르복실산
(화학식 C-44) (화학식 C-45)
1-메틸프로필 3',4',5',17-테트라 3',4',5',17-테트라히드로-17β-
히드로-6α-히드록시-17β-메틸-3,5' 메틸시클로펜타[13R,17]-18-노르
-디옥소시클로펜타[13R,17]-18-노르안 안드로스타-4,8,14-트리엔-3,5'
드로스타-4,8,14-트리엔-7α-카르복실산 (2'H)-디온
(화학식 C-46) (화학식 C-47)
(C-46) (C-47)
3',4',5',17-테트라히드로-6β-히드 메틸 3',4',5',17-테트라히드로-
록시-17β-메틸-3,5'-디옥소시클로 6β-히드록시-17β-메틸-3,5'-
펜타[13R,17]-18-노르안드로스타-4,8, 디옥소시클로펜타[13R,17]-18-
14-트리엔-7α-카르복실산 노르안드로스타-4,8,14-트리엔-
7α-카르복실산
(화학식 C-48) (화학식 C-49)
에틸 3',4',5',17-테트라히드로-6β 프로필 3',4',5',17-테트라히드
-히드록시-17β-메틸-3,5'-디옥소시클 로-6β-히드록시-17β-메틸-3,5'
로펜타[13R,17]-18-노르안드로스타-4,8, -디옥소시클로펜타[13R,17]-18-
14-트리엔-7α-카르복실산 노르안드로스타-4,8,14-트리엔-
7α-카르복실산
(화학식 C-50) (화학식 C-51)
1-메틸에틸 시클로펜틸 3',4',5',17-테트라
3',4',5',17-테트라히드로-6β-히드록시 히드로-17β-메틸-3,5'-디옥소
-17β-메틸-3,5'-디옥소시클로펜타[13R, 시클로펜타[13R,17]-18-노르
17]-18-노르안드로스타-4,8,14-트리엔 안드로스타-4,8,14-트리엔-7α-
-7α-카르복실산 카르복실산
(화학식 C-52) (화학식 C-1)
1-메틸프로필 3',4',5',17-테트라 메틸 2,2,3a,4,6,7,9,10,11,11a,
히드로-6β-히드록시-17β-메틸-3,5' 12,13-도데카히드로-3αβ,11α
-디옥소시클로펜타[13R,17]-18- β-디메틸-1,9-디옥소-1H-펜탈레
노르안드로스타-4,8,14-트리엔-7α- 노[1,6a-a]펜난트렌-6α-카르복
카르복실산 실산
(화학식 C-53)
부틸 3',4',5',17-테트라히드로-6β
-히드록시-17β-메틸-3,5'-디옥소시클로
펜타[13R,17]-18-노르안드로스타-4,8,14-
트리엔-7α-카르복실산
(화학식 C-201)
(7α,13R,17β)-3',4',5',17-테트라히드로-14-히드록시-17-메틸-3,5'-디옥소-γ-락톤, 시클로펜타[13,17]-18-노르안드로스타-4,9(11)-디엔-7-카르복실산
(화학식 C-202)
[13S,17β]-3',4'-디히드로-3-히드록시-9,17-
디메틸시클로펜타[13,17]고나-1,3,5(10)-트리엔-5'[2'H]-온
(화학식 C-203)
[13S,17β]-3',4'-디히드로-3-히드록시-9,17
-디메틸시클로펜타[13,17]고나-1,3,5,(10),6-테트라엔-5'[2'H]-온
(화학식 C-204)
[13S,17β]-3',4'-디히드로-17-메틸-시클로펜타[13,17]-18-
노란드로스타-4,6,8(14)-트리엔-3,5'[2'H]-디온
가장 바람직한 구체예에서 화합물은 메틸 2,2,3a,4,6,7,9,10,11,11a,12,13-도데카히드로-3αβ,11αβ-디메틸-1,9-디옥소-1H-펜탈레노[1,6a-a]페난트렌-6α-카르복실산:
(화학식 C-1)
화학식 C-1의 이 화합물은 특히 에폭시멕스레논 제조에서 바람직한 크로마토그래픽 마커이다.
여기서 논의되는 신규 화합물은 또한 그들의 염 형태로 존재할 수 있다.
신규화합물의 제조
일반적으로, 바로 위에서 설명된 신규 화합물은 이전 상기에서 설명된 20-스피록산 고리 및 스테로이드 핵을 갖는 스테로이드를 트리할로겐화된 알카노산과 반응시킴으로서 얻어질 수 있다. 이롭게는, 반응제제는 이용된 알카노산의 알칼리금속염을 더욱 포함한다. 반응제제가 트리플루오로아세트산과 트리플루오로아세트산 칼륨과 같은 그것의 알칼리금속염으로 이루어지는 것은 특히 더 바람직하다. 더욱이, 무수트리플루오로아세트산과 같은 건조제는 산 내부에 존재하는 유리수를 감소시키기 위해 반응과정에서 바람직하게 이용된다.
원료로서 사용되는 스테로이드 화합물은 바람직하게 다음과 같은 화학식을 갖는다:
(화학식 C-3)
(식에서, -A-A-, -D-D-, -E-E-, -A-E-, -G-G-, -J-J-, -L-L-, -J-L-, -M-M-, -J-M-, -Q-Q- 및 -Q-T-는 상기한 바와 같다). 여기서 상기 논의한 바와 같은 반응식 1의 에폭시멕스레논 합성 방법에서 기술된 것과 유사한 방법에 의해 그러한 출발물질을 제조 및/또는 단리할 수 있다. 다르게는, 출발물질은 시판제품일 수도 있다.
화학식 C-3의 스테로이드 화합물의 초기 농도는 전체 반응혼합물의 적어도 약 0.1중량%인 것이 바람직하고, 약 2중량% 내지 약 20중량%인 것이 더욱 바람직하고, 약 5중량% 내지 약 15중량%인 것이 한층 바람직하다. 과량의 트리할로알칸산이 존재하는 것이 바람직하다. 트리플루오로아세트산 무수물을 사용할 경우에는, 전체 반응혼합물의 적어도 약 3중량%의 비율로 존재해야 하고, 더욱 바람직하게는 약 5중량% 내지 약 25중량%, 가장 바람직하게는 약 10중량% 내지 약 15중량%의 비율로 존재해야 한다.
게다가, 반응온도는 실온 보다 높아야한다(22℃). 바람직하게는, 반응온도가 약 40℃ 내지 100℃, 더욱 바람직하게는 50℃ 내지 80℃, 한층 더 바람직하게는 60℃ 내지 70℃, 그리고 가장 바람직하게는 60℃ 내지 65℃인 것이 좋다. 반응온도를 약 70℃ 이상까지 증가시키면, 반응에서 생성되는 부산물 C14 락톤의 양이 증가된다. 반응시간은 바람직하게는 적어도 약 30분, 더욱 바람직하게는 약 30분 내지 약 6시간, 한층 더 바람직하게는 약 45분 내지 약 4시간, 그리고 가장 바람직하게는 약 1시간 내지 2시간이어야 한다. 바람직한 실시예에서, 반응시간은 약 1시간 내지 2시간이고, 반응온도는 약 60℃에서 유지된다.
아래의 반응식 S-1은 이 방법의 특히 바람직한 실시예를 예시한다:
(반응식 S-1)
아래의 반응식에서 기술된 바와 같이, 스테로이드 전체의 다양한 위치에서 서로 다른 치환기를 갖는 축합고리 스테로이드를 제조할 수 있다. 당업자들은 스테로이드의 서로 다른 위치에서 다양한 치환기를 도입하기 위해 여기서 구체적으로 기술되지 않는 추가적인 절차 및 방법을 알고 있다. 출발물질은 축합고리 스테로이드 또는 20-스피록산 고리 스테로이드일 수 있다. 출발물질이 축합고리 스테로이드인 경우에 기술을 간단히 하기 위하여, 다음의 반응식은 예시적인 출발물질로서 특정한 스테로이드 또는 스테로이드들의 군을 채용한다. 그러나, 출발물질로서 서로 다른 축합고리 스테로이드를 사용함으로써, 서로 다른 축합고리 스테로이드 유도체 또는 유사체를 동일한 일련의 반응에서 생성할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 유사하게, 출발물질이 20-스피록산 고리 스테로이드인 경우에 기술을 간단히 하기 위하여, 특정한 20-스피록산 고리 스테로이드를 출발물질로서 사용한다. 그러나, 출발물질로서 서로 다른 20-스피록산 고리 스테로이드를 사용함으로써, 다른 20-스피록산 고리 스테로이드 유도체 또는 유사체를 동일한 일련의 반응에서 생성할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
화학식 C-1의 화합물과 같은 C7 알콕시카르보닐 치환기를 갖는 스테로이드의 비누화에 의해 C7 카르복실산 치환기를 갖는 스테로이드를 제조할 수 있다. 물이 존재하는 상태에서 또는 존재하지 않는 상태에서 용매의 비점까지의 온도에서 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등의 적합한 용매 중의 수산화나트륨 또는 수산화칼륨과 같은 염기성 시약으로 출발 스테로이드를 처리함으로써, 비누화 반응을 수행할 수 있다. 반응식 S-2에서 예시된 바와 같이, 화학식 C-1의 화합물을 비누화시키면 화학식 C-101의 카르복실산이 산출된다.
출발물질로서 C-101과 같은 카르복실산을 사용하여, 메타노에이트 이외의 C7 카르복실산 에스테르 치환기를 갖는 스테로이드를 제조할 수 있다. 디메틸포름아미드와 같은 용매 중에서 염기(중탄산나트륨, 탄산나트륨, 중탄산칼륨, 또는 트리에틸아민과 같은)가 존재하는 상태에서 할로겐화 알킬과 같은 알킬화제로 그러한 카르복실산을 처리하면 원하는 에스테르가 산출된다. 적합한 알킬화제의 예로는 요오드화에틸, 브롬화에틸, 요오드화이소프로필, 요오드화헥실, 브롬화벤질, 요오드화알릴 등을 들 수 있다.
또한, 카르복실산 C-101은 카르바밀의 합성을 위한 적합한 출발물질이다. 염기가 존재하는 상태에서 클로로포름산 이소부틸 또는 클로로포름산 에틸과 같은 클로로포름산염으로 카르복실산을 처리하면 혼합 무수물이 산출된다. 아민(디메틸아민, 메틸아민 또는 벤질아민과 같은)으로 혼합 무수물을 처리하면 카르바밀(R1 및 R2가 각종 아민 상의 치환기임)이 산출된다.
(반응식 S-2)
출발물질로서 화학식 C-105(아래의 반응식 S-3에 나타냄)의 화합물과 같은 불포화 케톤을 사용하여 C7 위치에서 몇가지 변형을 이룬다. 염기성 조건 하에서 적합한 티올의 첨가에 의해 황화물을 합성한다. 적합한 티올의 예로는 메틸 메르캅탄, 에틸 메르캅탄 등을 들 수 있다. 적합한 염기는 피페리딘, 트리에틸아민 등을 포함한다.
티오아세트산과 같은 티오알칸산으로 불포화 케톤(화학식 C-105의 화합물과 같은)을 처리하면 아세틸티오와 같은 C7 티오아실 화합물을 제공한다.
적합한 용매 중에서 적합한 염기(수소화나트륨과 같은)로 할로겐화 트리메틸술폭소늄을 처리함으로써 생성되는 디메틸술폭소늄 메틸리드로 불포화 케톤(화학식 C-105의 화합물과 같은)을 처리하면 축합 C6, C7 시클로프로필 치환기를 첨가할 수 있다.
이러한 다양한 합성 반응식이 아래의 반응식 S-3에 예시되어 있다:
(반응식 S-3)
C6 스피로시클로프로필 고리를 갖는 스테로이드를 아래의 반응식 S-4에 기술된 절차에 따라서 합성한다. p-톨루엔술폰산과 같은 산이 존재하는 상태에서 오르토포름산 트리에틸 또는 오르토포름산 트리메틸과 같은 오르토 에스테르로 처리함으로써 화학식 C-110의 화합물과 같은 에논을 먼저 C3 에놀 에테르로서 보호한다. 디메틸포름아미드에 옥시염화인을 첨가함으로써 원래의 위치에서 생성되는 Vilsmeier 시약으로 결과되는 에놀 에테르를 처리하여 화학식 C-112의 화합물과 같은 포르밀 화합물을 제공한다. 테트라히드로푸란과 같은 용매 중에서 리튬 트리-tert-부톡시알루미늄 수소화물과 같은 수소화물 환원제를 사용하여 포르밀기의 환원을 수행한다. 이로써 중간체 알코올이 생성되고, 이것을 산으로 처리하고 물을 제거하여 화학식 C-113의 화합물과 같은 6-메틸렌 화합물을 제공한다. 적합한 산은 수성 매질 중의 염산을 포함한다. 디아조메탄으로 6-메틸렌 화합물을 처리하면 중간체 피라졸린을 얻고, 이것을 가열하여 분해시켜 화학식 C-114의 화합물과 같은 스피로시클로프로필 화합물을 얻는다. 보호된 에놀 에테르(화학식 C-111의 화합물과 같은)는 휘발성 중간체이고, 수소화붕소 나트륨과 같은 수소화물 환원제로 처리한 후, 산 가수분해하여 화학식 C-115 및 C-116의 화합물과 같은 히드록시 화합물을 얻는다.
이러한 다양한 합성 단계들이 아래의 반응식 S-4에 예시되어 있다:
(반응식 S-4)
아래의 반응식 S-5에 예시된 과정에 따라서 C6 히드록시 치환기 및 C7 에스테르 치환기를 갖는 스테로이드를 합성할 수 있다. 산이 존재하는 상태에서 오르토포름산 트리에틸 또는 오르토포름산 트리메틸과 같은 오르토 에스테르를 사용하여 3,5-디에놀 에테르(화학식 C-117의 화합물과 같은)를 형성함으로써 C3 카르보닐에서 에스테르(화학식 C-1의 화합물과 같은)를 보호한다. 적합한 산은 p-톨루엔 술폰산이다. 메타-클로로퍼옥시벤조산과 같은 산화제로 에놀 에테르를 처리하여 화학식 C-118의 화합물과 같은 히드록시 화합물을 형성한다.
(반응식 S-5)
반응식 S-6은 스테로이드의 C1-C2 위치에 이중결합을 도입하는 것을 예시한다. 이것은, 비점까지의 온도 범위에서 적합한 용매(디옥산과 같은) 중의 디클로로디시아노벤조퀴논과 같은 적합한 산화제로 원하는 스테로이드(화학식 C-1, C-108 및 C-114와 같은)를 처리함으로써 수행된다. 이 절차에 따라 화학식 C-127, C-128 및 C-129의 화합물과 같은 C1-C2 불포화 화합물을 제조할 수 있다.
(반응식 S-6)
반응식 S-7은 축합고리 내에 이중결합을 도입하는 것을 예시한다. 산촉매(p-톨루엔술폰산과 같은)가 존재하는 상태에서 오르토 에스테르(오르토포름산 트리에틸 또는 오르토포름산 트리메틸과 같은)로 스테로이드(화학식 C-114의 화합물과 같은)를 처리하여 에놀 에테르(C3 카르보닐이 보호되어 있음)를 얻는다. 화학식 C-114의 화합물의 경우에는 C6 위치가 완전히 치환되어 있기 때문에 형성된 에놀 에테르가 C2-C3 에놀 에테르(화학식 C-131의 화합물과 같은)이다. 저온(-78℃ 내지 -30℃)에서 리튬 디이소프로필아미드와 같은 강염기로 에놀 에테르를 처리한 후, 페닐 셀레닐 클로리드와 같은 셀렌화제로 처리하여 화학식 C-132의 화합물과 같은 셀레노 유도체를 얻었다. 염화메틸렌과 같은 용매 중에서 피리딘과 같은 염기가 존재하는 상태에서, 예를 들면, 실온에서 과산화수소와 같은 산화제로 셀레노 유도체를 산화사키면, 셀레노기의 제거 및 이중결합의 도입을 야기한다. 에놀 에테르를 가수분해하여 화학식 C-134의 화합물과 같은 케톤을 얻는다.
(반응식 S-7)
반응식 S-8은 화학식 C-1의 화합물의 이중결합 이성질체의 합성을 예시한다. 화학식 C-1의 화합물의 합성을 위한 조건과 유사한 조건 하에서 반응식 S-8에 나타낸 것과 같은 각종 스피록산 화합물을 아세트산칼륨, 트리플루오르아세트산 무수물 및 트리플루오로아세트산으로 처리하면 화학식 C-121 및 C-123의 화합물을 얻는다.
(반응식 S-8)
반응식 S-9는 이러한 스테로이드의 족 내에서 이중결합 이성질체의 합성을 위한 다른 방법을 예시한다. 축합고리를 이미 갖고 있는 예비형성된 에논(그 합성에 대해 상기 기술된 화학식 C-24의 화합물과 같은)에서 출발하여, 화학식 C-108 및 C-109의 화합물과 같은 화합물의 합성을 위한 반응식 S-3에서의 상기 화학적 성질을 사용하여 C6-C7 축합 시클로프로판을 도입한다.
(반응식 S-9)
(식에서, X는 할로겐이다).
반응식 S-1에 대해 상기 논의된 바와 실질적으로 동일한 방식으로 P. Compain, et al., Tetrahedron, 52(31), 10405-10416(1996)(여기에 참고문헌으로서 포함됨)에 기술된 것과 같은 스테로이드를 트리플루오로아세트산, 아세트산칼륨 및 트리플루오로아세트산 무수물로 처리함으로써 방향족 A 고리를 갖는 축합고리 스테로이드를 제조할 수 있다.
방향족 A 고리 및 3-히드록시 치환기를 갖는 이들 신규 축합고리 스테로이드는 페놀에 대해 전형적인 모든 화학반응을 겪을 것으로 예상된다. 반응식 S-10은 그러한 축합고리 스테로이드로부터 3-페놀성 에테르를 합성하는 것을 예시한다. 특히, 이들 페놀성 화합물을 염기 및 할로겐화 알킬 또는 알킬 술포네이트로 처리하면 상응하는 페놀산 에스테르를 생성할 것으로 예상된다. 예를 들면, 여기에 참고문헌으로서 포함된 Feuer 및 Hooz, In The Chemistry of the Ether Linkage, Patai(Ed.), Interscience: New York, pp. 446-450, 460-468(1967); 그리고 Olson, W.T., J.Am.Chem.Soc., 69, 2451(1947)을 참조한다.
(반응식 S-10)
유사하게, 반응식 S-11은 방향족 A 고리 및 3-히드록시 치환기를 갖는 축합고리 스테로이드로부터 3-페놀산 에스테르를 합성하는 것을 예시한다. 특히, 카르복실산 무수물로 또는 카르복실산 할로겐화물로 이들 페놀성 화합물을 처리하면 상응하는 페놀산 에스테르를 제공할 것으로 예상된다. 예를 들면, 여기에 참고문헌으로서 포함된 March, J., Advanced Organic Chemistry, Wiley: New York, pp. 346-347(1985)를 참조한다.
(반응식 S-11)
*반응식 S-12는 방향족 A 고리 및 3-히드록시 치환기를 갖는 축합고리 스테로이드로부터 3-페놀성 탄산염을 합성하는 것을 예시한다. 특히, 알킬 할로포르메이트로 이들 페놀성 화합물을 처리하면 상응하는 페놀성 탄산염을 제공할 것으로 예상된다. 예를 들면, 여기에 참고문헌으로서 포함된 March, J., Advanced Organic Chemistry, Wiley: New York, pp. 346-347(1985)를 참조한다.
(반응식 S-12)
반응식 S-13은 방향족 A 고리 및 3-히드록시 치환기를 갖는 축합고리 스테로이드로부터 오르토 알릴치환된 페닐 유도체를 합성하는 것을 예시한다. 특히, 염기 및 할로겐화 알릴로 이들 화합물을 처리하면 상응하는 알릴 페닐 에테르를 제공할 것으로 예상된다. 알릴 페닐 에테르는 열적 재배치 시에 오르토 알린치환된 페닐 유도체의 혼합물을 제공해야 한다. 예를 들면, 여기에 참고문헌으로서 포함된 Shine, H., J.Aromatic Rearrangements; Reaction Mechanism in Organic Chemistry, Monograph 6, American Elsevier: New York, pp. 89-120(1967)를 참조한다.
(반응식 S-13)
반응식 S-14는 방향족 A 고리 및 3-히드록시 치환기를 갖는 축합고리 스테로이드로부터 오르토 디알킬화되고 치환된 페닐 유도체를 합성하는 것을 예시한다. 특히, 알코올 및 산으로 이들 화합물을 처리하면 상응하는 오르토 디알킬화된 페닐 유도체를 제공할 것으로 예상된다. 예를 들면, 여기에 참고문헌으로서 포함된 Calcott, W.S., J.Am.Chem.Soc., 61, 1010(1939)를 참조한다.
(반응식 S-14)
반응식 S-15는 방향족 A 고리 및 3-히드록시 치환기를 갖는 축합고리 스테로이드의 알릴성 산화를 예시한다. 특히, 이들 화합물을 셀레늄 디옥시드 및 t-부틸 히드로퍼옥시드와 반응시킴으로써 알릴성 위치에서 산화시켜 상응하는 알코올을 형성할 수 있다. 이 알코올을 탈수하여 상응하는 올레핀을 얻는다. 예를 들면, 여기에 참고문헌으로서 포함된 Schmuff, N.R., J.Org.Chem., 48, 1404(1983)을 참조한다.
(반응식 S-15)
반응식 S-16은 본 발명의 신규 축합고리 스테로이드의 3-카르보닐기의 보호 및 20-카르보닐기의 환원을 예시한다. 특히, 이들 화합물을 트리알킬오르토포르메이트 및 산과 반응시켜 3-에놀 에테르를 형성할 수 있다. 3-에놀 에테르를 수소화붕소 나트륨과 반응시켜 C-20 카르보닐기를 상응하는 C-20 알코올로 환원시킬 수 있다. C-20 아코올을 산 및 물로 처리하면 3-에놀 에테르를 탈보호화하여 3-케토 유도체를 형성한다.
(반응식 S-16)
반응식 S-17은 본 발명의 신규 축합고리 스테로이드 내에서 올레핀 결합을 수소화하는 것을 예시한다. 특히, 수소화는 단계적으로 진행될 것으로 예상된다. C-6, C-7 이중결합을 먼저 포화시킨 후 C-8, C-14 이중결합을 포화시킨다.
(반응식 S-17)
반응식 S-18은 본 발명의 보호된 11α-히드록시 축합고리 스테로이드의 재배치를 예시한다. 특히, 이 화합물의 11α-히드록시기를 먼저 2-메톡시에톡시메틸 에테르(MEM 에테르)와 같은 적합한 보호기로 보호한다. 산무수물이 존재하는 상태에서 보호된 11α-히드록시 스테로이드를 알칼리 금속 염 및 트리할로알칸산으로 처리하면 아래에 예시된 바와 같이 이들 분자 내의 락톤 부분의 재배치를 야기할 것으로 예상된다. MEM 에테르를 브롬화아연으로 제거하면 아래에 나타낸 재배치된 알코올을 제공할 것이다.
(반응식 S-18)
반응식 S-19는 본 발명의 신규 축합고리 스테로이드의 3-카르보닐기의 보호 및 19-위치의 알킬화를 예시한다. 특히, 이 화합물을 먼저 반응식 S-16에 예시된 바와 같이 3-알킬 에놀 에테르로 전환한다. 3-알킬 에놀 에테르를 리튬 디이소프로필아미드(LDA)로 처리한 후, 할로겐화 알킬로 처리하여 19-알킬 유도체를 형성한다. 3-알킬 에놀 에테르 보호기를 가수분해하여 3-케토 유도체를 얻는다.
(반응식 S-19)
반응식 S-20은 에스트론 메틸 에테르를 상응하는 스피로락톤으로 전화하는 것을 예시한다. 락톤의 상응하는 축합고리 스테로이드로의 재배치는 상기 반응조건 하에서, 바람직하게는 이용된 알칸산의 알칼리 금속 염의 존재 하에, 락톤을 트리할로겐화 알칸산으로 처리할 때 발생해야 한다. 예를 들면, Otsubo, K., Tetrahedron Letters, 27(47), 5763(1986)을 참조한다.
(반응식 S-20)
여기에 추가적으로 기술된 신규 화합물이 상기 기술된 것과 유사한 생물학적전환 공정을 거치도록 하여 다른 히드록시화 축합고리 스테로이드뿐만 아니라 9α, 9β, 11α 또는 11β-히드록시 치환기를 갖는 스테로이드와 같은 다른 신규 축합고리 스테로이드를 산출할 수 있다. 그리고나서, 원할 경우에는, 히드록시 치환기의 제거를 통해 히드록시화 스테로이드를 산화하여 9,11 올레핀 이중결합과 같은 올레핀 이중결합을 도입할 수 있다.
상기 관점에서, 본 발명의 몇가지 목적이 달성되고, 다른 이로운 결과가 얻어진다는 것을 알 수 있을 것이다.
본 발명의 범주에서 벗어나지 않으면서 상기 조성물 및 방법을 다양하게 변화시킬 수 있기 때문에, 상기 기술된 모든 내용은 제한적인 것이 아니고 예시적인 것으로 해석해야 한다.
다음의 비제한적인 실시예들은 본 발명의 다양한 태양을 예시하는 역할을 한다.
실시예 X-1A
메틸 2,3,3a,4,6,7,9,10,11,11a,12,13-도데카히드로-3αβ,11αβ-디메틸-1,9-디옥소-1H-펜탈렌[1,6a-a]페난트렌-6α-카르복실레이트(화합물 C-1)의 제조:
(화학식 C-1)
기계적 교반기, 응축기, 열전대 및 가열맨틀을 구비한 청결하고 건조한 반응기에 아세트산 칼륨(6.7g, 7.1mmol; Sigma-Aldrich 5128LG)을 첨가하였다. 이어서, 트리플루오로아세트산(25.0mL, 8.1몰; Sigma-Aldrich 7125MG) 및 트리플루오로아세트산 무수물(4.5mL, 31.0mmol; Sigma-Aldrich 11828PN)을 반응기에 첨가하였다. 그리고나서, 이 용액을 30분 동안 25℃ 내지 30℃의 온도에서 유지하였다.
예비형성된 TFA/TFA 무수물 시약을 실시예 36에 기술된 방식으로 제조된 7-메틸 수소 17-히드록시-11α-(메틸술포닐)옥시-3-옥소-17α-프레그나-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤
의 7g에 첨가하였다.
결과되는 혼합물을 60분 동안 60℃에서 가열하고, 전환율을 TLC 및/또는 HPLC에 의해 주기적으로 체크하였다. 반응이 완결되었을 때(대략 60분), 혼합물을 1구 플라스크로 옮기고, 진한 슬러리가 될 때까지 50℃에서 감압 하에 농축하였다.
결과되는 슬러리를 150mL의 아세트산에틸 및 80mL의 물/염수 혼합물로 희석하였다. 그리고나서, 상들을 분리하고, 수층을 80mL의 아세트산에틸로 재추출하였다. 염수강도는 12중량%이었다. 합한 아세트산에틸 용액을 12중량%의 염수(80mL)로 1회 세척하고나서, 1N NaOH 용액(80mL)으로 1회 세척하고, 최종적으로 12중량%의 염수(80mL)로 세척하였다. 혼합물을 분리를 위해 정치하고, 분리된 아세트산에틸층을 물 흡입기를 사용하여 45℃에서 감압 하에 농축하고 건조하여 약 3.8g의 미정제 고체 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 HPLC 분석하여 생성물이 화합물 C-1을 약 40면적% 함유한다는 것을 알았다.
그리고나서, 고체 생성물을 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 크로마토그래피에 의해 정제하여 210g의 메틸 2,3,3a,4,6,7,9,10,11,11a,12,13-도데카히드로-3αβ,11αβ-디메틸-1,9-디옥소-1H-펜탈렌[1,6a-a]페난트렌-6α-카르복실레이트(화합물 C-1)을 생성하였다.
질량분석 데이터는 고분해 데이터로부터 분자량이 380이고 화학식이 C24H28O4라는 것을 나타내었다. EI 질량스펙트럼은 m/z 380에서 M+ 피크를 가졌다. APCI 질량스펙트럼은 m/z 381 (MH)+ 및 m/z 398 (MNH4)+에서 피크를 가졌다. 탄소 및 수소 분석은 제안된 분자식과 일치하였다.
IR 스펙트럼은 카르보닐 흡수 영역에서 2개의 피크를 가졌다: 1722cm-1 및 1667cm-1. 13C NMR 스펙트럼이 포화 케톤으로 인해 δ 217.7에서, 그리고 카르보메톡시 카르보닐으로 인해 δ172.7에서 신호를 가졌기 때문에, 1722cm-1 피크를 2개의 카르보닐에 할당하였다. IR 스펙트럼에서 1773cm-1 피크가 없다는 것은 락톤 부분이 상실되었다는 것을 나타낸 것이다.
13C APT 및 HECTOR NMR 데이터는 다음 타입의 탄소가 존재한다는 것을 나타내었다: 3 카르보닐(σ 217.7, 198.4, 172.2); 4 완전치환 올레핀성 탄소(σ 166.3, 141.8, 139.3, 121.8); 2 메틴 올레핀성 탄소(σ 124.9, 122.0); 3 4차 지방족 탄소(σ 61.1, 50.7, 39.7); 1 메틴 지방족 탄소(σ 43.3); 8 메틸렌 탄소(σ 46.0, 37.5, 34.1, 33.3, 32.9, 31.9, 23.7, 22.2); 및 3 메틸 탄소(σ 51.9, 23.6, 23.1).
실시예 X-1B
(7α,13R,17β)-3',4',5',17-테트라히드로-14-히드록시-17-메틸-3,5'-디옥소-γ-락톤, 시클로펜타[13,17]-18-노란드로스타-4,9(11)-디엔-7-카르복실산(화합물 C-201)의 제조:
아세트산칼륨(8.9g, 90mmol), 트리플루오로아세트산(150mL, 1.480g/mL) 및 트리플루오로아세트산 무수물(33mL, 1.487g/mL)을 기계적 교반기, 응축기 및 가열맨틀을 구비한 250mL 둥근바닥 반응기에 첨가하였다. 결과되는 용액을 약 25℃ 내지 30℃에서 약 10분 동안 교반하였다.
예비형성된 TFA/TFA 무수물 시약을 15g(30.0mmol)의 7-메틸 수소 17-히드록시-11α-(메틸술포닐)옥시-옥소-17α-프레그나-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤
을 상기 실시예 36에서 기술된 방식으로 제조하였다.
결과되는 혼합물을 약 60 내지 70℃에서 약 1 내지 1.5시간 동안 가열하였다. 이 혼합물을 50℃에서 감압 하에 농축하여 진한 슬러리를 얻었다. 이 슬러리를 100mL의 아세트산에틸 중에 용해시키고, 약 20% 물/염수(매회 80mL)로 2회, 1N 수산화나트륨(80mL) 용액으로 1회 세척한 후, 약 20% 물/염수(80mL)로 1회 세척하였다. 미정제 생성물을 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하여 약 18g의 미정제 습재료를 얻었다.
이 재료를 컬럼크로마토그래피에 의해 2회 정제하여 약 3g의 순수한 (7α,13R,17β)-3',4',5',17-테트라히드로-14-히드록시-17-메틸-3,5'-디옥소-γ-락톤, 시클로펜타[13,17]-18-노란드로스타-4,9(11)-디엔-7-카르복실산(화합물 C-201)을 얻었다.
실시예 X-1C
[13S,17β]-3',4'-디히드로-3-히드록시-9,17-디메틸시클로펜타[13,17]고나-1,3,5(10)-트리엔-5'[2'H]-온(화합물 C-202)의 제조:
아세트산칼륨(6g, 61.1mmol), 트리플루오로아세트산(150mL, 1.480g/mL) 및 트리플루오로아세트산 무수물(26mL, 1.487g/mL)을 기계적 교반기, 응축기 및 가열맨틀을 구비한 250mL 둥근바닥 반응기에 첨가하였다. 결과되는 용액을 약 25℃ 내지 30℃에서 약 10분 동안 교반하였다.
예비형성된 TFA/TFA 무수물 시약을 15g(43.7mmol)의 17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-21-카르복실산, γ-락톤(알도나로도 알려짐; G.D. Searle & Co.)에 첨가하였다:
결과되는 혼합물을 60℃ 내지 70℃에서 약 1 내지 1.5시간 동안 가열하였다. 반응혼합물을 50℃에서 감압 하에 농축하여 진한 슬러리를 얻었다. 이 슬러리를 100ml의 아세트산에틸 중에 용해시키고, 약 20% 물/염수 용액(매회 80mL)로 2회, 1N 수산화나트륨 용액(80mL)으로 1회 세척한 후, 약 20% 물/염수 용액(80mL)으로 1회 세척하였다. 미정제 생성물을 황산마그네슘 상에서 50℃에서 감압 하에 건조될 때까지 건조하고, 여과하고, 농축하여 약 20g의 미정제 습재료를 얻었다.
이 재료를 컬럼크로마토그래피에 의해 2회 정제하여 약 125g의 순수한 [13S,17β]-3',4'-디히드로-3-히드록시-9,17-디메틸시클로펜타[13,17]고나-1,3,5(10)-트리엔-5'[2'H]-온(화합물 C-202)을 얻었다.
실시예 X-1D
[13S,17β]-3',4'-디히드로-3-히드록시-9,17-디메틸시클로펜타[13,17]고나-1,3,5(10),6-테트라엔-5'[2'H]-온(화합물 C-203)의 제조:
아세트산칼륨(6g, 61.1mmol), 트리플루오로아세트산(150mL, 1.480g/mL) 및 트리플루오로아세트산 무수물(26mL, 1.487g/mL)을 기계적 교반기, 응축기 및 가열맨틀을 구비한 250mL 둥근바닥 반응기에 첨가하였다. 결과되는 용액을 약 25℃ 내지 30℃에서 약 10분 동안 교반하였다.
예비형성된 TFA/TFA 무수물 시약을 3-메톡시-3,5,9(11)-안드로스타트리엔-17-온(Upjohn)으로부터 제조된 15g(45.9mmol)의 17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4,9(11)-디엔-21-카르복실산, γ-락톤(-9,11-알도나로도 알려짐)
에 첨가하였다. 결과되는 혼합물을 약 60℃ 내지 70℃에서 약 1 내지 1.5시간 동안 가열하였다. 반응혼합물을 50℃에서 감압 하에 농축하여 진한 슬러리를 얻었다. 이 슬러리를 100ml의 아세트산에틸 중에 용해시키고, 약 20% 물/염수 용액(매회 80mL)로 2회, 1N 수산화나트륨 용액(80mL)으로 1회 세척한 후, 약 20% 물/염수 용액(80mL)으로 1회 세척하였다. 미정제 생성물을 황산마그네슘 상에서 50℃에서 감압 하에 건조될 때까지 건조하고, 여과하고, 농축하여 약 18g의 미정제 습재료를 얻었다.
이 재료를 컬럼크로마토그래피에 의해 2회 정제하여 약 340g의 순수한 [13S,17β]-3',4'-디히드로-3-히드록시-9,17-디메틸시클로펜타[13,17]고나-1,3,5(10),6-테트라엔-5'[2'H]-온(화합물 C-203)을 얻었다.
실시예 X-1E
[13S,17β]-3',4'-디히드로-17-메틸-시클로펜타[13,17]-18-노란드로스타-4,6,8(14)-트리엔-3,5'[2'H]-디온(화합물 C-204)의 제조:
(화합물 C-204)
아세트산칼륨(8g, 81.5mmol), 트리플루오로아세트산(150mL, 1.480g/mL) 및 트리플루오로아세트산 무수물(33mL, 1.487g/mL)을 기계적 교반기, 응축기 및 가열맨틀을 구비한 250mL 둥근바닥 반응기에 첨가하였다. 결과되는 용액을 약 25℃ 내지 30℃에서 약 10분 동안 교반하였다.
예비형성된 TFA/TFA 무수물 시약을 15g(44.0mmol)의 17-히드록시-3-옥소-17α-프레근-4,6-디엔-21-카르복실산, γ-락톤(칸레논으로도 알려짐; G.D. Searle & Co.)
에 첨가하였다.
결과되는 혼합물을 60℃ 내지 70℃에서 약 1 내지 1.5시간 동안 가열하였다. 반응혼합물을 50℃에서 감압 하에 농축하여 진한 슬러리를 얻었다. 이 슬러리를 100ml의 아세트산에틸 중에 용해시키고, 약 20% 물/염수 용액(매회 80mL)로 2회, 1N 수산화나트륨 용액(80mL)으로 1회 세척한 후, 약 20% 물/염수 용액(80mL)으로 1회 세척하였다. 미정제 생성물을 황산마그네슘 상에서 50℃에서 감압 하에 건조될 때까지 건조하고, 여과하고, 농축하여 약 18g의 미정제 습재료를 얻었다.
이 재료를 컬럼크로마토그래피에 의해 2회 정제하여 약 2.2g의 순수한 [13S,17β]-3',4'-디히드로-17-메틸-시클로펜타[13,17]고나-18-노란드로스타-4,6,8(14)-트리엔-3,5'[2'H]-디온(화합물 C-204)을 얻었다.
실시예 X-2
다음 화학식의 화합물의 제조:
(화합물 C-105)
염화메틸렌(20mL) 중의 11α-히드록시칸레논(3.6g, 10mmol) 및 트리에틸아민 (1.2g, 12mmol)의 교반된 차가운(0℃) 용액에 염화메탄술포닐(1.1g, 10mmol)을 첨가한다. 이 혼합물을 3시간 동안 차가운 상태에서 교반하고, 실온까지 데운다. 박층 크로마토그래피가 반응이 완결되었음을 나타낼 때까지 교반을 계속한다. 그리고나서, 혼합물을 아세트산에틸로 희석하고, 물, 5% 중탄산나트륨 수용액 및 물로 추출하고, 황산나트륨 상에서 건조한다. 건조제를 여과하고, 여과액을 진공 하에 농축하여 다음 단계에서 사용하기에 적합한 다음의 미정제 메실레이트 C-136을 얻었다:
(화합물 C-136)
실시예 X-1에서 화합물 C-1의 합성을 위해 기술된 절차에 따라서, 메실레이트 C-136(4.3g, 10mmol)의 용액을 트리플루오로아세트산(25mL), 트리플루오로아세트산 무수물(4.5mL) 및 아세트산칼륨(6.7g, 7.1mmol)과 반응시킨다. 미정제 생성물을 실시예 X-1에서의 화합물 C-1을 위한 절차와 동일한 절차에 따라서 단리하고, 용리액으로서 아세트산에틸과 톨루엔 또는 아세트산에틸과 헥산의 혼합물을 사용하는 실리카겔 상에서의 크로마토그래피에 의해 정제한다. 그렇게 얻어진 생성물을 알코올, 알코올 및 물, 또는 아세트산에틸 및 헥산으로부터 재결정화함으로써 더 정제하여 테트라엔 C-105를 산출한다.
실시예 X-3
다음 화학식의 화합물의 제조:
(화합물 C-110)
메실레이트 C-138
을 염화메틸렌(20mL) 중의 11α,17-디히드록시-3-옥소-17-옥소-프레근-4-엔-21-카르복실산, γ-락톤(3.6g, 10mmol), 트리에틸아민(1.2g, 12몰) 및 염화메탄술포닐(1.1g, 10mmol)을 사용하여 합성 및 단리(메실레이트 C-136의 합성을 위해 실시예 X-2에 기술된 절차에 따라서)한다. 그렇게 단리된 메실레이트 C-138은 다음 단계에서 사용하기에 적합하다.
실시예 X-1에서 화합물 C-1을 합성하기 위해 기술된 절차에 따라서, 메실레이트 C-138(4.4g, 10mmol)의 용액을 트리플루오로아세트산(25mL), 트리플루오로아세트산 무수물(4.5mL) 및 아세트산칼륨(6.7g, 7.1mmol)과 반응시킨다. 미정제 생성물 C-110을 실시예 X-1의 화합물 C-1을 위한 절차와 동일한 절차에 따라서 단리하고, 용리액으로서 아세트산에틸 및 톨루엔 또는 아세트산에틸 및 헥산의 혼합물을 사용하는 실리카겔 상에서의 크로마토그래피에 의해 정제한다. 그렇게 얻어진 생성물을 알코올, 알코올 및 물, 또는 아세트산에틸 및 헥산으로부터 재결정화함으로써 더 정제한다.
실시예 X-4
3',4',5',17-테트라히드로-17β-메틸-3,5'-디옥소시클로펜타[13R,17]-18-노란드로스타-4,8,14-트리엔-7α-카르복실산(화합물 C-101)의 제조:
화합물 C-1(3.8g, 10mmol) 및 1N 수산화나트륨 수용액(35mL)의 에탄올(60mL) 중의 용액을 8시간 동안 환류시킨다. 반응물을 실온까지 냉각하고, 진공 하에 회전증발기 상에서 농축하고, 잔류 수층을 아세트산에틸로 3회 추출한다. 그리고나서, 수층을 1N 염산용액으로 산성화하고, 아세트산에틸로 3회 추출한다. 합한 유기층을 물로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조한다. 건조제를 여과하고, 여과액을 회전증발기 상에서 농축한다. 잔류 미정제 카르복실산 C-101을 아세트산에틸로 처리함으로써 결정화하고, 아세트산에틸 및 헥산 또는 메탄올 또는 에탄올 및 물로부터 재결정화한다.
실시예 X-5
1-메틸에틸3',4',5',17-테트라히드로-17β-메틸-3,5'-디옥소시클로펜타[13R,17]-18-노란드로스타-4,8,14-트리엔-7α-카르복실레이트(화합물 C-102)의 제조:
중탄산나트륨(3.5g)과 디메틸포름아미드(35mL) 중의 카르복실산 C-101(3.7g, 10mmol) 및 요오드화 이소프로필(3mL)의 용액의 혼합물을 하룻밤 동안 실온에서 교반한다. 반응물을 물에 붓고, 수용액을 아세트산에틸로 3회 추출한다. 합한 유기층을 물로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조한다. 건조제를 여과하고, 여과액을 진공 하에 농축한다. 잔류 미정제 이소프로필 에스테르 C-102를 아세트산에틸 또는 알코올로 처리함으로써 결정화하고, 실리카겔 상에서의 크로마토그래피에 의해 정제하고, 아세트산에틸 및 헥산 또는 알코올 또는 알코올 및 물로부터 재결정화한다.
실시예 X-6
에틸 3',4',5',17-테트라히드로-17β-메틸-3,5'-디옥소시클로펜타[13R,17]-18-노란드로스타-4,8,14-트리엔-7α-카르복실레이트의 제조:
중탄산나트륨(3.5g)과 디메틸포름아미드(35mL) 중의 카르복실산 C-101(3.7g, 10mmol) 및 요오드화 에틸(3mL)의 용액의 혼합물을 하룻밤 동안 실온에서 교반한다. 반응물을 물에 붓고, 수용액을 아세트산에틸로 3회 추출한다. 합한 유기층을 물로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조한다. 건조제를 여과하고, 여과액을 진공 하에 농축한다. 잔류 미정제 에틸 에스테르 C-103을 아세트산에틸 또는 알코올로 처리함으로써 결정화하고, 실리카겔 상에서의 크로마토그래피에 의해 정제하고, 아세트산에틸 및 헥산 또는 알코올 또는 알코올 및 물로부터 재결정화한다.
실시예 X-7
헥실 3',4',5',17-테트라히드로-17β-메틸-3,5'-디옥소시클로펜타[13R,17]-18-노란드로스타-4,8,14-트리엔-7α-카르복실레이트(화합물 C-104)의 제조:
중탄산나트륨(3.5g)과 디메틸포름아미드(35mL) 중의 카르복실산 C-101(3.7g, 10mmol) 및 요오드화 헥실(3mL)의 용액의 혼합물을 하룻밤 동안 실온에서 교반한다. 반응물을 물에 붓고, 수용액을 아세트산에틸로 3회 추출한다. 합한 유기층을 물로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조한다. 건조제를 여과하고, 여과액을 진공 하에 농축한다. 잔류 미정제 n-헥실 에스테르 C-104를 아세트산에틸 또는 알코올로 처리함으로써 결정화하고, 실리카겔 상에서의 크로마토그래피에 의해 정제하고, 아세트산에틸 및 헥산 또는 알코올 또는 알코올 및 물로부터 재결정화한다.
실시예 X-8
3',4'-디히드로-17-메틸-7α(메틸티오)-시클로펜타[13,17]-18-노란드로스타-4,8,14-트리엔-3,5'(2'H)-디온(화합물 C-106)의 제조:
메탄올(40mL) 중의 테트라엔 C-105(3.2g, 10mmol)의 용액 및 피페리딘(4mL)을 5℃까지 냉각한다. 7g의 중량 증가가 관찰될 때까지 기체 메틸 메르캅탄을 통과시킨다. 가압용기를 밀봉하고 20시간 동안 실온에서 유지한다. 이 용액을 얼음물에 붓고, 침전물을 여과하고, 물로 세척하고, 공기건조한다. 메틸티오 생성물 C-106을 메탄올 또는 아세트산에틸 및 헥산으로부터 재결정화함으로써 정제한다. 예를 들면, 여기에 참고문헌으로서 포함된 A. Karim 및 E.A. Brown, Steroids, 20, 41(1972)에 기술된 절차를 참조한다.
실시예 X-9
7α(아세틸티오)-3,4'-디히드로-17-메틸-시클로펜타[13,17]-18-노란드로스타-4,8,14-트리엔-3,5'(2'H)-디온(화합물 C-107)의 제조:
티오아세트산(10mL) 중의 테트라엔 C-105(3.2g, 10mmol)의 용액을 1시간 동안 85-95℃에서 가열한다. 과량의 티오아세트산을 진공 하에 제거하고, 결과되는 미정제 7α-티오아세트산염 C-107을 메탄올 또는 아세트산에틸 또는 아세트산에틸 및 헥산과 같은 적합한 용매로부터 재결정화함으로써 정제한다. 예를 들면, 여기에 참고문헌으로서 포함된 미국 특허 3,013,012, J.A. Cella 및 R.C. Tweit, Dec. 12, 1961에 기술된 절차를 참고한다.
실시예 X-10
1,2,4bR(4bR*),5,5aS*,7,7aR*,8,9,11,12bS*-도데카히드로-7a,12b-디메틸-10aR*-시클로프로팔[1]펜탈렌[1,6a-a]페난트렌-3,10-디온
및
1,2,4bS(4bR*),5,5aS*,8,9,11,12,12bR*-도데카히드로-7a,12b-디메틸-10aS*-시클로프로팔[1]펜탈렌[1,6a-a]페난트렌-3,10-디온(화합물 C-109)
의 제조:
건조 디메틸술폭시드(20mL) 중의 요오드화 트리메틸술폭소늄(1g, 4.6mmol)의 용액에 수소화나트륨(광물성 기름 중의 50% 분산액 220mg, 4.6mmol)을 첨가한다. 이 혼합물을 수소의 방출이 중지될 때까지 질소 하에 실온에서 교반한다. 그리고나서, 디메틸술폭시드(4mL) 중의 테트라엔 C-105(1.12g, 3.5mmol)의 용액을 첨가하고, 질소 분위기 하에서 4시간 동안 교반을 계속한다. 반응혼합물을 물로 희석하고, 결과되는 침전물을 여과하고, 공기건조한다. 생성물은 6β, 7β(화합물 C-108)와 6α, 7α(화합물 C-109) 이성질체의 혼합물이다. 이들 이성질체들을 실리카겔 상에서의 크로마토그래피에 의해 분리하고, 각각의 이성질체를 아세트산에틸 및 헥산, 알코올, 또는 알코올 및 물과 같은 용매로부터 재결정화함으로써 더 정제한다.
실시예 X-11
다음 화학식의 화합물의 제조:
(화합물 C-111)
오르토포름산 에틸(10mL) 중의 에논 C-110(3.2g, 10mmol) 및 무수 에탄올(10mL)의 현탁액에 p-톨루엔술폰산 일수화물(0.05g)을 첨가한다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 피리딘을 몇방울 첨가함으로써 퀀칭한다. 0℃에서 다시 5분 동안 교반한 후, 결과되는 침전물을 여과하고, 소량의 메탄올로 세척하고, 흔적량의 피리딘을 함유하는 알코올 또는 아세트산에틸 및 헥산으로부터 재결정화하여 순수한 에놀 에테르 C-111을 얻는다.
다르게는, 진공 하에 모든 용매를 제거함으로써 그리고 에테르, 아세트산에틸 또는 헥산과 같은 용매의 첨가에 의해 잔류물을 재결정화함으로써 피리딘의 첨가 후에 반응을 진행시킬 수도 있다. 미정제 C-111을 상기한 바와 같이 재결정화한다. 예를 들면, 여기에 참고문헌으로서 포함된 R.M. Weier 및 L.M. Hofmann, J. Med. Chem., 20, 1304-1308(1977)에 개시된 절차를 참고한다.
실시예 X-12
다음 화학식의 화합물의 제조:
(화합물 C-112)
예를 들면, 여기에 참고문헌으로서 포함된 R.M. Weier 및 L.M. Hofmann, J. Med. Chem., 20, 1304-1308(1977)을 참고한다.
0℃에서 옥시염화인(4.59g, 30mmol)을 디메틸포름아미드(30mL)에 첨가함으로써 Vilsmeyer 시약을 제조한다. 5분 후에, 디메틸포름아미드(5mL) 중의 에놀 에테르 C-111(3.5g, 10mmol)의 용액를 첨가하고, 반응물을 0℃에서 2시간 동안 그리고 실온에서 하룻밤 동안 교반한다. 반응물을 아세트산나트륨 수용액에 붓고, 2시간 동안 교반한다. 침전물을 여과 및 건조하여 미정제 알데히드 C-112를 얻는다. 알코올, 알코올 및 물 또는 아세트산에틸 및 헥산과 같은 용매로부터의 재결정화에 의해 정제를 수행한다. 다르게는, 미정제 알데히드 C-112를 아세트산에틸과 같은 용매로 추출함으로써 아세트산나트륨 수용액으로부터 단리한다. 황산나트륨 상에서 건조하고 용매를 제거한 후에, 잔류물을 재결정화함으로써 또는 실리카겔 상에서의 크로마토그래피를 수행한 후 재결정화함으로써 정제한다.
실시예 X-13
다음 화학식의 화합물의 제조:
(화합물 C-113)
테트라히드로푸란 중의 리튬 트리-tert-부톡시알루미늄 히드리드(3.05g, 12mmol)의 교반된 차가운 용액에 알데히드 C-112(3.78g, 10mmol)를 첨가한다. 반응물을 실온에서 5시간 동안 교반하고, 물 및 아세트산을 첨가함으로써 퀀칭하고, 주의를 기울여 혼합물을 약한 염기성으로 유지한다. 이 혼합물을 진공 하에 농축하고, 결과되는 고체를 아세트산에틸 중에서 슬러리화한다. 고체를 여과하고, 여과액을 진공 하에 농축한다. 잔류물을 최소 부피의 아세톤 및 물(3:1)의 용액 중에 용해시키고, 산성화된 수성 아세톤(pH 1.5-2.0)에 첨가한다. 산성 반응혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 진공 하에 농축한다. 결과되는 미정제 디에논 C-113을 알코올, 알코올 및 물 또는 아세트산에틸 및 헥산과 같은 용매로부터 재결정화함으로써 정제한다. 다르게는, 미정제 디에논 C-113을 실리카겔 상에서의 크로마토그래피에 의해 정제하고나서 재결정화한다. 예를 들면, 여기에 참고문헌으로서 포함된 R.M. Weier 및 L.M. Hofmann, J. Med. Chem., 20, 1304-1308(1977)에 기술된 절차를 참고한다.
실시예 X-14
2',3',3'aα,4',6',10',11',11'aα,12',13'-데카히드로-3'aR,3'a,11'a-디메틸-13'aR*-스피로[시클로프로판-1,7'(9'H)-[1H]펜탈렌[1,6a-a]페난트렌-1'9'-디온의 제조:
(화합물 C-114)
테트라히드로푸란(30mL) 중의 디에논 C-113(1.17g, 0.05mmol)의 용액에 에테르(7mL) 중의 디아조메탄(0.2g, 0.07mmol)의 용액을 첨가한다. 결과되는 반응용액을 실온에서 수일 동안 저장한다. 그리고나서, 아세트산을 첨가하여 과량의 디아조메탄을 없애고, 반응물을 진공 하에 농축한다. 중간체 피라졸린인 잔류물을 아세톤, 헥산, 아세트산에틸 또는 에탄올과 같은 용매 하에 결정화하고나서 재결정화한다. 이 재료를 스피로시클로프로판 C-114로 전환한다. 따라서, 고체 C-114를 진공 하에 190℃에서 가열하고, 결과되는 고체를 알코올, 알코올 및 물, 아세톤 및 물 또는 아세트산에틸 및 헥산으로부터 재결정화한다. 다르게는, 아세톤 중의 피라졸린의 용액을 실온에서 약 1시간 동안 붕소 트리플루오리드 에테레이트로 처리한다. 물을 첨가하고, 결과되는 침전물을 여과하고, 공기건조한다. 재결정화함으로써 정제를 수행한다. 예를 들면, 여기에 참고문헌으로서 포함된 F.B. Colton 및 R.T. Nicholson, 미국 특허 3,499,891, March 10,(1970)에 기술된 절차를 참조한다.
실시예 X-15
다음 화학식의 화합물의 제조:
(화합물 C-115)
및
(화합물 C-116)
메탄올(20mL) 중의 에놀 에테르 C-111(3.2g, 10mmol)의 용액에 수소화붕소 나트륨(38mg)을 첨가한다. 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하고, 30분 동안 1N 염산으로 처리한다. 반응물을 물로 더 희석하고, 침전물을 여과하고, 물로 세척하고, 건조한다. 2가지 에피머성 알코올(화합물 C-115 및 화합물 C-116)의 혼합물로 이루어진 생성물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 수행하여 분리한다. 정제된 알코올 C-115 및 C-116을 알코올, 알코올 및 물, 아세트산에틸 및 헥산 그리고 아세톤 및 헥산과 같은 용매로부터 각각 재결정화한다. 다르게는, 희석된 반응혼합물을 아세트산에틸로 추출하고, 합한 유기층을 황산나트륨 상에서 건조하고, 그렇게 얻어진 미정제 생성물을 상기한 바와 같이 크로마토그래피를 수행하여 분리된 알코올 C-115 및 C-116을 얻는다.
실시예 X-16
다음 화학식의 화합물의 제조:
(화합물 C-117)
*
실시예 X-11에 기술된 화합물 C-111의 합성을 위해 기술된 절차에 따라서 오르토포름산 에틸(3.2g, 10mmol), 에탄올(10mL) 및 p-톨루엔술폰산 일수화물(0.05그)을 사용하여 화합물 C-1(3.8g, 10mmol)을 에놀 에테르 C-117로 전환한다.
실시예 X-17
3',4',5',17-테트라히드로-6α-히드록시-17β-메틸-3,5'-디옥소시클로펜타[13R,17]-18-노란드로스타-4,8,14-트리엔-7α-카르복실레이트(화합물 C-118)의 제조:
(화합물 C-118)
10% 수성 디옥산(20mL) 중의 57% m-클로로퍼옥시벤조산(3.64g)의 용액을 1N 수산화나트륨 용액으로 반중화한다. 이 용액을 0℃까지 냉각하고, 10% 수성 디옥산(20mL) 중의 에놀 에테르 C-117(4.1g, 10mmol)의 교반된 차가운 용액에 부분 첨가한다. 반응물을 실온에서 하룻밤 동안 교반하고, 얼음물에 붓고, 염화메틸렌 또는 아세트산에틸로 추출한다. 합한 유기층을 황산나트륨 상에서 건조한다. 용매를 증발시켜 미정제 히드록시 에스테르 C-118을 얻고, 이것을 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 수행함으로써 정제한다. 예를 들면, 여기에 참고문헌으로서 포함된 R.M. Weier 및 L.M. Hofmann, J. Med. Chem., 20, 1304-1308(1977)에 기술된 절차를 참고한다.
실시예 X-18
다음 화학식의 화합물의 제조:
(화합물 C-117)
메틸리튬(에테르 중의 1.6M 용액 19mL, 30mmol)을 아르곤 불활성 분위기 하에 0℃에서 에테르(30mL) 중의 요오드화 제일구리(2.86g, 15mmol)의 교반된 현탁액에 첨가함으로써 리튬 디메틸 큐프레이트를 제조한다. 15분 동안 냉기 하에 교반한 후, 테트라히드로푸란(25mL) 중의 테트라엔 C-105(1.6g, 15mmol)의 용액을 25분에 걸쳐 적하한다. 반응물을 30분 더 반응시키고, 격렬히 교반하면서 포화염화암모늄용액에 붓는다. 수성 혼합물을 아세트산에틸 또는 염화메틸렌으로 추출한다. 합한 유기층을 염화암모늄 수용액 및 물로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조한다. 용매를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 아세트산에틸 또는 염화메틸렌 중에 용해시키고 30분 내지 1시간 동안 증기욕 상에서 p-톨루엔술폰산(100mg)으로 처리한다. 유기용액을 물로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조한다. 용매를 진공 하에 제거하여 미정제 에논 C-119를 얻는다. 알코올, 알코올 및 물 또는 아세트산에틸 및 헥산으로부터 재결정화함으로써 정제를 수행한다. 다르게는, 미정제 에논 C-119를 실리카겔 상에서 크로마토그래피하고나서 재결정화한다. 예를 들면, 여기에 참고문헌으로서 포함된 J.K. Grunwell et al., Steroids, 27, 759-771(1976)에 기술된 절차를 참조한다.
실시예 X-19
다음 화학식의 화합물의 제조:
(화합물 C-121)
에스테르 C-120(4.00g, 10mmol)
(화합물 C-120)
(여기에 참고문헌으로서 포함된 R.M. Weier 및 L.M. Hofmann, J. Med. Chem., 18, 817(1975)에 기술된 절차에 따라서 제조됨)을 실시예 X-1에서 화합물 C-1의 합성을 위해 기술된 절차에 따라서 트리플루오로아세트산(25mL), 트리플루오로아세트산 무수물(4.5mL) 및 아세트산칼륨(6.7g, 7.1mmol)과 반응시킨다. 미정제 생성물 C-121을 실시예 X-1의 화합물 C-1을 위한 절차와 동일한 절차에 따라서 단리하고, 용리액으로서 아세트산에틸 및 톨루엔 또는 아세트산에틸 및 헥산의 혼합물을 사용하는 실리카겔 상에서의 크로마토그래피에 의해 정제하고, 그렇게 얻어진 생성물을 알코올, 알코올 및 물, 또는 아세트산에틸 및 헥산으로부터 재결정화함으로써 더 정제한다.
실시예 X-20
다음 화학식의 화합물의 제조:
(화합물 C-123)
에논 C-122(3.68g, 10mmol)
(화합물 C-122)
(여기에 참고문헌으로서 포함된 F.B. Colton 및 R.T. Nicholson, 미국 특허 3,499,891, March 10,(1970)에 기술된 절차에 따라서 제조됨)을 실시예 X-1에서 화합물 C-1의 합성을 위해 기술된 절차에 따라서 아세트산칼륨(6.7g, 7.1mmol), 트리플루오로아세트산(25mL) 및 트리플루오로아세트산 무수물(4.5mL)과 반응시킨다. 미정제 생성물을 상기 참고문헌에 기술된 대로 단리하고, 용리액으로서 아세트산에틸 및 헥산 또는 아세트산에틸 및 톨루엔의 혼합물을 사용하는 실리카겔 상에서의 크로마토그래피에 의해 정제한다. 정제된 C-123을 알코올, 알코올 및 물, 또는 아세트산에틸 및 헥산으로부터 재결정화함으로써 더 정제한다.
실시예 X-21
다음 화학식의 화합물의 제조:
(화합물 C-125)
및
(화합물 C-126)
화합물 C-108 및 C-1의 합성을 위해 위에서 사용된 절차에 따라서 화합물 C-125 및 C-126을 합성한다. 따라서, 건조 디메틸술폭시드(20mL) 중의 요오드화 트리메틸술폭소늄(1g, 4.6mmol)의 용액에 수소화나트륨(광물성 기름 중의 50% 분산액 220mg, 4.6mmol)을 첨가한다. 이 혼합물을 수소의 방출이 중지될 때까지 질소 하에 실온에서 교반한다.
그리고나서, 디메틸술폭시드(4mL) 중의 트리에논 C-124(1.14g, 3.5mmol)
(화합물 C-124)
의 용액을 첨가하고, 질소 분위기 하에 4시간 동안 교반을 계속한다. 출발물질로서 11α-히드록시 칸레논 대신에 칸레논을 사용함으로써 테트라엔 C-105의 제조를 위해 실시예 X-2에 기술된 절차에 따라서 트리에논 C-124를 제조한다. 반응혼합물을 물로 희석하고, 결과되는 침전물을 여과하고 공기건조한다. 생성물은 6β, 7β(화합물 C-125)와 6α, 7α(화합물 C-126) 이성질체의 혼합물이다. 이들 이성질체를 실리카겔 상에서의 크로마토그래피에 의해 분리하고, 아세트산에틸 및 헥산, 알코올 또는 알코올 및 물과 같은 용매로부터 재결정화함으로써 개별 이성정질체를 더 정제한다.
실시예 X-22
3',4',5',17-테트라히드로-17β-메틸-3,5'-디옥소시클로펜타[13R,17]-18-노란드로스타-1,4,8,14-테트라엔-7α-카르복실레이트(화합물 C-127)의 제조:
(화합물 C-127)
여기에 참고문헌으로서 포함된 R.M. Weier 및 L.M. Hofmann, J. Med. Chem., 18, 817(1975)에 기술된 절차에 따라서 디에논 C-127을 합성한다. 따라서, 디옥산(80mL) 중의 화합물 C-1(3.8g, 10mmol) 및 디클로로디시아노벤조퀴논(2.72g, 12mmol)의 용액을 24시간 동안 교반하면서 환류시킨다. 반응혼합물을 진공 하에 농축하고, 잔류물을 염화메틸렌으로 분해하고, 여과하고, 여과액을 2% 아황산나트륨, 5% 수산화나트륨 및 포화 염화나트륨 용액으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조한다. 건조제를 여과하고, 여과액을 진공 하에 농축한다. 미정제 생성물 디에논 C-127을 용리액으로서 아세트산에틸 및 톨루엔의 혼합물을 사용하는 실리카겔 상에서의 크로마토그래피에 의해 정제하고, 그렇게 단리된 생성물 27을 알코올로부터의 재결정화에 의해 더 정제한다.
실시예 X-23
2',3',3'aα,4',6'11'aα,12',13'-옥타히드로-3'aR,3'a,11'a-디메틸-13'aR*-스피로[시클로프로판-1,7'(9'H)-[1H]펜탈렌,[1,6a-a]페난트렌]1'9'-디온(화합물 C-128)의 제조:
(화합물 C-128)
디에논 C-127의 합성을 위해 실시예 X-22에서 기술된 절차 및 작업을 사용하여, 에논 C-114(3.48g, 10mmol)을 디옥산(80mL) 중의 디클로로디시아노벤조퀴논 (2.72g, 12mmol)을 사용하여 디에논 C-128으로 전환한다.
실시예 X-24
4bR(4bR*),5,5aS*,7,7aR*,8,9,11,12,12bS*-데카히드로-7A,12b-디메틸-10R*-시클로프로파(1)펜탈렌[1,6a-a]페난트렌-3,10-디온(화합물 C-129)의 제조:
(화합물 C-129)
디에논 C-127의 합성을 위해 실시예 X-22에서 기술된 절차 및 작업을 사용하여, 에논 C-108(3.34g, 10mmol)을 디옥산(80mL) 중의 디클로로디시아노벤조퀴논 (2.72g, 12mmol)을 사용하여 디에논 C-129로 전환한다.
실시예 X-25
다음의 화학식의 화합물의 제조:
(화합물 C-130)
테트라히드로푸란(35mL) 중의 카르복실산 C-101(3.66g, 10mmol) 및 N-메틸모르폴린(1.01g, 10mmol)의 차가운(0℃) 교반된 용액에 클로로포름산 이소부틸 (1.36g, 10mmol)을 첨가한다. 반응물을 0℃에서 20분동안 교반하고, 여과하고, 여과액을 진공 하에 농축한다. 잔류물은 혼합 무수물이고, 다음 단계에서 사용하기에 적합하다.
가압용기 내의 테트라히드로푸란(40mL) 중의 혼합 무수물(4.6g, 10mmol)의 차가운(0℃) 용액 중에서 기체 디메틸아민으로 기포를 발생시킨다. 15분 후에, 가압용기를 밀봉하고, 반응물을 24시간 동안 실온에서 정치시킨다. 반응물을 30분 동안 40℃까지 데우고, 다시 0℃까지 냉각한다. 실온까지 데운 후에, 용기를 대기에 통기시키고, 과량의 디메틸아민을 증발시킨다. 반응물을 진공 하에 농축하고, 잔류물을 아세트산에틸 중에 용해시키고, 1N 수산화나트륨 용액 및 물로 추출한다. 황산나트륨 상에서 건조한 후에, 유기층을 스트리핑하고, 용리액으로서 아세트산에틸 및 톨루엔의 혼합물을 사용하는 실리카겔 상에서의 크로마토그래피에 의해 잔류물을 정제한다. 그렇게 단리된 아미드 C-130을 알코올, 알코올 및 물 또는 아세트산에틸 및 헥산으로부터의 재결정화에 의해 더 정제한다.
실시예 X-26
다음 화학식의 화합물의 제조:
(화합물 C-131)
오르토포름산 에틸(10mL) 및 무수 에탄올(10mL) 중의 에논 C-114(3.5g, 10mmol)의 현탁액에 p-톨루엔술폰산 일수화물(0.05g)을 첨가한다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 피리딘 몇방울을 첨가함으로써 퀀칭한다. 0℃에서 5분 더 교반한 후에, 결과되는 침전물을 여과하고, 소량의 메탄올로 세척하고, 흔적량의 피리딘을 함유하는 알코올 또는 아세트산에틸 및 헥산으로부터 재결정화하여 순수한 에놀 에테르 C-131을 얻는다.
다르게는, 진공 하에 모든 용매를 제거하고 헥산, 에테르, 아세트산에틸 또는 헥산과 같은 용매를 첨가하여 잔류물을 결정화함으로써 피리딘의 첨가 후에 반응시킬 수도 있다. 미정제 에놀 에테르 C-131을 상기한 바와 같이 재결정화한다.
실시예 X-27
다음 화학식의 화합물의 제조:
(화합물 C-132)
리튬 비스(트리메틸실일)아미드의 차가운(-78℃) 용액(테트라히드로푸란 중의 1.0M 용액 10mL)에 테트라히드로푸란(20mL) 중의 에놀 에테르 C-131(3.8g, 10mmol)의 용액을 20분에 걸쳐서 적하한다. 반응물을 -78℃에서 10분 동안 교반하고, 테트라히드로푸란(5mL) 중의 염화페닐셀렌일(1.9g, 10mmol)의 용액을 첨가한다. 반응물을 5분 동안 교반하고, 1% 황산수소나트륨 용액의 첨가에 의해 퀀칭한다. 반응물을 물로 더 희석하고, 아세트산에틸로 추출한다. 합한 유기층을 5% 중탄산나트륨 수용액으로 세척하고, 물로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조한다. 건조제를 여과하고, 여과액을 진공 하에 농축한다. 용리액으로서 아세트산에틸 및 톨루엔 또는 아세트산에틸 및 헥산의 혼합물을 사용하는 실리카겔 상에서의 크로마토그래피에 의해 잔류물을 정제하여 순수한 셀레니드 C-132를 얻는다.
실시예 X-28
다음 화학식의 화합물의 제조:
(화합물 C-133)
염화메틸렌(40mL) 중의 셀레니드 C-132(g, 10mmol) 및 피리딘(1.61mL, 20mmol)의 차가운(0℃) 용액에 물(3mL) 중의 과산화수소(30%용액 3.1g, 27mmol)의 용액을 서서히 첨가한다. 온도를 30-35℃ 보다 낮게 유지한다. 발열이 가라앉은 후에, 얼음욕을 제거하고, 반응물을 실온에서 15분 동안 격렬하게 교반한다. 반응물을 염화메틸렌으로 희석하고, 5% 중탄산나트륨 용액 및 물로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조한다. 건조제를 여과하고, 여과액을 진공 하에 농축한다. 용리액으로서 아세트산에틸 및 톨루엔 또는 아세트산에틸 및 헥산의 혼합물을 사용하는 실리카겔 상에서의 크로마토그래피에 의해 정제하여 순수한 불포화 케톤 C-133을 얻고, 이것을 아세트산에틸 및 헥산 또는 알코올로부터 재결정화함으로써 더 정제한다.
실시에 X-29
다음 화학식의 화합물의 제조:
(화합물 C-134)
아세톤(15mL) 중의 케톤 C-133(2g)의 용액을 실온에서 1시간 동안 1N 염산(4mL)으로 처리한다. 반응물을 진공 하에 농축한다. 잔류물을 물로 희석하고, 아세트산에틸로 추출한다. 합한 유기층을 5% 중탄산나트륨 용액 및 물로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조한다. 건조제를 여과하고, 여과액을 진공 하에 농축하여 미정제 케톤 C-134를 얻는다. 용리액으로서 아세트산에틸 및 톨루엔의 혼합물을 사용하는 실리카겔 상에서의 크로마토그래피에 의해 미정제 생성물을 정제하여 순수한 케톤 C-134를 얻고, 이것을 아세트산에틸 및 헥산 또는 알코올로부터 재결정화함으로써 더 정제한다.
본 발명에 따르면, 에폭시멕스레논, 다른 20-스피록산 및 공통된 구조적 특징을 가지고 있는 다른 스테로이드들을 보다 개선된 방법으로 제조할 수 있다. 즉, 일반식 IA 의 생성물 및 다른 관련된 화합물들을 고수율로 제조하는 개선된 제조 방법을 제공하고; 최소한의 단리 단계를 포함하는 그러한 제조 방법을 제공하며; 타당한 자본 비용을 제공할 수 있고 타당한 전환비용으로 작동될 수 있는 그러한 방법을 제공한다. 더 구체적으로, 본 발명은 5,7-락톤-△9,11- 17-스피로락톤 스테로이드 (화합물 E 및 F)와 이의 제조방법을 제공한다.
도 1 은 칸레논(canrenon) 또는 칸레논 유도체의 해당하는 11α-히드록시 화합물로의 생체내 전환 방법을 보여주는 개략적인 흐름도이다.
도 2 는 칸레논 및 칸레논 유도체의 생체내 전환/11-α-히드록실화에 대한 바람직한 방법의 개략적인 흐름도이다.
도 3 은 칸레논 및 칸레논 유도체의 생체내전환/11-α-히드록실화에 대한 특별히 바람직한 방법의 개략적인 흐름도이다.
도 4 는 도 2 의 방법에 따라 제조되는 칸레논에 대한 입자 크기 분포를 도시한다.
도 5 는 도 3 의 방법에 따라 전환 발효기에서 멸균된 칸레논에 대한 입자 크기 분포를 도시한다.
해당하는 참조 기호는 전 도면을 통하여 해당하는 부분을 가리킨다.

Claims (8)

  1. 3-탄소에서 케토 또는 디알콕시로 치환되고, 다음의 부분
    (화학식 XXX)
    (식에서, C(5)는 락톤 화합물의 스테로이드 구조의 5-탄소를 나타내고, C(7)은 락톤 화합물의 스테로이드 구조의 7-탄소를 나타낸다)을 포함하는 4,5-디히드로-5,7-락톤 스테로이드 화합물의 제조방법으로서,
    7-시아노 치환된 스테로이드를 대응하는 7-카르복실산 치환 스테로이드로 전환한 후에, 7-카르복실산 치환 스테로이드를 대응하는 5,7-락톤 치환 스테로이드로 전환하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 7-카르복실산 치환 스테로이드가 3-케토-△-4,5-7-카르복시 스테로이드를 포함하고, 3-디알콕시-5,7-락톤을 포함하는 케탈 중간체가 형성되고, 상기 3-디알콕시-5,7-락톤을 산성 조건 하에 가수분해하여 3-케토-5,7-락톤을 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 화학식 E
    (화학식 E)
    (식에서, -A-A-는 -CHR4-CHR5- 또는 -CR4=CR5- 기를 나타내고;
    R3, R4 및 R5 는 독립적으로 수소, 할로, 히드록시, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 시아노 및 아릴옥시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R17은 C1 내지 C4 알킬이고;
    -B-B- 는 -CHR6-CHR7- 기 또는 알파- 또는 베타- 배향의 다음의 기
    (화학식 III)
    (식에서, R6 및 R7 은 독립적으로 수소, 할로, C1-C4 알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어진 군으로부터 선택된다)을 나타낸다)에 해당하는 화합물의 제조방법으로서,
    화학식 DE2에 해당하는 화합물을 알칼리 금속 할로겐화물의 존재 하에 열분해하는 것을 포함하고,
    상기 화학식 DE2의 화합물이 다음의 구조
    (화학식 DE2)
    (식에서, R12는 C1 내지 C4 알킬이고, -A-A-, -B-B-, R3 및 R17은 상기 정의한 바와 같다)를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 화학식 DE2
    (화학식 DE2)
    (식에서, -A-A-는 -CHR4-CHR5- 또는 -CR4=CR5- 기를 나타내고;
    R3, R4 및 R5 는 독립적으로 수소, 할로, 히드록시, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 시아노 및 아릴옥시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R12 및 R17은 독립적으로 C1 내지 C4 알킬 중에서 선택되고;
    -B-B- 는 -CHR6-CHR7- 기 또는 알파- 또는 베타- 배향의 다음의 기
    (화학식 III)
    (식에서, R6 및 R7 은 독립적으로 수소, 할로, C1-C4 알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어진 군으로부터 선택된다)을 나타낸다)에 해당하는 화합물의 제조방법으로서,
    화학식 DE1의 화합물을 염기의 존재 하에 디알킬 말로네이트로 축합시키는 것을 포함하고,
    상기 화합물 DE1의 화합물이 다음의 구조
    (화학식 DE1)
    (식에서, -A-A-, -B-B-, R3 및 R17은 상기 정의한 바와 같다)
  5. 화학식 E에 해당하는 화합물:
    (화학식 E)
    식에서, -A-A-는 -CHR4-CHR5- 또는 -CR4=CR5- 기를 나타내고;
    R3, R4 및 R5 는 독립적으로 수소, 할로, 히드록시, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R17은 C1 내지 C4 알킬이고;
    -B-B- 는 -CHR6-CHR7- 기 또는 알파- 또는 베타- 배향의 다음의 기
    (화학식 III)
    (식에서, R6 및 R7 은 독립적으로 수소, 할로, C1-C4 알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어진 군으로부터 선택된다)을 나타낸다.
  6. 화학식 F에 해당하는 화합물:
    (화학식 F)
    식에서, -A-A-는 -CHR4-CHR5- 또는 -CR4=CR5- 기를 나타내고;
    R3, R4 및 R5 는 독립적으로 수소, 할로, 히드록시, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    -B-B- 는 -CHR6-CHR7- 기 또는 알파- 또는 베타- 배향의 다음의 기
    (화학식 III)
    (식에서, R6 및 R7 은 독립적으로 수소, 할로, C1-C4 알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어진 군으로부터 선택된다)을 나타낸다.
  7. 화학식 A211에 해당하는 화합물:
    (화학식 A211)
    식에서, -A-A-는 -CHR4-CHR5- 또는 -CR4=CR5- 기를 나타내고;
    R3, R4 및 R5 는 독립적으로 수소, 할로, 히드록시, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    -B-B- 는 -CHR6-CHR7- 기 또는 알파- 또는 베타- 배향의 다음의 기
    (화학식 III)
    (식에서, R6 및 R7 은 독립적으로 수소, 할로, C1-C4 알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어진 군으로부터 선택된다)을 나타내고;
    R80 및 R90은 독립적으로 각각 R8 및 R9으로부터 선택되거나, 또는 R80 및 R90은 함께 케토를 형성하고;
    R8 및 R9 는 독립적으로 수소, 히드록시, 할로, C1-C4 알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐알킬, 알콕시카르보닐알킬, 아실옥시알킬, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R8 및 R9 는 함께 카르보고리형 또는 헤테로고리형 고리 구조를 구성하거나, 또는 R6 또는 R7 과 함께 5-원 고리형 D 고리에 융합된 카르보고리형 또는 헤테로고리형 고리 구조를 구성한다.
  8. 화학식 A210에 해당하는 화합물:
    (화학식 A210)
    식에서, -A-A-는 -CHR4-CHR5- 또는 -CR4=CR5- 기를 나타내고;
    R3, R4 및 R5 는 독립적으로 수소, 할로, 히드록시, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    -B-B- 는 -CHR6-CHR7- 기 또는 알파- 또는 베타- 배향의 다음의 기
    (화학식 III)
    (식에서, R6 및 R7 은 독립적으로 수소, 할로, C1-C4 알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어진 군으로부터 선택된다)을 나타내고;
    R80 및 R90은 독립적으로 각각 R8 및 R9으로부터 선택되거나, 또는 R80 및 R90은 함께 케토를 형성하고;
    R8 및 R9 는 독립적으로 수소, 히드록시, 할로, C1-C4 알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐알킬, 알콕시카르보닐알킬, 아실옥시알킬, 시아노 및 아릴옥시 기로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R8 및 R9 는 함께 카르보고리형 또는 헤테로고리형 고리 구조를 구성하거나, 또는 R6 또는 R7 과 함께 5-원 고리형 D 고리에 융합된 카르보고리형 또는 헤테로고리형 고리 구조를 구성한다.
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Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA74141C2 (uk) 1998-12-09 2005-11-15 Дж.Д. Сірл Енд Ко. Фармацевтична композиція на основі тонкоподрібненого еплеренону (варіанти), спосіб її одержання та спосіб лікування розладів, опосередкованих альдостероном (варіанти)
NZ513961A (en) * 1999-12-08 2004-02-27 Pharmacia Corp Eplerenone crystalline form exhibiting enhanced dissolution rate
JP4219105B2 (ja) * 1999-12-08 2009-02-04 ファルマシア コーポレーション エプレレノン結晶形
EP1505072A3 (en) * 1999-12-08 2006-06-21 Pharmacia Corporation Eplerenone crystalline form exhiniting enhanced dissolution rate
EP1580193A3 (en) * 1999-12-08 2010-06-23 Pharmacia Corporation Eplerenone crystalline form
US6716829B2 (en) 2000-07-27 2004-04-06 Pharmacia Corporation Aldosterone antagonist and cyclooxygenase-2 inhibitor combination therapy to prevent or treat inflammation-related cardiovascular disorders
DK1313485T3 (da) * 2000-08-28 2005-12-27 Pharmacia Corp Anvendelse af en aldosteronreceptorantagonist til forbedring af kognitiv funktion
CN1531590A (zh) 2000-10-30 2004-09-22 赭曲霉11α-羟化酶和氧化还原酶
US7235655B2 (en) * 2002-03-22 2007-06-26 Pharmacia & Upjohn Company Processes to prepare eplerenone
KR20040097201A (ko) * 2002-03-22 2004-11-17 파마시아 앤드 업존 캄파니 에플레레논의 제조 방법
CN1694897A (zh) 2002-11-06 2005-11-09 法玛西亚普强责任有限公司 7－羧基取代的甾族化合物的制备方法
KR100667123B1 (ko) * 2002-11-07 2007-01-12 파마시아 앤드 업존 캄파니 엘엘씨 Ｃ-7 치환된 5-안드로스텐의 제조 방법
CL2004000574A1 (es) * 2003-03-21 2005-02-11 Pharmacia Corp Sa Organizada B Proceso para preparar un compuesto 17-espirolactona o la sal de lactona abierta por carbonilacion del correspondiente 17-alquenil o alquinil derivado, los intermediarios que se usan y su proceso de obtencion.
EP1626980A4 (en) 2003-05-29 2007-07-04 Univ Washington NEUROACTIVE 13,24-CYCLO-18,21-DINORCHOLANES AND STRUCTURELY RELATED PENTACYCLIC STEROIDS
CA2560389A1 (en) * 2004-03-22 2005-10-06 Pharmacia & Upjohn Company Llc Improved process for the preparation of 9,11 epoxy steroids
EP1793187B1 (en) * 2004-09-21 2011-11-23 Vives Joan Iglesias Method and machine for the sintering and/or drying of powder materials using infrared radiation
CA2525205C (en) * 2004-11-08 2013-06-25 Ecolab Inc. Foam cleaning and brightening composition, and methods
HUP0402466A2 (en) * 2004-11-30 2006-07-28 Richter Gedeon Vegyeszet Industrial process for preparing 17-hydroxy-6-betha, 7-betha, 15-betha, 16-betha-bis-methylene-3-oxo-17-alpha-pregn-4-ene-21-carboxylic acid gamma lacton and the main, intermediates of the process
CN1321128C (zh) * 2005-07-15 2007-06-13 浙江医药股份有限公司新昌制药厂 孕甾－4－烯－7，21－二甲酸，9，11－环氧－17－羟基－3－氧代，γ－内酯，甲酯，(7α,11α,17α)－的制备方法
US8222237B2 (en) * 2008-11-25 2012-07-17 Evestra, Inc. Progestational 3-(6,6-ethylene-17B-hydroxy-3-oxo-17A-pregna-4-ene-17A-yl)propionic acid G-lactones
ES2566934T3 (es) 2010-05-10 2016-04-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Métodos y composiciones para el tratamiento de la acumulación de líquido en y/o bajo la retina
EP2582365B1 (en) 2010-06-16 2019-03-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Compositions for stimulating reepithelialisation during wound healing
CN104844681B (zh) * 2014-02-13 2016-06-01 合肥久诺医药科技有限公司 一种l晶型依普利酮的精制方法
EP3009443B1 (en) 2014-10-17 2018-09-12 INDUSTRIALE CHIMICA S.r.l. Process for the preparation of 7alfa-(methoxycarbonyl)-3-oxo-17alfa-pregn-4,9(11)-dien-21,17-carbolactone, a useful intermediate for the synthesis of molecules with pharmacological activity
WO2017055248A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of heart failure
WO2017064121A1 (en) 2015-10-13 2017-04-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of choroidal neovascularisation
CN105541960A (zh) * 2016-02-22 2016-05-04 浙江仙琚制药股份有限公司 17α-羟基-3-氧代-γ-内酯-孕甾-4-烯-（7α，9α）-二羧酸内酯的制备方法
ES2973248T3 (es) 2016-07-26 2024-06-19 Inst Nat Sante Rech Med Antagonista del receptor mineralocorticoide para el tratamiento de la osteoartritis
CN106349326A (zh) * 2016-07-29 2017-01-25 北京万全德众医药生物技术有限公司 依普利酮杂质a的制备方法
CN107602652A (zh) * 2017-10-11 2018-01-19 浙江仙琚制药股份有限公司 制备6β‑甲基泼尼松龙的方法
CN108445236B (zh) * 2018-02-07 2021-04-20 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 甾体类衍生物和其保存液以及其应用
CN110698529A (zh) * 2019-11-19 2020-01-17 湖南新合新生物医药有限公司 一种依普利酮中间体△9,11烯酯的制备方法
US20240366632A1 (en) 2021-08-31 2024-11-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of ocular rosacea
CN115433252A (zh) * 2022-08-24 2022-12-06 浙江亚瑟医药有限公司 一种δ9(11)-坎利酮的制备方法

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3053856A (en) * 1958-10-29 1962-09-11 Shell Oil Co Epoxidation of ethylenic compounds with peroxycarboximidic acids
US3200113A (en) 1963-01-09 1965-08-10 Sterling Drug Inc 7-cyano steroids and derivatives thereof
US3300489A (en) 1964-07-24 1967-01-24 Smith Kline French Lab Steroidal c-17 spirolactones and processes and intermediates used in the preparation thereof
US3413288A (en) 1965-07-07 1968-11-26 Parke Davis & Co Process for the production of steroidal c-17 spirolactones
US3759791A (en) 1970-12-10 1973-09-18 Searle & Co Selective microbiological preparation of androst-4-ene-3,17-dione
DE2404948C2 (de) * 1973-02-06 1983-04-14 Roussel-Uclaf, 75007 Paris 7&alpha;-Acylthio-Steroidspirolactonderivate
FR2216273B1 (ko) 1973-02-06 1977-07-22 Roussel Uclaf
GB1455220A (ko) * 1973-09-14 1976-11-10 Searle & Co
DE2349022A1 (de) 1973-09-26 1975-04-10 Schering Ag Neue d-homo-steroide
FR2260569B1 (ko) 1974-02-08 1978-06-16 Ugine Kuhlmann
IE44711B1 (en) 1976-03-05 1982-03-10 Schering Ag 17 -hydroxypropyl-4-3-keto-steroids and esters thereof, and process for their manufacture
YU41412B (en) 1978-08-15 1987-04-30 Gist Brocades Nv Process for obtaining 17 beta-hydroxy -3-dxo-17 alpha-pregn-4-en-21-carboxylic acid
US4270994A (en) 1980-02-20 1981-06-02 G. D. Searle & Co. Electrochemical dehydrogenation of steroidal Δ3,5 enol ethers under basic conditions to provide steroidal Δ4,6 dienones
JPS58179498A (ja) * 1982-04-13 1983-10-20 Dainippon Ink & Chem Inc 微生物による１１α−ヒドロキシル化アンドロスタン系化合物の製造方法
US4559332A (en) * 1983-04-13 1985-12-17 Ciba Geigy Corporation 20-Spiroxanes and analogues having an open ring E, processes for their manufacture, and pharmaceutical preparations thereof
EP0123734A1 (en) 1983-04-29 1984-11-07 Gist-Brocades N.V. 17-(Isocyano-sulfonylmethylene)-steroids, 17-(formamido-sulfonylmethylene)-steroids and their preparation
US4670551A (en) * 1984-06-21 1987-06-02 Ciba-Geigy Corporation Epoxy steroids
WO1988002753A2 (en) 1986-10-10 1988-04-21 Gist-Brocades N.V. 9-alpha-hydroxy steroids and process for their preparation
US5502222A (en) 1994-06-01 1996-03-26 Schering Corporation Process for preparing delta 9,11 and 21-chloro corticosteroids
WO1997021720A2 (en) * 1995-12-11 1997-06-19 G.D. Searle And Co. Processes for preparation of 7 alpha-carboxyl 9,11-epoxy steroids and intermediates useful therein and a general process for the epoxidation of olifinic double bonds

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CA2273343A1 (en) 1998-06-18

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