KR100271136B1

KR100271136B1 - 난초류의 형질전환 방법

Info

Publication number: KR100271136B1
Application number: KR1019980019613A
Authority: KR
Inventors: 한경환; 양재모
Original assignee: 박찬구; 금호석유화학주식회사
Priority date: 1998-05-29
Filing date: 1998-05-29
Publication date: 2001-02-01
Anticipated expiration: 2018-05-29
Also published as: KR19990086584A

Abstract

본 발명은 가속 미세립자 투사법에 의한 형질전환 기술을 이용하여 유전공학적으로 조작된 난초류를 제공하는 방법에 관한 것이다. 난초의 정단 분열조직을 배양하면 원괴체상구체(protocorm-like body ; PLB)라는 특수조직으로 유도가 가능하며, 이들 원괴체상구체는 분열조직으로서 완전한 식물체로의 재분화가 가능하다. 효율적인 형질전환을 위해서는, 비교적 많은 수의 분열조직 세포에 DNA로 코팅한 미세립자를 투사하는 것이 필요하다. 또한, 효율적인 형질전환을 위해서는, 미세립자 투사 후 항생물질을 이용한 선발을 하기전이나 선발을 하는 동안 연속적인 분열조직 발생을 자극하는 것과 미세립자 투사에 의한 조직 손상에 의해 분비된 페놀산의 산화물의 독성 영향을 감소시키는 것이 매우 중요하다. 본 발명에 기재된 기술을 이용함으로써 분열조직 발생을 미세립자 투사 전ㆍ후에 분열조직의 분화를 유도시키는 한편, 페놀산 산화물의 독성 영향을 감소시켜 결과적으로 성공적인 형질전환을 수행하게 한다. 미세립자로 투사된 원괴체상구체들을 증식시키며 도입된 유전자의 적절한 발현을 확인하기 위한 선발과정을 거친다. 그후 신초(shoot) 재발생이 원괴체상구체로부터 유도되어지고 형질전환된 묘목이 생산된다. 본 발명을 수행하기 위한 바람직한 식물은 심비디움(Cymbidium)속의 난초류이다.

Description

난초류의 형질전환 방법

본 발명은 일반적인 식물의 유전자 조작 기술에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 미세립자 투사법에 의한 형질전환 기술(particle-mediated transformation technique)을 이용하여 난초류를 형질전환 시키는 방법에 관한 것이다.

난초류는 통상 전세계에 걸쳐 생장하고 있으며, 800속 및 25,000종 이상으로 꽃식물 중 가장 큰 과에 속한다. 난초의 유전공학적 조작에 의한 질병 및 스트레스 저항성, 조기개화의 유도, 다양하게 조작된 꽃 색깔 및 형태변이 유도등은 상업적 중요성을 지닌다. 종래의 식물 육종 방법에 의한 난초류의 개량은 발아에서 개화기까지 이르는 기간이 길고(수년), 느린 종자 숙성(수개월) 및 묘목 분석의 어려움등이 있어 실질적으로 이용하는데 효율적이지 못하다. 그러므로, 유전공학적 기술을 이용한 난초류의 개량이 관심의 대상이 되고 있다.

유전공학은 새로운 유전자를 선발된 개체에 삽입하여 원하는 형질을 얻는 방법이다. 교배와는 달리, 우수한 품종의 유전자형을 그대로 유지하면서 새로운 유전자를 첨가하는 것이다. 유전공학적 접근을 성공적으로 수행하기 위해서는 주어진 종으로의 효과적인 유전자 이식 시스템을 갖는 것이 선결조건이다. 식물의 형질전환 (유전자이식)을 위해서는 두 가지 방법이 있는데 : 생물학적 벡터를 이용하여 세포로 DNA를 전달하는 것으로 주로 토양 식물 병원체 세균인 아그로박테리움(Agrobacterium)을 통한 방법과, 식물 세포내로 DNA를 직접 전달하는 것으로 주로 미세립자 투사를 통한 방법등이 있다.

오늘날 가장 보편적으로 이용되고 있는 형질전환 기술은 토양 식물 병원체인 아그로박테리움을 이용하는 것으로, 이들 세균은 그들의 Ti(종양-유도성 ; Tumor-inducing) 또는 Ri(뿌리-유도성 ; root-inducing) 플라스미드의 DNA 단편을 감염된 식물 세포내로 전이시키는 능력을 지니고 있다. 그러나, 이 기술의 성공적인 적용은 아그로박테리움의 숙주 범위(host range)에 의존하며, 많은 경제적으로 유용한 작물은 아직 이 방법에 의한 형질전환이 되지않고 있다. 식물종이나 유전형에 관계 없이 유전자 이식이 가능한 방법을 개발하기 위한 노력의 일환으로, DNA를 식물 세포로 직접 전달하는 몇가지 기술이 연구되었으며, 이들은 전기충격에 의한 DNA 흡입(electroporation), 미세주사법(microinjection), PEG- 또는 리포좀-매개를 이용한 DNA 흡입, 탄화실리콘 휘스커스(silicon carbide whiskers) 및 미세립자 투사법 등이다. 또한 바이오리스틱스(biolistics) 또는 마이크로프로젝타일스(microprojectiles)로 알려져 있는 미세립자투사 기술은 작은 캐리어 입자들에 DNA를 코팅하고, 이 입자들을 물리적으로 식물 세포내로 투사시키는 것이다. 이러한 방법은 몇 가지 장점을 가지고 있다. 첫째, DNA를 도입하는 데에 세포벽의 제거가 필요하지 않다. 둘째, DNA를 분열조직 및 원괴체상구체와 같이 분화된 세포질내로 도입할 수 있다. 셋째, 특별한 생물학적 운반체의 조작이 필요하지 않다. 마지막으로, 세포막으로 DNA를 전이하는 데에 숙주세포와 생물학적 벡터의 결합 내지 상호 인식에 의존하지 않는다.

현재, 난초류의 번식과 육종은 종자 및 신초의 정단 분열조직에서 유도된 원괴체상구체의 배양에 의존한다. 저장 기관인 원괴체(protocorm)는 배아(embryo)로부터 형성되고, 정단분열조직(apical meristem)과 엽원기(leaf primodium)를 지니고 있다. 또한, 체세포(somatic) 원괴체로 알려진 원괴체상구체(protocorm-like body: PLB)는 정단 또는 측아분열조직(axillary bud meristem)의 시험관내(in vitro) 배양으로 유도되어 지며, 기능적으로나 구조적으로 배아의 원괴체와 유사하다. 그러한 분열조직은 입자 투사와 형질전환 식물의 재분화(recovery)에 적당하다. 이들 입자투사된 세포들이 아그로박테리움 형질전환(Klein 등의., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88, pages 8502-8505, 1988)과 유사한 방식으로 형질전환 되어질 수 있다는 것이 일부 일년생(herbaceous) 식물에서 증명되어 진바 있다. 대두의(soybean) 생식세포를 이 입자투사-매개 형질전환 기술(McCabe 등의., Bio/Technology, 6, pages 923-926, 1988)에 의해 형질전환 한 바 있으며, 미합중국 특허 제5,015,580호에 이 기술이 기재되어 있다. 또한, 미합중국 특허 제5,681,730호에도 미세립자 투사를 이용한 침엽수(gymnosperm)의 형질전환 기술이 기재되어 있다. 이 접근 방법의 장점은 그 신초를 일차 및 이차 분열조직으로부터 재분화의 어려움없이 직접적으로 발생시킬 수 있어 이것은 식물호르몬(phytohormone) 처리를 줄이고 체세포변이(somaclonal variation)를 최소화 시킬 수 있다.

미세립자투사법에 의한 형질전환 방법이 난초류 형질전환에 이용된 사례는 극히 제한 되어 있으며, 단지 두 개의 연구문헌만이 덴드로비움(Dendrobium)류의 난초 형질전환에 관하여 보고되어 있고, 상업적 가치가 높은 심비디움류에 있어서는 이 방법에의한 유전자 이식에 관한 보고는 없다. Kuehnle과 Sugii (Plant Cell Reports 11:484-488, 1992)는 형질전환된 덴드로비움을 얻은 바 있다. 그러나, GUS 와 같은 스크린 가능한 표식 유전자의 발현을 보여주지는 못하였으며, 형질전환된 식물이 키메릭(chimeric)인지 아닌지 확인하지 못했다. Chia등 (Plant Journal 6:441-446, 1994)은 입자투사 기술을 이용하여 덴드로비움 난초를 형질전환 한 바 있다. 그들은 항생물질적 선택방법 대신에, 도입된 반딧불의 형광물질을 만드는 유전자(luciferase)의 발현을 이용한 다른 선택방법을 개발하였다. 이 시스템은, 포토-카운팅 비디오 카메라 - 포토멀티플라이어 (photon-counting video camera - photomultiplier) 시스템과 고배율 분석용 현미경을 이용하여 발광 세포 군집의 선발과 분리를 한다. 전체 선발과 분리를 순수한 형질전환된 세포 라인이 분리될 때까지 반복한다. 그후 분리된 세포 라인에서 식물체를 재생시킨다. 이 방법은 고가의 장비가 필요하고, 시간-소모적인 형질전환 세포의 현미경 선발 및 난초류의 특징적인 느린 발육 생장 때문에 이 기술은 난초 개량을 위한 형질전환에는 실용적이지 못하다.

난초류는 실제로 형질전환에 있어서 다른 식물들과는 다른 몇가지 특징이 있다. 첫째로, 난초류 세포들은 증식속도가 낮다. 둘째로, 난초류 세포들은 조직배양에 있어 각종 조작에 잘 반응하지 않는다. 셋째로, 분리된 분화세포로부터의 식물 재발생이 난초류에서는 이루어지지 않는다. 넷째로, 난초류 세포들은 가나마이신과 같은 항생물질을 이용한 선발이 용이하지 않다. 난초는 통상 가나마이신(kanamycin)같은 아미노글리코사이드(aminoglycoside)계에 저항성이 높은 것으로 알려져 있으며, 형질전환 세포를 선발하기 위해서는 보통 500mg/L 이상의 가나마이신이 필요하다 (Chia 등, Plant Journal 6:441-446, 1994). 다섯째, 난초류 세포들에는 페놀산의 함량이 많으며 이들의 산화물은 세포들에 독이 된다. 마지막으로, 난초의 형질전환에 쓰이는 분열조직 (원괴체상구체)의 다중세포 구조 때문에, 야기된 형질전환 식물이 때로 형질전환 과 비-형질전환 부분을 지닌 키메라(chimera)가 될 수 있다. 입자투사가 가해진 분열조직으로부터 균일하게 형질전환된 개체를 수득하는 한 가지 방법은 처리된 세대(generation)를 자가수분시키고, 차세대 (F1) 및 차차세대 (F2)를 생산하고 이들로부터 첨가되어진 특성을 가진 개체를 선발하는 방법이 있다. 다른 하나는 DNA를 분화의 초기 단계 내 분열조직으로 삽입하고, 그런 후 항생물질적 선발을 하는 동안 계속되는 분열조직 발생을 자극하는 것이다. 전술한 방법을 난초의 형질전환에 적용한다는 것은 주로 긴 세대교번과 조직배양에서의 낮은 생장 때문에 한계가 있다. 그러므로, 어떠한 프로토콜(protocol)도 난초류, 특히 심비디움속의 유전공학 기술의 실제 이용에 유용하지 못하다.

따라서, 본 발명의 목적은 미세립자 투사법으로 난초류, 특히 심비디움속을 형질전환시키는 유효한 방법을 제공하는 것이다.

더욱 상세하게는 생성된 원괴체상구체를 형질전환시키기 위한 입자 투사전 내지 입자투사후 동안의 연속된 분열조직의 발생을 자극하는 방법을 제공하며, 이어서 형태발생(morphogenesis), 분화능이 있는 원괴체상구체를 형질전환시키는 방법을 제공하고, 난초개량을 가속화시킬 수 있는 난초류의 유전공학적 기술의 광범위한 적용 가능성을 지니는 방법(methodology)을 제공한다.

도 1은 입자 충격전에 원괴체상구체 증식에 대한 세가지 서로 다른 배양 기술의 영향을 나타낸 것이다.

도 2는 유전자 운반체 pKH200의 T-DNA 영역의 개략도이다. GUS-INT 유전자와 NPTⅡ유전자 관련 부위가 담배 기질접속부위(Matrix Attachment Regions) DNA 들의 사이에 위치하게 된다.

도 3은 미세립자 투사후에 원괴체상구체 증식에 대한 두 가지 배양 방법의 영향을 나타내는 챠트이다.

도 4는 세 가지 형질전환된 난초 라인(line)에서 표식 유전자(GUS)의 장기간 안정된 발현을 나타내는 그림이다.

도 5는 두 개의 형질전환된 난초 라인으로 부터 도입된 적절한 표지 유전자(NPTⅡ)의 PCR (Polymerase chain reaction) 증폭된 단편을 나타낸 것이다.

본 발명은 유전공학적으로 조작한 난초류를 식물체에서 발현가능한 유전자 운반체를 이용하여 생산함에 있어서,

1) 1차 원괴체상구체를 액체배지에서 배양하여 2차 원괴체상구체를 유도하고;

2) 미세입자투사를 위한 표적 표면에 1차 및 2차 원괴체상구체 모두를 포함하는 원괴체상구체를 두고;

3) 원괴체상구체의 세포보다 훨씬 작은 미세입자들에 물리적으로 가속을 가하여 투사하며, 이 미세입자들은 최소한 목적으로하는 외부 유전자와 선택가능한 표지 유전자 하나를 포함하는 외래 유전자 벡터들을 전달하며 ;

4) 액체 배지에서 신초를 형성할 수 있는 원괴체상구체들을 형성하기 위해 투사된 원괴체상구체의 증식을 유도하고, 이 증식된 원괴체상구체들로부터 형질전환되어 목적하는 유전자가 발현되는 개체를 선발하기 위해 선발 물질을 함유하는 배지에서 원괴체상구체를 배양하고 ; 그리고

5) 그후 생성된 신초를 클론의 형질전환된 난초류로 재발생시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 유전자 재조합으로 제조된 난초류의 제조방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 방법은 형질전환된 난초 세포를 포함하는 형질전환된 난초 식물을 생산하기 위해 이용되어질 수 있고, 이 형질전환된 난초 세포는 발현 카세트(cassette)를 구성하는 헤테로로거스(heterologous) DNA 운반체 (또는 벡터)를 함유하는데, 그 구조는 5'에서 3' 방향으로, 전사개시 영역 및 상기 언급한 전사개시 영역으로부터 하부쪽이면서 그의 전사조절 영역 아래에 위치한 펩타이드 코딩 영역을 포함한다. 난초류의 유전공학 기술은 원괴체상구체를 미세입자로 전달된 DNA를 가지고 형질전환시킨 다음 형질전환체를 선발하는 입자투사-매개 식물 형질전환 기술의 이용을 통해 달성할 수 있다. 여기에 기재된 배양기술은 입자투사가 가해진 비교적 많은 수의 분열조직 세포들의 재생을 이용하고, 투사된 분열조직의 연속적인 발생을 자극하여, 그 결과로 안정된 형질전환 빈도를 증가시키는 것이다. 투사된 분열조직을 증식시키고 도입된 유전자가 발현되고 있는 원괴체구상구체들을 선발한다. 그후 신초 재발생을 분열조직으로부터 유도하고 형질전환된 묘목을 생산한다. 본 발명을 수행하는 데에 바람직한 식물은 심비디움 속이다.

본 발명의 목적, 장점 및 특성은 이하 명세서와 도면을 통해 더욱 명백할 것이다.

본 발명에 따라 식물 조직의 입자투사-매개 형질전환의 일반적 접근은 조직배양내의 난초류에 성공적으로 적용할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이 방법을 이용하여 형질전환된 심비디움 난초류를 개발할 수 있었다. 본 발명에 이용된 기술은 다른 난초류에서도 또한 동일하게 적용될 수 있기 때문에, 이제는 유전공학적으로 난초류의 질병에 대한 저항성, 개화시기의 조작, 꽃의 색깔과 형태의 조작 및 다른 원예적 가치가 있는 형질전환된 난초식물의 개발이 가능해진다. 이 방법은 모든 난초류와 특히 심비디움 난초류에 적용가능하다.

본 발명에 사용되는 난초라는 용어는 종자식물문(Spermatophyta) 내의 난초목(Orchidales)에 관한 것이다. 본 발명의 실시에 이용되는 난초류의 예를 들면, 아시안터스(Acianthus), 에어라이드스(Aerides), 에노엑토실러스(Anoectochilus), 안셀리아(Ansellia), 아플렉트럼(Aplectrum), 아레터사(Arethusa), 칼란테(Calanthe), 케틀레야(Cattleya), 코엘로자인(Coelogyne), 코렐로이자(Corallorhiza), 심비디움(Cymbidium), 시프리페디움(Cypripedium), 크리토포디움(Crytopodium), 덴드로비움(Dendrobium), 에피덴드럼(Epidendrum), 구우디에라(Goodyera), 리스테라(Listera), 마코드스(Macodes), 온시디움(Oncidium), 팔라에높시스(Phalaenopsis), 폴리도타(Pholidota), 린코스타일리스(Rhynchostylis) 및 반다(Vanda) 속을 포함하는 난초과(Orchidaceae)이다. 본 발명의 실시를 위해서는 심비디움이 바람직하다.

여기에 기재된 방법은 난초 식물의 염색체내로 외래 유전자들을 도입하는 것에 관한 것이다. 그러한 외래 유전자들은 다른 유기조직 즉, 동일하거나 다른 종으로부터 유래된 DNA 가 바람직하고, 이를 인위적인 조작을 통해 난초 세포로 도입시킨다. 외래 유전자들은 보통 그 생성물이 난초 세포의 전사 생성물 또는 관심있는 단백질을 합성할 수 있는 염기서열을 포함한다.

DNA 운반체 (Construct)는 전형적으로 단백질의 발현을 야기시키는 데에 효과적인 측면 조절 서열(flanking regulatory sequence)을 포함한다. 측면 조절 서열의 예로는 식물세포에서 전사(transcription)를 개시하기에 충분한 프로모우터, 그리고 전사 또는 전위(translation)의 종료에 의한 유전자 생성물을 종료하기에 충분한 터미네이터 및/또는 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 서열이 있다. 또한 유전자 발현, 특히 단백질 생성물의 발현의 효율을 돕기 위해서 프로모우터 주위에 전사에 번역 증진부위(enhancer)를 포함시키는 것도 가능하다. 이 모든 조절 영역들로 형질전환된 세포내에서 유전자를 항상(Constitutively) 발현시키거나 , 조직-특이적 혹은 특정요소에 의한 유도 방식으로 발현시키는 조작이 가능하다.

DNA 구조체는 임의적으로 크로마틴(chromatin) 조직에 함유된 측면 DNA 서열을 포함할 수도 있다. 그러한 DNA 서열의 예로는, 기질 부착 영역(matrix attachment region)(Spiker 와 Thompson, Plant Physiol.110:15-21, 1996), 형질전환 부스터(booster) 서열(Meyer 등의., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8568-8572, 1988)이 있다. 형질전환 부스터 서열의 이용은 바이오리스틱스(biolistics)를 이용한 형질전환 빈도수를 몇 배 증가시킨 결과를 나타내었다(Buising 과 Benbow, Mol. Gen. Genet. 243:71-81, 1994). 측면 기질 부착 영역의 이용은 포플러(poplar)에 도입된 유전자의 발현을 촉진하였다(Han 등의., Transgenic Research 6, 415-420, 1997).

난초류에 다양한 유전자들이 이용될 수 있다. 표현형적 특징 중에는 질병에 대한 저항성을 제공하는 효소, 개화시기의 조작, 식물 색깔과 형태의 조절, 식물 향기(aroma)의 조절, 식물의 생장 및 형태변이 및 그와 같은 것이 있다. 유전자는 원핵생물 또는 진핵생물, 박테리아, 곰팡이, 효모, 바이러스, 식물 및 포유동물 또는 그의 전체 혹은 일부분에서 합성된 것들로부터 수득할 수 있다.

보통 식물체에 사용되는 발현플라스미드 (expression plasmid)는 1종 이상의 카세트(cassette)가 포함되어 있는데, 그 생성물은 독립적으로 혹은 결합하여 작용할 수 있다. 다양한 카세트가 이용될 시, 동일한 플라스미드 또는 다른 플라스미드에서 할 수 있다. 다른 플라스미드에 카세트가 존재할 시, 이 플라스미드는 동일한 미세입자(microprojectile)에 의해 수행되어지거나, 또는 다른 미세입자에 의해 수행되어지기도 하며, 그리고 이들 미세입자들은 서로 혼합하여 표적조직에 투사되어지도록 한다.

발현 카세트는 전사 개시 영역, 개시 코돈(codon), 유전자의 코딩 서열, 전사적 터미네이션 영역에 뒤따르는 전위 정지 코돈을 포함하도록 조작될 수 있다. 그 방향성(direction)은 전사 방향인 5'-3'이다. 카세트는 보통 그 길이가 약 10 킬로베이스(kb) 이하이며, 종종 약 6 kb 이하로서 최소한의 길이는 보통 약 1kb 이다. 발현 카세트는 또한 적어도 1회의 복제(replication) 시스템을 지니는 DNA 운반체에 제공되어 진다. 편의상, 대장균(Escherichia coli)에서 기능적 복제 시스템을 지니는 것이 일반적이다.

이 방법에서 각각의 조작 후의 단계는, 야기된 운반체 (Construct)를 클론하여 염기서열결정등을 통해 조작의 정확성(correctness)을 확인한다. 추가로, 대장균(E. coli) 복제 시스템에서는 광범위한 숙주 범위 복제 시스템이 이용될 수 있다. 추가로 복제 시스템에 , 종종 적어도 1개의 표지유전자가 존재하여 1종 이상의 숙주에 유용하게 이용되거나, 개개의 숙주에 서로 다른 표지유전자들이 이용되기도 한다. 즉, 한 개의 표지유전자는 원핵생물적 숙주에서의 선발에 이용되며, 반면 다른 표지유전자는 진핵생물적 숙주, 특히 난초 숙주에서의 선발에 이용되어진다. 표지유전자들은 항생물질, 독소, 중금속 또는 그와 같은 바이오사이드(biocide)에 대해 내성을 부여하며, 형질전한 식물에서 새로운 화합물의 생성을 통한 가시적 표현형(phenotype)을 제공한다. 이용되어진 실례의 유전자는 네오마이신 포스포트랜스퍼레이즈(neomycin phosphotransferase ; NPTⅡ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼레이즈(hygromycin phosphotransferase ; HPT), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼레이즈(chloramphenicol acetyltransferase ; CAT), 니트릴레이즈(nitrilase) 및 겐타마이신(gentamicin) 저항성 유전자를 포함한다.

식물체 선발에 적절한 표지유전자의 예로는 인디고(indigo) 생성을 제공하는 베타-글루쿠로니데이즈(beta-glucuronidase), 가시적 빛의 생성을 제공하는 루시퍼레이즈(luciferase), 가나마이신 저항성(kanamycin) 또는 G418 저항성을 제공하는 NPTⅡ, 하이그로마이신 저항성을 제공하는 HPT 및 글리포세이트(glyphosate) 저항성을 제공하는 돌연변이된 aroA 유전자가 있다. 다양한 DNA 운반체 (Construct), 발현 카세트, 표지유전자 및 그와같은 것들을 포함하는 다양한 단편들을 적당한 제한효소에 의한 절단, 그리고 이용가능한 부위로 특정한 운반체 혹은 단편의 삽입에 의해 연속적으로 도입시킨다. 라이게이션과 클로닝을 한 후, DNA 운반체는 이후의 조작을 위해 분리되어진다. 이러한 모든 기술들은 문헌에 상세히 예시화되어 있고, Sambrook 등의., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1987 에 특정 예시화가 되어 있다.

캐리어 입자들을 식물 세포로 도입하기 위한 몇가지 기구 또는 장치들이 당 분야에 통상의 지식을 가진 자들에게 알려져 있다. 바이오리스틱(Biolistic) 세포 형질전환 장치가 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 장치의 예가 바이오리스틱스 입자-가속화 기구(모델 Biolistic PDS-1000/He)로 알려진 기구로 현재 Bio-Rad Laboratories, 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547 (전화번호 510-741-1000)로부터 이용 가능하다. 그 장치는 높이 조절이 가능한 정지판에 의해 두 개의 분리된 구획으로 나뉘어 지는 입자투사 챔버(chamber)를 지니고 있다. 최상단에 가압판을 설치한고 미세립자가 코팅된 판이 가압된 헬륨에 의해 정지판으로 신속히 추진된다. 정지판에 미세립자가 전달되면, 미세립자가 코팅된 판이 정지하고 미세립자만 표적판으로 발사된다. 미세립자가 표적판에 있는 세포의 세포벽을 관통하여 DNA 운반체들을 표적조직의 세포안으로 옮겨놓는다. 미세립자는 금속, 유리, 실리카, 얼음, 폴리에틸렌, 폴리프로필린, 폴리카보네이트 및 카본 화합물(예를 들면, 흑연, 다이아몬드)을 포함한다. 현재로는 금속 입자가 바람직하다. 적절한 금속의 예에는 제한이 없으며 텅스텐, 금 및 이리디움(iridium)을 포함한다. 공기의 유입으로 마이크로프로젝타일의 추진력이 과도하게 저하시키는 것을 방지하기위해 이용되기 전에 입자투사 챔버를 부분적으로 진공으로 만든다. 챔버는 표적 조직이 그들의 입자투사동안 분리되어지지 않도록 부분적인 진공을 가한다. 400∼800mmHg 사이의 진공이 적당하다.

신초의 다음 재발생이 가능한 표적 조직이 본 발명의 실시를 위해 이용되어 진다. 특정 조직의 선택은 이용가능한 클론적 증식(propagation) 시스템에 따라 다양해지고, 가장 적합한 특정 종이 형질전환된다. 표적 조직의 예로는 배아, 캘러스 조직, 줄기, 존재하는 분열조직(예를 들면, 정단분열조직 및 뿌리 분열조직) 및 유도된 분열조직(예를 들면, 원괴체, 원괴체상구체)을 포함한다. 바람직하게는 분열조직(존재 내지 유도된 것 모두)으로 구성된 종류에서 선택된 조직과 분열조직으로의 유도가 가능한 조직이다. 더욱 바람직하게는 원괴체상구체이다. 미세립자들이 1종이상의 세포로 도입되어 형질전환되어지도록 투사를 표적조직으로 향하게 한다.

본 발명의 실시를 위해 바람직한 클론적 증식 방법은 하기 기재된 방법이다. 이 방법은 몇 가지 스텝으로 구성되어 있는데; 1)원하는 정단 분열조직에서 원괴체상구체의 형성을 유도하기에 충분한 시간동안 고체 원괴체상구체 유도 배지에 처리하고; 2) 처리된 조직을 분열조직의 연속된 발생을 자극하기 위해 액체 원괴체상구체 증식 배지로 옮기며; 3)원괴체상구체들을 신초의 형성을 유도하기에 충분한 시간동안 신초 재발생 배지에 처리하고; 4) 처리된 신초들은 뿌리가 자랄때까지 영양배지로 옮긴다. 이러한 방법으로 형질전환된 식물체(propagule)의 생성을 야기하고 토양에서 완전한 식물체로 자라게 한다.

상기 기재된 조직 배양 시스템은 입자투사될 조직에서 더 많은 수의 세포들을 형질전환이 잘되는 세포분열 사이클의 특정 페이스내에 존재하게 하여 형질전환빈도를 높이는 방법을 제공하게 된다. 그러므로, 조직내에서 이 페이스(phase)에 있는 더 많은 부분의 세포들에 충격이 가해질수록, 충격을 받은 조직내에서 안정한 발현을 수득할 가능성도 높아지게 된다. 표적조직의 첫 번째와 두 번째 피하(sub-epidermal) 세포들로 표면 분열조직의 형성을 유도하기에 충분한 최소한의 시간동안 액체 원괴체상구체 증식 배지에서 처리한 후 DNA 구조체로 바람직하게 입자투사를 한다. 또한, 조직을 신초를 생성하기 위한 신초 재발생 배지로 전이하기 전에 DNA 운반체로 투사를 한다.

세포로 전달된 작은 캐리어 입자들로 코팅된 DNA는 투사된 세포의 어느 부분의 게놈 DNA로 들어간다. 적절한 선발을 한 후, 일반적으로 전체 조직 또는 유기체들을 형질전환된 세포로부터 재발생시킨다. 형질전환된 식물을 수득하기 위해 식물 조직의 입자투사-매개 형질전환의 일반적 과정을 적용하는 데에는, 형질전환된 세포와 비형질전환된 세포를 모두 함유하는 키메릭(chimeric) 형질전환 식물체의 재발생을 피하게 하는 것이 중요하다. 분열조직과 같은 분화된 조직내로 유전자를 투사함으로써 비키메릭(non-chimeric) 형질전환 식물을 수득하는 것이 일반적으로 중요하며, 이어서 묘목으로 직접 재발생될 수 있다는 것이 미합중국 특허 제5,015,580호에 기재되어 있다. 본 발명은 입자 투사전에 액체 배지에서 원괴체상구체를 배양함으로써 분열조직의 연속된 발생을 자극하고, 입자투사 후에도 분열조직을 증식하게 하는 것이다. 또한 본 발명은 액체 및 고체 배지의 조합으로 투사된 분열조직의 배양에 의해 안정하게 형질전환된 난초식물을 수득할 수 있는 것이다.

우수한 선발유전자의 이용은 형질전환 방법에서 필수적 부분이다. 형질전환 세포의 효과적인 선발에 중요한 요인들은 선발가능한 표지유전자의 타입, 발현 수준 및 형질전환 후 선발 시점과 효력이다 (Angenon등의., 리뷰를 보면, Angenon, 등의., in Plant Molecular Biology Manual C1: 1-13, Kluwer Academic Publishers, Boston, Gelvin and Schilperoort, Eds, 1994). 표지유전자들은 항생물질, 대사길항물질 및 살충제 저항성을 암호화하는 유전자를 유용하게 포함하고, 아미노산 또는 동족체(analog)의 독성 수준에 대한 저항성을 부여하게 된다. 네오마이신 포스포트랜스퍼레이즈 Ⅱ(NPTⅡ)는 식물의 형질전환을 위한 선발가능한 표지유전자로 가장 널리 이용되고 있다. 선발가능한 표지유전자에 대한 식물세포의 민감도는 생리학적 상태, 식물의 크기 및 타입과 같은 표현형과 조직 배양상태에 의존한다. 그러므로, 비형질전환된 세포의 생장을 완전히 저해할 수 있는 선발 작용제의 최소 수준을 각각의 형질전환 및 재발생 시스템을 위해 결정한다. 가나마이신은 일반적으로 50∼200 mg/L 의 농도에서 이용된다. 인접한 형질전환된 세포에 사멸한 세포의 독성을 최소화하는 반면 비형질전환된 세포의 생장을 효율적으로 억제하는 선발 작용제로서, 투사된 세포의 생장을 확실히 하기에 충분한 기간을 둔다.

반대로, 스크리닝이 가능한 표지 유전자는 검색 및 형질전환된 조직을 스크리닝하기 쉬운 생성물을 암호화하는 유전자이다. 유용하게 스크리닝가능한 표지유전자는 GUS 또는 종래의 칼라로메트릭 에세이 시스템(colorometric assay system)에 이용되어지기 위한 베타-글루쿠로니데이즈(β-glucuronidase) 유전자이다. 일반적으로, GUS 유전자를 함유하는 인트론의 이용은 그 인트론을 지닌 유전자가 다른 오염된 미생물이 아닌 오로지 진핵(식물같은)세포에서만 발현되기 때문에 바람직하다. GUS 발현은 입자-매개의 형질전환에 뒤따르는 일시적 유전자 발현과 선발후 재발생 뒤에 사실상 모든 식물 조직으로부터의 안정된 유전자 발현 모두를 관찰할 수 있다. 일단 식물 또는 묘목이 형질전환된 것으로 보이면, 그 식물체를 육성한다. 그러한 형질전환된 식물은 세포 및 조직 배양의 이용에 의해 반복적으로 재발생시킬 수 있다.

다음 실시예는 본 발명의 더 좋은 이해를 위해 기술되어진 것으로 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 다음 특정 실시예들에서 사용된 중요 용어의 설명은 다음과 같은데 : 분열조직(meristem) - 새로운 세포가 발생되어져 이로부터 분화되지 않은 식물조직 ; 원괴체(protocorm) - 정단분열조직과 잎 원기(primordium)를 함유한 배아로부터 유도된 작은 저장기관 ; 원괴체상구체(protocorm like body ; PLB) - 무성 조직으로부터 유도된 조직 구조이며, 원괴체와 닮았다 ; 1차 원괴체상구체 - 정단 분열조직 끝을 무균적으로 배양하여 유도된 원괴체상구체 ; 2차 원괴체상구체 - 배양에서 1차 원괴체상구체의 표면에 형성된 원괴체상구체 ; 증식적 원괴체상구체 - 1차 및 2차 원괴체상구체를 포함하는 원괴체상구체 이식의 표면에서 증식하는 원괴체상구체이다.

(실시예 1) 입자충격을 위한 심비디움 원괴체상구체의 제조

심비디움 난초의 분열조직 정단부위를 멸균상태에서 분리하고 Paek등의., Proc. NIOC, Nagoya, Japan (1997)에 기재된 바와 같이 원괴체를 형성하기 위해 유도한다. 유도된 원괴체에서 12개월 미만의 어린 1차 원괴체상구체를 5%의 수크로즈, 2mg/L의 알파-나프탈렌 아세트산, 0.1%의 목탄(charcoal) 및 0.7%의 한천(pH 5.4)이 첨가된 누드슨 난초 배지(Knudson Orchid medium ; Duchefa Biochmie BV, Izaak Enchedeweg 40, 2031 CS Haarlem, The Netherlands)에서 유도하고 유지시킨다. 입자충격을 가하기 전에, 원괴체상구체를 7∼10일동안 저속도 교반기(50∼100rpm)를 이용하여 액상배지에서 배양하고, 그후 표적 표면으로서 작용되어질 60mm 페트리 디쉬내에 5%의 수크로즈와 0.7%의 한천이 첨가된 누드슨 난초 배지상의 1~2 cm의 원안에 옮겨둔다. 대조군(충격을 가하지 않은 조직)을 유사하게 플레이트한다. 모든 식물물질의 인큐베이션은 백열등을 이용하여 25∼45 uE/m sup 2초 하에서 16시간의 일조시간으로 25±2℃에서 실시한다.

(실시예 2) 입자충격 전에 원괴체상구체 증식에서 액상 배양의 영향 측정

식물호르몬(phytohormone)없이 3%의 수크로즈를 지닌 배지에서 Murashige 와 Skoog(MS), 15 Physiologia Plantarum 31(1962)을 이용한 세가지 다른 배양; 교반을 통한 액체 배양, 고정 액체 배양 및 고체 배양이 입자 충격전에 2차 원괴체상구체를 형성하기 위한 1차 원괴체상구체를 유도하기 위해 이용되어 진다. 고체 배양에서는, 40개의 원괴체상구체를 0.7%의 한천이 첨가된 25ml MS 배지를 함유한 90mm 페트리 디쉬에서 배양한다. 액체 배양에서는, 40개의 원괴체상구체를 50ml MS 액상 배지를 함유한 250ml 얼리메이서-플라스크(Earlymeyer-flask)에서 50-100 rpm으로 교반 또는 교반 없이 배양한다. 대조군(충격을 가하지 않은 조직)을 유사하게 배양한다. 배양된 원괴체상구체를 2차 원괴체상구체의 생성을 위해 측량한다.

도 1은 이 과정으로부터 수득된 데이타를 나타낸 것이다. y축은 증식(원괴체상구체 대비 증식된 원괴체상구체의 수)의 비율을 나타낸 것이고, x축은 입자충격전에 배양한 날을 나타낸 것이다. 저속도로 교반한 액체 배양이 가장 높은 원괴체상구체의 증식을 야기하였다.

(실시예 3) 유전자 발현 벡터

본 실시예에 사용된 식물 유전자 발현 벡터는 pKH200이고, 도 2와 Han 등의., Transgenic Research, 1997에 개시되어 있다. 이 벡터는 식물세포내 발현가능한 두 개의 다른 유전자를 위한 두 개의 다른 식물 발현 카세트를 포함하고, 항생물질 저항성 표지유전자(가나마이신 저항성)가 추가되어져 박테리아 숙주에 이용되게 된다. 식물 유전자 발현 카세트중의 하나는 항생물질 가나마이신에 대한 저항성을 나타내는 유전자 NPT-Ⅱ를 함유한다. 가나마이신은 몇가지 식물 종에서 선발가능한 표지물질로서의 유용성을 제공한다. NPT-Ⅱ 발현 카세트는 노파린(nopaline) 신테이즈 프로모우터와 코딩 서열 측면의 옥토핀(octopine) 신테이즈 폴리아데닐레이션 서열을 포함한다. 두 번째 발현 카세트는 베타-글루쿠로니데이즈 효소 또는 GUS를 암호화하고, 그 발현이 종래의 조직화학적(histochemical) 분석방법에 의해 검색될 수 있는 스크리닝 가능한 마아커로서 이용된다. GUS 유전자는 3'에 컬리플라워(Cauliflower) 모자이크 바이러스 35s 프로모우터(CaMV35s)와 5'에 노파린 신테이즈 폴리아데닐레이션 영역을 지닌다. 두 개의 발현 카세트는 담배의 게놈 클론으로부터 얻은 매트릭스 접근 영역(matrix attachment region ; MAR) 단편의 측면에 있다(Hall 등의., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991).

(실시예 4) 마이크로프로젝타일 입자투사의 조건

실제 입자 가속 방법이 사용되는 수치들은 모델 바이오리스틱 PDS-1000/He (Bio-Rad Laboratories, 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)의 이용에 기초하여 조작자에 의해 제공된 매뉴얼에 기재된 대로 계산한다. 정지판, 헬륨가속판 및 미세립자일들을 바이오-라드 레보러토리즈(Bio-Rad Laboratories)에 의해 공급받는다. 플라스미드 DNA를 Klein등의., 327 Nature 70 (1987)에 기재된 바와 같이, 미세립자 존재하에 침전시킨다. 미세립자는 지름이 약 0.6μm인 금(gold) 입자로부터 제조한다. 각 충격은 6μl 부피내에 0.42μg의 플라스미드 DNA로 연합된 약 500μg의 입자들을 분출한다. 입자투사 챔버는 28 인치의 수은주 압력으로 진공을 만든다. 모든 입자투사는 정지판에서 표적 조직의 표면까지 약 60mm 범위, 1,100∼1,550 psi의 범위내에 헬륨으로 압력을 가하여 수행한다.

(실시예 5) 입자투사 후 조직배양

입자투사 후에 조직배양은 두 페이스(phase), 증식적 원괴체상구체 유도와 선택 배양으로 나누어 지는데 ; 1)증식적 원괴체상구체 유도 - 1/2배 강도의 Murashige 와 Skoog, Physiologia Plantarum, 1962, 증식적 원괴체상구체 발생을 촉진하기 위해 식물호르몬(phytohormone)이 없으며 3%의 수크로즈를 첨가한 배지에 두(액체 대비 고체) 배양 기술을 이용한다. 고체 배양에서는, 40개의 충격이 가해진 원괴체상구체들을 0.7% 한천이 첨가된 25ml MS 배지가 함유된 90mm 페트리 디쉬에 플레이트한다. 고체 배양에서는, 40개의 투사된 원괴체상구체들을 50ml MS 액체배지가 함유된 250ml 얼리메이어 플라스크에서 교반(50-100 rpm) 또는 교반 없이 배양한다. 배양된 원괴체상구체들을 증식적 원괴체상구체의 생산을 위해 측량한다. 표 1은 이 실험의 결과를 나타낸다. 저속도로 교반한 액체 배양이 고체 배양보다 더욱 연속된 원괴체상구체들의 발생을 자극하게 된다. 액체 배양동안 가나마이신 선택을 이용하지 않는다. 배양기술은 증식적 원괴체상구체들의 생성을 측량하게 된다. 2)선택적 배양 - 표면에 다수의 증식적 원괴체상구체들을 지닌 40개의 이차 원괴체상구체들을 0.7% 한천과 100-200 mg/L의 가나마이신이 보충된 25ml MS 배지가 함유된 90mm 페트리 디쉬로 옮긴다. 배양을 신선한 배지로 일주일마다 계대양하여 유지한다. 배양실 상태는 실시예 1에서 사용한 것과 동일하다.

입자충격을 가한 후 원괴체상구체 증식에 대한 두 가지 다른 배양(액체 대비 고체)의 영향

배양방법¹	원괴체상구체 증식 비율²
액체	7.72 + 0.44
고체	4.20 + 0.14

¹액체배양 : 40개의 투사된 원괴체상구체들을 25ml 1.5배 강도의 Murashige 와 Skoog(MS) 배지, Physiologia Plantarum 31 (1962), 0.7% 한천, 3%의 수크로즈가 첨가된 배지 및 증식적 원괴체상구체 발생을 촉진하기 위해 식물호르몬 없는 배지가 함유된 90mm 페트리 디쉬에 플레이트한다. 액체배양을 위해서는, 40개의 충격에 가해진 원괴체상구체들을 50ml MS 액체배지가 함유된 250ml 얼리메이어 플라스크에서 교반(50-100 rpm) 또는 교반 없이 배양한다.

²배양된 원괴체상구체들을 증식적 원괴체상구체들의 생성을 위해 측량한다. 증식율을 생성된 전체 원괴체상구체 수를 초기 원괴체상구체 수로 나누어 계산한다. 데이터는 세 개의 독립된 실험으로부터 수집하였다.

(실시예 6) GUS 활성을 위한 입자충격되어진 조직의 에세이

원괴체상구체들의 집합을 베타-글루쿠로니데이즈(GUS) 활성율을 측정하기 위하여 시간의 변화에 따라 샘플링한다. 원괴체상구체들을 기질 용액에서 배양하는데, 2.0mM 5-브로모-4-클로로-3-인도일-베타-D-글루쿠로닉 산( 5-bromo-4-chloro -3-indoyl-beta- D-glucuronic acid ; X-gluc), 0.1M NaPO₄sub 4 버퍼, pH 7.0, 0.01M Na sub 2 EDTA, pH 7.0, 0.5 mM K sub 4 Fe(CN) sub 6 3H sub 2 O, pH 7.0 및 0.5 mM K sub 3 Fe(CN) sub 6 과 0.1% 트리톤(Triton) X-100이 함유된 기질용액을 37℃에서 18시간동안 배양한다. 원괴체상구체가 있는 GUS 포사이(foci)를 분석용 입체현미경 하에서 그 수를 확인한다.

도 3은 일시적인 GUS 발현을 위한 분석에서 입자투사된 원괴체상구체의 분석을 반복적으로 수행한 결과를 도표로 나타낸 것이다.

(실시예 7) 형질전환된 원괴체상구체의 선발과 분석

일시적 활성으로부터 비교적 덜 안정한 융합의 결과를 스크린하기 위해, 가나마이신 선발을 이용한다. 실시예 5에 기재된 바와 같이 액체배지에서 10∼45일간 배양된 원괴체상구체를 0.7%의 한천과 형질전환된 원괴체상구체를 선발하기위한 100∼200 mg/L의 가나마이신이 첨가된 것만 제외하고는 동일한 배지로 옮긴다. 가나마이신에 배양한 것을 가나마이신 독성이 완화되어 벗어난 것들의 수를 최소화하기 위해 일주일마다 신선한 배지로 계대배양한다. 형질전환된 원괴체상구체는 그들의 가나마이신 배지에서 생장할 수 있는 능력 때문에 초기에 확인되어 진다. 이어서, 안정한 융합과 발현을 각각 PCR 분석과 GUS 발현 분석에 의해 확인한다. 실제로 수백개의 원괴체상구체가 연속적인 원괴체상구체 증식을 통해 생성된다. 160개 이상의 그러한 원괴체상구체는 가나마이신 선발에서 생존하였다. 92개 이상의 가나마이신 저항성 식물체를 원괴체상구체로부터 수득하였다. 이들중 52개를 선택하여 GUS 분석을 한 결과, 36개가 GUS 유전자를 발현하였다. 도 3은 투사된 원괴체상구체로부터의 GUS 발현을 나타낸다. 본질적으로, 도입된 외부 유전자의 장기간에 걸친 안정한 발현이 이루어 짐을 확인하였다. 다른 식물들에서 과거 경험에 기초하여, 삽입된 유전자는 일반적으로 다음 세대에는 정상적으로 분리되고, 멘델 유전법칙을 통해 유전된다. 일반적으로, 그 과정은 전체 난초식물에서 발생가능한 형질전환된 원괴체상구체를 재생성할 수 있다.

본 발명의 효과는 미세입자 투사법으로 난초류, 특히 심비디움속을 형질전환시키는 유효한 방법을 제공하는 것이다. 더욱 상세하게는 생성된 원괴체상구체를 형질전환시키기 위한 입자 투사전 내지 투사후의 연속된 분열조직의 발생을 자극하는 방법을 제공하며, 이어서 형태발생(morphogenesis)을 수행하는 조직을 지닌 원괴체상구체를 형질전환시키는 방법을 제공하고, 난초개량을 가속화시킬 수 있는 난초류의 유전공학적 기술의 광범위한 적용가능성을 지니는 방법(methodology)을 제공한다.

Claims

유전공학적으로 조작한 난초류의 제조방법에 있어서, 이 형질전환된 난초 세포는 발현 카세트(cassette)로 구성된 DNA 구조체를 함유하며, 그 구조는 5'에서 3' 방향으로, 전사개시 영역 및 상기 전사개시 영역으로부터 하부쪽이면서 그의 전사조절 영역 아래에 위치한 펩타이드 코딩 영역을 포함하는 것으로,

1) 2차 원괴체상구체를 유도하기 위해 액체배지에서 난초의 1차 원괴체상구체를 배양시키고 ;

2) 표적 표면에 1차 및 2차 원괴체상구체 모두를 포함하는 원괴체상구체를 두고 ;

3) 원괴체상구체에 미세립자를 물리적으로 가속을 가하고, 미세립자는 최소한 관심있는 외부 유전자와 선발가능한 표지 유전자중 하나를 포함하는 외부 유전자 구조체의 카피들을 전달하며 ;

4) 액체 배지에서 신초를 형성할 수 있는 증식적 원괴체상구체를 형성하기 위해 투사된 원괴체상구체를 유도하는데, 유도의 과정동안 전체적으로 형질전환되어 있으며 관심있는 유전자가 발현되는 원괴체상구체를 선발하기 위해 저항성을 제공하는 선발유전자의 선발 물질을 함유하는 배지에서 원괴체상구체를 배양하고 ; 그리고

5) 그후 생성된 신초를 클론의 형질전환된 난초류로 재발생시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 형질전환 난초류 (Transgenic Orchids)의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 난초 세포는 아시안터스(Acianthus)속, 에어라이드스(Aerides)속, 에노엑토실러스(Anoectochilus)속, 안셀리아(Ansellia)속, 아플렉트럼(Aplectrum)속, 아레터사(Arethusa)속, 칼란테(Calanthe)속, 케틀레야(Cattleya)속, 코엘로자인(Coelogyne)속, 코렐로이자(Corallorhiza)속, 심비디움(Cymbidium)속, 시프리페디움(Cypripedium)속, 크리토포디움(Crytopodium)속, 덴드로비움(Dendrobium)속, 에피덴드럼(Epidendrum)속, 구우디에라(Goodyera)속, 리스테라(Listera)속, 마코드스(Macodes)속, 온시디움(Oncidium)속, 팔라에높시스(Phalaenopsis)속, 폴리도타(Pholidota)속, 린코스타일리스(Rhynchostylis)속 및 반다(Vanda) 속으로 구성된 류에서 선택됨을 특징으로 하는 형질전환 난초류 (transgenic orchids)의 제조방법
제 2항에 있어서, 상기 난초류는 심비디움(Cymbidium)속임을 특징으로 하는 형질전환 난초류의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 원괴체상구체는 분열조직을 포함하고, 분열조직으로의 유도 및 식물 또는 묘목으로의 재발생이 가능한 조직임을 특징으로 하는 형질전환 난초류의 제조방법
제 4항에 있어서, 일차 원괴체상구체는 난초의 정단 분열조직으로부터 유도된 분열조직을 포함하고, 이차 원괴체상구체로의 유도 및 식물 또는 묘목으로의 재발생이 가능한 조직이고, 이차 원괴체상구체는 난초의 1차 원괴체상구체로부터 유도된 분열조직을 포함하고, 증식적 원괴체상구체로의 유도및 식물 또는 묘목으로의 재발생이 가능한 조직임을 특징으로 하는 형질전환 난초류의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 증식적 원괴체상구체는 난초의 1차 및 2차 원괴체상구체 모두를 포함하는 원괴체상구체 이식으로부터 유도된 분열조직을 포함하고, 식물 또는 묘목으로의 재발생이 가능한 조직임을 특징으로 하는 형질전환 난초류의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 외부 유전자 구조체는 플라스미드를 포함하거나, 스크린 가능한 표식 유전자를 포함하여 그의 발현이 원괴체상구체에서 검색 가능하며, 선발으로 생존한 형질전환 원괴체상구체의 특성으로 확인 가능함을 특징으로 하는 형질전환 난초류의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 선발가능한 표지 유전자는 항생물질 저항적 특성의 발현을 암호함을 특징으로 하는 형질전환 난초류의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 미세립자는 지름이 약 0.5∼3㎛인 금속 입자를 포함함을 특징으로 하는 형질전환 난초류의 제조방법
제 1항에 있어서, 다수의 상기 미세립자를 제공하고, 상기 외부 유전자 구조체를 지닌 각각의 미세립자를 그 위에 고정시키고, 각각의 상기 미세립자를 상기 식물 표적 조직에 추진시킴을 특징으로 하는 형질전환 난초류의 제조방법
제 1항에 있어서, 더 나아가 상기 형질전환된 식물 조직으로부터 뿌리의 발생의 과정을 포함함을 특징으로 하는 형질전환 난초류의 제조방법
제 1항의 유전자 재조합 방법에 따라 제조된 형질전환 난초류