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KR100426807B1 - 엘-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 엘-쓰레오닌 제조방법 - Google Patents

엘-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 엘-쓰레오닌 제조방법 Download PDF

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KR100426807B1 KR10-2001-0034559A KR20010034559A KR100426807B1 KR 100426807 B1 KR100426807 B1 KR 100426807B1 KR 20010034559 A KR20010034559 A KR 20010034559A KR 100426807 B1 KR100426807 B1 KR 100426807B1
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Abstract

본 발명은 L-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 L-쓰레오닌 제조방법에 관한 것이다. 피루베이트 카이네이즈 이소자임(pyruvate kinase isozyme)을 인코딩하는 pykA 또는 pykF 유전자 발현활성을 억제된 본 발명의 E. coli ABA/fus-pykF 16 (KCCM-10269)를 이용하면 종래의 방법에 비하여 L-쓰레오닌을 보다 높은 수율로 생산할 수 있으며, 이렇게 제조된 L-쓰레오닌은 사료 및 식품 첨가제와 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로 널리 사용될 것이다.

Description

엘-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 엘-쓰레오닌 제조방법{L-threonine producing microorganism and method for producing L-threonine using the same microorganism}
본 발명은 L-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 L-쓰레오닌 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 2개의 포스포에놀 피루베이트 카르복실레이즈(phosphoenol pyruvate carboxylase; ppc) 코딩 유전자와 2개의 쓰레오닌 오페론을 보유하여 포스포에놀 피루베이트(PEP)로부터 쓰레오닌 생합성의 전구체인 옥살로아세테이트(oxaloacetate)로 전환해주는 효소인 ppc 발현량과 옥살로아세테이트로부터 쓰레오닌을 합성하는 경로에 관련된 유전자인 쓰레오닌 오페론의 발현량이 증대되고, 포도당 해당경로 효소인 피루베이트 카이네이즈(pyruvate kinase) 효소를 인코딩한 pykA 또는 pykF 유전자의 발현활성을 억제시켜 피루베이트 카이네이즈에 의한 포스포에놀 피루베이트(phosphoenol pyruvate; PEP)로부터 피루베이트로의 전환속도를 감소시킴으로서 균체내에 쓰레오닌 대사의 전구체인 PEP를 축적시켜 L-쓰레오닌의 생산이 향상된 것을 특징으로 하는 E. coli ABA/fus-pykF 16(KCCM-10269 )과 이를 배양하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료 및 식품 첨가제로 널리 사용되며 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로도 사용된다.
L-쓰레오닌은 발효법으로 제조하는데 대장균, 코리네형 세균, 세라티아속 세균, 프로덴시아속 균주의 야생주로부터 유도된 인공변이주를 사용하고 있다. 이러한 변이 균주들로는 아미노산 유사체 및 약제 변이 내성주 또는 이들 내성주에 디아미노피메릭산, 메티오닌, 라이신, 이소루이신 영양요구성을 부여한 인공변이주가 공지되어 있다 (일본국 공개특허출원 제평2-219582호, Appl. Microbiol. Biotechnol., 29. 550-553(1988), 한국특허공고 제92-8365호).
대장균에서 포도당 해당경로의 중간물질중 하나인 포스포에놀 피루베이트(PEP)는 쓰레오닌의 전구체이며, 대장균의 대사 경로 중에서 포스포에놀 피루베이트(PEP)의 주된 사용경로는 PEP:글루코오스 포스포트랜스퍼라제 시스템(glucose phosphotransferase system; PTS)과 피루베이트 카이네이즈 이소자임(pyruvate kinase isozyme)들이다. pykA 유전자와 pykF 유전자에 의해 인코딩되는 피루베이트 카이네이즈 이소자임(pyruvate kinase isozyme)들은 1분자의 포스포에놀 피루베이트(PEP)를 피루베이트로 전환시키면서 1 분자의 ATP를 생성시킨다.
또한, 포도당 해당경로의 중간물질중 하나인 포스포에놀 피루베이트(PEP)는 쓰레오닌의 전구체인 동시에 트립토판을 포함하는 방향족 화합물의 전구체이다.
트립토판 생산 균주에서 포스포에놀 피루베이트(PEP)를 트립토판으로 전환시키는 효소인 피루베이트 카이네이즈(pyruvate kinase)의 효소 활성을 약화시킴으로서 트립토판의 수율 향상을 시도한 보고가 있다 (참고문헌: Gosset et al, A direct comparison of approaches for increasing carbon flow to aromatic bisynthesis in Escherichia coli, Journal of industrial microbiology, 1996, 47-52). 하지만 이를 L-쓰레오닌 생산 수율 향상에 적용한 사례는 보고되고 있지 않다.
본 균주개발 방법에서는 위 참고문헌의 선행기술의 균주개발 방법과 비교해 볼 때 유사한 점은 피루베이트 카이네이즈(pyruvate kinase) 효소 활성을 약화시킴으로 PEP 축적을 이루었다는 점이지만, 최종 목표물질이 L-쓰레오닌과 트립토판으로 전혀 다르며, 본 기술을 적용한 균주인 당 연구소 균주의 경우는 쓰레오닌 생합성 관련 효소들이 상당히 강화되어 있고 선행기술에 사용된 모균주는 트립토판을 포함한 방향족화합물 생합성 관련 효소들이 상당히 강화 되어 있어 피루베이트 카이네이즈(pyruvate kinase) 효소 활성을 약화 시켰을 때 전자는 쓰레오닌의 생산이 현저히 증가된 반면 후자는 트립토판의 수율 향상을 일부 보고하였다.
따라서 본 발명에서는 이 피루베이트 카이네이즈 이소자임(pyruvate kinase isozyme)들의 발현활성을 억제시켜 L-쓰레오닌의 전구체로 사용되는 PEP를 축적함으로써 L-쓰레오닌의 수율 향상을 기대할 수 있다.
본 발명의 목적은 2개의 포스포에놀 피루베이트 카르복실레이즈(phosphoenol pyruvate carboxylase; ppc) 코딩 유전자와 2개의 쓰레오닌 오페론을 보유한 L-쓰레오닌 생산 미생물로부터 pykA 또는 pykF 유전자의 발현활성이 억제되어 균체내에PEP가 보다 많이 축적됨으로서 L-쓰레오닌의 생산성이 증대된 E. coli ABA/fus-pykF 16(KCCM- 10269 )과 이를 배양하여 L-쓰레오닌을 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 L-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 L-쓰레오닌 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용한 L-쓰레오닌의 생산 균주는 E. coli ABA/fus-pykF 16로서, E. coli TF4076 (KFCC10718, 대한민국 특허출원 제90-22965)에서 유래한 것으로, E. coli TF4076 (KFCC10718, 대한민국 특허출원 제90-22965)의 염색체로부터 폴리머레이즈 체인 반응(polymerase chain reaction: 이하 PCR)을 통해 얻은 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈 유전자 (phosphoenol pyruvate carboxylase gene: 이하 ppc 유전자)와 또한 동일한 균주로부터 클로닝된 쓰레오닌 오페론(operon)을 다시 모균주인 E. coli TF4076의 염색체에 삽입시킴으로써 염색체 DNA 중에 ppc 유전자와 쓰레오닌 오페론의 수를 2개로 늘림으로써 PEP로부터 쓰레오닌 생합성의 전구체인 옥살로아세테이트(oxaloacetate)로 전환해주는 효소인 ppc 유전자의 발현량과 옥살로아세테이트로부터 쓰레오닌을 합성하는 경로에 관련 유전자들 (thrA: aspartokinase I-homoserine dehydrogenase, thrB:homoserine kinase, thrC: threonine synthase)의 발현량을 증가시킴으로써 L-쓰레오닌의 생산량을 향상시킨 E. coli pGmTN-PPC 12 (KFCC-10236,대한민국 특허출원 2001-6976)를 개발하였으며, 다시 공지된 E. coli pGmTN-PPC 12 (KFCC-10236) 균주에서 포도당의해당경로 중의 피루베이트 카이네이즈 이소자임(pyruvate kinase isozyme)을 인코딩하는 pykA 혹은 pykF 유전자를 무력화시켜 PEP로부터 pyruvate로 전환되는 속도를 줄임으로써 균체내에 쓰레오닌 대사의 전구체인 PEP를 축적시키고 강화된 포스포에놀 피루베이트 카르복실레이즈(phosphoenol pyruvate carboxylase, ppc)의 작용과 쓰레오닌 오페론에 함유된 효소들의 활성 강화로 L-쓰레오닌의 생산량이 향상된 E. coli ABA/fus-pykF 16 균주이다.
기출원된 당 연구소의 L-쓰레오닌 생산균주인 E. coli TF4076 (KFCC-10718, 대한민국 특허출원 제90-22965호)는 메티오닌 요구성, 쓰레오닌 유사체(AHV: α-아미노-β-하이드록시 발레릭산)에 대한 내성, 라이신 유사체(AEC: S-(2-아미노에틸)-L-시스테인)에 대한 내성, 이소루이신 유사체(α-아미노부티릭에시드) 대한 내성, 메티오닌의 유사체(에티오닌)에 대한 내성 등의 특성을 가지고 있다.
따라서, 본 발명의 상기 L-쓰레오닌의 생산균주인 E. coli ABA/fus-pykF 16를 2001년 5 월 9 일자로 서울 서대문구 홍제동 소재 사단법인 한국종균협회에 기탁번호 제 KCCM-10269호로 기탁하였다.
하기 실시예를 통하여 본 발명의 미생물분리 및 획득방법을 좀더 구체적으로 기술한다.
실시예 1: 피루베이트 카이네이즈 이소자임(pyruvate kinase isozyme)의 발현활성이 억제된 균주 개발
피루베이트 카이네이즈 이소자임의 발현활성이 억제된 균주를 개발하기 위하여 피루베이트 카이네이즈 이소자임(pyruvate kinase isozyme)의 발현활성을 억제시키는 방법은 위의 참고문헌 1 (Gosset et al, A direct comparison of approaches for increasing carbon flow to aromatic biosynthesis in Escherichia coli, Journal of industrial microbiology , 1996, 47-52)의 방법을 응용하였고, 또 다른 참고문헌 2 (Ponce et al, Cloning of the two pyruvate kinase isoenzyme structural genes from Escherichia coli : the relative roles of these enzymes in pyruvate biosynthesis, Journal of Bacteriology, 1995, 5719-22)의 균주를 이용하였다.
전체적으로는 박테리오파아지 P1-매개 형질도입법(bacteriophage P1-mediated transduction)을 이용하였다. 좀더 상세하게 설명하면 자연형 대장균 E. coli W3110을 4개의 삼각 플라스크에 신선배지(fresh medium) 25 mL씩을 넣고 배양하면서 박테리오파지 P1 분해물(lysate)을 각각 100 ㎕, 50 ㎕, 10 ㎕, 0 ㎕ 넣고 250 rpm으로 3-4시간 배양한 다음 세포의 분해(lysis)를 확인하였고, 적절한 분해수준에 도달하였을 때 1 mL 용액을 취한 다음 클로로포름 50 ㎕을 넣고 1분간 흔들어주어 잘 섞은 다음 12000 rpm에서 2분간 원심분리한 후 상층액 800 ㎕를 취하였다. 이렇게 얻은 박테리오파지 P1 분해물로 참고문헌 2 (Ponce et al, Cloning of the two pyruvate kinase isoenzyme structural genes from Escherichia coli : the relative roles of these enzymes in pyruvate biosynthesis, Journal of Bacteriology, 1995, 5719-22)의 균주 E. coli PB25에 대하여 위와 동일한 방법으로 박테리오파지 P1-매개 형질도입법 수행하여 박테리오파지 P1 분해물(pPB25)을얻었다.
L-쓰레오닌 생산균주인 pGmTN-PPC 12 (KFCC-10236)를 밤새 배양한 배양액 5 mL을 5000rpm에서 5분간 원심분리하여 회수한 다음 상층액을 버리고 펠릿(pellet)을 MC buffer (0.1 M MgSO4, 5 mM CaCl2) 2.5 mL로 재현탁시켰다. 그 후 위에서 얻은 박테리오파지 P1 분해물(pPB25)을 이용하여 표 1과 같은 조건으로 박테리오파지 P1-매개 형질도입을 수행하였다.
박테리오파지 P1 매개 형질도입 조건
튜브 번호 pGmTN-PPC 12(μl) pPB25 파지 분해물(μl)
1 100 0
2 100 10
3 100 50
4 100 100
5 0 100
이후 30 ℃ 에서 교반하지 않고 30분간 배양한 후 1 M 소듐 사이트레이트(sodium citrate)를 100 ㎕ 넣고 잘 섞은 후, 1 mL의 LB 배지를 각 튜브에 넣고 잘 섞어 준 다음, 30 ℃ 에서 교반하지 않고 60분간 배양한 후, 12000 rpm에서 2분간 원심분리하였다. 이어 상층액 일부분을 버린 후 남은 300 ㎕을 다시 재현탁시킨 후 적절한 항생제가 들어있는 고체 아가배지에 50 ㎕, 250 ㎕씩 도말한 다음 30 ℃ 배양기에서 밤새 배양하였다.
생성된 콜로니중에서 pykA 발현이 억제된 돌연변이주는 카나마이신 고체배지(kanamycin plate)에서 pykF 발현이 억제된 돌연변이주는 클로람페니콜 고체배지(chloramphenicol plate)에서 선별하였다.
실시예 2: 선별 군주에 대한 삼각 플라스크에서 쓰레오닌 생산 역가 비교 실험
카나마이신 고체배지에서 선별한 pykA 발현이 억제된 돌연변이주와 클로람페니콜 고체배지에서 선별한 pykF 발현이 억제된 돌연변이주를 각 15주씩 총 30주를 선별하여 표 2에 나타낸 쓰레오닌 역가배지를 사용하여 삼각 플라스크에서 쓰레오닌 생산성을 비교하였다.
쓰레오닌 역가배지
조성물 농도(리터당)
포도당 70g
황산암모늄 28g
KH2PO4 1.0g
MgSO4·7H2O 0.5g
FeSO4·7H2O 5mg
MnSO4·8H2O 5mg
탄산칼슘 30g
L-메티오닌 0.15g
효모엑기스 2g
pH 7.0
32 ℃의 배양기에서 LB 고체 배지 중에 밤새 배양한 단일 콜로니들을 25 ml의 역가배지에 1 루프씩 접종하여 32 ℃에서 250 rpm으로 48시간 동안 배양하였고 이의 분석 결과를 표 3에 나타내었다. 콘트롤 균주인 E. coli TF4076의 역가는 20 g/L인 반면 신개발 재조합 균주들인 30주 모두는 모균주에 비해 우수한 역가를 나타내었으며, 특히 26 g/L 이상의 역가를 보인 균주도 8주나 되었으며, 가장 높은 역가를 나타낸 균주의 경우 27 g/L의 쓰레오닌을 생산함으로써 수율이 모균주에 비하여 약 35 % 정도 향상되었음을 관찰하였으며, 이를 E. coli ABA/fus-pykF 16 (KCCM-10269)로 명명하였다.
신개발 재조합 균주들의 플라스크 역가 시험 결과
20-22 g/l 22-24 g/l 24-26 g/l 26 g/l 이상
7 6 9 8
실시예 3: 발효조를 이용한 쓰레오닌 비교시험
실시예 2에서 선별된 우수 균주 E. coli ABA/fus-pykF 16 (KCCM-10269) 와 대조균주인 E. coli TF4076을 사용하여 5L 발효조에서 쓰레오닌 생산성을 비교하여 보았다. 초기 배지 조성은 표 4에 나타난 바와 같다. 종균 배양은 LB 배지에 포도당 10 g/L와 L-메티오닌을 0.1 g/L 첨가한 배지를 사용하였고, 발효조의 초기 접종 부피는 초기 배양 부피의 3-5%로 조정하였다. 추가당은 6회에 걸쳐 당 고갈시 첨가하였으며, 추가한 직후의 포도당 농도가 5% 되게 하였다. 또한 포도당을 추가할 때 제일인산칼륨(KH2PO4)을 총중량기준으로 1% 되게 함께 첨가하였다. 초기 배양 부피는 1.5 L이고 최종 부피는 3.0 L이며, 발효종료 후 투입된 총 포도당의 농도는 250 g/L이다. 교반속도는 700 -1000 rpm이고, pH와 온도는 각각 7.0과 32 ℃로 유지하였다. 배양 중 pH의 조절은 25 내지 28 %의 암모니아수를 사용하였다. 또한 통기량은 0.5 vvm으로 조정하였다. 실험 결과를 표 5에 나타내었으며, 결과에서 알 수 있는바와 같이 대조 균주인 E. coli TF4076은 75.3 g/L의 쓰레오닌을 생산하여 소비한 포도당에 대해 30.1 %의 수율을 보인 반면, 재조합 균주 E. coli ABA/fus-pykF 16 (KCCM-10269)는 102 g/L의 쓰레오닌을 생산하여 40.8 %의 수율을 보임으로써, 농도와 수율 면에서 대조 균주에 비해 35.4 %의 월등한 역가 향상을 나타내었다. 또한 재조합 균주에서 흔히 나타나는 생육 저해 현상에 따른 발효시간 및 당소모 속도 지연 현상도 전혀 나타나지 않고 대조 균주와 유사한 양상을 보였다.
5 리터 발효조의 초기 배지 조성
조성물 농도(리터당)
포도당 50g
KH2PO4 4g
(NH4)2SO4 6g
효모엑기스 3g
MgSO4·7H2O 2g
L-메티오닌 1g
FeSO4·7H2O 40mg
MnSO4·8H2O 10mg
CaCl2·2H2O 40mg
CoCl2·6H2O 4mg
H3BO3 5mg
Na2MoO4·2H2O 2mg
ZnSO4·7H2O 2mg
pH 7.0
재조합 균주의 5리터 발효조에서의 발효 역가
균주명 쓰레오닌 농도(g/l) 발효시간(시간) 수율(%)
E. coli TF4076 75.3 78 30.1
E. coli ABA/fus-pykF16 102 77 38.0
본 발명은 L-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 L-쓰레오닌 제조방법에 관한 것이다. 피루베이트 카이네이즈 이소자임(pyruvate kinase isozyme)을 인코딩하는 pykA 또는 pykF 유전자 발현활성이 억제된 본 발명의 E. coli ABA/fus-pykF 16 (KCCM-10269)를 이용하면 종래의 방법에 비하여 L-쓰레오닌을 보다 높은 수율로 생산할 수 있으며, 이렇게 제조된 L-쓰레오닌은 사료 및 식품 첨가제와 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로 널리 사용될 것이다.

Claims (2)

  1. 2개의 포스포에놀 피루베이트 카르복실레이즈(phosphoenol pyruvate carboxylase; ppc) 코딩 유전자와 2개의 쓰레오닌 오페론을 보유하는 E. coli pGMTN-PPC 12(KCCM-10236)에서 유래되고, 피루베이트 카이네이즈 이소자임을 인코딩하는 pykA 또는 pykF 유전자의 발현활성이 억제된 L-쓰레오닌 생산균주 E. coli ABA/fus-pykF 16(KCCM-10269).
  2. 제 1항에 따른 미생물 E. coli ABA/fus-pykF 16 (KCCM-10269)을 LB 배지에서 종균배양한 후, 초기 배지에서 32℃에서 교반, 통기하에 본 배양을 실시하면서 포도당 농도가 5%가 되도록 추가당을 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌 생산방법.
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