KR100303886B1 - 상황버섯으로부터항암성분을추출하는방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자실층 및 균피층이 생성된 상황의 인공 배양물로부터 항암성분을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 추출방법은 톱밥을 주원료로 한 배지에 상황버섯(Phellinus linteus)균사체를 배양한 상황버섯의 자실층, 균피층을 물, 알칼리 용액, 산용액 등을 가한 다음, 호모게나이저로 곱게 분쇄하고, 즉시 또는 2-18시간 방치 후, 상압하에서 80~100℃에서 추출하거나 가압하에서 110~130℃로 추출한 다음, 추출물을 감압여과하고 진공농축한 후, 95% 에탄올을 가하고 정치한 다음, 1000~8000 rpm에서 원심분리하여 얻은 침전물을 물에 녹인 다음, 분자량 8000~12000 이하의 물질을 투석할 수 있는 투석막을 이용하여 투석하거나 극초여과(ultrafiltration)한 후, 동결건조하는 것으로 구성되며 황색의 자실층 및 균피층이 생성된 균사배양물로부터 대량으로 추출한 추출물은 면역활성효과 및 항암효과를 가지므로 본 발명은 의약 및 의료분야에서 매우 유용한 발명이다.

Description

상황버섯으로부터 항암성분을 추출하는 방법

본 발명은 자실층 및 균피층이 생성된 상황(桑黃, Phellinus Linteus, 목 : 진흙버섯)인공 배양물로 부터 면역활성 성분 및 암세포 살멸 효과 성분을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 구멍장이 버서과(polyporaceae)에 속하는 담자균류의 일종인 상황(Phellinus Linteus)의 균사체를 톱밥을 주성분으로한 고체 배지내에서 배양하여 완숙하게 성장시킴으로써 황색의 자실층 및 균피층이 생성된 균사배양물로 부터 상황의 유효 약효성분을 대량으로 추출할 수 있는 독창적이며 진보적인 방법에 관한 것이다.

상황(桑黃, Phellinus Linteus)은 매우 희귀한 버섯으로서 오래된 뽕나무 그루터기 등에 붙어나는 특징적인 진한 황색의 버섯으로 다년생의 단단한 물질의 버서이다. 상황은 잘라진 단면까지도 특징적인 진한 황색을 띄고 자실체 상부에 나이테 모양의 무늬를 갖는다. 상황은 고대로부터 귀중한 한약재로서 지한제(止汗劑) 혹은 부인과 질환에 사용되어 왔으며 1968년에는 96.7%의 매우 강력한 항암작용(Ikegawa 등)이 확인되었다. 그러나 상황은 매우 희귀하여 일반에 잘 알려지지 않았으며 그 약효성분의 개발도 지체되어 왔다.

그러나 희귀한 야생 버섯이라 할지라도 그 유효 약리성분을 공업적으로 생산하여 식품 또는 의약품으로 이용하는 방법이 있는데 이에는 두가지 방법이 주로 사용되어 왔다. 즉 첫째 방법은 인공적으로 자실채(버섯 자체)를 재배하여 그 자실체를 재료로 이용하는 방법이며 두 번째 방법은 균사를 분리하여 그 균사체를 액체 배지내에 배양하여 그로부터 유효성분을 추출하는 방법이다. 이중 두 번째 방법이 가능한 이유는 버섯류가 식물과는 달리 담자균류에 속하는 곰팡이의 일종이기 때문이다. 상황의 경우도 야생 상황 버섯은 매우 희귀하기 때문에 그 유효 약리 성분을 활용하기 위해서는 상황버섯 자실체를 다량 재배해 내어 이용하는 길을 생각할 수 있으나 아직까지는 상황버섯 인공 재배에 성공한 예는 없다.

따라서, 본 발명자 등은 그 균사체의 액내 배양기술을 개발하여 배양된 균사체의 항암면역 증강 효과를 보고한 바 있다. 한편, 한국신약(주)에서는 상황의 액체배양 균사체 추출물을 항암면역요법제(상품명 : 메시마-엑스)로 허가 받아 발매하고 있으며 암의 치료에 크게 기여하고 있다.

그러나 액체 배지내에 진탕 배양한 균사체는 다당체 이외의 버섯자체가 갖는 다양한 2차 대사물을 거의 생성하지 않으며 따라서 상황의 경우도 버섯자체가 갖는 다양한 2차 대사물 즉 다양한 약리활성 성분을 균사기에서 기대하기는 불가능하다.

따라서, 본 발명은 상기 종래의 문제점을 감안하여 안출한 것으로서, 상황 버섯에서 다양한 약리활성 성분을 얻는데 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적은 상황버섯의 자실층 및 균피층으로 부터 탁월한 암세포 살멸효과 물질을 추출하는데 있다.

이와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 상황버섯을 톱밥배지에 완숙시킬 경우 다양한 2차 대사물 즉 다양한 약리활성 성분이 함유된 자실층 및 균피층이 생성되었으며 이로부터 탁월한 암세포 살멸효과 물질을 추출하여 본원발명을 완성하게 되었다.

제1도는 톱밥을 주성분으로 하는 버섯배지에 상황 균사를 배양하여 얻어진 균사부, 균피층 및 자실층을 보여주는 도면이다.

이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 구성 및 실시예를 상세히 설명한다.

도1에 도시한 바와 같이 본 발명의 균사배양물은 그 최상부에는 톱밥배지가 섞이지 않은, 순수 상황균사로 치밀하게 짜여진 두께 약 1.5㎝의 선명하고 진한 황색 자실층(이하 자실층이라 함)일 생성되며, 그 아랫부분에는 배양용기와 접하는 외곽부에 톱밥배기에 성장한 균사와는 상이한 치밀한 균사조직으로 이루어진 두께 0.5~3㎝의 진한 황색 균피층이 생성되고 나머지 톱밥 배지 전체에는 황색의 균사가 성장한 톱밥 균사부가 생성된다.

본 발명의 균사배양물에서 사용되는 배지는 참나무나 뽕나무 등 주로 활엽수 톱밥을 주성분으로 하고 여기에 쌀겨 등을 첨가한 배지를 유리병이나, 플라스틱 용기 또는 P.P. 포대 등에 충전하고, 살균시킨 다음 상황버섯 종균을 접종시켜 균사 성장에 적합한 온도(23~30℃)에서 배양하여 톱밥배지 내에 균사를 충만하게 성장시킨 후 계속 배양을 진행하면 종균 접종 3~4개월만에 도면에 나타낸 균피층 및 자실층이 생성된다.

이때 톱밥 배지는 접종한 상황 균사체에 의해 톱밥 성분이 대부분 분해 흡수되어 상황 균사체로 전환된 상태이며 충분한 기간동안 완숙되는 과정에서 상황의 고유하고 다양한 성분들이 생성됨으로써 상황의 고유한 진한 황색을 그대로 지닌 자실층 및 균피층이 생성된다. 따라서 이들 자실층 및 균피층을 활용하여 유효성분을 추출하면 일반 톱밥 배양 균사체 혹은 액체배양 균사체와는 달리 상황버섯 자체의 유효약리 성분을 다량 획득할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 따라 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1: 상황버섯의 인공배양]

상황버섯을 인공배양하기 위해서 본 발명의 균사배양물에서 사용되는 배지는 참나무나 뽕나무 등 주로 활엽수 톱밥을 주성분으로 하고 여기에 쌀겨 등을 첨가한 배지를 유리병이나, 프라스틱 용기 또는 P.P. 포대 등에 충전하고, 살균시킨 다음 23~30℃에서 배양하여 톱밥배지 내에 균사를 충만하게 성장시킨 후 계속 배양한다.

[실시예 2: 상황버섯 추출물의 분리]

상기 실시예1에서 배양된 상황의 자실층 및 균피층을 적당량의 물, 0.1~2. ON NaOH 등 알카리 용액, 0.1N-1.ON HC1등 산용액 등을 가하고 호모케나이저로 곱게 분쇄하여 즉시 또는 2-18시간 방치 후 상압하에서 80~100℃에서 1-2시간씩 2-3회 추출하거나 가압하에서 110-130℃로 15~60분간 추출한다.

[실시예 3: 상황버섯 추출물에서 항암성분의 추출]

실시예2의 추출물을 감압여과한 후 진공농축하여 2~5배량의 95% 에탄올을 가하고 10분 내지 하룻밤 정치한 다음 1000~8000 rpm에서 10~30분간 원심분리 한다. 이와같이 하여 상기 실시예2에서 얻은 침전물을 다시 소량의 물에 녹여서 분자량 8000-12000 이하의 물질을 투석할 수 있는 투석막을 이용하여 약 2~7일간 투석하거나 극초여과(ultrafiltration) 한후 -40 내지 -70℃에서 동결 건조하여 며역활성효과 및 항암효과를 나타내는 수용성 담갈색 고분자 추출물을 1.4-5%의 수득률로 얻었다.

[실시예 4: 상황버섯 추출물에서 항암성분의 추출]

음지에서 건조한 상황 자실층 및 균피층이 생성된 배양물 20g을 가는 분말로 분쇄하여 300~500ml의 메탄올을 가하고 상온에서 2시간 진탕한 후 추출액을 감압여과한 다음, 상기 메탄올 추출물을 감압농축하여 진한 엑기스상으로 회수한다. 이때 메탄올 대신 95% 에탄올, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트 등의 다른 유기 용매를 사용할 수 있으며 진탕하지 아니하고 2-18시간 정치하여 추출할 수도 있다. 회수된 엑기스는 일반 균사 배양물에서는 얻어지지 않거나 매우 낮은 수율로 얻어지는 암세포 살멸 효과 성분을 고농도로 함유한다.

[실시예 5: 면역활성 효과 실험]

상기 실시예1에서 얻어진 고분자 분획을 발브씨 마우스 (BALB.c mouse)의 비장 백혈구에 가하고 면역활성을 조사하였다. 즉 스트렙토마이신(100㎍/ml)), 페니실린(100U/ml) 및 피탈보바인 혈청(fetal bovine serum)을 10% 가한 알피엠아이 배지(RPMI medium)(이하 완전 RPMI 배지라 함) 발브씨 마우스 비장 백혈구를 배지 1ml 당 1 ×10^a세포가 되도록 부유시키고 여기에 세균 여과막을 통해 멸균한 시료를 200, 100, 50 ㎍/ml가 되도록 가하고 17℃ 5% CO₂함유, 100습도 상태의 CO₂배양기 내에서 3일간 배양한 후 임파구 생성여부를 이미 보고한 방법(정 경수, 신약 개발의 실제와 문제 한국응용약물학회 주계 심포지움 초록집, 7, 12, 1993년)에 따라 유세포분석법(flowcytomtry)으로 분석하였다. 그 결과 상황 균피층 및 자실층으로부터 추출한 고분자 분획이 임파구의 생성을 33% 증가시키는 등 현저한 면역활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

[실시예 6: 암세포 살멸 실험]

상기 실시예2 에서 얻어진 메탄올 추출물의 암세포 살멸 효과를 실험하였다.

실험 암세포주는 쥐 백혈병 세포인 RMA-S세포를 사용하였고 배지는 실시예3에서 기술한 완전 RPMI 배지를 사용하였으며 실시예2와 동일한 조건에서 배양한 후 세포를 인산염완충액으로 3회 세척하고 프로피디움 요드(propidium iodide)를 이용하여 살멸된 세포를 분별염색 한 후 유세포분석기를 이용하여 살멸된 세포를 분별 계수하였다. 추출물을 배지로 1 : 10의 비유로 희석한 경우 98%의 암세포 살멸 효과가 입증되었다.

상기에 기재된 바와 같이, 본 발명은 황색의 자실층 및 균피층이 생성된 균사배양물질로부터 대량으로 추출한 추출물은 면역활성효과 및 항암효과를 가지고 있으므로 본 발명은 의약 및 의료분야에서 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (2)

1. 톱밥을 주원료로 한 배지에 상황버섯(Phellinus Linteus)균사체를 배양하여 자실층, 균피층이 생성된 상황버섯 균사 배양물을 음건한 후, 이 생성된 배양물 20g을 가는분말로 분쇄한 다음, 메탄올, 에탄올, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트 중에서 선택되는 어느 하나의 유기용매 300-500ml를 가하고 상온에서 2시간 진탕한 후 추출액을 감압여과하여 추출하는 것을 특징으로 하는 상황버섯으로부터 항암성분을 추출하는 방법.
2. 톱밥을 주원료로 한 배지에 상황버섯(Phellinus Linteus)균사체를 배양한 상황버섯의 자실층, 균피층을 물, 알칼리 용액, 산용액 등을 가한 다음, 호모게나이저로 곱게 분쇄하고, 즉시 또는 2-18시간 방치 후, 상압하에서 80~100℃에서 추출하거나 가압하에서 110~130℃로 추출한 다음, 추출물을 감압여과하고 진공농축한 후, 95% 에탄올을 가하고 정치한 다음, 1000~8000 rpm에서 원심분리하여 얻은 침전물을 물에 녹인 다음, 분자량 8000-12000 이하의 물질을 투석할 수 있는 투석막을 이용하여 투석하거나 극초여과(ultrafiltration)한 후, 동결건조하여 추출하는 것을 특징으로 하는 상황벗섯으로부터 항암성분을 추출하는 방법.