KR100410738B1 - 식물 번역 조절 종양 단백질 유전자의 프로모터 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아라비돕시스 번역 조절 종양 단백질(TCTP) 유전자의 5′비전사 영역에서 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명에서 TCTP 프로모터로 언급되는 핵산 분자는 리포터 유전자를 적절하게 배열하여 높은 수준으로 발현되도록 조절한다. TCTP 프로모터는 식물 유전공학에서 현재 이용할 수 있는 프로모터들과 비교되는 수준으로 유전자 발현을 개시하고 조절한다. 완전한 조절 활성을 위해서는 최소 300개의 염기 서열 영역이면 충분하다. TCTP 프로모터는 뿌리 정상의 분열조직에서 가장 높은 활성을 가지며 테스트된 모든 식물조직에서 기능이 있다. 본 발명은 농경상 중요한 식물에서 유용한 유전자를 높은 수준으로 발현하는데 이용할 수 있다.

Description

식물 번역 조절 종양 단백질 유전자의 프로모터 시스템{PROMOTOR SYSTEM OF TRANSLATIONALLY CONTROLLED TUMOR PROTEIN GENE}

본 발명은 유전자 전환 식물에서 리포터 유전자를 적절하게 배열하여 높은 수준으로 발현되도록 조절하는, 아라비돕시스 번역 조절 종양 단백질(TCTP) 유전자의 5′비전사 영역에서 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.

진핵세포의 시스템에서 유전자 발현은 다양한 시스-작용 및 트랜스-작용 조절 요소들 사이에서의 복잡한 상호작용을 통해 조절된다. 시스-작용 요소는 다양한 전사 요소라 불리는 트랜스-작용 요소의 결합을 조절함으로써 유전자의 발현을 직접 또는 간접적으로 조절하는 유전자에 인접한 DNA 서열로 정의된다. 프로모터는 가장 중요한 시스-작용 요소 중 하나이며 일반적으로 유전자의 전사 개시 부위의 5 말단 상류에 위치한 뉴클레오타이드 서열 영역으로 간주된다. 프로모터는 RNA 중합효소 Ⅱ에 대한 결합 부위를 포함하며 유전자의 전사를 개시한다. 또한, 프로모터는 전사 개시 부위(+1)와 관련되어 있는 염기 위치 -70 부근의 CAAT 박스 및 염기 위치 -30 부근의 TATA 박스와 같이 잘 보전된 여러 개의 서열 요소를 포함한다(Joshi 1987). TATA 박스는 전사의 개시를 정확하게 위치화하는데 중요하다. CAAT 박스는 모든 프로모터에 존재하지는 않으며, GC가 풍부한 영역이 대체된 몇몇 프로모터에 존재한다. 이러한 염기 요소들뿐 아니라, 프로모터는 또한 건조한 스트레스, 열 쇼크, 추위 스트레스, 영양소의 유용성, 광 및 이온 강도와 같은 생리적인 조건과 환경 신호에 반응하는 부가적 염기서열을 포함한다. 또한, 어떤 프로모터는 조직-특이적 유전자 발현 또는 세포-특이적 유전자의 발현을 유도하는 서열 요소를 포함한다. 또한, 프로모터는 발현 수준, 조직 특이성 또는 세포-특이성, 발달 단계 의존성 및 특이적 환경 자극에 대한 반응성 등의 조건에 의해 유전자 발현을 조절함으로써 중요한 농경 식물에서 이로운 유전자를 발현할 수 있으므로 식물 유전 공학에 중요하다.

번역 조절 종양 단백질(TCTP)은 최근 식물 및 동물로부터 확인된 성장 관련 단백질 중의 하나이다. TCTP는 인간, 동물, 식물 및 효모를 포함하는 다양한 유기체에 고도로 보전된 세포질 단백질이며, 매우 탄탄한 구상 구조를 가지고 열, pH, 이온 강도 및 단백질 분해 효소에 대해서 매우 안정하다(Woo et al. 1997). TCTP단백질의 한가지 흥미로운 특성은 그 발현이 세포의 성장 조건에 밀접하게 관련된다는 것이다. 이에 따르면, TCTP 단백질은 식물의 캘러스 조직, 정상의 줄기와 잎, 뿌리의 분열조직 및 동물의 암에 걸린 조직을 포함하는 급속히 성장하는 조직에서 분리되었다. 이러한 관찰은 TCTP 단백질이 세포증식에 있어서 조절 역할을 가질 수 있다는 것을 나타낸다(Woo et al. 1997; MacDonald et al. 1995; Hughes et al. 1993). 그러나, TCTP 단백질이 건강한 동물과 식물 조직에서도 발현되며 그 발현을 전사 수준 및 후전사 수준에서 칼슘 이온에 의해 조절된다는 사실은 그 후에 발견되었다(Wu et al. 1999; Sanchez et al. 1997; Xu et al. 1999). TCTP 단백질은 동물 세포에서 칼슘 이온(Ca²⁺)에 의존적인 방식으로 α-튜뷸린 및 β-튜뷸린과 직접적으로 상호 작용함에 따라 세포골격의 미세관식 네트워크와 관련된다(Gachet et al. 1999; Gachet et al. 1997). TCTP 단백질은 전체적으로 약 4.0의 등전점(pI)을 가지는 산성 단백질이지만, 중앙부위의 약 50개의 아미노산으로 이루어진 도메인은 9.4의 등전점을 가지는 강한 염기성이다. 이러한 염기성 도메인은 물리적으로 튜뷸린과 상호 작용한다(Gachet et al. 1999). 종합해 볼 때, 이러한 관찰은 TCTP 단백질이 세포 성장 및 분화의 조절에 있어서 관리 역할을 수행한다는 것을 나타낸다. 많은 TCTP 유전자 및 유전자 서열이 동물과 식물의 다양한 조직에서 분리되었다(Sage-Ono et al. 1998; Tamaoki et al. 1997; Woo et al. 1997). 그러나, 소수의 경우를 제외하고는 특히 식물에 있어서는 상세한 분자 생물학적 분석 및 기능 분석 없이 단지 TCTP 유전자 서열만이 데이터베이스에 기탁되었다. 완두TCTP 유전자는 뿌리 정상(apical) 내의 급속도로 분화하는 세포에서 높은 수준으로 발현된다(Woo et al. 1997). 단일 식물인 일본 나팔꽃에서(Pharbitis nil cv. Violet), TCTP mRNA는 식물이 어둠에서 성장할 때 높은 수준으로 축적되나, 그 발현 수준이 빛이 있을 때에는 감지되지 않을 정도로 감소되는데, 이는 TCTP가 이러한 식물 종에서는 적어도 빛에 의해 조절되는 성장에 어떤 역할을 가진다는 것을 의미한다(Sage-Ono et al. 1998). 이러한 두 가지 경우를 제외하고는 식물에 있어서 상세한 연구결과가 보고된 바 없다.

우리는 완두 TCTP 단백질이 어둠에서 성장한 완두 종자의 상배축에서 현저하게 발현되고, 광억제성을 띠는 랩(Rab)-유사 작은 분자량 GTPase (small GTPase)인 완두 Pra3와 직접적으로 상호 작용한다는 것을 발견하였다. 노던 블랏 분석 결과, 완두 TCTP 유전자는 줄기, 잎, 뿌리와 같이 실험된 모든 식물 부분에서 높은 수준으로 전사되었으나, 뿌리 정상의 분열조직에서 최고의 전사 수준을 나타내었다. 게다가, 식물에 건조한 스트레스를 주는 조건으로 15% PEG를 처리함으로써 전사가 2-3배 더 유도되었다. 또한, 담배 TCTP 유전자 상동물에서도 동일한 발현 패턴이 관찰되었다. 종래의 보고서들을 종합해 볼 때, 이러한 결과는 식물 TCTP 유전자의 프로모터가 높은 경제적 가치를 가지는 유전자 전환 식물에 유익한 외래 유전자를 발현하기 위해 유용하게 이용된다는 것을 나타낸다. 식물에서의 TCTP 유전자 발현에 대한 조절 메카니즘을 연구하고 식물 유전 공학에서 TCTP 프로모터의 잠재성을 평가하기 위하여, 아라비돕시스의 TCTP 유전자의 5말단 비전사 영역으로부터 DNA 서열을 분리하고, 일련의 절제에 의해 프로모터 영역으로 정의하였으며, 유전자 전환식물에서 TCTP 프로모터의 조절 하에 배치된 리포터 유전자의 발현 수준 및 패턴을 실험하였다.

아라비돕시스 TCTP 프로모터 영역은 -120의 염기 위치에 ATG 개시 코돈과 관련된 특유의 TATA 일치 서열을 포함한다. 그러나, 5말단 비전사 영역의 적절한 위치에서 CAAT 박스나 GC가 풍부한 서열이 확인되지는 않는다. 상기의 관찰들로부터 일치되는 것은 한 쌍의 광반응 요소가 확인된다는 것이다. TCTP 프로모터는 완두 식물에서의 종래 결과에 일치하는 바와 같이, 뿌리 정상의 분열 조직에서 최고의 전사 수준을 가지며 모든 식물에서 리포터 유전자의 발현을 높은 수준으로 유도한다(Woo et al. 1997). 5말단을 삭제하여 구성한 여러 가지 상이한 TCTP 프로모터는 리포터 유전자에 결합시켰으며, 발현 카세트는 유전자 전환 아라비돕시스 식물에서 실험하였다. 리포터 유전자의 높은 수준의 발현을 위해서는 최소 300개의 염기 서열이면 충분하다. 게다가, 300개 염기 서열의 프로모터가 뿌리의 분열조직에서 가장 우세하게 배치된 발현을 나타내었다. 이러한 특성은 TCTP 프로모터가 적절한 숙주 식물에서 유일한 유전자의 발현을 높은 수준으로 유도하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

최근 식물 조직 배양 및 식물 유전공학 기술의 발달 및 진보와 함께, 종래의 품질개량으로는 쉽게 얻을 수 없는 생산성 및 품질 향상을 위해 바람직한 숙주 식물에 유용한 유전자를 도입하는 것은 현재 일상적인 실험이다. 이와 같은 목적을 달성하기 위하여, TCTP 프로모터에 외래 유전자를 정확하게 결합시켜 유전자 전환 식물에서 프로모터의 조절 하에 그 유전자가 발현될 수 있도록 한다.

본 발명의 목적은 발현 카세트를 포함하는 유전자 식물과 그 제조 방법을 제공하는데 있다.

임의의 바람직한 유전자를 적절한 발현 카세트에서 TCTP 프로모터의 조절 하에 위치시킨 후, 그 재조합 카세트를 본 기술분야에서 잘 알려진 다양한 형질전환 방법으로 숙주 세포에 도입하였다. 또한, 본 발명의 프로모터는 가뭄의 스트레스에 반응하여 2-3배로 더 유도하였다. 이러한 점에서, 본 발명은 특히 유전자를 표준조건하에서 특정 수준으로 발현시키고 가뭄 스트레스에 의해 더욱 유도될 수 있도록 조작하는데 이용될 수 있다.

농경 식물 분야에서는 뿌리 성장이 중요하다. 본 발명에 의한 TCTP 프로모터는 특히 가뭄 스트레스 또는 수분 결핍 하에서도 뿌리 성장을 가속시킬 수 있다. 본 발명의 일례에서, TCTP 프로모터는 뿌리 성장 및 발달의 조절과 자극에 관련된 유전자를 발현하는데 이용할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명은 TCTP의 조절 하에 배열된 유익한 임의의 유전자를 포함하는 유전자 전환 식물 세포 및 식물과 아라비돕시스 식물의 TCTP 프로모터 서열을 분리하는 실험 방법을 제공한다.

본 발명에 의하면, 생물학적으로 중요한 물질을 대량 생산하고 성장률과 발달을 증진시키거나 환경 변화에 대한 적응력을 높이기 위하여 식물을 조작할 수 있다.

본 발명의 유전자 전환 식물의 제조 방법은, 서열 번호 1에 나타난 염기 서열을 포함하는 TCTP 프로모터의 조절 하에서 핵산 분자를 클로닝 벡터와 결합하는 단계, 상기 클로닝 벡터를 식물 세포내에 도입하여 식물 세포를 형질 전환하는 단계, 상기 형질 전환된 식물 세포를 성장시키는 단계를 포함하여, 유전자를 발현하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 아라비돕시스 게놈 DNA를 주형으로 사용하고, 한 쌍의 특이적 PCR 프라이머를 사용하여 상기 PCR에 의해 아라비돕시스로부터 서열 번호 1에 나타난 염기 서열을 포함하는 TCTP 프로모터 서열을 분리하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 유전자 전환 식물 세포는, 서열 번호 1에 나타난 염기 서열을 가지는 아라비돕시스 번역 조절 종양 단백질(TCTP) 유전자의 5' 비전사 영역으로부터 분리되는 TCTP 프로모터의 조절하에서 유전자를 발현하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 식물은 완두, 아라비돕시스, 담배 또는 일본 나팔꽃인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 전환 식물의 종자, 잎, 줄기, 떡잎 및 뿌리를 특징으로 한다.

도 1은 완두 TCTP 유전자 발현의 노던 블랏 분석을 나타낸다.

도 1a는 빛에서 성장한 완두 식물을 잎, 정상(apical) 잎, 줄기, 정상의 줄기 및 꽃의 기관으로 절개하였다. 각각의 식물 부분에서 선택적으로 전체 RNA를 분리하였다. 전체 RNA의 3㎍을 각각의 레인에 로딩하였으며 P32로 표지한 TCTP 유전자 서열을 탐침으로 하였다. 이 노던 블랏 분석에서 하이본드-N+ 필터(HiBond-N+ filter)를 30분 동안 노출시켰다.

도 1b는 완두 식물을 생리학적 농도의 다양한 식물 성장 호르몬의 존재 하에서 성장시켰다. 각각의 처리로부터 줄기 부분을 분석하였다. C; 미처리, G; GA3, P; 15% PEG, I; IAA, K; 카이네틴, A; ABA. 다른 식물 부분에서도(뿌리와 잎) 유사한 결과가 얻어졌다.

도 2는 아라비돕시스 TCTP 프로모터의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 특이적 프라이머 한 쌍을 사용하여 폴리메라아제 사슬 반응(PCR)에 의해 아라비돕시스 게놈 DNA로부터 DNA 분자를 분리하였다. 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1에 나타나 있으며, 유전자 은행 데이터베이스에 기탁하였다(승인 번호 AF237735). TCTP 유전자의 개시 코돈은 굵은 활자로 인쇄된 것이며, 추정의 TATA 박스 일치 서열은 두 줄로 밑줄친 부분이다. 프로모터는 전형적인 CAAT 서열을 가지지는 않으나, 표시된 대로 추정된 광-반응성 서열 한 쌍을 가진다. PCR 프라이머가 다른 길이를 가지는 TCTP 프로모터(도 3)를 합성하기 위해 PCR 프라이머를 사용하였으며 PCR 프라이머는 5말단에서 3말단 방향으로 화살표로 표시하였다. 프라이머 1; -1990에서 -1963, 프라이머 2; -1312에서 -1296, 프라이머 3; -681에서 -663, 프라이머 4는 -303에서 -284, 프라이머 5; -1에서 -28. 번호는 TCTP 유전자의 개시 코돈에 관련된 염기 위치를 나타낸다.

도 3은 본 발명에서 생성하고 실험된 TCTP 프로모터의 개략도를 나타낸다. 2 kbp, 1.3 kbp, 0.7 kbp 및 0.3 kbp의 길이를 가지는 프로모터 영역은 PCR 실행에 의해서 분리하였으며, pBI에 기초한 프로모터가 없는 벡터에서 GUS 유전자 서열에 전사적으로 결합된 것이다. 모든 발현 카세트는 직접적인 DNA 염기 서열에 의해서 확인되었다. 35S 프로모터를 대조군으로 사용하였다. 숫자는 도 2에서와 같이 (+1) ATG 코돈으로부터 시작하는 염기 위치를 나타낸다. T; 노스 터미네이터(nos terminator), A; 아라비돕시스 TCTP 유전자 및 그 5말단 비전사 영역, B; 본 발명에서 생성한 TCTP 프로모터, C; 대조군으로 사용한 CaMV 35S 프로모터.

도 4는 조직화학적 분석에 의해 검출된 식물 전체에서의 GUS 활성을 나타낸다. GUS-TCTP 프로모터 융합물을 포함하는 발현 카세트를 아라비돕시스 식물에 형질전환하였으며, 가나마이신 선발법(kanamycin selection)을 반복하여 동질 접합체(homozygotic lines)를 분리하였다. 식물 전체를 사용하여 GUS 염색을 4시간 동안 실시하였으며, 밤새 실온으로 순수 에탄올에서 엽록소를 제거하였다. 아래쪽의 패널은 15% PEG로 처리한 유전자 전환 식물을 나타낸다. 대조군의 식물은 TCTP 프로모터 서열을 가지지 않는 프로모터가 없는 벡터로 형질전환하였다.

도 5는 뿌리에서의 GUS 유전자의 발현을 나타낸다. 뿌리는 도 4에서 사용된 유전자 전환 식물에서 분리하였으며, 도 4에서와 동일방법으로 처리하였다. 대조 식물도 또한 도 4에서와 같다.

도 6은 도 3에 나타난 TCTP 프로모터의 활성을 나타낸다. 35S 프로모터를 대조군으로 사용하였다. 단일-카피 삽입물을 가지는 유전자 전환 아라비돕시스 식물의 동질 접합체(homozygotic lines)를 35S 프로모터를 가진 대조군 식물을 포함하는 서던 블랏 분석에 의해 분리하였다. 빛에서 성장한 유전자 전환 식물의 종자로부터 분리한 조 추출물로 형광 GUS 분석을 실시하였다. GUS 활성은 실시예에 설명된 대로 계산하였다. 세 개의 독립적인 측정치를 평균하였다.

이하, 본 발명의 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명한다.

대부분의 동물과 소수 식물에서의 분자 생물학적 및 생화학적 연구는 번역 조절 종양 단백질(TCTP)이 성장과 발달의 조절에 있어서 관리 역할을 가진다는 것을 나타내었다. TCTP 단백질이 원래 비정상적으로 급속한 성장을 나타내는 조직에서 분리되었지만, 그 후 일반 세포에서도 높은 수준으로 발현되며 전사 수준 및 번역 수준에서 그 발현이 조절된다는 사실이 확인되었다. 식물에서 TCTP 단백질의 생리학적 역할은 아직 확인되지 않았다. 몇몇 분자 생물학적 연구가 수행된 소수의 경우, TCTP 유전자 발현은 빛에 의해서 조절되며 뿌리의 분열조직에서와 같이 급속히 분열되는 세포에서 우세하게 발현되는데, 이는 TCTP 단백질이 식물에서 세포 분열과 분화에 관련되어 있다는 것을 나타낸다.

"프로모터"란 용어는 유전자 발현을 개시 및 조절하는 구조 유전자의 5말단 상류 영역에 위치한 염기 서열로 간주한다. 일반적으로 프로모터는 여러 가지의 잘 보전된 서열을 포함한다. 그 중 한가지는 전사 개시 부위(+1)에서 약 10-40 염기의 상류에 위치하며 5'-TATAAT-3'의 서열을 가지는 TATA 박스이다. 다른 한 가지는 대부분의 경우에 5'-CCAAT-3'의 서열을 가지는 CAAT 박스이다. 이는 대체로 전사 개시 부위의 40-110 염기의 상류에 위치한다. 세 번째 서열인 GC-풍부 영역도 또한 몇몇 프로모터에 존재한다. 다른 프로모터에서, CAAT 박스는 N이 네 개의 염기 중 하나인, 5'-AG(또는 T)NGA-3'의 서열을 가지는 AGGA 박스로 대체된다. 프로모터가 항상 유전자를 발현하기 위해 충분한 것은 아닐 지라도, 유전자 발현을 조절하기 위하여 가장 중요한 성분임에는 틀림없다. 그러므로, 프로모터 시스템의 설명은 식물의 성장과 발달에 있어서 유전자 발현의 기초를 이루는 조절 메카니즘의 이해를 위해 필수적인 것이라 할 수 있다. 게다가, 일정한 유전자의 발현이 특이적 프로모터에 의해 조작되므로 프로모터 시스템은 식물 유전 공학에 있어서 중요한 요소인 것이다.

본 발명은 아라비돕시스 TCTP 유전자에서 분리한 강한 구성 프로모터를 제공한다. 프로모터는 유전자가 프로모터에 적절하게 결합하였을 때 모든 식물 부분에서 유전자를 높은 수준으로 발현한다. 게다가, 프로모터 활성은 특히 줄기에서 가뭄 스트레스에 대해 2-3 배로 더욱 유도된다.

"프로모터에 적절하게 결합된"이란 그 유전자의 발현을 프로모터에 의해 조절하기 위해 이로운 구조 유전자를 프로모터 서열의 3' 말단에 결합한다는 것을 나타낸다. 유전자의 조절은 그 유전자에 결합된 프로모터에 의존하여 구성하거나 유도할 수 있다. 유도할 수 있는 발현은 추위, 가뭄 또는 병원균 감염 등과 같은 환경 요인에 의해 조절할 수 있다. 또한, 유전자 발현은 발달 단계에 의존적인 방법 또는 세포-특이적 방법이나 조직-특이적 방법으로 조절할 수 있다.

구조 유전자의 발현에 대한 프로모터의 조절 역할이나 효과는 전사 수준 또는 번역 수준에서 실험할 수 있다. 전사 수준에서 이를 실험하기 위한 수단으로는 DNA-RNA 하이브리디제이션 기술을 이용하였다. 이를 실행하기 위하여, 전체 RNA 또는 mRNA를 적당한 식물 재료로부터 분리하여 아가로스 겔을 실시하고 보조 막(supporting membrane)에 옮겼으며, 방사성 동위 원소로 표지한 DNA 탐침으로 실험하였다. 전사 수준의 분석에서는 본 기술분야에서 공지된 기술을 사용하여 식물 재료로부터 조 추출물 또는 정제된 단백질을 분리하고 특이적 항체를 사용하여 실험하였다.

본 발명에서의 프로모터는 TCTP 프로모터로 디자인되었다. TCTP 프로모터는 아라비돕시스 TCTP의 5' 상류 영역에서 파생된 것이며, 서열 번호 1에 나타난 염기서열을 가진다(유전자은행 승인 번호 AF237735). 염기 서열은 아라비돕시스 게놈 DNA를 주형으로 사용하고 한 쌍의 특이적 PCR 프라이머를 사용하여 PCR에 의해서 분리할 수 있다. 상기 염기 서열의 부분적인 서열 영역도 또한 동일한 방법으로 합성하였다.

또한, 본 발명은 매우 엄격한 조건하에서 서열 번호 1의 염기 서열을 가지는 핵산 분자에 하이브리디제이션되는 핵산 분자에 관한 것이다. "매우 엄격한 조건하에서 하이브리디제이션된다"는 것은 Sambrook 등에 의해서 설명된 바와 같이, 그러한 핵산 분자를 종래의 하이브리디제이션 조건하에서 염기 대합(pairing)을 통해 핵산 분자에 하이브리디제이션시킨다는 것을 나타낸다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^ndEd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). 상기 핵산 분자와 하이브리디제이션된 핵산 분자는 일반적으로는 임의의 식물, 선택적으로는 농경, 산림, 원예에서 유익한 식물로부터 얻은 것을 포함한다.

서열 번호 1에 나타낸 핵산 분자에 하이브리디제이션된 핵산 분자를 분리하기 위한 수단으로, 본 기술분야에서 공지된 분자 생물학적 기술인 콜로니 하이브리디제이션 방법을 통해 상기 설명된 핵산 분자를 탐침으로 사용하여 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝하였다.

또한, 본 발명에서의 핵산 분자는 서열 번호 1에 나타낸 핵산 분자를 변형시킨 것과 관련된다. "변형"이란 그러한 핵산 분자의 염기 서열이 상기에 기재된 핵산 분자와 하나 또는 그 이상의 염기 위치가 다르며 상기 핵산 분자에 고도로 상동성을 가진다는 것을 의미한다.

"상기 핵산 분자에 상동"이란 핵산 분자의 염기 서열은 염기 서열에 있어서 상기 핵산 분자와 최소 70%, 특히 80% 또는 그 이상이 일치한다는 것을 나타낸다.

또한, 본 발명은 삽입, 삭제, 염기 치환 또는 재조합에 의해서 생성한 상기 핵산 분자의 임의의 유도체를 포함한다.

게다가, 본 발명은 유전자 전환 식물 세포 또는 식물에서 상기 프로모터를 평가하는데 유용하며 리포터 유전자에 기능적으로 결합된 TCTP 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서, TCTP 프로모터가 바람직한 유전자에 실시 가능하도록 결합되었다는 것은 식물의 성장을 향상시키기 위하여 모든 식물 부분, 특히 뿌리의 분열조직에서 유전자를 높은 수준으로 발현한다는 것이다.

또한, 본 발명은 식물 세포의 형질전환에 사용할 수 있도록 TCTP 프로모터를 포함하는 발현 카세트 및 플라스미드에 관한 것이다.

최근 식물 조직 배양 및 유전 공학의 급속한 진보와 함께, 경제적으로 중요한 임의의 식물 내에 실질적으로 이로운 유전자를 도입하는 것이 가능하다. 이러한 목적을 위해서는 본 발명의 TCTP 프로모터와 같은 유전자 발현 조절 요소가 중요하다.

그러므로, 본 발명은:

1. 서열 번호 1의 염기 서열을 포함하는 아라비돕시스 TCTP 유전자의 5' 상류 영역의 핵산 분자 및,

2. 벡터 pTCTP-2K 로 형질전환된 대장균 변종 XL1-blue(KCTC 0807BP)를 제공한다. 벡터 pTCTP-2K는 서열번호 1에 나타낸 염기 서열을 가지는 핵산 분자를 포함한다.

(실시예)

발현 카세트의 구성

식물 TCTP 유전자는 모든 식물 부분에서 극도로 높은 수준을 갖고 구성적으로 발현된다. 그 발현은 또한, 가뭄 스트레스 및 빛에 의해서 조절된다. 이러한 특성은 TCTP 프로모터가 유전 공학적으로 조작된 식물에서 바람직한 유전자를 발현시키기 위해 매우 유용하다는 것을 나타낸다. 아라비돕시스 게놈 DNA와 한 쌍의 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 실시함으로써 아라비돕시스 TCTP 유전자의 5' 상류 영역으로부터 약 2.2 kbp의 길이를 가지는 DNA 단편을 분리하였다. DNA 염기서열에 의해 완전한 염기 서열을 확인하고 유전자 은행 데이터베이스에 기탁하였다(승인 번호: AF237735). 또한, 일련의 PCR을 실시함으로써 서로 다른 길이를 가지는 몇 개의 프로모터 서열들을 구성하였다(도 2 및 도 3). 그 후, TCTP 프로모터 서열을 pBI에 기초한 프로모터가 없는 벡터에서 β-글루크로이데이즈(β-glucuronidase; GUS)를 암호화하는 유전자 서열에 전사적으로 융합하였다. GUS-TCTP 프로모터 융합물을 포함하는 발현 카세트를 DNA 염기서열에 의해 확인하였다.

식물 재료 및 성장 조건

형질전환을 위하여 아라비돕시스 탈리아나 생태형 콜럼비아(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia; Col-0)를 사용하였다. 살균한 종자를 발아시킨 다음 1%의 아가와 자당(Sucrose)을 포함하는 0.5X MS 배지(Murashige and Skoog medium)에서 성장시켰다. 모든 아라비돕시스의 배양은 22℃의 배양실에서 70%의 습도와 12시간의 광주기를 갖도록 통제된 환경으로 유지하였다.

식물 형질전환

GUS-TCTP 프로모터 융합 발현 구성물을 엄격한 조건하에서 아라비돕시스 식물내로 도입하였다. 아그로박테리움(Agrobacterium)을 매개로 한 형질전환을 간소화한 플로랄 딥 방법(floral dip method)을 사용하여 실행하였다(Clough and Bent, 1998). 먼저, 발현 구성물을 아그로박테리움 튜메파시엔스 변종 LBA4404(Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404)내에 형질전환한 다음, 그 발현 구성물을 포함하는 세포를 아라비돕시스 식물을 감염시키는데 사용하였다. 형질전환체를 선택하기 위하여 가나마이신(kanamycin) 및 세포타심(cefotaxime)을 각각 200 mg/l과 500 mg/l 사용하였다.

RNA 추출 및 노던 하이브리디제이션

제조업자의 제조방법에 따라 키아젠(Qiagen, Valencia, CA)사의 알앤이지 식물 전체 RNA 분리 키트(RNeasy Plant Total RNA Isolation Kit)를 사용하여 적당한식물 재료로부터 전체 RNA 샘플을 분리하였다. RNA 샘플을 50%(v/v)의 폼아마이드(formamide) 및 2.2M의 폼알데하이드(formaldehyde)를 첨가한 MOPS 완충용액(20mM MOPS, 8mM 소듐 아세테이트, 1 mM EDTA)내에서 65℃의 온도로 10분간 변성시켰으며, 동일한 변성 완충용액에서 조제된 1%의 아가로스 겔로 분별하였다. 탐침은 α-[P³²]dATP의 존재 하에서 임의대로 주입함으로써 제조하였다. 이전에 기재했던 방법대로 하이본드-N(Hybond-N) 막에 옮기고 그 다음 과정을 실행하였다(Sambrook et al. 1989).

DNA 추출 및 서던 하이브리디제이션

제조업자의 방법에 몇 가지 변경을 가하여 키아젠사(Qiagen)의 디엔이지 식물 미니 키트(DNeasy Plant Mini Kit)를 사용하여 아라비돕시스 식물로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 간단히 말해서, 식물 재료를 액체 질소에서 막자사발을 이용하여 고운 가루로 만들었다. 그 후, 가루를 에펜도프 튜브(Eppendorf tube)에 옮겨서 액체 질소를 증발시켰다. 500㎕의 완충용액 AP1 및 RNase A 용액을 첨가하여 강하게 교반하였다. 그 혼합물을 10분 동안 65℃에서 배양하였다. 세포의 분해 후, 160㎕의 완충용액 AP2를 첨가하고, 그 최종 혼합물을 5분 동안 얼음에서 배양하였다. 상기 단계는 계면활성제, 단백질 및 다당류를 침전시키기 위한 것이다. 최고 속도로 5분 동안 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 그 다음 상청액을 키아쉬레더 스핀 컬럼(QIAshredder spin column)에 넣고 최고 속도로 2분 동안 원심분리하였다.

그 용액을 1 vol의 순수한 에탄올과 0.5의 완충용액 AP3과 혼합하여 DNeasy 미니 스핀 컬럼에 넣고 8000rpm으로 1분 동안 원심분리하였다. 그 컬럼에 500㎕의 완충용액 AW를 첨가하여 컬럼 막을 건조시키기 위하여 최대 속도로 2분 동안 다시 원심분리하였다. 게놈 DNA를 추출하기 위하여, 그 막에 100㎕의 예열된(65℃) 완충용액 AE를 직접 첨가하여 5분 동안 실온에서 배양하였다. 그 후, 컬럼을 최대 속도로 1분 동안 원심분리하였다. 그 결과물인 게놈 DNA 용액을 같은 부피의 페놀:클로로폼:아이소아밀 알콜(25:24:1)로 추출하고 실온에서 5분 동안 에탄올로 침전시킨 다음, 원심분리에 의해 DNA를 회수하였다.

아라비돕시스 식물을 형질전환하기 위해 사용하는 발현 카세트내의 GUS 유전자에는 존재하지 않는 인식 부위인 EcoRⅠ 및 HindⅢ로 게놈 DNA를 분해하였다. 1㎍의 게놈 DNA 당 각각 5 단위의 제한효소를 사용하였으며, 그 혼합물을 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 아가로스 겔에서 보다 나은 분석 결과를 얻기 위하여, 분해 혼합물을 에탄올로 침전시킨 후 그 뭉침(pellet)을 70%의 에탄올로 2회 헹구어 내고 공기로 말렸다. 시료를 1X 로딩 완충용액에 용해하여 0.8%의 겔 상에 로딩하였다. 탐침은 방사성-라벨된 GUS 유전자 서열을 사용하였다. 아라비돕시스 유전자 전환 식물은 고유의 TCTP 프로모터 서열을 갖기 때문에 TCTP 프로모터 서열 대신에 GUS 유전자 서열을 탐침으로 사용하였다.

GUS 활성의 조직 화학적 분석

식물 전체 또는 식물의 특정 부분을 X-gluc 용액(0.1M의 소듐 포스페이트,pH 7.0, 10mM의 EDTA, 0.5mM이 포타슘 페리시아나이드, 0.5mM의 포타슘 페로시아나이드, 0.1%의 트리톤 X-100, 0.3%의 5-브로모-4-클로로-3-인돌일 글루쿠로나이드 및 20%의 메탄올)에 2-4시간 동안 담가두었다. 식물 재료를 사용하기 바로 전에 트리톤 X-100을 새로 첨가하였다. 그 후, 엽록소를 제거하기 위하여 식물 재료를 순수 에탄올에 실온에서 밤새 담가두었다. 배양하는 동안 에탄올을 4-5회 교환하였다. 오물을 제거한 시료를 광학 현미경으로 관찰하고 필요하다면 사진 촬영을 하였다.

GUS 활성의 형광 분석

GUS 활성의 발현 수준을 형광성 방법을 사용하여 분석하였다(Jefferson 1988). GUS 활성을 분석하기 위하여 형광 기질로 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루쿠로나이드(4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide; MUG)를 사용하였다. 식물의 조 추출물을 다음과 같이 제조하였다. 식물 재료를 액체 질소에서 고운 가루로 갈고 세포 용해 완충용액(0.5M의 Tris.Cl, pH 7.5, 1mM의 DTT, 1mM의 1,2-다이아미노사이클로헥산-N,N,N',N'-테트라아세트산, 10%의 글리세롤, 1%의 트리톤 X-100, 1mM의 EDTA)으로 추출하였다. 1g의 신선한 식물 재료에 대해 200㎕의 세포 용해 완충용액을 사용하였다. 4℃에서 최대 속도로 원심분리를 15분 동안 실시하여 임의의 불용해성 물질과 세포 파편을 제거하였다. 형광 측정을 위하여 상등액을 더 정제하지 않고 사용하였다. 브래드포드 방법(Bradford method)을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다. 형광 측정은 제퍼슨에 의한 방법을 기초로 하여 실시하였다(Jefferson,1998).

(결과)

식물 TCTP 유전자의 이중 발현 패턴: 구성적 발현 및 유도적 발현

번역 조절 종양 단백질(TCTPs)은 아직 정확한 생리학적 기능이 밝혀지지는 않았지만, 특유의 구조적 특성 및 기능적 특성을 가진다. TCTPs는 여러 유기체들 사이에서 높은 아미노산 서열 동질성(서열 전체의 60-70%)을 가지기 때문에, 식물 및 동물에서의 그들의 생리학적 역할은 동일한 것으로 예상된다. TCTP 단백질은 심지어 단백질 분해효소에 대해서도 매우 안정하다. TCTP 단백질은 4.0의 등전점(pI)을 가지는 강한 산성을 띠는 세포질 단백질이지만, 그 중앙에 9.2의 등전점을 가지는 높은 염기성 도메인을 가지고 있다. 이러한 염기성 도메인은 직접적으로 튜뷸린과 상호작용하며, 이러한 상호작용은 세포 분열 및 분화에 관련된다는 것이 입증되었다. TCTP 단백질은 동물의 암 세포 및 식물의 캘러스 조직과 같이 급속도로 성장하는 조직에서 고도로 발현된다. 또한, TCTP 단백질은 조직마다 조금씩 차이는 있지만, 정상적인 조직에서 고도로 발현된다. 식물에서의 TCTP 발현은 종-특이적 방식으로 빛에 의해 조절된다. 게다가, 최근에 TCTP 발현이 15% PEG 처리에 의해 유도된다는 것을 발견하였는데, 이는 식물에서의 스트레스 반응에 대한 TCTP 단백질의 역할을 나타낸다. 특별한 이점은 TCTP 유전자가 적어도 본 발명에서 실험한 담배, 완두, 아라비돕시스 식물에서 극도로 높은 수준으로 전사되며, 아마도 모든 고등 식물에서 높은 수준으로 전사된다는 점이다.

식물 유전 공학에 유용한 프로모터 시스템을 개발하고 TCTP 유전자 발현에 대한 조절 메카니즘을 연구하기 위하여, TCTP 유전자의 5' 비전사 영역을 아라비돕시스로부터 분리하였으며, 리포터 유전자 발현에 대한 그 조절 역할을 조직 특이성, 환경 요인에 대한 반응성 및 상대적 활성의 조건에 대하여 실험하였다.

먼저, 완두 식물에서 TCTP 유전자의 전사 수준 및 전사 패턴을 노던 블랏 분석에 의해 실험하였다. 전사 수준은 줄기에서는 비교적 높은 수준으로, 꽃의 기관에서는 비교적 낮은 수준으로 나타난 바와 같이 다른 식물 부분마다 조금씩 차이는 있지만, 실험한 모든 식물 부분에서 극도로 높게 나타났다(도 1a). TCTP 유전자는 대부분 정상(apical) 줄기 및 잎과 같이 급속도로 성장하는 부분에서 고도로 전사된다. 이것은 TCTP 단백질이 식물의 성장 및 발달에 관련되어 있다는 것을 의미한다(Woo et al. 1997). 식물을 여러 가지 식물 호르몬으로 처리하였을 때, 식물에 가뭄 조건을 주는 15% PEG의 처리를 제외하고는 어떤 것도 전사 수준에 영향을 미치지 못하였다. 15% PEG의 처리는 2-3 배로 전사를 유도하였다(도 1b). 특별히 주목할만한 사실은 전체적으로 전사 수준이 매우 높다는 사실이다. 일반적인 노던 블랏 분석에서는 대체로 15-20㎍의 전체 RNA를 사용하는데 반해, 도 1에 나타낸 노던 블랏 분석에서는 3㎍의 전체 RNA를 각각의 레인에 로딩하였다. 게다가, 10-20분 동안 노출하면 TCTP 전사의 검출을 위해 충분하였다. 종합해 볼 때, 이러한 관찰은 TCTP 유전자가 모든 식물 조직에서 높은 수준으로 구성적으로 발현되며, 그 발현은 가뭄 스트레스와 같은 환경적 요인(들)에 의해서 더욱 유도된다는 것을 나타낸다.

놀랍게도 일본 나팔꽃 식물에서 관찰된 종래의 결과와는 달리(Sage-ono etal. 1998), 빛이 완두 식물에서는 TCTP의 전사에 중대한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 또한, 담배 TCTP 유전자에서도 동일한 결과를 얻었다. 그러므로, 빛의 영향은 식물의 종에 의존한다는 설명이 가능하다. 선택적으로, 식물은 각각 다른 메카니즘에 의해 조절되는 여러 가지 TCTP 유전자를 가질 수 있다. 완두, 담배 및 아라비돕시스의 서던 분석 결과, 각각의 식물 종은 단일 카피 유전자(완두, 아라비돕시스) 또는 많아야 두 개의 카피 유전자(담배, 일본 나팔꽃)를 가진다는 것을 나타냈다.

이들을 모두 종합해 볼 때, 식물 TCTP 유전자는 모든 식물 부분에서 매우 높은 수준으로 구성적으로 전사되며, 그 전사는 세포 증식 및 분화에 있어서 TCTP 단백질에 대해 중요한 조절 역할을 나타내는 환경 요소에 의해서 더욱 높게 조절된다는 것이 증명된다. 또한, 식물 TCTP 유전자의 프로모터는 활성이 매우 높으므로, 유전공학적으로 조작된 농경식물에서 다량으로 유익한 단백질을 발현하고 식물의 성장 및 발달을 향상시키기 위하여 사용할 수 있다.

아라비돕시스 TCTP 유전자의 프로모터 영역

프로모터의 조절 역할을 실험하기 위해 선택할 수 있는 능률적인 방법은 구조 유전자를 기능적으로 프로모터에 결합시킨 키메릭 융합물(chimeric fusion)을 구성하고 상기 발현 구성물을 유전자 전환 식물에 도입하는 것이다. 유전자 전환 식물에서 구조 유전자 생성물의 활성 수준 또는 발현 수준은 시험관내에서(in vitro) 쉽게 분석할 수 있다. 이러한 실험에서 종종 사용되는 리포터 유전자는 대체로 쉽게 탐지할 수 있는 물질의 생성을 촉매하는 효소를 암호화한다. 그 후, 생성물을 융합 구성물의 활성을 추론하고 그 결과 프로모터의 조절 활성을 측정하기 위하여 사용한다(Jefferson, 1988). 본 발명의 리포터 시스템에서, 프로모터 또는 추정 프로모터 요소를 대장균 β-글루쿠로니데이즈(β-glucuronidase; GUS)를 암호화하는 유전자 서열에 융합하였다. GUS는 여러 가지 β-글루쿠로니데스(β-glucuronides)를 수산화하며, 리포터로 사용될 수 있는 유용한 생화학적 특성들을 가진다. 이는 모든 고등 식물에는 사실상 거의 존재하지 않으며, 계면활성제, pH 및 이온 조건에 대해 매우 안정하다. 게다가, 보충하는 보조인자(supplementary cofactors)를 필요로 하지 않는다. 이는 절대적으로 세포질내에 위치하며 후-전사의 수식을 필요로 하지 않는다. 이러한 특성들이 GUS 시스템을 고등 식물에서 사용할 수 있고 식물 재료에서 분리한 조 추출물에서 분석할 수 있는 완전한 리포터로 만든 것이다.

식물의 유전 공학에서 사용되는 유용한 프로모터 시스템을 개발하고 유전자 발현에서의 조절 역할을 실험하기 위하여 식물의 TCTP 유전자의 5' 상류 영역으로부터 프로모터를 분리하였다. 스트레스에 관련된 라스-유사 스몰 GTPase(Ras-like small GTPase)인 완두 Pra3와 직접적으로 상호 작용하는 TCTP 단백질의 능력에 기초한 완두 TCTP 유전자를 분리하였다(Nagano et al. 1995; Yoshida et al. 1993). 분자 생물학적 분석 결과, 모든 식물 부분에서 높은 수준으로 구성적 발현된다는 것이 나타났다. 데이터베이스 조사로 아라비돕시스의 염색체 3에 대한 TCTP 유전자 상동물을 확인하였다. 게놈 클론 MGL6의 염기 서열에 기초하여(승인 번호:AB022217), 한 쌍의 특이적 프라이머를 디자인하고, 2181 염기의 프로모터 영역을 아라비돕시스 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다. 프라이머는 클로닝을 위해 각각의 5' 말단에 BamHI 제한 부위를 가지는 5'-GCCGGATCCTGACCCAACCCAAGTGTCCC(5' 말단 프라이머, 서열 번호 2) 및 5'-GCCGGATCCAAGATCTTGGTACACCAACATG(3' 말단 프라이머, 서열 번호 3)을 사용하였다. PCR 생성물을 pTCTP-2K 백터에서 pGEM-7Z(+)로 클로닝하였으며, 그 염기 서열을 DNA 염기서열에 의해 확인하여 유전자 은행 데이터베이스에 기탁하였다(유전자 은행 기탁 번호. AF237735). DNA 단편의 3' 말단은 추정의 아라비돕시스 TCTP 단백질의 처음 7개 아미노산을 암호화하는 짧은 코딩 서열을 포함한다.

추정 TCTP 프로모터 영역은 ATG 코돈과 관련된 -120의 염기 위치에 전형적인 TATA 박스를 포함한다(도 2). 추정 CAAT 박스는 TATA 박스에서 약 270개의 염기의 상류에 위치한다. 그러나, 그 위치는 식물 유전자에서 실험적으로 증명된 CAAT 박스의 위치와 일치하지 않기 때문에 TCTP 유전자 발현의 조절에서는 기능하지 않는 것으로 여겨진다. 게다가, 추정 CAAT 박스 주위의 염기 서열인 5'-GAACAATCA는 식물 유전자에서의 전형적인 서열인 5'-GG(T/C)CAATCT와는 다소 상이하다. -1352 및 -767의 각각의 염기 위치의 5'-AGAAACAA 및 5'-AGCTATCCA와 같이 다른 식물 유전자에서 실험적으로 확인된 TCTP 프로모터에서 한 쌍의 광-반응성 요소가 확인되었다(Conley et al. 1994; Park et al. 1996). 광-반응성 요소가 기능하는지 또는 기능하지 않는지는 분명하지 않으나, TCTP 유전자의 전사가 빛에 의해 철저하게 억제된 일본 나팔꽃에서의 종래 결과와 관련될 수 있다. 게다가, 벼의글루텔린(glutelin) 유전자에서 확인된 바와 같이 염기 위치 -1396에서 GA-반응 서열인 5'-CCTTTTG가 확인되었다(Takaiwa et al. 1991).

식물 기관에 의존적인 발현

유전자 발현에서 TCTP 프로모터의 조절 역할을 실험하기 위해 3' 말단 프라이머, 프라이머 5 및 5' 말단 프라이머, 프라이머 1을 사용하여 pTCTP-2K 벡터로부터 약 2 kbp의 영역을 재증폭하였다(도 2). 그 결과로 생성된 PCR 생성물을 GUS를 암호화하는 서열에 프로모터의 3' 말단을 전사적으로 융합시키는 방법을 이용하여 pBI에 기초한 프로모터가 없는 벡터에 클로닝하였다. 그 후, 생성된 발현 카세트(도 3의 2K)를 아라비돕시스 식물에 형질전환하였으며, 동질접합체(homozygotic line)를 가나마이신에 의한 서열 선발(sequential selection)을 통해 분리하였다. 2K의 구성물 외에도, TCTP 프로모터의 경계선을 결정하고 트랜스-작용 요소와 상호작용하기 위해 필요한 일치(consensus) 서열을 정의하기 위해 2K 구성물의 5' 말단에서 염기 서열을 절제함으로써 몇몇의 구성물을 디자인하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이 적절한 프라이머 한 쌍을 사용하여 PCR을 실시함으로써 각각의 구성물을 산출하였다. 모든 프로모터 구성물을 위해 3' 말단 프라이머로써 프라이머 5를 사용하였다. 1.3K, 0.7K 및 0.3K의 구성물을 위해 사용한 5' 말단 프라이머로는 각각 프라이머 2, 프라이머 3, 프라이머 4를 사용하였다(도 2). 그 결과로 생성된 발현 카세트는 도 3에 나타내었다. 35S 프로모터는 양성 대조군(positive control)으로 포함되었으며(도 3c), 어떤 삽입물도 없이 프로모터가 없는 벡터는 음성대조군(negative control)으로 사용되었다.

그 다음, 유전자 전환 식물의 GUS 활성을 식물 전체를 사용하는 표준 방법에 따라 분석하였다(Jefferson 및 Wilson 1991). TCTP 프로모터는 35S 프로모터를 가진 것과 같은 도관(vascular) 조직에서 가장 짙은 착색이 나타났으며, 잎, 줄기, 떡잎 및 뿌리를 포함하는 모든 식물 부분에서 기능하는 것으로 분명하게 나타났다(도 4). 한 가지 다른 점은 TCTP 발현 카세트를 포함하는 유전자 전환 식물에서는 뿌리의 분열조직이 가장 짙게 착색되었으나, 35S 프로모터를 포함하는 조직은 그러한 분포 양식을 나타내지 않았다는 것이다. 게다가, TCTP 프로모터를 포함하는 유전자 전환 식물의 경우에는 35S 대조군 유전자 전환 식물에서 보다 훨씬 빨리 염색 용액에 담근 후 수분 내로 블루 스팟이 분명하게 가시화 되었다. 이것은 TCTP 프로모터는 적어도 35S 프로모터만큼은 강하며, 35S 프로모터보다는 강하다는 것을 타나낸다.

300-bp의 프로모터

GUS 활성 분석은 300bp의 TCTP 프로모터가 리포터 유전자 발현의 조절에서 기능하며, 그 활성은 2K 프로모터의 활성과 크게 다르지 않음이 입증되었다(도 4). 흥미롭게도, 뿌리의 분열조직에서 GUS의 발현이 TCTP 프로모터로부터 절제한 5' 말단 서열보다 더 우세하였다(도 4 및 도 5). 잎과 줄기 따위의 다른 식물 기관에서는 GUS 활성 분포가 다른 프로모터 구성물들 사이에서 거의 동일한 반면에, 뿌리의 분열 조직에서 0.3K의 프로모터는 GUS 발현을 거의 독점적으로 유도하였다(도 4).이러한 결과는 염기 위치 -300 및 -1사이의 서열은 뿌리의 분열 조직에서 TCTP 유전자의 집중적 발현을 유도하거나 또는 다른 조직에서 TCTP 유전자의 발현을 억제하는 시스-작용 요소를 포함한다는 것을 나타낸다.

0.3K 프로모터는 TATA 박스를 제외하고는 임의로 인식할 수 있는 시스-작용 요소를 포함하지 않으나, 리포터 유전자 발현에 있어서 강한 조절 활성을 나타낸다. 특히 중요한 것은 뿌리의 분열조직에서 리포터 유전자의 발현이 우세하다는 것이다. 이러한 특성은 바람직한 유전자, 특히 뿌리의 성장 및 발달에 관련된 유전자를 뿌리의 분열조직에서 선택적으로 발현할 때 매우 유용하다.

TCTP 프로모터의 상대적 강도

프로모터 융합물을 포함하는 유전자 전환 식물의 GUS 활성을 대조군 프로모터 융합물을 포함하는 유전자 전환 식물의 GUS 활성과 비교함으로써, 프로모터의 조절 하에 위치한 구조 유전자가 발현하는 동안의 프로모터의 조절 기능을 더욱 정확하게 분석할 수 있다. 더욱 정확한 측정을 위하여, 실험군 및 대조군 유전자 전환 식물은 동일한 수의 프로모터 융합물을 삽입하였다.

각각의 TCTP 프로모터 융합물로 감염시킨 유전자 전환 아라비돕시스 식물뿐만 아니라 35S 프로모터 융합물을 가지는 유전자 전환 아라비돕시스 식물로부터 10-15의 동질 접합체(homozygotic lines)를 분리하였다. 그 다음, 게놈 DNAs를 사용하여 서던 블랏 분석을 실시함으로써 각각의 유전자 전환 식물에서 삽입물 수(insertion numbers)를 측정하였다. 모체의 아라비돕시스 식물이 본 발명에서 사용한 고유의 TCTP 프로모터를 가지기 때문에 TCTP 프로모터 서열의 카피 수보다는 GUS 서열의 카피 수를 이용하였다. GUS 서열에 나타나지 않은 인식 서열인 EcoRⅠ 및 HindⅢ의 제한 효소로 게놈 DNAs를 분해하였으며, 분해된 DNAs를 막에 옮겨 아가로스 겔을 실시하였다. 그 다음, 막을 방사성-라벨링한 GUS 서열로 실험하여 단일 삽입물을 가지는 유전자 전환 식물을 선택하였다. 유전자 전환 식물은 빛을 비추어 9일 동안 성장시켰으며, 종자 전체를 형광 GUS 활성 분석을 위해 사용하였다. 조 추출물을 준비하여 표준적인 방법에 따라 GUS 활성을 측정하였다(Kim 및 Guiltinan 1999; Jefferson 1998). 그 중 한 결과를 도 6에 나타내었다.

실험한 모든 TCTP 프로모터는 35S 프로모터보다 약 25-38%정도 높은 GUS 활성을 나타내었다. 0.3K TCTP 프로모터도 대조군 프로모터보다 강하게 나타났다. 2K TCTP 프로모터는 TCTP 프로모터 사이에서 가장 낮은 활성을 가지는 것으로 나타났는데(도 6), 이는 개시 코돈(+1)에 관련된 -1300∼-2000의 염기들을 포함하는 서열이 아라비돕시스 TCTP 전사에 대한 마이너스의 조절 서열을 포함한다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 TCTP 프로모터가 유전자 전환 식물에서 유용한 유전자를 발현하는데 있어서 35S 프로모터보다 우세하다는 것을 나타낸다. 게다가, TCTP 프로모터는 추가적인 이점을 가지는데 그것은 급속히 성장하는 뿌리의 정상에서 유용한 유전자를 높은 수준으로 발현시킬 수 있다는 것이다.

상기에 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면 생물학적으로 중요한 물질을 대량 생산하고 성장률과 발달을 증진시키거나 환경 변화에 대한 적응력을 높이기 위하여 식물을 조작할 수 있는 이점이 있다.

Claims (5)

1. 서열 번호 1에 나타난 염기 서열을 포함하는 TCTP 프로모터의 조절 하에서 핵산 분자를 클로닝 벡터와 결합하는 단계, 상기 클로닝 벡터를 식물 세포내에 도입하여 식물 세포를 형질 전환하는 단계, 상기 형질 전환된 식물 세포를 성장시키는 단계를 포함하여, 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 유전자 전환 식물의 제조 방법.
2. 아라비돕시스 게놈 DNA를 주형으로 사용하고, 한 쌍의 특이적 PCR 프라이머를 사용하여 상기 PCR에 의해 아라비돕시스로부터 서열 번호 1에 나타난 염기 서열을 포함하는 TCTP 프로모터 서열을 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 서열 번호 1에 나타난 염기 서열을 가지는 아라비돕시스 번역 조절 종양 단백질(TCTP) 유전자의 5' 비전사 영역으로부터 분리되는 TCTP 프로모터의 조절하에서 유전자를 발현하는 유전자 전환 식물 세포.
4. 제3항에 있어서, 상기 식물은 완두, 아라비돕시스, 담배 또는 일본 나팔꽃인 것을 특징으로 하는 유전자 전환 식물.
5. 제4항의 유전자 전환 식물의 종자, 잎, 줄기, 떡잎 및 뿌리.