KR100236766B1 - 히아루론산 또는 그 염의 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물에 의해 생성된 히아루론산을 배양액으로 부터 고순도하에 보다 고수율로 정제하는 방법에 관한 것이다. 보다 특히 본 발명은 히아루론산 생산균주의 배양액에 유기용매를 가하여 히아루론산을 침전시키는 단계, 아연 알루미네이트 분말을 넣고 교반하는 단계 및 히아루론산을 분리하는 단계를 포함하는, 미생물 배양액으로부터 히아루론산 염을 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 정제과정에 단백질, 핵산등의 제거 능력이 탁월한 아연 알루미네이트를 사용함으로써 고순도의 히아루론산을 수득하며, 또한 전체 정제 공정을 0 내지 15℃의 저온에서 수행하여 보다 고분자량의 히아루론산을 수득한다.

Description

히아루론산 또는 그 염의 정제방법

제1도는 정제 과정을 상온 및 저온에서 수행한, 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 LBF 707에 의해 수득된 히아루론산 염, 시판 히아루론산인 힐론(HEALON), 균주 NCTC 7023 및 ATCC 35246에 의해 수득된 히아루론산 염을 고속 액체 크로마토그래피하여 측정한 각 히아루론산의 분자량을 비교한 것이다.

본 발명은 미생물을 배양하여 그 배양액중의 히아루론산을 정제함에 있어서, 아연 알루미네이트를 이용함을 특징으로 하는, 불순 단백질,핵산 및 기타 금속이온을 제거하는 정제방법 및 또한 이러한 정제과정을 저온에서 수행함으로써 보다 고순도의 히아루론산을 얻는 방법에 관한 것이다.

히아루론산은 생체 고분자의 일종으로 분자량이 5만 내지 1,300만 달톤에 이르는 무색 투명한 고점도의 선형 다당류이며 반복 단위인 클루쿠론산과 N-아세틸 글루코즈아민이(1-3)과 (1-4)로 번갈아 결합되어 있다. 히아루론산은 피부, 눈의 초자체, 관절액, 탯줄, 닭 벼슬 등에 널리 분포되어 있으며 스트렙토코커스 속 등의 박테리아에 의해 생성되기도 한다.

히아루론산은 보습 효과가 강하며 물리적 마찰에 대한 윤활 효과 및 세균 등의 침입에 대한 보호 효과가 있어 피부 노화 방지용 고급 화장품 첨가제, (백내장, 녹내장, 각막 손상 등으로 인한)안과수술시 눈 조직의 보호제, 관절염 치료제, 외상 피복제, 외과 수술시 피복제 등과 같이 화장품 및 의료용으로 광범위하게 개발되고 있다.

미국 특허 제2,585,546호(하디안(HADIAN))는 탯줄로 부터 히아루론산을 추출하여 정제하는 방법을 설명한 것으로 정제과정이 매우 복잡하고 생산성이 낮아 효율적이지 못하다.

미국 특허 제3,396,081호(빌렉(BILLEK))는 눈의 초자체, 탯줄 및 미생물로부터 히아루론산을 정제하는 방법을 제시하고 있는데, 여기서는 정제시 단백질 분해효소를 사용하여 단백질을 아미노산으로 분해시킨 후 이온 교환 수지를 사용하여 유리 아미노산 및 금속염을 제거함과 동시에 남아있는 단백질은 pH를 약 3 내지 4로 낮추어 침전에 의해 단백질을 제거하는 방법을 사용하였다. 그러나, 이 방법의 단점은 pH를 산성으로 낮출 경우 고분자량의 히아루론산이 분해되는 것을 방지하기가 어려우므로 분자량 감소가 야기된다는 것이다.

미국 특허 제4,141,933호(발라즈(BALAZS))는 고도로 순수한 고분자량의 히아루론산 분획을 동물 조직으로부터 정제하는 방법을 기술하였다. 히아루론산을 함유한 동물 조직으로 부터 클로로포름을 사용하여 pH 6 내지 7에서 단백질 및 미확인된 염증원인 물질을 제거하여 고순도의 히아루론산을 얻었다. 그러나 이 방법은 매우 복잡하고 생산수율이 낮고 생산 비용이 높을 뿐 아니라 염증원인 물질의 제거가 제한된 범위내에서만 가능한 것이 단점이다.

즉 상기와 같이 추출에 의하여 얻어진 히아루론산에는 콘드로이틴 설페이트, 글리칸 설페이트 등의 불순물이 혼입되어 있어 이들을 제거하기 위하여 복잡한 정제 공정이 필요할 뿐 아니라 비용이 많이 소모되어 추출에 의한 방법은 대량생산에 부적합하다. 이에 반하여 미생물에 의한 히아루론산 생산방법은 상기의 불순물 혼입을 배제할 수 있을 뿐아니라 비교적 저렴하게, 고 수율로, 고분자량의 히아루론산을 얻을 수 있다.

미국 특허 제4,517,296호(브레이크(BRAKE))등은 스트렙토코커스 파이오젠 으로부터 생산된 히아루론산을 정제하는 방법을 개시하였다. 상기 특허에서는 먼저 트리클로로 아세트산으로 박테리아를 죽여 제거한후 유기용매로 침전과정을 수회 반복하여 정제하였다.

미국 특허 제4,782,046호(브라운(BROWN))에서는 스트렙토코커스 이퀴를 배양시킨 배양액에 0.01% 음이온 계면활성제인 라우릴 황산염을 넣어 세포벽에 붙은 히아루론산을 분리시킨 후 비이온 계면활성제인 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드를 넣어 히아루론산 침전물을 만든 후 알콜 침전 과정을 수회 반복하여 정제하였다.

미국 특허 제4,784,990호(님로드(NIMROD))에서는 스트렙토코커스 주에피데미쿠스를 배양시킨 배양액에 에탄올을 첨가하여 미생물로부터 히아루론산을 분리시킨 후 염화세틸 피리디늄 침전 과정을 수회 반복하여 정제하였다.

상기 미생물에 의해 생산된 히아루론산의 정제 방법들은 계면활성제를 사용하여 에탄올 처리 과정이 수회 포함될 뿐만아니라 계면활성제를 제거하기 위하여 별도의 공정이 추가되어 생산원가가 높아진다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점들을 해결하기 위해 연구하던 중 아연 알루미네이트가 정제 효과를 증대시킴을 발견하게 되었다. 아연 알루미네이트는 질산 아연과 질산 알루미늄을 반응시킨 후, 반응 생성물을 건조시키고 소성시킨 후 분쇄시켜 제조할 수 있다. 이렇게하여 제조된 아연 알루미네이트는 아연(Zinc)이 아미노산중 히스티딘과 시스틴에 선택적으로 흡착되고 알루미네이트의 단백질 흡수능력이 뛰어난 점으로 인해 정제공정에 사용되는데 특히 아연 알루미네이트는 핵산 제거능력이 뛰어난 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 히아루론산 생산 균주의 배양액에 유기 용매를 가하여 히아루론산을 침전시키는 단계, 아연 알루미네이트 분말을 넣고 교반하는 단계 및 히아루론산을 분리하는 단계를 포함하는, 미생물 배양액으로부터 히아루론산 염을 정제하는 방법에 관한 것이다.

이에 본 발명에서는 아연 알루미네이트를 이용하여 히아루론산의 정제시 불순 단백질 및 핵산을 효율적으로 제거하여 종래의 기술에서 수회 반복되던 에탄올 침전회수를 최소화하고 염화세틸 피리디늄 처리 단계를 배제시켰다.

또한, 전체 공정을 낮은 온도(0 내지 15℃)에서 실시함으로써 히아루론산의 분해현상을 현저히 줄여 분자량의 감소를 방지함으로써 높은 분자량의 히아루론산을 얻을 수 있었다.

정제에 사용한 아연 알루미네이트는, 질산 알루미늄(Al₂(NO₃)₃9H₂O)과 수산화 나트륨(NaOH)을 넣어 pH를 약 7.0으로 만든 후, 질산 아연(Zn(NO₃)₂6H₂O)과 수산화나트륨(NaOH)을 가하고, pH를 6.3정도로 유지하여 원심분리한 후, 여러차례 물로 세척하고, 95℃에서 건조시키고, 350℃에서 3시간정도 소성한 후, 100메쉬 이상으로 분쇄시켜 제조할 수 있다. 이때 제조되는 아연 알루미네이트의 분자식은 (Zn)_y(Al)_x(O)_z(여기서, 0.2<x<0.33, y=1-x, z=1+0.5x이다)이다.

본 발명자들은 상기 방법으로 제조된 아연 알루미네이트를 사용하여 히아루론산 정제에 응용한 바 히아루론산을 고순도로 정제하는 방법을 개발하였을 뿐아니라 상기 정제과정을 저온에서 수행함으로써 고분자량의 히아루론산을 얻을 수 있었다.

즉, 본 발명의 목적은 스트렙토코커스속 미생물에 의해 생산된 히아루론산을 아연 알루미네이트를 사용하여 고순도로 정제하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 상기 정제공정을 저온에서 수행함으로써 보다 고분자량의 히아루론산을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명의 일련의 정제과정은 에탄올 침전단계, 활성탄 처리단계, 아연 알루미네이트 처리단계, 실리카겔 크로마토그래피 단계, 및 에탄올 침전 단계로 이루어지나 필요에 따라 일부 단계를 생략하거나 다른 단계를 추가할 수 있으며, 공정 순서를 변경할 수도 있다.

스트렙토코커스속 미생물에 의해 생산된 히아루론산을 에탄올을 사용하여 배양액에서 미생물을 제거한 후 활성탄, 아연 알루미네이트, 실리카겔크로마토그래피, 및 다시 에탄올 침전을 거쳐 미생물과 일부 불용성 불순물을 제거하기 전에 배지의 온도를 4 내지 15℃ 정도(특히 4 내지 10℃)정도로 조절한 후 NaCl을 농도가 1M 정도 되도록 첨가하여 2 내지 4배 정도 희석하고 pH를 약 7.0으로 조절한다. 에탄올과 같은 유기 용매를 미생물이 포함된 히아루론산 배양액에 첨가한 후, 침전된 히아루론산을 수거하여 에탄올로 철저히 세척한다. 히아루론산 염을 모아 0.15M NaCl 수용액에 약 1 내지 3.0g/ℓ의 농도, 특히 2.5 내지 3.0g/ℓ의 농도가 되도록 용해시킨 후 단백질, 핵산 및 잔류 미생물을 제거하기 위하여 활성탄 0.1 내지 3%를 가한다. 활성탄을 가하여 히아루론산 농도가 0.1 내지 0.15% 정도가 되도록 희석하여 충분히 교반시킨 후, 원심분리 및 여과에 의해 활성탄, 미생물 및 기타 이물질을 제거한다.

단백질, 핵산 및 기타 불순물을 완전히 제거하기 위하여 맑은 히아루론산 수용액에 아연 알루미네이트를 첨가한다. 이때 pH를 6.0 내지 8.0, 특히 7.0으로 조절한다. 아연 알루미네이트를 가하여 충분히 교반시킨 후 원심분리 및 여과 등에 의해 맑은 상징액을 얻는다. 맑은 히아루론산 수용액중의 NaCl 농도가 약 1M이 되도록 조절한 후, 미리 1M NaCl로 평형시킨 실리카겔 컬럼에 흘려보내 금속 이온과 발열성 물질을 제거한다. 그런 후에 여과에 의해 수득된 히아루론산 수용액을 살균하고 여기에 살균된 에탄올을 가하여 침전시킨다. 상기와 같이 정제된 히아루론산을 살균된 조건하에서 진공건조 및 동결건조에 의해 건조시킨다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하지만 이는 본 발명을 예시하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.

[실시예 1]

[저온에서의 정제공정]

본 실시예의 정제과정은 모두 4℃에서 실시하였다.

에탄올 침전 : 상기 비교예에서 사용한 바와같은 균주 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 LBF707(균주 기탁번호 KCTC0075BP)을 배양시켜 얻은 배양액에 약 1M의 NaCl 수용액을 가하여 약 3배 정도 희석하고, pH를 약 7.0으로 조절하였다. 여기에 약 1.5배 부피의 에탄올을 교반하에 서서히 가하였다. 1.5배 부피의 에탄올에 의하여 침전된 히아루론산을 회수하기 위하여 상징액을 제거한 후 불순물과 미생물을 제거하기 위하여 여기에 소량의 65% 에탄올을 수회 첨가하여 세척하였다.

활성탄 처리단계 : 상기 단계에서 침전된 히아루론산을 수거하여 0.15M NaCl 수용액에 약 2.5g/ℓ의 농도가 되도록 가하여 교반하에 용매시켰다. 0.25% 정도의 히아루론산 수용액에 활성탄 약 30g/ℓ를 첨가하고 히아루론산 농도가 약 0.1 내지 0.15% 정도가 되도록 희석한 후 1시간 이상 교반하였다. 교반후 히아루론산 수용액을 여과시켜 상징액을 취하였다.

아연 알루미네이트 처리단계 : 상기 단계에서 얻어진 히아루론산 수용액에 약 3%의 아연 알루미네이트(100 내지 200 메쉬)를 가하고 1 시간정도 교반하였다. 이때의 pH를 약 7.0 부근이 되도록 조절하였다. 약 1시간이상 교반시킨 후, 원심 분리하고 여과시켜 상징액을 취하였다.

실리카겔 크로마토그래피 단계 : 상기 단계에서 얻어진 히아루론산 수용액중의 NaCl 농도가 1M 이 되도록 조절한 후 1M NaCl로 미리 평형시킨 실리카겔(30 내지 60 메쉬)크로마토그래피 컬럼에 히아루론산 수용액을 1.5㎖/분의 속도로 흘려 보냈다. 상기 과정으로부터 얻어진 히아루론산 용액을 0.2μ의 여과지에 통과시켜 완전무균상태가 되도록 하였다. 히아루론산 수용액에 0.2μ 여과지를 통과시킨 1.5배 부피의 분석용 에탄올을 가하여 히아루론산을 침전시킨 후 소량의 65% 에탄올로 수회 세척하였다.

상기와 같이 수득된 히아루론산 침전물을 진공건조 및 동결건조에 의하여 건조시켰다.

상기 과정에서 얻어진 수율은 약 70% 정도였으며 단백질 및 핵산의 제거 정도는 하기의 표 1에 나타나 있다.

[실시예 2]

[상온에서의 정제공정]

전체 정제공정을 상온(20 내지 25℃)에서 수행함을 제외하고 기타 정제조건을 상기의 실시예 1)과 모두 동일한 조건에서 상기 실시예 1)의 절차에 따라 정제과정을 수행하였다. 최종 정제된 히아루론산의 용출시간에 따른 분자량을 제1도에 비교하여 나타내었다.

[실시예 3]

[스트렙토코커스 주에피데미쿠스 ATCC 35246 배양액의 정제]

스트렙토코커스 주에피데미쿠스 LBF707(균주기탁번호 KCTC 0075BP)의 모균주인 ATCC 35246을 배양시켜 생산된 히아루론산을 실시예 1과 동일한 조건에서 그와 동일한 절차에 따라 정제하였다. 최종 정제된 히아루론산의 용출시간에 따른 분자량을 제1도에 비교하여 나타내었다.

[실시예 4]

[스트렙토코커스 주에피데미쿠스 NCTC 7023 배양액의 정제]

균주 NCTC 7023은 히아루론산 분해효소인 히아루로니다제의 활성을 갖지 않는 균주로서 실시예 1의 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 LBF707의 배양 및 정제 과정과 동일한 조건에서 동일한 절차에 따라 실시하여 비교실험하였다. 최종 정제된 히아루론산의 용출시간에 따른 분자량을 제1도에 비교하여 나타내었다.

[실시예 5]

본 실시예의 정제과정은 모두 4℃에서 실시하였다.

에탄올 침전 : 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 LBF707을 배양시켜 얻은 배양액에 약 1M NaCl 수용액을 가하여 3배 정도 희석하고, pH를 7.0으로 조절하였다. 여기에 약 1.5배 부피의 에탄올을 교반하에 서서히 가하였다. 1.5배 부피의 에탄올에 의하여 침전된 히아루론산을 회수하기 위하여 상징액을 제거한 후, 불순물과 미생물을 제거하기 위하여 여기에 소량의 65% 에탄올을 수회 가하여 세척하였다.

미생물 및 불순물 제거 : 상기 단계에서 침전된 히아루론산을 수거하여 0.15M NaCl 수용액에 히아루론산 농도가 약 2.5g/ℓ가 되도록 가하고 교반하에 용해시켰다. 약 0.25%의 히아루론산 수용액에 활성탄 약 1g/ℓ 및 여과 보조제인 교조토 10g/ℓ를 가하고, 히아루론산 농도가 약 0.15% 정도가 되도록 희석한 후 1시간정도 교반하였다. 교반후 히아루론산 수용액을 여과하여 상징액을 취하였다.

아연 알루미네이트 처리 : 상기 단계에서 수득된 히아루론산 수용액에 약 5%의 아연 알루미네이트를 가하여 1시간정도 교반하였다. 이 때의 pH를 7.0이 되도록 조절하였다. 1시간이상 교반한 후 여과시켜 많은 여과액을 얻었다.

실리카겔 크로마토그래피 단계 : 상기 단계에서 얻어진 히아루론산 수용액중의 NaCl 농도가 1M이 되도록 조절한 후, 1M NaCl로 미리 평형시킨 실리카겔(30 내지 60 메쉬) 크로마토그래피 컬럼에 히아루론산 수용액을 1.5㎖/분의 속도로 흘려보낸다. 상기 과정으로부터 얻어진 히아루론산 용액을 0.2μ의 여과지에 통과시켜 완전무균상태가 되도록 하였다. 히아루론산 수용액에 0.2μ 여과지를 통과시킨 1.5배 부피의 분석용 에탄올을 가하여 히아루론산을 침전시킨후 소량의 65% 에탄올로 수회 세척하였다.

상기와같이 수득된 히아루론산 침전물을 진공건조 및 동결건조에 의하여 건조시켰다.

상기 과정에서 얻어진 수율은 약 70% 정도였으며 단백질 및 핵산의 제거정도는 하기 표 1에 나타나 있다.

[비교예]

[아연 알루미네이트를 사용하지 않은 경우]

본 비교예의 정제과정은 모두 4℃에서 실시하였다.

에탄올 침전단계 : 본 출원인이 개발하여 유전자 은행(KCTC)에 기탁한, 고분자량의 히아루론산을 생성하는 돌연변이 균주인 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 LBF707(균주기탁번호 KCTC 0075BP)을 배양시켜 얻은 배양액에 약 1M의 NaCl 수용액을 가하여 약 3배 정도 희석하고 pH를 약 7.0으로 조절하였다. 여기에 약 1.5배 부피의 에탄올을 교반하에 서서히 가하였다. 1.5배 부피의 에탄올을 가하여 침전된 히아루론산을 회수하기 위해 상징액을 제거한 후 불순물과 미생물을 제거하여 위하여 여기에 약 65%의 에탄올 소량을 수회 가하여 세척하였다.

활성탄 처리단계 : 상기 단계에서 침전된 히아루론산을 수거하여 0.15M NaCl 수용액에 약 2.5g/ℓ의 농도가 되도록 가하여 교반하에 용해시켰다. 0.25% 정도의 히아루론산 수용액에 활성탄 약 30g/ℓ를 첨가하고 히아루론산 농도가 약 0.1 내지 0.15% 정도가 되도록 희석한 후 1시간 이상 교반한다. 교반후 히아루론산 수용액을 여과시켜 상징액을 취하였다.

에탄올 침전단계 : 상기 단계에서 수득된 히아루론산 수용액에 약 1M NaCl을 넣은 후, 1.5배 부피의 에탄올을 가하여 히아루론산을 침전시킨다. 침전된 히우루론산을 회수하기 위하여 상징액을 제거한 후 여기에 소량의 65%의 에탄올을 수회 가하여 철저히 세척하였다.

실리카겔크로마토그래피 단계 : 상기 단계에서 얻어진 히아루론산의 수용액 중의 NaCl 농도가 1M이 되도록 조절한 후, 1M NaCl로 미리 평형시킨 실리카겔(30 내지 60 메쉬)크로마토그래피 컬럼에 히아루론산 수용액을 1.5㎖/분이 속도로 흘려보낸다. 상기 과정에서 얻어진 히아루론산 용액을 0.2μ의 여과지에 통과시켜 완전무균 상태가 되도록 하였다. 히아루론산 수용액에 0.2μ의 여과지를 통과시킨 1.5배 부피의 분석용 에탄올을 가하여 히아루론산을 침전시킨 후 소량의 65% 에탄올로 수회 세척하였다.

상기와 같이 얻어진 히아루론산 침전물을 진공건조 및 동결건조에 의하여 건조시켰다. 단백질 및 핵산의 제거정도는 하기 표 1에 나타나 있다.

[표 1]

제1도는 상온과 저온에서 수행한 균주 LBF 707에 의해 생산된 히아루론산 염, 시판 히아루론산인 파마시아사의 힐론(HEALON), NCTC 7023과, LBF 707의 모균주인 ATCC 35246에 의해 수득된 히아루론산을 고속 액체 크로마토그래피하여 측정한 HPLC 분자량의 비교 도면이다.

고속 액체 크로마토그래피에 의한 분자량 측정방법(컬럼 : 바이오-겔(Bio-Gel) SEL 60-XL, 300×7.8㎜, 용출속도 0.5㎖/분)은 폴리에틸렌옥사이드(알드리치(Aldrich)를 표준물질로하여 표준곡선을 구한 후 동일조건에서 용출시켜 표준곡선을 이용하여 분자량을 확인하였다. 그림에서 볼 있듯이 상온(RT)과 저온(LT)에서의 분자량 비교결과 정제시의 온도에 의하여 히아루론산의 분자량이 많은 영향을 받는다. 또한 현재 시판중인 파마시아의 힐론에 비하여 본 발명에 따라 저온에서 정제한 LBF 707에 의해 생산된 히아루론산의 분자량이 월등히 큰 것을 알 수 있다.

[정제된 히아루론산의 성질]

1) 히아루론산 염의 함량

변형된 카바졸방법[Bitter and Muir, Anal, Biochem, 4, 330 (1962)]에 의해 분석한 결과 86 내지 90% 정도였다.

2) 평균 분자량

분자량 측정은 고속 액체 크로마토그래피에 의하여 실시하였다. 폴리에틸렌 옥사이드를 표준물질로(알드리치)하여 표준곡선을 구한 후 동일조건에서 용출시켜 표준곡선에 의해 분자량을 확인하였다. 정제된 히아루론산 염의 평균 분자량은 약 400만 달톤 되었다.

3) 글루쿠론산과 N-아세틸글루코즈아민의 비율:

변형된 모간(Morgan)과 엘슨(Elson)의 방법[Carbohydrate chemistry 8, 89 (1980)]에 의하여 분석한 결과 1:1이었다.

4) 수분함량 : 10% ±2%

5) 단백질함량 : 1% 히아루론산 수용액의 단백질 농도를 로리(Lowry) 방법에 의하여 측정한 결과 0.01% 미만이다.

6) 나트륨이온함량 : 5% ± 1%

7) 황산염함량 : 검출되지 않음.

8) 핵산 함량 : 1% 히아루론산 수용액을 260㎚에서의 흡광도를 측정한 결과 0.01% 미만이다.

9) 발열성 물질 : 음성

Claims (5)

1. 히아루론산 생산 균주의 배양액으로부터 히아루론산 또는 그 염을 정제하는 방법에 있어서, 히아루론산 생산 균주의 배양액에 아연 알루미네이트 분말을 가하여 교반하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 정제방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 히아루론산 생산 균주가 스트렙토코커스 속 균주임을 특징으로 하는 히아루론산 정제방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 히아루론산 생산 균주의 배양액에 유기용매를 가하여 히아루론산을 침전시키는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 히아루론산 정제방법.
4. 제3항에 있어서, 침전된 히아루론산을 NaCl 수용액에 용해시킨 후 활성탄을 첨가하여 여과하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 히아루론산 정제방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 정제과정을 4 내지 15℃의 온도에서 수행함을 특징으로 하는 히아루론산 정제방법.