KR100511055B1

KR100511055B1 - 효소침전반응과 결합된 ｓｐｒ을 이용한 바이오칩 및바이오센서 측정방법

Info

Publication number: KR100511055B1
Application number: KR10-2003-0090410A
Authority: KR
Inventors: 김민곤; 정봉현; 신용범; 노현수
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2003-12-11
Filing date: 2003-12-11
Publication date: 2005-08-30
Anticipated expiration: 2023-12-11
Also published as: KR20050058154A

Abstract

본 발명은 바이오칩 및 바이오센서를 이용한 단백질의 측정방법에 관한 것으로, 구체적으로는 시료 단백질의 항체를 SPR(surface plasmon resonance) 칩에 고정화시키는 단계; 상기 SPR 칩에 시료 항원 단백질을 반응시키는 단계; 상기 시료 항원 단백질에 결합할 수 있는 감지용 항체를 결합시키는 단계; 상기 감지용 항체에 결합 가능한 효소를 반응시키는 단계; 및 상기 효소와 반응하는 반응물질을 첨가하여 SPR 칩 표면에 침전물을 형성시켜 SPR 신호를 증폭시키는 단계를 포함하는 단백질의 측정방법에 관한 것이다. SPR 센서 또는 SPR 이미징(SPRI) 센서에 상기 본 발명의 측정방법을 도입함에 의하여 생화학적 시료내 다수의 항원 단백질의 미량 및/또는 다양한 농도에 대한 정량분석이 가능하다.

Description

효소침전반응과 결합된 ＳＰＲ을 이용한 바이오칩 및 바이오센서 측정방법{Measuring method of biochip and biosensor using surface plasmon resonance combined with an enzymatic precipitation}

본 발명은 바이오칩 및 바이오센서를 이용한 단백질의 정량방법에 관한 것으로, 구체적으로는 미량 및 다양한 농도를 정량할 수 있는 바이오센서 및 바이오칩을 이용한 단백질의 정량방법에 관한 것이다.

항원 단백질의 정량 측정 기술은 임상적 진단, 프로테오믹스(proteomics) 연구 등에 중요한 기술이다. 종래에는 주로 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법을 사용하는 데, 이 방법은 항체를 먼저 지지물(matrix)에 고정화시키고 상기 항체가 고정화된 표면에 항원 단백질이 혼합되어 있는 시료용액을 일정 시간 반응시킨 뒤, 상기 항원단백질이 결합된 표면 위에 항원 단백질과 선택적으로 결합하는 감지용 항체를 결합시킨 다음, 상기 감지용 항체에 효소를 결합시켜 상기 효소가 발색반응이 일으킬 수 있는 반응물질을 첨가하여 발색 반응이 일어나도록 함으로써 미량의 항원 단백질을 정량하는 방법이다. 상기 ELISA 방법이 현재까지 효과적으로 미량 항원 단백질을 측정하는 방법으로 사용되고 있기는 하나, 항원 단백질의 분석 범위가 10 pg/㎖ ~ 1 ng/㎖ 정도이며, 한번에 하나의 항원 단백질 분석이 가능하여 다양한 항원 단백질을 분석하기 위해서는 많은 시료양을 요구하는 단점이 있다.

한 번에 많은 수의 항원 단백질을 동시에 분석하기 위한 기법으로 단백질칩 측정기술이 개발되어 활용되고 있다. 단백질칩이란 다양한 항체 또는 리셉터(receptor) 단백질이 하나의 기판 위에 배열된 것으로, 이러한 단백질칩 위에 시료를 반응시켜 칩에 결합된 단백질의 양을 측정하게 된다. 단백질칩 위에 결합된 다양한 시료 단백질의 양을 측정하기 위하여, 동위원소, 형광, 효소반응 등에 의해 신호변환이 가능한 분석기법이 도입되고 있다. 그러나, 동위원소 측정법은 안전성에 문제가 있으며, 효소반응 측정법은 분석범위가 좁아 다양한 농도로 존재하는 시료를 분석하는 데 어려움이 있으며, 형광측정법은 고가의 형광물질을 사용해야 하는 문제점이 있다(Schweitzer, B. and Kingsmore, S.F., Curr. Opin. Biotechnol., 2002, 13, 14-19; Schweitzer, B. et al., Nature Biotechnol., 2002, 20, 359-366). 따라서, 상기 분석법들의 문제점을 해결하기 위한 방법에 대한 필요성이 계속 제기되어왔다.

한편, 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance; 이하, 'SPR'이라 약칭함) 센서 기술은 단백질과 같은 생체물질이 센서 표면에 결합될 경우 신호 변화를 일으키는 현상을 이용하여 바이오센서 및 바이오칩 측정방법으로 많이 이용되고 있다(Nice, E.C. and Catimel, B., BioEssays, 1999, 21, 339-352). 표면 플라즈몬이란 금속 표면과 같은 도체 표면을 따라서 전파하는 자유전자의 양자화된 진동이다. 이와 같은 표면 플라즈몬은 프리즘과 같은 유전매체를 지나 유전 매체의 임계각 이상의 각도로 금속박막에 입사하는 입사광에 의해 여기 되며 일정한 각도에서 공명을 일으킨다. 이러한 SPR이 일어나는 입사각, 즉 공명각은 금속박막에 근접한 물질의 굴절률 변화에 민감하다. SPR 센서는 이러한 성질을 이용하여 금속박막에 근접한 물질, 즉 시료의 굴절률 변화로부터 시료의 정량 분석, 정성 분석 및 박막인 시료의 두께를 측정하는데 이용된다. 그러나, 기존의 SPR 바이오센서는 낮은 농도의 생체물질을 분석하기에는 그 감도가 떨어지는 문제점이 있다(Homola, J., Yee, S.S. and Gauglitz, G., Sens. Actuators B, 1999, 54, 3-15). 더욱이 SPRI 바이오칩은 SPR 바이오센서 보다 감도가 더 떨어지는 것으로 보고되고 있다.

이에, 본 발명자들은 바이오칩 및 바이오센서 측정방법으로 효소반응 증폭 기술을 SPR 센서에 도입하여 SPR 신호의 증폭을 통하여, 미량 농도 및 다양한 농도의 생체분자 분석이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 감도가 높으며, 다양한 농도로 존재하는 다양한 생체분자 동시 분석이 가능한 SPR을 이용한 바이오센서 및 바이오칩 측정방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 시료 단백질의 항체를 SPR(surface plasmon resonance) 칩에 고정화시키는 단계; 상기 SPR 칩에 시료 항원 단백질을 반응시키는 단계; 상기 시료 항원 단백질에 결합할 수 있는 감지용 항체를 결합시키는 단계; 상기 감지용 항체에 결합 가능한 효소를 반응시키는 단계; 및 상기 효소와 반응하는 반응물질을 첨가하여 SPR 칩 표면에 침전물을 형성시켜 SPR 신호를 증폭시키는 단계를 포함하는 단백질의 측정방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 단백질 측정방법은 시료 단백질의 항체를 SPR(surface plasmon resonance) 칩에 고정화시키는 단계; 상기 SPR 칩에 시료 항원 단백질을 반응시키는 단계; 상기 시료 항원 단백질에 결합할 수 있는 감지용 항체를 결합시키는 단계; 상기 감지용 항체에 결합 가능한 효소를 반응시키는 단계; 및 상기 효소와 반응하는 반응물질을 첨가하여 SPR 칩 표면에 침전물을 형성시켜 SPR 신호를 증폭시키는 단계를 포함한다.

이때, 상기 SPR 칩은 SPR 센서 또는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 센서로 측정하는 것이 바람직하고, 상기 SPRI 센서는 단백질 항체가 2차원적으로 배열하여 고정화된 것이 보다 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 SPR 칩 표면에 형성된 침전물은 SPR 신호를 크게 증폭시켜 저농도의 항원 단백질의 정량을 가능하게 하는 측정방법을 제공한다. 상기 분석과정을 SPR 센서에 적용할 경우 동시에 2~4개의 항원 단백질 분석이 가능한 SPR 바이오센서이고, SPRI 센서에 적용할 경우 동시에 수십~수천 개의 분석이 가능한 SPRI 바이오칩 기술이 완성된다.

또한, 상기 SPRI 바이오칩 측정방법은 최종 단계 이후에, 추가적으로 상기 침전물이 형성된 바이오칩의 각도를 변화시켜 상기 바이오칩에 배열된 개개의 스팟의 SPR 각도 변화를 분석하는 것이 바람직하다.

SPR은 금속표면 상의 굴절률 변화를 민감하게 측정하는 방법으로서, 금속표면에 단백질과 같은 생화학적 시료가 결합될 경우, 그것의 양을 감지할 수 있는 특징이 있다(Nice, E.C. and Catimel, B., BioEssays, 1999, 21, 339-352). SPR은 별도의 신호증폭 없이 생체시료의 결합을 직접적으로 측정할 수 있는 장점이 있으나, 극미량의 생체시료를 측정하고자 할 때 별도의 신호증폭 기술을 요구하게 된다.

본 발명의 측정방법은 상기 SPR 신호증폭을 위하여 효소침전반응을 도입하였다(도 1 참조). 구체적으로, 항체가 고정화된 SPR 칩에 항원 단백질, 감지용 항체, 효소를 차례로 결합시킨 후, SPR 칩 표면에 침전반응을 유도할 수 있는 효소의 반응물질을 도입할 경우, 급격한 SPR 신호 변화를 유도할 수 있다.

도 1의 각 과정 단계를 SPR 바이오센서로 분석함에 의하여, 항원-항체 반응이 선택적으로 SPR 센서 표면에 침전이 일어남을 확인하였다(도 2 참조).

또한, 본 발명에 있어서 시료 항원 단백질의 농도는 100 fg/㎖ ~ 100 ㎍/㎖ 범위인 것이 바람직하고, 10 pg/㎖ ~ 100 ng/㎖ 범위인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 실시예에 있어서는 시료 단백질로 인터페론-감마(IFN-γ)를 이용하였고, 상기 인터페론-감마의 농도가 증가함에 따라 효소 반응에 의한 SPR 값 변화가 로그 스케일로 증가하는 경향을 나타낸다(도 3 참조). 따라서, 본 발명의 측정방법은 기존의 ELISA 방법과 비교할 때, 바람직한 실시예에 있어서 10 pg/㎖ ~ 100 ng/㎖의 단백질을 용이하게 분석할 수 있었으며, 이것은 ELISA와 유사한 분석 감도를 가지면서도 로그스케일로 2배 이상(즉, 100배 넓은 범위)의 다양한 농도의 단백질 측정이 가능함을 나타낸다.

효소침전반응을 이용한 항원단백질의 측정 방법으로 전기화학적 바이오센서, QCM(quartz crystal microbalance) 바이오센서 등에 활용한 기술은 다른 문헌들에서 보고되고 있다(Abad, J.M. et al., Anal. Chim. Acta, 1998, 368, 183-189; Alfonta, L., Singh, A.K. and Willner, I., Anal. Chem., 2001, 73 , 91-102; Yoon, H.C., Yang, H. and Kim, Y.T., Analyst, 2002, 127, 1082-1087). 상기 전기화학적 및 QCM 바이오센서와 비교할 때, 효소침전반응이 SPR에 도입된 본 발명의 측정방법은 SPRI 측정방법 등의 활용에 의하여 한 번에 수십~수천 종류의 생체물질이 가능한 바이오칩 측정이 가능한 장점이 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 SPR 칩에 단백질 마이크로어레이를 만든 후, 상기 효소반응의 증폭방법을 이용하여 본 발명자들이 개발한 종래의 SPRI 시스템(대한민국 특허출원 제2003-61626호)에서 SPR 칩의 이미지를 통한 항원 단백질을 분석한 결과, 항원-항체 결합에 의한 선택적 마이크로어레이(microarray) 이미지를 확인하였다(도 4 참조).

도 4의 이미지에서 알 수 있는 바와 같이, 단순히 한 각도에서 이미지를 측정하는 것에 의해 다양한 농도의 항원 단백질을 측정하는 것은 곤란하다. 즉, 1 ng/㎖ 이상의 항원 단백질의 농도에서 각 마이크로어레이 스팟의 강도는 SPRI 센서의 원리에 기인하여 유사한 이미지로 측정된다. SPR 센서는 일반적으로 일정한 SPR 칩 지점에 각도가 다른 광을 한 번 또는 순차적으로 비춰주는 것에 의해 가장 낮은 반사율을 보이는 각도, 즉 표면플라즈몬 공명각의 변화가 SPR 칩 표면에 결합된 생체물질의 양(칩 표면의 굴절률 변화)과 비례하는 원리를 이용한다. 반면 SPRI 센서는 각도가 일정한 평형 광을 보다 넓은 면적에 비춰주어 반사되는 광의 세기 차이를 측정하는 원리를 이용하다. 이러한 원리에 기인하여 SPR 센서는 감도가 더 좋은 반면 한 번에 분석할 수 있는 시료의 양이 제한되며, SPRI 센서는 마이크로어레이 분석이 가능한 반면 감도가 떨어지고 칩 표면의 굴절률 변화에 반사 강도가 포화되어 다양한 농도의 생체물질의 측정이 곤란하게 된다.

본 발명에서는 SPRI 바이오칩에서도 SPR 바이오센서와 같이 생체물질의 다양한 농도분석이 가능하도록 하기 위하여, SPRI 센서의 각도를 변화시키며(스캐닝하며) 이미지를 저장하여 SPR 칩에 배열된 개개 스팟(spot)들의 표면플라즈몬 공명 각도를 측정하였다. 각 이미지 스팟들의 반사광(reflectance) 강도를 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 측정하고, 이들 값을 입사각의 각도에 대해 도시(plot)한 결과, 항원 단백질의 농도가 증가함에 따라 SPR 각도(최소의 반사를 나타내는 각도)가 증가함을 확인하였다(도 5 참조). 실시예에 이용된 항원 단백질의 분석범위는 로그 지표 값으로 3 정도(자유수로는 1,000 배 범위)로서, 기존 ELISA 형태의 단백질칩에 비해 크게 향상된 것으로, 형광 단백질과 유사한 분석범위를 나타낸다.

따라서, 본 발명의 측정방법은 SPR 칩 위에 쌓인 침전물의 두께에 따라 SPR 값이 변화하므로, 보다 개선된 분석과정을 이용할 경우에 기존 바이오칩 분석방법을 훨씬 능가하는 분석방법이 될 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 단백질 인터페론-감마(IFN-γ)의 측정

<1-1> 금박막칩의 제조 및 칩 활성화

95% 황산과 30% 과산화수소수를 부피비 3:1로 혼합한 용액에 금박막칩을 60 내지 65℃에서 20분 동안 담지시킨 후 증류수, 에탄올 순으로 금박막칩을 깨끗하게 세척하였다. 10 mM의 머캅토운데카노익산(mercaptoundecanoic acid)을 녹인 에탄올 용액에 상기 금박막칩을 상온에서 20시간 정도 담지시켜 자기조립단 분자막이 형성되도록 하였다. 에탄올, 증류수 순으로 상기 금박막칩을 세척한 후, SPR 바이오센서 시스템(Biacore X 모델)에 장착하였다. 이후, 1 ㎕/㎖의 흐름속도와 25℃ 온도의 조건에서 바이오센서를 작동하였다.

칩을 활성화하기 위하여, 증류수에 0.2 M의 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride)와 0.05 M의 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 녹인 용액을 10분 동안 흘려주었다. 그리고 나서, 상기 칩에 0.1 ㎎/㎖ 농도의 항인터페론-감마 항체를 함유한 10 ㎖의 아세테이트 완충용액(pH 4.5)을 30분 동안 흘려주었다. 반응하지 않은 활성화기를 제거하기 위하여, 이후 상기 칩에 1 M 농도의 에탄올아민 용액(pH 8.5)을 5분 동안 흘려주었다. 또한, 상기 칩에 비선택적 반응이 일어날 수 있는 부분을 막기 위하여, 1%의 BSA(bovine serum albumin)를 PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.4)에 녹인 용액을 30분 동안 흘려주었다.

<1-2> 퍼옥시다제 효소와 SPR 바이오센서를 이용한 단백질 인터페론-감마 측정

상기 칩에 100 pg/㎖ 농도의 항원 단백질인 인터페론-감마 및 0.1%의 BSA를 함유한 PBS 용액을 흘려주어 항원-항체 결합이 이루어지도록 하였다. 이와 동시에, 상기 실시예 <1-1> 과정을 동일하게 수행하지만, 항원 단백질을 주입하지 않는 바이오센서의 다른 유체 셀을 대조군으로 실시하였다. 이후 과정은 동일하게 수행하였다. 상기 칩에 0.1%의 BSA가 함유된 PBS에 0.05 ㎎/㎖ 농도의 비오틴화 감지용 항체와 0.05 ㎎/㎖ 농도의 아비딘-HRP(horseradish peroxidase)를 녹인 용액을 50분 동안 흘려주어, 항원 단백질에 결합하도록 하였다. 상기 칩에 결합된 퍼옥시다제 효소와 반응하여 침전이 일어날 수 있는 1 mM의 과산화수소수와 1 mM의 클로로나프톨(4-chloro-1-naphthol)을 용해시키고, 10%의 에틸렌글리콜을 함유한 pH 8.0, 50 mM의 트리스 완충용액을 30분 동안 흘려주었다.

상기 SPR 바이오센서를 이용하여 분석한 결과, 대조군과 비교할 때 100 pg/㎖의 인터페론-감마 용액을 흘린 실험군은 퍼옥시다제 효소반응에 의해 SPR 각도 변화가 큼을 확인하였다(도 2). 효소반응에 의한 SPR 값의 변화는 대조군이 240 RU(resonance unit)이고, 실험군은 2650 RU를 나타내었다.

<실시예 2> 퍼옥시다제 효소와 SPR 바이오센서를 이용한 단백질 인터페론-감마의 농도 분석

실시예 1과 동일한 절차에 따라 인터페론-감마의 농도를 변화시키며 실험을 하였다. 인터페론-감마의 농도를 변화에 따른 항원 단백질 반응, 감지용 항체 단백질 및 아비딘-HRP 결합, 효소 반응에 의해 변화된 SPR 값을 측정하였다(도 3). 그 결과, 인터페론-감마 농도의 증가에 따라서 효소 반응에 의한 SPR 값 변화가 로그스케일로 증가함을 확인하였다.

<실시예 3> 퍼옥시다제 효소와 SPRI 센서를 이용한 단백질 인터페론-감마 측정

<3-1> 단백질칩(항체 마이크로어레이) 제작

18 × 18 × 0.3 ㎜ 유리판 위에 2 ㎚ 두께로 크롬과 45 ㎚ 금을 증착한 항체 마이크로어레이 제작용 칩을 사용하였다. 실시예 1과 동일하게 칩에 머캅토운데카노익산 자기조립 단분자막을 형성시키고, 증류수에 20 mM의 EDC와 5 mM의 NHS를 녹인 용액에 상기 칩을 담지하여 활성화시켰다. 상기 칩을 증류수로 세척하고, 말린 후 단백질 마이크로어레이 제작에 사용하였다.

마이크로어레이용 단백질은 항인터페론-감마 항체, 항인터루킨-5 항체 및 0.1 ㎎/㎖ 농도의 BSA를 10 ㎖의 아세테이트 완충용액(20%의 글리세롤 함유)에 용해시켜 pH 4.5로 제조하였다. 상기 단백질 용액을 384 마이크로웰 플레이트에 분주한 뒤, 상기 칩을 마이크로어레이(Protegen, CM-1000)에 위치시켰다. 내부습도 75%를 유지하는 조건에서 구경 335 ㎛의 핀을 이용하여 칩 위에 마이크로웰플레이트 상에 분주된 단백질을 배열하였다. 처음 줄은 항 인터페론-감마 항체 용액, 두 번째 줄은 항 인터루킨-5 항체 용액, 세 번째 줄은 대조군으로 BSA 용액을 배열시켰다. 마이크로어레이어에서 같은 습도를 유지하면서 2시간 동안 정치시킨 후, pH 7.4, 10 mM의 인산완충액에 1% BSA를 녹인 용액에 담지하여 30분 동안 교반하여 주었다.

<3-2> 단백질칩 분석

상기 칩에 항원 단백질인 인터페론-감마 또는 인터루킨-5 용액(정해진 농도로 0.1% BSA를 함유한 PBS 용액에 녹임)으로 교체한 후, 1시간 동안 교반하여 항원-항체 결합이 이루어지도록 하였다. 상기 칩에 0.1%의 BSA가 함유된 PBS에 0.01 ㎎/㎖의 농도로 인터페론-감마 및 인터루킨-5의 비오틴화 감지용 항체를 각각 용해시키고, 0.05 ㎎/㎖의 농도로 아비딘-HRP(horseradish peroxidase)를 녹인 용액으로 치환하여 30분 동안 교반하여, 항원-항체 결합이 일어난 스팟(spot)에 퍼옥시다제가 결합하도록 하였다. 상기 칩을 증류수로 세척한 후, 퍼옥시다제 효소와 반응하여 침전이 일어날 수 있는 1 mM의 과산화수소수와 1 mM의 클로로나프톨(4-chloro-1-naphthol)을 녹인 10%의 에틸렌글리콜 함유 pH 8.0, 50 mM의 트리스 완충용액을 첨가하여 30분 동안 정치시켰다. 상기 칩을 증류수로 세척하고, 말린 후 SPRI 시스템에 장착하여 이미지 분석을 하였다.

44.0°의 입사각에서 측정한 상기 칩의 이미지 데이터를 측정한 결과, 인터페론-감마를 반응시킨 경우 첫 번째 줄에, 인터루킨-5를 반응시킨 경우 두 번째 줄에 뚜렷한 스팟 이미지를 확인하였다(도 3).

<3-3> SPRI 센서를 이용한 단백질칩에 배열된 각 스팟의 SPR 각도 분석

상기 칩상의 스팟들의 SPR 각도를 얻기 위하여, SPRI 센서의 각도를 변화시키며 이미지를 저장하였다. 각 이미지 스팟들의 강도를 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 구하였으며, 이들 값을 각도에 대해 도시하였다(도 4). 그 결과, 항원 단백질의 농도가 증가함에 따라 SPR 각도(최소의 반사를 나타내는 각도)가 증가함을 확인하였다.

종래의 측정방법은 10 pg/㎖ 정도의 분석감도와 3 로그값(log) 정도의 분석범위를 제공하는데 그치고 있으나. 실제 생화학적 시료들에 함유된 단백질의 농도 범위는 훨씬 넓게 분포되어 있다. 그에 반하여, 본 발명 측정방법은 효소침전반응과 SPR 및 SPRI 센서를 이용한 신호증폭으로 특정 또는 다양한 항원 단백질을 미량 및 넓은 범위에서 분석이 가능하며, 특히 SPRI 센서를 이용하면 보다 유용하다. 이와 같이, 본 발명은 전통적인 효소반응을 이용한 항원 단백질 측정법과 SPRI를 결합함으로써 바이오칩을 이용하여 효과적으로 단백질을 측정할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 측정방법은 단백질칩을 포함한 바이오칩 측정방법에 있어서 특정 또는 다양한 항원 단백질을 미량 및 다양한 농도의 범위에서 측정이 가능하다. 따라서, 본 발명은 인체진단, 프로테오믹스 연구 등에 사용될 수 있는 단백질칩에 대한 획기적인 분석방법으로 사용될 수 있다.

도 1은 미량의 단백질을 정량분석할 수 있는 효소침전반응과 결합된 SPR(surface plasmon resonance; 표면플라즈몬공명) 및 SPRI(SPR imaging; 표면플라즈몬공명 이미징) 센서를 이용한 신호증폭을 포함한 본 발명의 측정방법을 개략적으로 나타낸 모식도이고,

도 2는 SPR 바이오센서를 이용하여 상기 도 1의 각 과정의 인터페론-감마(IFN-γ) 단백질을 분석한 SPR 센서그램을 나타낸 그래프이고,

<도면에 대한 설명>

a : EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride)와 NHS(N-hydroxysuccinimide) 혼합액 주입 단계,

b : 항인터페론-감마 항체 용액 주입 단계,

c : 1 M의 에탄올아민 주입 단계,

d : 1%의 BSA(bovine serum albumin) 주입 단계,

e : 인터페론-감마 용액 주입 단계,

f : 비오틴화 인터페론-감마 감지용 항체와 아비딘(avidin)-HRP 혼합액 주입 단계,

g : 효소반응용액 주입 단계,

도 3은 인터페론-감마 농도에 따른 인터페론-감마 결합, 비오틴화 인터페론-감마 감지용 항체와 아비딘-HRP 혼합액 반응, 효소반응에 의해 변화되는 SPR 값을 보여주는 그래프이고,

인터페론-감마 결합에 의해 변화된 SPR 값,

비오틴화 인터페론-감마 감지용 항체와 아비딘-HRP 혼합액 반응에 의해 변화된 SPR 값,

효소반응에 의해 변화된 SPR 값,

도 4는 효소반응 증폭 과정을 거친 단백질칩을 SPRI 센서로 분석한 마이크로어레이 이미지를 나타낸 사진이고,

(a) : 100 pg/㎖ 인터페론-감마, (b) : 1 ng/㎖ 인터페론-감마,

(c) : 10 ng/㎖ 인터페론-감마, (d) : 100 ng/㎖ 인터페론-감마,

(e) : 100 pg/㎖ 인터루킨-5(IL-5), (f) : 1 ng/㎖ 인터루킨-5,

(g) : 10 ng/㎖ 인터루킨-5, (h) : 100 ng/㎖ 인터루킨-5,

도 5는 효소반응 증폭 과정을 거친 단백질칩의 입사각의 변화에 따른 반사광 의 각도 변화를 나타내기 위하여, SPRI 센서로 분석한 마이크로어레이 이미지로부터 각도와 이미지의 개개 스팟의 강도(intensity)를 도시(plot)한 인터페론-감마 분석(a) 및 인터루킨-5 분석(b) 그래프이다.

<도면에 대한 설명>

배경부분, 100 pg/㎖,

1 ng/㎖, 10 ng/㎖,

100 ng/㎖

Claims

ⅰ) 시료 단백질의 항체를 SPR(surface plasmon resonance) 칩에 고정화시키는 단계;

ⅱ) 상기 SPR 칩에 시료 항원 단백질을 반응시키는 단계;

ⅲ) 상기 시료 항원 단백질에 결합할 수 있는 감지용 항체를 결합시키는 단계;

ⅳ) 상기 감지용 항체에 결합 가능한 효소를 반응시키는 단계; 및

ⅴ) 상기 효소와 반응하는 반응물질을 첨가하여 SPR 칩 표면에 침전물을 형성시켜 SPR 신호를 증폭시키는 단계를 포함하는 단백질의 측정방법.
제 1항에 있어서, 상기 SPR 칩은 SPR 센서 또는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 센서로 측정하는 것을 특징으로 하는 측정방법.
제 2항에 있어서, 상기 SPRI 센서는 단백질 항체가 2차원적으로 배열하여 고정화된 것을 특징으로 하는 측정방법.
제 1항에 있어서, 상기 시료 항원 단백질의 농도는 10 fg/㎖ ~ 100 ㎍/㎖ 범위인 것을 특징으로 하는 측정방법.
제 4항에 있어서, 상기 시료 항원 단백질의 농도는 10 pg/㎖ ~ 100 ng/㎖ 범위인 것을 특징으로 하는 측정방법.
제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 ⅴ) 단계 이후에 추가적으로 상기 침전물이 형성된 바이오칩의 각도를 변화시켜 상기 바이오칩에 배열된 개개의 스팟의 SPR 각도 변화를 분석하는 것을 특징으로 하는 측정방법.