KR100526436B1 - 화살나무 수용성 추출물 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 화살나무 수용성 추출물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 화살나무를 유기용매로 처리하여 유기용매 용해성 분획을 제거한 후 남은 잔사를 물로 추출하여 기존의 화살나무 수 추출물과는 다른 새로운 수용성 추출물을 얻고, 이 수용성 추출물이 항암 활성을 가지고, 또한 항암제의 보조제 역할로 항암제의 독성완화 및 활성을 증강시키는 등의 효능이 강하고 독특한 생리활성을 밝힘으로써 이를 이용한 항암 및 항암제 보조용의 기능성 건강식품의 제조에 관한 것이다.
따라서, 상기 화살나무 수용성 추출물을 기능성 건강식품 등의 용도로 사용하여 암 예방 및 치료에 적용되어 보건향상에 기여함은 물론 화살나무가 특용작물로 채택되어 농가의 소득증진에 기여하는 효과가 예상된다.
Description
본 발명은 화살나무 수용성 추출물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 화살나무를 유기용매로 처리하여 유기용매 용해성 분획을 제거한 후 남은 잔사를 물로 추출하여 기존의 화살나무 수 추출물과는 다른 새로운 수용성 추출물을 얻고, 이 수용성 추출물이 항암 활성을 가지며, 또한 항암제에 보조제 역할로 항암제의 독성완화 및 활성을 증강시키는 등의 효능이 강하고 독특한 생리활성을 가지고 있음을 밝힘으로써 이를 이용한 항암 및 항암제 보조 기능성 건강식품에 관한 것이다.
환경의 악화와 노년인구의 증가로 세계 암 발생률이 매년 5%이상 증가하고 있으며, 1997년 암을 원인으로 한 사망자가 600만 명으로 세계 사망률의 12%에 달했다. 국내에서도 매년 10만 명의 암환자가 새롭게 발생하고 5만 여명이 매년 사망하고 있으며, 암환자 증가율도 10%에 이르고 있다. 1999년 국립암센터의 통계에 따르면 환자는 12만 명으로서 남자는 위암(24%), 간암(16%), 폐암(16%), 대장암(10%)의 순서이며, 여자는 위암(16%), 유방암(15%), 자궁경부암(12%), 대장암(10%)의 순서로 암 환자가 발생했다.
이러한 암의 치료를 위해서는 외과적 수술요법, 화학요법, 생물학적 요법, 방사선요법 등이 이용되고 있다. 화학요법은 흔히 말하는 약물요법으로서 핵산 알킬화제, 대사 길항제, 천연물, 호르몬제 등의 합성된 화학물질을 이용한 것이며, 생물학적 요법은 우리 몸이 원래 가지고 있는 면역 기능을 회복시키거나 증진시켜 암세포의 활동력을 약화시킴으로써 암의 진행을 막는 것으로서, 사이토카인, 면역요법제, 유전자 치료제, 암백신, 신생혈관형성 억제제 등이 있다. 현재까지는 이러한 방법들을 단독 혹은 병용하여 치료에 응용하고 있으나 부작용, 약제내성, 재발 등으로 완벽한 치료법이 없는 상태이다.
지금까지 항암제 연구는 암세포처럼 세포분열이 왕성한 조직에 대한 세포독성을 근거로 하여 행하여지기 때문에 세포분열이 빠른 피부, 점막, 골수 같은 정상조직 세포에도 독성을 나타내게 된다. 따라서, 효과적인 항암제 개발을 위해서는 암세포에만 특이적으로 작용하고 정상세포에 대해서는 독성이 적은 항암 활성물질의 탐색이 이루어져야 한다. 현재 식물과 미생물 등에서 추출한 항암물질에 대한 연구가 많이 진행되고 있으나, 이들 대부분이 미생물의 2차 대사산물이거나 생약재에서 추출된 물질에 관한 연구가 주를 이루고 있다.
암세포는 일반 정상조직 세포보다는 분열증식이 빠르다. 따라서, 항암제는 세포선택성이 없으며, 단지 비교적 빠르게 분열증식을 하는 세포에 보다 친화성을 보인다는 점에 그 적용한계를 보인다. 따라서, 항암제를 투여하면 암종세포의 분열억제효과(손상)를 보임과 동시에 정상조직에서도 암세포에서와 같이 빠르게 분화증식하는 골수세포, 모발 여포세포, 위장관 점막세포 등도 심한 손상을 받는다. 그 결과, 백혈구감소증(leukopenia), 빈혈(anemial), 중성구감소증(neutropenia), 쯔롬빈감소증(thrombocytopenia), 탈모증(alopecia), 오심, 구토, 위궤양 등의 부작용이 수반된다. 특히, 혈액세포의 기능저하는 면역능의 저하에 의한 암치료효율의 감소뿐만 아니라 감염에 대한 저항력의 감소를 야기하며, 위장관의 손상은 식이장애로 발전되어진다. 따라서, 함암제의 부작용을 완화시키기 위하여 독성 및 작용기전이 상이하거나 상승작용을 보이는 여러 항암제를 병합투여하지만 이는 부작용을 다소 경감시킬 뿐이며, 일단 부작용이 나타나면 감염을 예방하기 위하여 광범위 항생제를 투여하거나 제토제(antiemics)를 투여할 수 있을 뿐이다.
화살나무(Euonymus alatus, 일명 귀전우)는 한반도 중심의 동북아에 분포되어 있는 목본식물이며, 오래 전부터 재래민방에서 그 줄기를 위암 및 위궤양의 치료목적으로 사용하고 있다. 그러나, 이와 같은 재래방법(그 줄기를 물로 자비 추출하여 음용함)으로는 비록 독성은 인지되지 않으나 효능을 과학적으로 검정할 수 없다. 그 이유는 재래방법으로 추출한 추출액 내에는 서로 길항작용을 가진 작용이 상반되는 물질이 혼합되어 있을 뿐만 아니라 이들은 산에는 안정하나 위의 소화효소에 의해서 불활화되기 때문이다. 따라서, 지금까지 많은 연구자가 본 재료를 소재로 한 연구를 수행하여 왔으나 만족할 만한 결과를 표출하지 못하였다.
본 발명자는 화살나무에 대한 연구를 수년간 해왔으며, 이미 화살나무를 물로 직접 추출한 수 추출물에서 항암활성 및 항암보조활성이 나타났지만, 의약물로 적용하기에는 그 유효활성이 눈에 띄지 않아 이의 적용범위가 제한되었다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 화살나무를 유기용매로 처리하여 유기용매 용해성 분획을 제거한 후 남은 잔사를 다시 물로 추출한 수용성 추출물이 기존의 수 추출물과는 유효 성분 분포에서 차이가 있었으며[도 1 참조], 그 적용 효과에서도 항암제의 독성을 완화하고 항암활성을 증강시키는 등의 현저한 효과로 인해 항암제 보조 기능성 식품으로 적용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 화살나무를 유기용매로 처리하여 유기용매 용해성 분획을 제거한 후 남은 잔사를 물로 추출하여 얻은 수용성 추출물을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 화살나무 수용성 추출물을 함유하는 항암제, 항암제 보조제 및 건강식품을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 화살나무를 유기용매로 처리하여 유기용매 용해성 분획을 제거한 후 남은 잔사를 물로 추출하여 얻은 수용성 추출물을 그 특징으로 한다.
또한, 상기 수용성 추출물을 함유하는 항암제, 항암제 보조제 및 건강식품을 또 다른 특징으로 하며, 경구용으로 사용하기 위하여 장용코딩함을 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 화살나무를 유기용매로 처리하여 유기용매 용해성 분획을 제거한 후 남은 잔사를 물로 추출하여 기존의 화살나무 수 추출물과는 다른 새로운 수용성 추출물을 얻고, 이 수용성 추출물을 장용코팅함으로써 경구투여하면 항암 활성을 가지고, 또한 항암제의 보조제 역할로 항암제의 독성완화 및 활성을 증강시키는 등의 효능이 강하고 독특한 생리활성을 밝힘으로써 이를 이용한 항암 및 항암제 보조기능성 건강식품에 관한 것이다.
화살나무 수용성 추출물을 얻는 과정을 설명하면, 먼저 화살나무의 잔가지를 절단하여 건조시킨 후, 건조된 재료를 유기용매에 침적시켜 부치시킨다. 그런 다음, 유기용매를 여과하여 제거시키고 건조시켜 잔류된 유기용매를 완전히 휘발시킨다. 이와 같이 유기용매 용해성 물질을 제거시킨 재료를 증류수로 85℃에서 12시간 추출하여 수용성 추출물을 얻는다. 이때, 상기 유기용매로는 에틸 아세테이트, 에틸알콜, 메틸알콜, 에테르, 헥산, 부틸알콜 등이 바람직하며, 가장 바람직하기로는 에틸 아세테이트를 사용한다.
이렇게 얻은 화살나무 수용성 추출물은 기존의 화살나무 수 추출물과는 유효성분 분포에서 차이가 있으며[도 1 참조], 기존의 추출물에 비해 항암 활성 및 항암제 독성 완화 및 항암 활성을 증강시키는 데 있어 현저한 효과상의 차이가 있어 의약물로도 사용 가능하다.
따라서, 본 발명은 상기 화살나무 수용성 추출물이 유효성분으로 함유되는 항암 및 항암제 보조제와 같은 기능성 건강식품을 또 다른 특징으로 한다.
화살나무 수용성 추출물을 유효성분으로 함유하는 제품으로 제조시에는 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제(diluent) 등과 혼합하여 분말, 과립, 캡슐 또는 주사제 등으로도 제조가 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 화살나무 수용성 추출물의 투여용량은 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태 식이, 투여시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 상기 화살나무 수용성 추출물은 체중 1 ㎏당 10 ∼ 30 ㎎ 정도를 투여하는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 추출물을 함유하는 항암 및 항암제 보조제는 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
또한, 화살나무는 오래 전부터 생약제로 사용되어 안전하며, 실험 동물에서도 급성 독성을 나타내지 않았다.
이상에서 설명한 화살나무 수용성 추출물이 유효성분으로 함유된 의약품 및 기능성 식품은 암 예방 및 치료에 매우 탁월하다.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
비교예 1: 기존의 화살나무 수 추출물의 제조
화살나무의 잔가지를 세절하여 증류수로 85 ℃에서 12시간 중탕하여 추출한 후 여과시켜 감압농축시킨 다음 냉동건조시켰다. 여기서 얻은 추출물을 HPLC 스펙트럼으로 확인한 결과는 도 1(좌편 water extract)과 같다.
실시예 1: 본 발명의 수용성 추출물의 제조
늦가을에 수확한 화살나무의 콜크질이 잘 발달된 잔가지를 0.5 ㎝로 절단하여 열풍건조실에 넣어 50 ℃에서 24시간 건조시켰다.
건조된 상기 재료를 에틸 아세테이트에 침적시켜 60 ℃에서 12시간 부치시킨 후 에틸 아세테이트를 여과하여 제거시킨 다음 50 ℃ 건조실에서 24시간 건조시켜 잔류된 에틸 아세테이트를 완전히 휘발시켰다. 이와 같이 에틸 아세테이트 용해성 물질을 제거시킨 재료를 증류수로 85 ℃에서 12시간 추출하여 수용성 추출물을 얻었다. 이어 이 추출물을 감압여과시킨 후 여과액을 진공농축기를 이용하여 25 ∼ 60 Brix로 농축시켜 농축액을 얻은 후 냉동건조시켰다.
여기서 얻은 추출물을 HPLC 스펙트럼으로 확인한 결과는 도 1(우편 pre-ethyl acetate water extract)과 같으며, 상기 비교예 1(좌편 water extract)의 추출물과는 피크 2(RT: 4.17), 3(RT: 5.00), 5(RT: 6.67) 부분에서 차이가 있으며, 이로 인하여 다음 실시예에 나타낸 활성들에 있어 매우 우수한 효과를 가짐을 알게 되었다.
실험예 1: 종양억제 활성
1) 화살나무 수용성 추출물의 발암제(3-methylcholanthrene) 발암원성 억제효과
화살나무 수용성 추출물의 화학적 발암제에 의한 발암원성 억제 효능을 확인하기 위하여, Balb/c 마우스를 대상으로 아세톤에 용해한 0.4% 3-MCA(3-methylcholanthrene) 0.2 ㎖를 각 마우스의 면도된 배부 피부에 주 3회씩 2개월간 국소 도포하여 편평상피세포 암종(squamous cell carcinoma)의 발생을 유도하였다. 이때 화살나무 수용성 추출물은 1 ㎎/마우스의 농도로 매일 동일기간 경구로 투여했으며, 대조군은 동일기간 식염수를 투여하였다. 그 후 종양유도 개시 9주에 각군의 종양발생율, 종양마우스당 종양의 수 및 무게를 측정하였던 바, 그 결과는 다음 표 1과 같다. 즉, 화살나무 수용성 추출물 투여군에서의 종양발생율, 종양의 수 및 무게는 대조군의 그것들에 비하여 각각 22%, 57.8% 및 31.7%의 수준에 머물러 물 추출물이 암 발생 뿐만 아니라 발생된 암종의 증식을 현저히 저하시켰다.
| 구분 | 대조군(식염수) | 화살나무 수용성추출물 투여군 |
| 마우스 수 | 93 마리 | 87 마리 |
| 종양발생빈도(%) | 29 마리(31.9) | 6 마리(6.9) |
| 종양동물당 종양의 수 | 1.9 | 1.1 |
| 마우스당 종양의 중량* | 6.52 mg | 2.07 mg |
| * 종양의 중량(㎎) = 종양의 장축(㎜) ×종양의 단축(mm)/2 | ||
2) 화살나무 수용성 추출물의 종양세포 이식에 의한 종양발생 억제효과
화살나무 수용성 추출물의 종양세포 이식에 의한 종양발생 억제효과를 확인하기 위하여, C57BL/6 마우스를 대상으로 Lewis 폐암종 세포주인 3LL세포, 마우스 육종세포주인 S-180세포 및 페장 친화성 흑색종 세포주인 B16세포를 각 마우스의 면도된 배부 피내에 1 ×106cells/마우스로 이식한 후 발생된 종양 빈도와 종양의 크기를 경시적으로 관찰하였다. 이때 화살나무 수용성 추출물은 1 ㎎/마우스의 용량으로 종양세포 이식 1주 전부터 1주 후까지 14일간 매일 1회 경구투여하였다. 그 결과, 종양의 발생빈도와 종양의 크기 모두 화살나무 수용성 추출물을 투여한 군에서 대조에 비하여 이식한 세포주에 따라 다소 정도차이는 보이나 모두 유의하게 감소되었다[표 2]. 이와 같은 결과는 화살나무 수용성 추출물이 종양세포주의 이식에 의한 종양의 발생과 증식을 모두 억제함을 제시한다.
| 종양세포주 | 이식 후 기간 | 화살나무 수용성 추출물 투여 | 종양 빈도 | 종양 중량(㎎)* | |
| 수 | % | ||||
| 3LL세포 | 5일 | - | 16/20 | 80 | 49.8 ±6.5 |
| + | 7/20 | 35 | 30.4 ±4.2 | ||
| 10일 | - | 16/20 | 80 | 97.5 ±5.7 | |
| + | 6/20 | 30 | 68.4 ±7.3 | ||
| 15일 | - | 16/20 | 80 | 219.9 ±10.6 | |
| + | 5/20 | 25 | 86.5 ±5.4 | ||
| S-180세포 | 5일 | - | 15/20 | 75 | 60.2 ±9.1 |
| + | 8/20 | 40 | 45.0 ±5.2 | ||
| 10일 | - | 20/20 | 100 | 148.7 ±8.8 | |
| + | 14/20 | 70 | 85.4 ±5.9 | ||
| B16세포 | 5일 | - | 12/20 | 60 | 40.3 ±4.8 |
| + | 4/20 | 20 | 21.6 ±4.3 | ||
| 10일 | - | 20/20 | 100 | 87.2 ±9.8 | |
| + | 16/20 | 80 | 35.4 ±5.5 | ||
| 15일 | - | 20/20 | 100 | 108.6 ±12.9 | |
| + | 14/20 | 70 | 66.0 ±7.9 | ||
| * 종양의 중량(㎎) = 종양의 장축(㎜) ×종양의 단축(mm)/2 | |||||
3) 화살나무 수용성 추출물의 독소루비신 항암활성 상승작용.
본 발명이 기존 항암제의 항암작용에 미치는 효과를 확인하기 위하여, Balb/c 마우스를 대상으로 실험하였다. 독소루비신(doxorubicin, 0.15 mg in 0.1 ㎖)을 미정맥 내로 1회 주사한 마우스의 면도된 배부 피내에 Lewis 폐암종인 3LL세포(5 ×105/마우스)를 이식하여 종양의 발생빈도와 크기를 이식 10일에 측정하였다. 화살나무 수용성 추출물은 종양이식일부터 1일 1 mg씩 10일간 경구투여하였다. 그 결과, 아무 것도 처리하지 않은 대조마우스에서는 모두 종괴가 형성되었으나, 화살나무 수용성 추출물 단독군에서는 종양 발생빈도와 종괴의 크기가 대조에 비하여 각각 17%, 37.5%가 억제되었으며, 독소루비신 단독군에서는 종양의 발생율과 종괴의 크기가 각각 50%, 84.4% 억제되었으나, 화살나무 수용성 추출물과 독소루비신을 병합투여한 군에서는 완벽하게 종양발생이 차단되었다[표 3]. 이와 같은 결과는 화살나무 수용성 추출물 자체가 항암활성이 있을 뿐만 아니라 타 항암제와 상승적으로 작용함을 제시한다.
| 구분 | 종양 빈도 | 종양 중량(mg) | |
| 수 | % | ||
| 식염수 | 6/6 | 100 | 0.64 ±0.10 |
| 화살나무 수용성 추출물 | 5/6 | 83 | 0.40 ±0.06 |
| 독소루비신 | 3/6 | 50 | 0.10 ±0.02 |
| 화살나무 수용성 추출물+ 독소루비신 | 0/6 | 0 | - |
4) 화살나무 수용성 추출물의 암전이 억제효과 및 독소루비신의 전이억제에 미치는 영향
화살나무 수용성 추출물이 독소루비신의 항암활성에 미치는 영향을 보기 위하여 실험하였다. ICR마우스를 대조군, 화살나무 수용성 추출물 단독투여군, 독소루비신 단독투여군 그리고 화살나무 수용성 추출물과 독소루비신을 병용투여한 군으로 나누어 대수증식기의 B16F10 흑색종세포를 마우스 당 5 ×105세포씩 미정맥 내로 주사한 다음 주사 10일에 마우스를 희생하여 폐장을 적출한 후, 폐장 표면에 나타난 흑색종세포 증식반의 수를 산출하였다. 화살나무 수용성 추출물은 물로만 추출한 기존의 것과 유기용매 용해성 분획을 제거한 후 물로 추출한 본 발명품을 각각 매일 1회 1 ㎎씩 종양세포주입 7일전부터 세포주입 10일까지 경구투여하였으며, 독소루비신은 마우스당 0.5 ㎎씩 세포주입 당일과 3일에 정맥내로 주사하였다. 그 결과, 기존의 화살나무 추출물을 단독으로 또는 독소루비신과 병용하여도 암전이억제 효과는 인지되지 않았으나, 본 발명에 따른 화살나무 수용성 추출물을 단독으로 투여시에는 대조에 비하여 53.3%의 전이억제를 보였으며, 이를 독소루비신과 병용하면 독소루비신(단독 억제율; 81,9%)과 상승효과를 보여 암전이가 전혀 일어나지 않았다[표 4]. 이와 같은 결과는 화살나무 수용성 추출물이 암전이를 억제함을 제시한다.
| 처리 | 흑색종괴반의 수 | 대조군 대비율 (%) |
| 식염수 | 77.5 ±17.4 | - |
| 기존 화살나무 추출물 | 71,3 ±11.3 | 92.0 |
| 화살나무 수용성 추출물 | 36.3 ±14.7 | 46.8 |
| 독소루비신 | 14.5 ±3.2 | 18.1 |
| 기존 화살나무 추출물+ 독소루비신 | 15.3 ±7.6 | 19.7 |
| 화살나무 수용성 추출물 + 독소루비신 | 0 | 0 |
실험예 2: 면역 활성
상기와 같은 항암활성 발현기전은 화살나무 수용성 추출물이 직접적으로 암종세포에 작용하여 그 증식을 억제하여 유발되었을 가능성도 유추할 수 있으나, 화살나무 수용성 추출물이 림프구의 증식과 분화(표 5), NK세포의 활성(표 6) 그리고 지연성 과민반응과 항체생산능(표 7) 등을 촉진시킨 결과로 미루어 화살나무 수용성 추출물의 항암활성 발현은 면역계의 활성화에 기인하였을 가능성을 생각할 수 있다.
1) 화살나무 수용성 추출물의 사람 편도 림프구 증식 항진효과
화살나무 수용성 추출물이 정상 림프구의 증식에 미치는 영향을 평가하였다. T림프구와 B림프구는 사람의 적출된 편도로부터 얻은 단핵세포를 로젯형성 수기를 이용하여 분리하였다. T세포는 PHA(phytohemagglutinin) 5 ㎍/㎖로 자극하고, B세포는 SAC(Staphylococcus aureus Cowan 1) 0.0075%(v/v)로 자극하여 37 ℃ 5% CO2 배양기에서 72시간 배양하였다. 화살나무 수용성 추출물은 배양초기에 첨가하였으며, 증식능은 [3H]TdR 결합(incorporation) 방법으로 측정하였다. 그 결과, T세포 및 B세포 모두 고농도의 화살나무 수용성 추출물을 첨가하여 배양하면 증식이 억제되었으나, 저농도(1 및 4 ㎍/㎖)의 추출물을 첨가하면 현저히 증식이 촉진되었다[표 5]. 이와 같은 결과는 화살나무 수용성 추출물이 림프구의 증식을 촉진시킴을 제시한다.
| 화살나무 추출물(㎍/㎖) | [3H]TdR uptake(cpm) | |
| SAC | PHA | |
| None | 26,842 | 48,015 |
| 1,024 | 1,331 | 9,768 |
| 256 | 3,284 | 34,711 |
| 64 | 13,125 | 47,171 |
| 16 | 26,105 | 55,368 |
| 4 | 40,246 | 70,764 |
| 1 | 53,423 | 76,370 |
2) 화살나무 수용성 추출물에 의한 NK세포의 활성 항진
NK세포는 항종양 작용에 제 1선에서 작용한다. 따라서, 본 실험은 화살나무 수용성 추출물이 NK세포의 활성에 미치는 영향을 평가하기 위하여 실시되었다. NK세포의 활성능 측정은 단 세포 단위 분석(single cell level assay)법으로 실시하였다. 효과세포는 여러 농도의 화살나무 수용성 추출물로 1시간동안 전처리한 마우스 비장세포를, 표적세포는 마우스 림프종 세포주인 Yac 1 세포를 사용하였다. 그 결과, 화살나무를 처리하면 대조에 비하여 효과세포의 표적세포와의 결합능뿐만 아니라 결합-표적세포의 상해능이 항진되어 NK세포의 활성도는 10 ㎍/㎖ 농도의 추출물 처리군에서 대조의 그것보다 약 50% 증가되었다[표 6]. 이와 같은 결과는 화살나무 수용성 추출물이 NK세포의 활성을 증가시킴을 제시한다.
| 화살나무 수용성 추출물 (㎍/㎖) | 표적세포와 결합한 효과세포 (%) | 결합된 표적세포의 용해 (%) | NK세포의 활성도 (%)* |
| - | 2.0 ±0.09 | 52.6 ±4.2 | 1.05 ±0.05 |
| 1 | 2.6 ±0.12 | 54.3 ±5.0 | 1.41 ±0.10 |
| 10 | 2,7 ±0.10 | 55.2 ±4.1 | 1.49 ±0.07 |
| 100 | 2.2 ±0.07 | 58.6 ±2.3 | 1.29 ±0.08 |
| * NK세포의 화성도(%)= 결합한 효과세포 ×결합된 표적세포의 용해/100 | |||
3) 화살나무 수용성 추출물의 생체내 면역반응 항진효과
화살나무 수용성 추출물이 생체내 면역반응에 미치는 영향을 조사하기 위하여 본 실험을 실시하였다. 항원은 T세포 의존성 항원인 면양적혈구를, 동물은 ICR마우스를 사용하였으며, 면역은 면양적혈구 부유액(1 ×108/㎖) 0.1 ㎖를 마우스의 미정맥내로 주사하여 실시하였으며, 족척종창반응 검사는 면역 4일에 20% 면양적혈구 부유액 0.03 ㎖를 족척 피내에 야기주사하여 24시간에 족척의 종창도를 측정하여 평가하였다. 한편, 응집항체의 역가는 면역 7일에 체혈하여 혈청을 분리한 다음 측정하였다. 화살나무 수용성 추출물은 각 마우스에 면역 4일 전부터 면역 후 4일까지 8일간 1일 1회 1 ㎎씩 경구로 투여하였다. 그 결과, 족척종창반응을 평가한 세포성 면역반응과 응집역가로 평가한 체액성 면역반응 모두 화살나무 수용성 추출물의 투여로 항진되었다[표 7].
| 구분 | 족척 종창도(㎛) | 적혈구응집역가(log2) | ||
| Arthus 반응 | 지연성 과민반응 | |||
| 24시간 | 48시간 | |||
| 식염수 | 32.2 ±2.8 | 36.4 ±1.9 | 11.5 ±3.1 | 5.6 |
| 화살나무 수용성 추출물 | 48.0 ±3.2 | 40.2 ±2.0 | 33.8 ±2.1 | 7.2 |
실험예 3: 혈관형성 억제 활성
고형종양의 증식과 전이는 종양세포에로의 혈관형성(angiogenesis)과 밀접한 관계가 있다는 Folkman과 Klagsbrum의 보고를 감안하면 화살나무 수용성 추출물이 혈관형성을 억제하여 항암 활성을 발현하였을 가능성도 고려할 수 있다. 혈관형성은 정상적인 건강한 성인에서는 창상치유 과정이나 황체(corpus leuteum), 자궁내막(endometrium) 또는 태반의 형성 등 여성의 생식주기 등 특수한 경우를 제외하고는 생체 내 맥관형성 억제인자(angiostatic factor)와 맥관형성 촉진인자(angiogenic factor)의 균형적인 분비에 의하여 엄격히 통제되어지며, 체내 맥관내피세포의 1% 미만에서만 증식이 일어난다. 이와는 반대로, 류마티스양 관절염, 건선(psoriasis), 후수정체 섬유증식증(retrolental fibroplasia), 당뇨병성 막막증(diabetic retinopathy), 혈관종(hemangiomas), 이식장기 거부, 고형종양 등 병리적 상태에서는 혈관형성이 더 이상 제어를 받지 않고 극적으로 항진되어 해당 조직 맥관내피세포의 10% 이상이 증식된다.
특히, 고형종양에 의하여 유도된 병리적 혈관형성은 종양세포에로의 영양과 산소의 공급을 활발하게 하여 종양증식을 촉진시키기 때문에 종양임상에 중요한 의미를 갖는다. 즉, 혈관형성이 활발한 종양(well-vascularized tumors)은 증식과 전이가 잘 되지만 혈관형성이 거의 없는 종양(avascular tumors)은 겨우 1 ∼ 2㎜ 미만의 종괴를 형성할 뿐이다. 특히, 종양환자 사망의 주요 원인은 종양전이이며 종양전이는 종양을 효율적으로 치료하는 데에 가장 큰 장애요소이다. 종양전이는 다단계의 혈관형성 과정을 거쳐 일어나며, 표적기관이나 장기로 전이된 종양세포의 증식은 거의 전적으로 혈관형성의 정도에 좌우된다.
지금까지 병리적 혈관형성의 발현기전은 명확히 밝혀져 있지 않지만 맥관형성 촉진인자가 과도로 활성화 또는 생산되거나 맥관형성 억제인자가 감소 또는 소실되는 등 이들 인자의 생체내 불균형에 의하여 야기된다는 것이 정설로 알려져 있다. 따라서, 종양의 증식과 기타 맥관성 질환을 제어할 수 있는 물질을 찾고자 여러 천연산물 및 합성물을 대상으로 맥관형성 억제활성능을 검출하고자 하는 많은 시도가 이루어져 그 결과 몇 가지 물질이 맥관형성 억제에 의한 항종양활성이 있음이 입증되었다.
본 발명자는 화살나무 수용성 추출물이 혈관형성에 미치는 영향을 평가하고자 CAM 검사(chorioallantoic membrane anigiogenesis assay, 양막 혈관형성 검사)와 에반스 블루(Evans blue) 피부검사를 실시하고, 그 작용기작을 밝히기 위하여 맥관내피세포의 증식능에 미치는 영향을 검사하였다.
CAM 검사에 사용한 혈관형성인자(angiogenic factor), 즉 대조 배지(conditioned media)는 대수증식기의 B16F10세포를 우태아혈청이 함유되어 있지 않은 RPMI 1640배지에 5 ×105/㎖의 농도로 부유하여 24시간 배양한 다음 배양상청액을 얻어 사용하였다. CAM에의 혈관형성은 화살나무 추출물(20 ㎎/egg)를 처리하거나 처리하지 않은 10일령의 부화란을 대상으로 양막강에 대조 배지 0.5㎖를 주입하여 유도하였다. 혈관형성의 정도는 그 후 4일 및 8일에 부화란에서 CAM을 적출하여 CAM에 형성된 혈관의 형태를 해부현미경으로 검경하여 평가하였다. 그 결과, 대조군(도 2의 A)에서의 혈관형성에 비하여 대조 배지를 처리한 군(도 2의 B)에서는 신생혈관의 과형성으로 CAM이 육안적으로 혼탁하게 보일 정도로 혈관형성이 유의하게 촉진되었다. 그러나, 대조 배지와 화살나무 수용성 추출물을 병용주입한 경우(도 2의 C)에는 혈관의 신생이 완전히 억제되었다.
또한, 3LL세포를 마우스의 피내로 이식하여 형성된 종양괴에 화살나무 수용성 추출물을 주입한 후 4일에 에반스 블루(Evans blue)를 정맥 내로 주사하고 박피하여 종양 부위의 혈관형성을 관찰하였던 바, 대조군에서는 극심한 종양조직으로의 혈관형성을 보였으나, 화살나무 수용성 추출물 주입군에서는 종양부에 이미 형성된 혈관이 퇴축되고 있음을 보임과 동시에 종양 자체도 위축되어 있음을 관찰할 수 있었다.
이와 같은 결과는 화살나무 수용성 추출물이 정상적인 혈관형성은 다소 항진시키나 종양세포-유도 맥관형성 인자에 의한 혈관형성은 거의 완벽하게 차단함을 제시한다.
종양-혈관형성은 종양세포의 증식에 필요한 물질을 공급할 뿐만 아니라 종양세포로부터 감성산물(degradation products)을 배설하고 원발성 종양괴로부터 종양세포를 탈출시켜 전이병소를 형성하는 등 고형종양의 증식에 필수적인 과정이다. 종양조직의 혈관신생(neovascularization)은 맥관형성 인자가 내피세포에 있는 수용체와 결합하면 1)내피세포가 자극되어 혈관을 싸고 있는 기저막을 분해하는 단백분해효소를 분비하여 모세혈관 기저판의 퇴화(degradation)와 주위조직의 붕괴, 2) 내피세포의 증식과 종양부로의 이주, 3) 이주세포의 재증식, 4) 맥관 주변세포(vascular pericytes)와 근세포의 증식 5) 맥관조립과 인접모세관과의 연결 등의 다단계의 과정을 거쳐 일어나기 때문에 화살나무 추출물에 의한 혈관형성의 억제기전은 불분명하다. 그러나, 혈관형성은 TNF-α, IL 1, PAF(platelet activating factor) 등에 의한 혈관 내피세포의 증식에 주로 기인한다는 보고 그리고 화살나무 수용성 추출물에 의하여 TNF, NO 및 IL 1의 생산이 현저히 억제되고 PAF의 작용이 차단된 결과(도표 생략)로 미루어 화살나무 수용성 추출물에 의한 종양전이 억제는 화살나무 수용성 추출물이 종양유도-혈관내피세포의 증식을 차단함으로써 발현되었을 가능성이 크다.
이에, 화살나무 수용성 추출물의 종양유도-혈관형성 억제작용이 혈관내피세포에 대한 직접적인 작용에 기인하는가를 알아보기 위하여 실험하였다. 사람 제대정맥으로부터 분리한 후 5대 계대한 HUVEC(human umbilical vein endothelial cells, 2×105/㎖)를 VEGF(vascular endothelial growth factor)로 자극하거나 자극하지 않고 화살나무 수용성 추출물(10 ㎍/㎖) 또는 이 추출물의 제조과정에서 제거했던 에틸 아세테이트 용해성 물질(1 ㎍/㎖)을 첨가하여 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 배양하여 [3H]TdR 업테이크 분석법으로 그 증식반응을 측정하였다. 그 결과, 종양증식과 전이를 억제시킨 화살나무 수용성 추출물을 첨가한 경우에는 VEGF의 자극 유무와는 무관하게 그 증식반응이 현저히 억제되었으나, 에틸 아세테이트 용해성 분획을 첨가하여 배양하면 VEGF첨가와는 무관하게 그 증식이 현저히 항진되어 VEGF만으로 자극한 군에서보다 높은 증식반응을 보였다[표 8].
이와 같은 실험성적은 화살나무 수용성 추출물이 혈관내피세포의 증식에 직접적으로 작용하여 그 증식을 억제시킴은 물론 VEGF에 의한 내피세포의 반응도 억제시키는 등 강력한 항맥관형성 인자(antiangiogenic factor)로 작용함을 제시하여 결과적으로 화살나무 수용성 추출물의 강력한 항암활성은 주로 종양조직에로의 혈관의 형성을 억제하여 발현됨을 시사한다. 또한, 본 실험결과는 에틸 아세테이트 분획이 VEGF보다도 강력한 맥관형성 자극인자(angiogenic stimulator)로 작용함을 제시하여 화살나무 수용성 추출물의 제조공정에서 반드시 에틸 아세테이트 용해성 물질을 제거시켜야 강력한 항암활성이 발현됨을을 제시한다.
| HUVEC의 배양조건 | [3H]TdR uptake (cpm) | |
| VEGF 무첨가 | VEGF 첨가 | |
| 대조배지 | 728 | 1058 |
| 화살나무 수용성 추출물 | 164 | 166 |
| 화살나무 에틸 아세테이트 추출물 | 1128 | 1198 |
또한, 화살나무 수용성 추출물의 HUVE세포의 증식억제작용이 이들 세포에 대한 직접적인 독성작용에 기인하는가를 알아보기 위하여 HUVE세포에 화살나무를 물과 에틸아세테이트로 추출한 상기 농도의 추출물을 첨가하여 배양하면서 50분 및 12시간에 NAD 분석법으로 HUVE세포의 생존율을 검사하였다. 그 결과, 50분 및 12시간에 측정한 이들 세포의 생존율은 물 추출물과 에틸아세테이트 추출물 모두에서 추출물을 첨가하지 않은 대조에서와 유의한 차이를 보이지 않았다[표 9]. 이와 같은 성적은 화살나무 수용성 추출물의 HUVEC에 대한 증식억제 작용이 세포에 대한 직접적인 독성작용에 의하지 않고 이들 세포의 대사에 관여하여 분열과 증식을 억제함으로 야기되었음을 제시한다.
| HUVEC의 배양조건 | 배양시간에서의 생존율 (OD at 570㎚) | |
| 50분 | 12시간 | |
| 배지 | 0.771 | 1.163 |
| 수용성 추출물 | 0.887 | 1.654 |
| 에틸아세테이트 추출물 | 0.861 | 1.091 |
실험예 4: 항암제의 독성 완화작용
화살나무 수용성 추출물이 타항암제 및 약제의 독성능에 미치는 영향을 확인하고자, 화살나무 수용성 추출물이 독소루비신의 림프구의 독성에 미치는 영향, 독소루비신의 피내주사에 의한 랫트에서의 독성능 완화작용, 독소루비신의 마우스에 대한 반치사량에 미치는 영향, 항암요법 환자의 백혈구감소증 및 중성구 감소증에 미치는 영향, 그리고 갈락토사민(GalN)/내독소(LPS) 및 Con A에 의한 간 손상에 미치는 영향을 다음과 같이 실험하였다.
1) 화살나무 수용성 추출물이 독소루비신의 림프구에 대한 독성능에 미치는 영향
사람 편도림프구(2 ×106 cells/㎖)를 SAC 0.001%(v/v), PHA 5 ㎍/㎖ 및 Con A(concanavalin A) 4 ㎍/㎖로 각각 자극하였다. 이를 96-혈 배양 플레이트의 각 혈에 0.1 ㎖씩 분주한 다음 화살나무 수용성 추출물(15 ㎍/㎖)과 여러 농도의 독소루비신을 가하여 혈당 총량이 0.2 ㎖되게 하여 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 72시간 배양한 후 [3H]TdR 업테이크 분석법으로 증식의 정도를 평가하였다. 그 결과, 림프구를 독소루비신 존재 하에 배양하면 독소루비신의 농도에 비례하여 그 증식이 현저히 억제되었다[표 10]. 그러나, 화살나무 수용성 추출물을 단독으로 첨가하면 림프구의 증식반응을 다소 항진하였으며, 독소루비신 처리와 병행하여 추출물을 첨가하면 독소루비신에 의한 증식반응의 억제를 완화시켰다. 이와 같은 성적은 항암요법환자에서 항암제 투여로 인한 혈액세포의 감소가 화살나무 수용성 추출물을 복용함으로 완화되리라는 것을 시사한다.
| 독소루비신(㎍/㎖) | 화살나무 수용성 추출물(1 ㎍/㎖) | [3H]TdR uptake(cpm) | |||
| Medium | SAC | PHA | Con A | ||
| None | - | 1,492 | 23,445 | 35,370 | 31,321 |
| + | 1,636 | 25,601 | 36,632 | 42,061 | |
| 0.2 | - | 132 | 2,310 | 5,101 | 9,248 |
| + | 184 | 10,094 | 11,640 | 14,461 | |
| 0.1 | - | 344 | 10,151 | 13,384 | 13,914 |
| + | 335 | 18,262 | 22,543 | 21,937 | |
| 0.05 | - | 589 | 20,089 | 27,667 | 25,789 |
| + | 866 | 19,164 | 31,779 | 40,375 | |
2) 화살나무 수용성 추출물에 의한 항암요법 환자에서의 백혈구 및 과립구 감소증 완화
화살나무 수용성 추출물이 독소루비신에 의한 림프구의 손상을 완화시킨 위에서의 성적은 화살나무 추출물을 항암요법 환자에 투여하면 항암요법에 의한 백혈구 감소증을 예방 또는 완화시킬 수 있으리라는 것을 시사한다. 따라서, 본 실험은 이를 확인하고자, 혈액암 요법 중에 있는 백혈병 환자에게 장용코딩하여 정제로 만든 화살나무 수용성 추출물을 암요법 시작 4 ∼ 5주 후부터 1일 1 g씩 매일 경구투여하였다. 그 후 1주일 간격으로 채혈하여 혈액내 총 백혈구 수를 산출함과 아울러 백혈구 중 과립구의 백분율을 검사하였다. 그 결과 환자별로 다소의 개체차가 인정되지만 대체로 총 백혈구 수(도 3 참조)와 과립구의 백분율(도 4 참조) 모두 화살나무 수용성 추출물 투여 3주부터 거의 정상치로 회복하였다.
3) 화살나무 수용성 추출물의 독소루비신-혈관 외 유출에 의한 조직괴사 완화작용
비록 독소루비신이 비교적 좋은 항암효능이 있지만, 이의 임상실제에의 적용은 여러 심각한 문제를 안고있어 사용이 주저되는 약제이다. 이의 투여로 인하여 심혈관 및 간장 장애가 발생되며, 또한 만일 주사시 실수로 혈관외로 약제가 소량이라도 유출되면 주사부위 조직에 광범위한 괴사가 수반된다. 본 실험은 화살나무 수용성 추출물이 이와 같은 독소루비신의 독성능에 어떠한 영향을 미치는가를 보기 위하여 실험하였다. 실험은 Sprague-Dawley 랫트의 면도된 배부 피내에 독소루비신(0.5 ㎎/rat)를 단독으로 또는 화살나무 수용성 추출물(10 ㎎/rat)과 혼합하여 주사한 다음 발현되는 피부의 궤양반의 크기를 경시적으로 측정하고, 각군 랫트의 생존율을 검사하였다. 그 결과, 독소루비신을 단독으로 주사한 랫트는 주사부위에 극심한 염증반응이 유발되어 주사 7일에 40%가 폐사하기 시작하여 주사 50일에는 모두 폐사하였다[표 11]. 그러나, 랫트에 독소루비신과 화살나무 추출물을 혼합하여 주사하면 주사초기 주사부위에 약간의 발적과 부종을 보이다가 급속히 소실되었으며 모든 랫트는 전 관찰기간동안 외견상 정상적인 건강상태를 유지하였다. 이와 같은 성적은 화살나무 수용성 추출물이 독소루비신의 조직 독성작용을 완화 또는 차단시킴을 제시하며, 독소루비신의 조직독성작용에는 활성산소가 밀접히 관여한다는 보고로 미루어 화살나무 추출물 내에는 강력한 활성산소 제거제가 함유되어 있음을 시사한다.
| 화살나무수용성 추출물 | 주사부 병변 크기(mm2) | 치사율 (%) | ||||
| 3일 | 7일 | 14일 | 7일 | 14일 | 50일 | |
| - | 40.3 ±2.2 | 102.8 ±8.6 | 98.6 ±9.5 | 40 | 65 | 100 |
| + | 38.6 ±3.5 | 18.4 ±4.0 | 6.8 ±2.2 | 0 | 0 | 0 |
4) 화살나무 수용성 추출물에 의한 독소루비신의 반치사량 증가
화살나무 수용성 추출물의 독소루비신 독성능 완화작용을 간접적으로 평가하기 위하여 화살나무 추출물이 독소루비신의 반치사량에 미치는 영향을 측정하였다. 실험은 2배 계열희석한 독소루비신을 각각 ICR 마우스의 미정맥내로 주사한 다음, 화살나무 수용성 추출물을 매일 1회 1 ㎎씩 7일간 경구투여하였다. 그 후 독소루비신주사 후 30일 동안 마우스의 생존율을 조사하여 각군에서 마우스가 50% 이상 사망한 독소루비신의 농도를 반치사량으로 판정하였다. 그 결과, 독소루비신만을 단독으로 주사한 군에서는 독소루비신를 마우스 당 0.5 ㎎을 주사하여도 10%의 마우스가 폐사하기 시작하여 1 ㎎을 주사하면 50%가, 그리고 4 ㎎을 주사하면 100% 폐사하였다[표 12]. 그러나, 독소루비신을 주사하고 화살나무 수용성 추출물을 7일간 투여한 군에서는 독소루비신을 마우스 당 16㎎ 주사하여도 겨우 10%가, 32㎎ 주사시 55%, 그리고 64㎎ 주사시 100% 폐사하였다. 따라서, 독소루비신의 반치사량은 독소루비신 단독군에서는 4 ㎎/마우스이었으나, 독소루비신 투여 후 화살나무 수용성 추출물을 투여한 군에서는 30 ㎎/마우스이었다.
| 화살나무수용성추출물 | 마우스 수 | 독소루비신 주사량 (mg/mouse)에 따른 마우스 폐사율 (%) | |||||||
| 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | ||
| - | 20 | 10 | 50 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| + | 20 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 10 | 55 | 100 |
5) 화살나무 수용성 추출물의 약물-유도성 간 손상억제
간은 이물질이나 약제의 체내 대사처리의 중추기관이므로 약물에 의한 간 손상은 거의 모든 약품에 대한 잠재적인 합병증 결과의 하나라고 볼 수 있으며, 특히 항암요법자에게는 더욱 심각한 문제를 야기한다. 따라서, 본 실험은 화살나무 수용성 추출물의 독성완화작용을 평가하기 위한 방법의 일환으로 실험적 간손상 유발모델이 정립되어 있는 방법을 이용하였다. 간기하면, 700 ㎎/㎏의 갈락토사민(GalN)과 5 ㎍/㎏의 내독소(LPS)을 복강내로 투여하거나 또는 12 ㎎/㎏의 Con A를 미정맥내로 투여하고, 투여 9시간에 체혈하여 혈청내 SGPT(serum alanine aminotransferase)의 농도를 측정하여 간 손상의 정도를 평가하였다. 이때 화살나무 추출물은 1일 4 ㎎씩 약물 투여 직전과 투여 1일 2일 전 모두 3회 경구투여 하였다. 그 결과, 간 손상은 GalN/LPS군과 Con A군 모두에서 화살나무 수용성 추출물을 투여하면 대조에 비하여 각각 30.5%와 45.3%의 수준으로 현저히 억제되었다[표 13]. 이와 같은 성적은 비록 본 실험이 항암제로 유도한 간 손상실험은 아닐지라도 화살나무 수용성 추출물을 복용하면 항암요법에 의한 간손상이 완화될 수도 있음을 시사한다.
| 화살나무 수용성 추출물 | SGPT | |
| ( U/ℓ) | % of control | |
| GalN/LPS-유도 간손상 | ||
| 비투여 | 3785±302 | |
| 두여 | 1158±170 | 30.5 |
| Con A-유도 간손상 | ||
| 비투여 | 205±57 | |
| 투여 | 93±20 | 45.3 |
6) 화살나무 수용성 추출물의 단핵구-활성산소 생산억제 작용
화살나무 수용성 추출물이 독소루비신의 독성과 유도성 간손상을 완화하고 항암요법 환자의 백혈구 및 중성구의 감소증을 회복시킨 작용, 나아가서는 결과적으로 화살나무가 항암활성을 보인 것은 여러 경로를 통하여 일어날 수 있으리라 유추할 수 있으나 그 가운데 화살나무 수용성 추출물 자체의 항산화작용(유리기 제거작용)을 통하여 발현되기도 한다고 생각된다. 따라서, 본 실험은 이를 확인하고자 화살나무 수용성 추출물이 단핵구의 활성산소 생산에 미치는 직접적인 영향을 조사하였다. 사람 말초 단핵구를 화이트 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(white polystyrene microtiter plate)의 각 혈에 5 ×104cells/혈의 농도로 50 ㎕씩 분주하고 여기에 50 ㎕의 지모산(zymosan) 107 particles/㎖ 또는 PAF(혈소판활성인자, 5 ×10-5M)을 가한 다음 다시 여기에 50 ㎕의 화살나무 수용성 추출물 (2.5 ㎍/㎖) 또는 대조로 배지를 가하여 15분간 부치시킨 다음 각 혈에 루시게닌(lucigenin, 2.5 ×10-5M)을 첨가하여 37 ℃에서 15분간 처리하여 37 ℃를 유지하면서 MicroLumat LB96P를 이용하여 매 5분 간격으로 90분동안 발광도를 측정하였다. 그 결과, 지모산 및 PAF으로 자극한 단핵구의 수퍼옥사이드(superoxide) 생산능은 모두 화살나무 수용성 추출물으로 처리하였을 경우 현저히 억제되었다[도 5].
이상의 화살나무 수용성 추출물의 독성완화작용에 대한 실험의 결과를 요약하면, 화살나무 수용성 추출물을 독소루비신과 병용투여하면 독소루비신의 림프구에 대한 독성능을 완화시킴과 동시에 독소루비신의 전신투여에 의한 조직괴사 및 폐사 등 전신 독성작용을 차단하였음은 물론 화살나무 수용성 추출물을 독소루비신과 병용투여하면 독소루비신의 반치사량을 30배 증가시켰다. 또한, 화살나무 수용성 추출물을 항암요법 시행 환자에 투여하면 항암제에 의한 백혈구 및 중성구 감소증을 완화시켰으며, 화살나무는 약물에 의한 간손상과 면역계에 의한 간손상 모드를 완화시켰으며, 단핵구의 활성산소 생산을 억제시켰다.
이상의 결과는 화살나무 수용성 추출물이 독소루비신의 독성능에 대한 완화작용을 가지고 있다는 실험적 증거로서 지금까지의 다른 어느 독소루비신-독성 완화제보다도 그 작용이 강력함을 제시한다.
화살나무 수용성 추출물의 독성 완화기전은 화살나무 수용성 추출물이 히스타민과 염증성 사이토키나제의 분비를 억제할 뿐만 아니라 유리기-제거작용(항산화작용), 혈소판활성인자에 대한 길항작용, 그리고 세포의 안정화 작용을 가지고 있음을 감안할 때 비록 단언할 수는 없다 할지라도 다음과 같은 몇 가지 기전이 복합적으로 작용하여 유도되었을 가능성을 유추할 수 있다. 즉, 화살나무 수용성 추출물이 히스타민 등의 분비와 파종성 혈관내 응고를 억제하여 염증반응을 완화하고, 활성산소를 제거함으로써(도 5) 세포의 안정화를 유도하고, 염증성 사이토카인의 분비를 억제하여 병소의 진행과정을 완화함으로써 화살나무 수용성 추출물의 독소루비신-독성완화 작용이 발현되었다고 확신한다.
실험예 5: 독성시험
상기 실시예 1에서 얻은 화살나무 수용성 추출물에 대하여 독성실험을 다음과 같이 수행하였다.
상기 화살나무 수용성 추출물을 마우스에 100 ㎎/마우스의 용량으로 1회 또는 10 ㎎/마우스의 용량으로 1일 1회 30일간 경구투여하거나 복강 내로 주사한 다음 100일간 관찰하였으나 모든 동물은 외견상 건강하였으며, 체중의 증감도 관찰되지 않았다.
또한, 화살나무 수용성 추출물을 정상 림프구에 16 ㎍/㎖의 농도로 첨가하여도 림프구의 증식에 영향을 미치지 않았고(표 5 참조), 사람 제대혈관 내피세포에 10㎍/㎖의 농도로 첨가하여도 이들 세포의 생존율은 영향을 받지 않았다(표 8 참조).
제조예 1: 캡슐제의 제조
상기 실시예 1의 화살나무 수용성 추출물을 전체 함량의 20%가 되도록 취한 다음, 약제학적 분야에서 사용하는 통상적인 부형제를 혼합하여 균일하게 하였다. 이 혼합물을 적당한 크기로 분말화한 후 일정량씩을 의약 및 식품용 경질 젤라틴 캡슐에 충진시켜 제조하였다.
추출물 10 g, 옥수수전분 70 g, 카르복시셀룰로오스 15 g 및 마그네슘 스테아레이트 5 g을 잘게 부숴 혼합하여 분말을 제조하였다. 경질 캡슐에 분말 100 mg을 넣어 캡슐제를 제조하였다.
제조예 2: 주사제의 제조
본 발명의 화살나무 수용성 추출물 200 ㎎을 폴리옥시에틸렌 수소화 카스트로 오일을 함유하는 생리 식염수 200 ㎎에 가열 용해시켜 혼합 추출물을 0.1의 농도로 함유하는 주사제를 제조하였다.
제조예 3: 건강식품의 제조
1) 분말 형태의 건강식품 제조
상기 실시예 1의 화살나무 수용성 추출물 농축액에 탈크. HPNCP, 피마자유 등을 혼합한 후 분사 건조기(spray dryer, 내부 온도: 115 ℃, 배출온도: 85 ℃)를 이용하여 장용성 분말제품을 만들었다.
2) 환 형태의 건강식품 제조
상기 실시예 1의 화살나무 수용성 추출물 농축액에 올리고당, LHPC-22, St-Mg를 가한 후 500 ㎎의 정으로 만들고, 여기에 HPMCP55, 피마자유, F-68, 에틸 알코올, 정제수 혼합액으로 장용코팅하여 환제품을 제조하였다.
본 발명은 화살나무에 함유되어 있는 길항물질을 제거하고, 경구투여시 위장내 효소에 의해 불활성화되는 것을 방지하기 위한 방법을 적용함에 근거를 두고 있다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 화살나무를 유기용매로 처리하여 유기용매 용해성 분획을 제거한 후 남은 잔사를 물로 추출하여 얻은 수용성 추출물이 우수한 항암효능을 보임은 물론 이 수용성 추출물이 타 항암제와 병용시 항암제의 항암활성을 상승시킬 뿐만 아니라 항암제 자체의 독성을 완화시키는 작용을 가진 것으로 나타났다. 이러한 결과는 화살나무 수용성 추출물이 항암제 및 항암제 보조제로서의 기능이 우수한 것으로 판명되어 본 발명의 특징이 있는 것으로 평가된다.
특히, 본 발명은 항암제 투여에 의한 총백혈구 및 과립구의 감소를 저지시킴과 더불어 간 해독기능을 가지며, 체내 면역기능을 강화시킨다.
또한, 이러한 재료의 사용은 새로운 항암제의 개발을 유도할 뿐만 아니라 농가의 또 다른 작물 재배 보급효과로 농가소득에 기여할 수 있으리라 본다.
도 1의 좌변(water extract)은 기존 화살나무의 수 추출물의 HPLC 스펙트럼을 나타낸 것이며, 우변(pre-ethyl acetate water extract)은 본 발명에 따른 화살나무 수용성 추출물의 HPLC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2는 10일령의 부화란 양막강에 화살나무 수용성 추출물을 단독으로 또는 종양세포배양액과 병합주입한 다음 4일 및 8일에 부화란으로부터 CAM (chorioallantoic membrane)을 적출하여 CAM상에 형성된 혈관의 형성상태를 나타낸 것이다.
도 3은 항암제 투여 백혈병 환자들의 백혈구감소증에 대한 화살나무 수용성 추출물의 회복효과를 나타낸 것이다.
도 4는 항암제 투여 백혈병 환자들의 과립구(중성구) 감소증에 대한 화살나무 수용성 추출물의 회복효과를 나타낸 것이다
도 5는 지모산(zymosan) 및 혈소판활성인자(PAF)로 인간의 말초단핵세포를 자극하여 이들 세포로부터 활성산소 생산분비를 유도한 실험에서 화살나무 수용성 추출물의 활성산소생산 억제효과를 나타낸 것이다.
Claims (5)
- 화살나무(Euonymus alatus)를 유기용매로 처리하여 유기용매 용해성 성분을 제거한 후 남은 잔사를 물로 추출하여 얻은 것을 특징으로 하는 항암활성을 갖는 화살나무 수용성 추출물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 유기용매는 에틸 아세테이트, 에틸알콜, 메틸알콜, 헥산, 에테르 및 부틸알콜 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 화살나무 수용성 추출물.
- 청구항 1의 화살나무 수용성 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 항암제.
- 청구항 1의 화살나무 수용성 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 항암제 보조제.
- 삭제
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