JPWO2009133928A1 - 白血球の分析方法およびそれに使用する分析試薬 - Google Patents
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Abstract
白血球含有試料の希釈率が低い場合、または、分析時の流速が遅い場合でも、安定して高精度に白血球の分類および計測が可能な白血球の分析方法およびそれに使用する分析試薬を提供する。本発明の分析方法は、白血球および赤血球を含む試料と、白血球に反応する界面活性剤を含む分析試薬とを混合する混合工程と、前記試料と前記分析試薬との混合液を、細孔を通過させ、前記通過時に検出される信号を測定し、前記試料中の白血球を分類および計数する測定工程を含む白血球の分析方法であって、前記分析試薬が、さらに、非イオン性界面活性剤を含み、前記非イオン性界面活性剤が、親水性部として糖残基を有し、疎水性部として脂肪鎖を有することを特徴とする。
Description
本発明は、白血球の分析方法およびそれに使用する分析試薬に関する。
医療診断において、血液分析が一般に行われている。前記血液分析の分析項目には、白血球、赤血球、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット値等がある。これらの分析対象の数、濃度、比率等から、例えば、多血症、貧血等の血液疾患、感染症等の疾患を診断可能である。中でも、白血球の数や比率は、感染症等の疾患の診断における重要な指標である。このため、血液中の白血球の分類および計数の精度向上を目的とし、種々の分析方法が開発されている。前記白血球の分析方法として、白血球および赤血球に溶解剤を反応させる方法（例えば、特許文献１）等が提案されている。
一方、近年、医療診断における生体試料の分析等において、微小化学分析システム（Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ、以下、「μＴＡＳ」という。）が検討されている。前記μＴＡＳは、シリコン等の基板上に、微小な流路、ポンプ、バルブ、センサ等を集積させた化学分析システムであり、サンプルの少量化、測定用カートリッジのディスポーザブル化、装置の小型化等の利点がある。前記白血球は、集団健診等における分析項目でもあるため、前記μＴＡＳを使用した分析方法の開発が望まれているが、前記μＴＡＳでは、微小システムのため、試料の希釈率は低くなり、かつ分析時の流速は遅くなる。従来の白血球の分析方法では、試料の希釈率が低いと、前記試料中の赤血球が、白血球と分析試薬との反応に影響するおそれがあり、赤血球含有率（ヘマトクリット値等）によって、前記白血球の測定結果が変化する場合がある。このため、安定して分析できない。また、前記分析時の流速が遅いと、測定できる白血球数が少ないことから、分析精度が低くなる。このため、分析精度を高めるには、測定時間を長くして総流量を増やす必要がある。しかし、従来の白血球の分析方法では、前述のように、測定時間を長くすると、前記白血球と前記分析試薬との反応が測定時間内に進行し、安定して分析できない。
そこで、本発明の目的は、例えば、前記白血球および赤血球を含む試料の希釈率が低い場合、または、分析時の流速が遅い場合にも、安定的に白血球の分類および計測が可能な白血球の分析方法およびそれに使用する分析試薬を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明の分析方法は、白血球および赤血球を含む試料と、白血球に反応する界面活性剤を含む分析試薬とを混合する混合工程と、前記試料と前記分析試薬との混合液を、細孔を通過させ、前記通過時に検出される信号を測定し、前記試料中の白血球を分類および計数する測定工程とを含む白血球の分析方法であって、前記分析試薬が、さらに、非イオン性界面活性剤を含み、前記非イオン性界面活性剤が、親水性部として糖残基を有し、疎水性部として脂肪鎖を有することを特徴とする。
本発明の分析試薬は、本発明の分析方法に使用するための、白血球に反応する界面活性剤を含む分析試薬であって、さらに、非イオン性界面活性剤を含み、前記非イオン性界面活性剤が、親水性部として糖残基を有し、疎水性部として脂肪鎖を有することを特徴とする。
本発明によれば、例えば、白血球および赤血球を含む試料の希釈率が低い場合でも、白血球と分析試薬との反応における赤血球の影響が抑制され、白血球の安定した分析が可能である。また、本発明によれば、例えば、分析時の流速が遅い場合でも、白血球に対する分析試薬の反応が緩慢に起こるため、測定時間を長く設定することが可能であり、分析に十分な流量を得ることができ、安定して分析できる。さらに、本発明は、μＴＡＳに利用可能なため、例えば、サンプルの少量化、ディスポーザブルなカートリッジの利用、分析装置の小型化が可能である。
本発明の分析方法において、前記非イオン性界面活性剤は、前記糖残基が、二糖の残基であることが好ましい。
本発明の分析方法において、前記非イオン性界面活性剤は、前記脂肪鎖が、脂肪酸残基またはアルキル基であることが好ましい。
本発明の分析方法において、前記非イオン性界面活性剤は、スクロースモノラウレート、スクロースラウレート、スクロースモノカプレートおよびドデシルマルトシドからなる群から選択される少なくとも一つであることが好ましい。
本発明の分析方法において、前記非イオン性界面活性剤が、スクロースモノラウレートまたはスクロースラウレートであることが好ましい。
本発明の分析方法において、前記試料と前記分析試薬との前記混合液中の前記非イオン性界面活性剤の濃度が、０．００１〜５ｗ／ｖ％の範囲であることが好ましい。
本発明の分析方法において、前記白血球に反応する界面活性剤が、第四級アンモニウム塩であることが好ましい。
本発明の分析方法において、前記試料と前記分析試薬との前記混合液中の、前記白血球に反応する界面活性剤の濃度が、０．０１〜５ｗ／ｖ％の範囲であることが好ましい。
本発明の分析方法において、前記分析試薬が、さらに、赤血球に反応する界面活性剤を含むことが好ましい。
本発明の分析方法において、前記赤血球に反応する界面活性剤が、サポニンであることが好ましい。
本発明の分析方法において、前記試料と前記分析試薬との前記混合液中の前記サポニンの濃度が、０．０５〜５ｗ／ｖ％の範囲であることが好ましい。
本発明の分析方法は、前記混合工程において、前記試料（Ｘ）と前記分析試薬（Ｙ）との混合体積比（Ｘ：Ｙ）が、１：０．４〜１：９９の範囲であることが好ましい。
本発明の分析方法は、前記測定工程において、前記白血球を、その体積により３種類に分類することが好ましい。
本発明の分析方法は、前記測定工程において、前記細孔を有するカートリッジを使用し、前記混合液を、前記カートリッジ内の前記細孔を通過させることが好ましい。
本発明の分析方法において、前記カートリッジが、微小分析システムであることが好ましい。
本発明の分析試薬において、前記糖残基が、二糖であることが好ましい。
本発明の分析試薬において、前記脂肪鎖が、脂肪酸残基またはアルキル基であることが好ましい。
本発明の分析試薬において、前記非イオン性界面活性剤が、スクロースモノラウレート、スクロースラウレート、スクロースモノカプレートおよびドデシルマルトシドからなる群から選択される少なくとも一つであることが好ましい。
本発明の分析試薬において、前記白血球に反応する界面活性剤が、第四級アンモニウム塩であることが好ましい。
本発明の分析試薬において、前記分析試薬が、さらに、赤血球に反応する界面活性剤を含むことが好ましい。
本発明の分析試薬において、前記赤血球に反応する界面活性剤が、サポニンであるのことが好ましい。
つぎに、本発明について、例をあげて説明する。
＜分析方法＞
前述のように、本発明の分析方法は、白血球および赤血球を含む試料と、白血球に反応する界面活性剤を含む分析試薬とを混合する混合工程と、前記試料と前記分析試薬との混合液を、細孔を通過させ、前記通過時に検出される信号を測定し、前記試料中の白血球を分類および計数する測定工程とを含む白血球の分析方法であって、前記分析試薬が、さらに、非イオン性界面活性剤を含み、前記非イオン性界面活性剤が、親水性部として糖残基を有し、疎水性部として脂肪鎖を有することを特徴とする。なお、本発明の分析方法において使用する前記分析試薬は、本発明の分析試薬に該当する。
前述のように、本発明の分析方法は、白血球および赤血球を含む試料と、白血球に反応する界面活性剤を含む分析試薬とを混合する混合工程と、前記試料と前記分析試薬との混合液を、細孔を通過させ、前記通過時に検出される信号を測定し、前記試料中の白血球を分類および計数する測定工程とを含む白血球の分析方法であって、前記分析試薬が、さらに、非イオン性界面活性剤を含み、前記非イオン性界面活性剤が、親水性部として糖残基を有し、疎水性部として脂肪鎖を有することを特徴とする。なお、本発明の分析方法において使用する前記分析試薬は、本発明の分析試薬に該当する。
本発明によれば、例えば、赤血球含有率（ヘマトクリット値等）の影響を受けにくく、安定した分析が可能である。また、本発明によれば、例えば、リンパ球よりも小さなパルスとして検出される血液成分（ノイズ）と、リンパ球との分離精度を向上でき、また、顆粒球の分離精度を向上できる。このため、本発明によれば、例えば、分析精度の向上が可能である。
混合工程
前記混合工程では、前記試料と前記分析試薬とを混合し、前記試料中の前記白血球および前記赤血球を、前記分析試薬と反応させる。前記白血球に対する反応としては、例えば、白血球の細胞膜の溶解による裸核化、浸透圧変化による収縮または膨張等があげられる。また、本発明において、前記赤血球に対する反応としては、例えば、溶血、赤血球膜の溶解等があげられる。
前記混合工程では、前記試料と前記分析試薬とを混合し、前記試料中の前記白血球および前記赤血球を、前記分析試薬と反応させる。前記白血球に対する反応としては、例えば、白血球の細胞膜の溶解による裸核化、浸透圧変化による収縮または膨張等があげられる。また、本発明において、前記赤血球に対する反応としては、例えば、溶血、赤血球膜の溶解等があげられる。
前記白血球および前記赤血球を含む試料としては、特に限定されず、例えば、血液試料、血液試料を処理した試料等があげられる。前記血液試料としては、例えば、全血、血球等があげられる。前記処理としては、特に制限されないが、例えば、希釈処理等があげられる。前記希釈処理は、特に制限されないが、希釈液として、例えば、生理食塩水、緩衝液等を使用できる。前記希釈倍率は、特に制限されないが、例えば、１〜５００倍の範囲、好ましくは、５〜４００倍の範囲であり、より好ましくは、２００〜３００倍の範囲である。また、例えば、全血を希釈する場合、前記希釈試料と前記分析試薬とを混合した際に、結果的に、全血が、５〜１０００倍に希釈されることが好ましく、より好ましくは、１５〜４００倍である。また、この際、前記希釈試料と前記分析試薬とを混合した前記混合液における、前記分析試薬の各成分の濃度範囲は、後述の範囲となることが好ましい。
前記緩衝液としては、特に限定されず、例えば、ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸）緩衝液、ＭＥＳ（２−モルフォリノエタンスルホン酸）緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス−（２−ヒドロキシエチル）イミノ−トリス−（ヒドロキシメチルメタン）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））緩衝液、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−アセタミド）−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ＭＯＰＳＯ（２−ヒドロキシ−３−モルフォリノプロパンスルホン酸）緩衝液、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）緩衝液、リン酸緩衝液等があげられる。前記緩衝液のｐＨは、例えば、ｐＨ２〜１２の範囲であり、好ましくは、ｐＨ５〜７．５の範囲である。
前記試料の動物種は、特に限定されず、例えば、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ等の哺乳類等があげられる。
本発明において、前記分析試薬は、前記白血球反応性界面活性剤および前記非イオン性界面活性剤を含む。
前記白血球反応性界面活性剤は、特に限定されないが、例えば、第四級アンモニウム塩、サポニン、ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤、ポリオキシエチレン系アニオン界面活性剤等があげられ、好ましくは、第四級アンモニウム塩である。前記白血球反応性界面活性剤は、例えば、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
前記第四級アンモニウム塩は、特に限定されないが、例えば、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム、塩化テトラトリメチルアンモニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベヘニルトリメチルアンモニウム、塩化ココベンジルジメチルアンモニウム、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム等があげられ、好ましくは、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム、塩化テトラトリメチルアンモニウムである。前記第四級アンモニウム塩は、例えば、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
前記試料と前記分析試薬との前記混合液中の前記白血球反応性界面活性剤の濃度は、特に制限されないが、例えば、界面活性剤の種類に応じて適宜設定可能であり、例えば、０．０１〜５ｗ／ｖ％の範囲であり、好ましくは、０．０７５〜１ｗ／ｖ％の範囲である。前記白血球反応性界面活性剤が前記第四級アンモニウム塩の場合、前記試料と前記分析試薬との前記混合液中の、前記第四級アンモニウム塩の濃度は、特に限定されず、例えば、前述の濃度範囲である。
本発明において、前記非イオン性界面活性剤は、前述のように、親水性部として、糖残基を有し、疎水性部として、脂肪鎖を有する。
前記糖残基としては、特に限定されず、例えば、単糖、二糖、オリゴ糖等の糖残基があげられる。前記糖残基における単糖の数は、特に限定されないが、例えば、１〜２０個の範囲であってもよい。前記単糖の糖残基としては、特に限定されないが、例えば、グルコース残基、ガラクトース残基、マンノース残基、チオグルコース残基、アラビノース残基、キシロース残基、グルクロン酸残基、グルコサミン残基等があげられる。前記二糖の糖残基としては、特に制限されないが、例えば、スクロース残基（ショ糖残基）、ラクトース残基、マルトース残基、チオマルトース残基等があげられ、好ましくは、スクロース残基である。
前記脂肪鎖としては、特に限定されず、例えば、脂肪酸残基、アルキル基等があげられる。前記脂肪酸残基としては、特に限定されず、例えば、飽和脂肪酸残基であってもよいし、不飽和脂肪酸残基であってもよい。また、前記脂肪酸残基は、例えば、直鎖脂肪酸残基、分岐脂肪酸残基、環状脂肪酸残基等があげられ、特に制限されない。前記脂肪酸残基の炭素数は、特に限定されず、例えば、４〜２８の範囲であり、好ましくは、１０〜２２の範囲である。前記飽和脂肪酸残基としては、特に制限されないが、例えば、カプリン酸残基、ラウリン酸残基、ミリスチン酸残基、ペンタデシル酸、パルミチン酸残基、ステアリン酸残基、アラキジン酸残基、べへニン酸残基等があげられ、好ましくは、カプリン酸残基、ラウリン酸残基であり、これらは、例えば、デカノイル基、ドデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、イコサノイル基、ドコサノイル基等のアシル基であることが好ましい。前記不飽和脂肪酸残基としては、特に制限されないが、例えば、オレイン酸残基、リノール酸残基等があげられ、これらは、例えば、ｃｉｓ−９−オクタデセノイル基、ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエノイル基等のアシル基が好ましい。
前記アルキル基としては、特に限定されず、例えば、直鎖状アルキル基であってもよいし、分岐状アルキル基であってもよい。前記アルキル基の炭素数は、特に限定されず、例えば、１〜１８個の範囲であってもよい。前記アルキル基の具体例としては、特に限定されず、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基等があげられる。
前記非イオン性界面活性剤の具体例としては、特に限定されず、例えば、ショ糖（スクロース）脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、アルキルオリゴ糖等があげられる。
前記ショ糖（スクロース）脂肪酸エステルとしては、特に制限されないが、例えば、スクロースカプレート、スクロースラウレート、スクロースミリステート、スクロースパルミテート、スクロースステアレート、スクロースベヘニレート、スクロースオレエート、スクロースリノレート等があげられ、好ましくは、スクロースカプレート、スクロースラウレートである。前記ショ糖（スクロース）脂肪酸エステルは、例えば、モノエステル、ジエステル、トリエステル等があげられ、特に制限されない。前記ショ糖脂肪酸モノエステルとしては、特に制限されないが、例えば、スクロースモノカプレート、スクロースモノラウレート、スクロースモノミリステート、スクロースモノパルミテート、スクロースモノステアレート、スクロースモノベヘニレート、スクロースモノオレエート、スクロースモノリノレート等があげられ、好ましくは、スクロースモノカプレート、スクロースモノラウレートである。前記ショ糖脂肪酸ジエステルとしては、特に制限されないが、例えば、スクロースジカプレート、スクロースジラウレート、スクロースジミリステート、スクロースジパルミテート、スクロースジステアレート、スクロースジベヘニレート、スクロースジオレエート、スクロースジリノレート等があげられ、好ましくは、スクロースジカプレート、スクロースジラウレートである。前記ショ糖脂肪酸トリエステルとしては、特に制限されないが、例えば、スクローストリカプレート、スクローストリラウレート、スクローストリミリステート、スクローストリパルミテート、スクローストリステアレート、スクローストリベヘニレート、スクローストリオレエート、スクローストリリノレート等があげられ、好ましくは、スクローストリカプレート、スクローストリラウレートである。
前記ショ糖脂肪酸エステルは、例えば、モノエステル、ジエステル、トリエステル等のいずれであってもよく、また、これらの混合物であってもよい。前記ショ糖脂肪酸エステルは、例えば、前記モノエステルを含むことが好ましく、前記ショ糖脂肪酸モノエステルの割合は、特に制限されないが、例えば、５０〜１００体積％の範囲、好ましくは、７０〜１００体積％の範囲である。
前記アルキルグルコシドとしては、特に制限されないが、例えば、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−マルトシド、ｎ−デシル−β−マルトシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、３−オキサトリデシル−α−Ｄ−マンノシド、ｎ−ヘプチル−β−チオグルコシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド等があげられる。
前記非イオン性界面活性剤は、例えば、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
前記試料と前記分析試薬との前記混合液中の前記非イオン性界面活性剤の濃度は、特に限定されず、例えば、０．００１〜５ｗ／ｖ％の範囲であり、好ましくは、０．００１〜１ｗ／ｖ％の範囲であり、より好ましくは、０．０１〜１ｗ／ｖ％の範囲である。
前記分析試薬は、前述のように、前記白血球反応性界面活性剤および前記非イオン性界面活性剤に加えて、さらに、前記赤血球に反応する界面活性剤（以下、赤血球反応性界面活性剤という。）を含むことが好ましい。
本発明において、前記赤血球反応性界面活性剤としては、特に限定されず、例えば、化学合成された界面活性剤でもよく、天然物由来の界面活性剤でもよい。前記化学合成された界面活性剤としては、特に限定されず、例えば、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤等があげられる。前記陽イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、ドデシルピリジニウムブロミド、セチルピリジニウムクロリド等があげられる。前記陰イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、テトラデシルスルホン酸ナトリウム等があげられる。前記両性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、ＣＨＡＰＳ（硫酸−３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン）、ドデシル−Ｎ−ベタイン等があげられる。また、前記天然物由来の界面活性剤は、特に限定されず、例えば、サポニン、カゼイン、レシチン等があげられる。前記赤血球反応性界面活性剤としては、このなかで、サポニンが好ましい。なお、前記サポニンは、前記白血球反応性界面活性剤と前記赤血球反応性界面活性剤とを兼ねてもよい。
前記試料と前記分析試薬の前記混合液中の前記赤血球反応性界面活性剤の濃度は、特に限定されず、例えば、使用する界面活性剤に応じて適宜設定できる。前記試料と前記分析試薬との前記混合液中の、前記赤血球反応性界面活性剤の濃度は、特に限定されず、例えば、０．０５〜５ｗ／ｖ％の範囲であり、好ましくは、０．１〜０．５ｗ／ｖ％の範囲である。前記サポニンを使用する場合、前記試料と前記分析試薬との前記混合液中の前記サポニンの濃度は、特に限定されず、例えば、前述の濃度範囲である。
本発明において、前記分析試薬は、前述の界面活性剤以外の組成は特に限定されず、例えば、緩衝液、添加剤等を含んでいてもよい。前記緩衝液としては、特に限定されず、例えば、前述の緩衝液等があげられる。前記緩衝液のｐＨは、特に限定されず、例えば、前述のｐＨ範囲と同様である。
前記添加剤としては、特に限定されず、例えば、再凝集防止剤、ヘモグロビン測定用の添加剤等があげられる。
前記再凝集防止剤は、例えば、血液試料成分の再凝集を防止するための溶液である。前記再凝集防止剤としては、特に限定されず、例えば、クエン酸ナトリウム、ヘパリン、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）、フッ化ナトリウム、ＡＣＤ（クエン酸−デキストロース液）等があげられる。
前記試料と前記分析試薬との前記混合液中の前記再凝集防止剤の濃度は、特に限定されず、使用する成分に応じて適宜設定できる。前記試料と前記分析試薬との前記混合液中の前記再凝集防止剤の濃度は、特に限定されず、例えば、０．０５〜５ｗ／ｖ％の範囲であり、好ましくは、０．１〜０．５ｗ／ｖ％の範囲である。前記再凝集防止剤として前記クエン酸ナトリウムを使用する場合には、前記試料と前記分析試薬との前記混合液中の前記クエン酸ナトリウムの濃度は、特に限定されず、例えば、前述の濃度範囲である。
前記ヘモグロビン測定用の添加剤としては、特に限定されず、例えば、亜硝酸ナトリウム、過塩素酸、チオシアン酸、ヨウ化カリウム、臭化カリウム、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸等があげられる。前記試料と前記分析試薬との前記混合液中の、前記ヘモグロビン測定用の添加剤の濃度は、特に限定されず、例えば、０．０１〜１ｗ／ｖ％の範囲であり、好ましくは、０．０１〜０．１ｗ／ｖ％の範囲である。前記亜硝酸ナトリウムを使用する場合、前記試料と前記分析試薬との前記混合液中の前記亜硝酸ナトリウムの濃度は、特に限定されず、例えば、前述の濃度範囲である。
本発明の分析方法では、前記反応工程において、前記試料（Ｘ）と前記分析試薬（Ｙ）との混合体積比は、特に限定されず、例えば、Ｘ：Ｙ＝１：０．４〜１：９９の範囲であり、好ましくは、Ｘ：Ｙ＝１：９〜１：９９の範囲であり、より好ましくは、Ｘ：Ｙ＝１：１９〜１：４９の範囲である。
前記混合液中において、例えば、全血１μＬあたり、前記白血球反応性界面活性剤は、例えば、０．０２〜２ｍｇの範囲が好ましく、前記非イオン性界面活性剤は、０．００１〜０．２５ｍｇの範囲が好ましく、前記赤血球反応性界面活性剤は、０．００４〜０．４ｍｇの範囲が好ましい。
前記反応工程において、前記試料と前記分析試薬を混合して、前記白血球および赤血球に前記分析試薬を反応させる時間は、特に制限されないが、例えば、１０〜３００秒の範囲であり、好ましくは、３０〜１２０秒の範囲である。前記反応時間を、前記時間の範囲内にすることにより、分類に適当な程度に白血球が分析試薬と反応し、かつその反応状態が一定に保持されるため、白血球を安定して分析できる。
本発明の分析試薬の剤形は、特に限定されず、例えば、液剤、粉剤、粒剤等があげられる。前記分析試薬の調製方法としては、例えば、従来公知の製造方法を採用でき、特に制限されない。前記液剤の調製方法としては、特に限定されず、例えば、前述の緩衝液に前述の界面活性剤を混合して調製してもよい。前記粉剤の調製方法としては、特に限定されず、例えば、前記液剤を乾燥させて、調製してもよい。また、前記粒剤の調製方法としては、特に限定されず、例えば、前記粉剤に造粒剤等の助剤を添加し、造粒装置等を使用して調製してもよい。本発明の分析試薬が、例えば、粉剤または粒剤の場合、前記試料と前記分析試薬とを混合することで、前記混合液中に、前記分析試薬の成分を、溶解、懸濁または分散させてもよいし、あらかじめ、緩衝液等に溶解、懸濁または分散してから、前記試料と混合してもよい。
測定工程
前記測定工程では、前記試料と前記分析試薬との前記混合液を、細孔を通過させ、前記通過時に発生する信号を測定し、白血球を分類および計数する。なお、本発明は、例えば、前記試料と前記分析試薬との前記混合液について、前記試料中の細胞の大きさに関する情報および形態に関する情報の少なくとも一方を検出することで、白血球を分類および計数する方法ともいえる。これらの情報は、後述するシグナルとして検出できる。
前記測定工程では、前記試料と前記分析試薬との前記混合液を、細孔を通過させ、前記通過時に発生する信号を測定し、白血球を分類および計数する。なお、本発明は、例えば、前記試料と前記分析試薬との前記混合液について、前記試料中の細胞の大きさに関する情報および形態に関する情報の少なくとも一方を検出することで、白血球を分類および計数する方法ともいえる。これらの情報は、後述するシグナルとして検出できる。
前記混合液の細孔の通過および前記通過時に発生する信号の測定は、特に制限されない。前記細孔は、例えば、流路の一部（一点）であってもよい。すなわち、例えば、流路に前記混合液を通過させた際、前記流路の所望の部位（一点）を前記細孔部とし、この部位を通過する際の信号を測定してもよい。また、前記細孔は、流路の途中がくびれて形成されてもよい。すなわち、流路における「くびれ部分」が細孔となってもよい。このように、前記流路が、前記細孔を有する場合、例えば、前記流路の一端側から前記流路内に、前記試料と前記分析試薬との前記混合液を導入し、充填する。そして、前記試料を前記流路の他端側に移動させる。これにより、前記混合液を、前記細孔を通過させ、前記混合液を前記細孔を通過させる際に発生する信号を測定する。前記混合液を流路内に導入する方法は、特に制限されず、例えば、前記流路の他端側に、減圧ポンプ等を連結してエアを吸引することで導入してもよいし、電極と電極との間に前記細孔を配置し、前記両電極間に電圧を印加することで導入してもよい。後者の場合は、例えば、前記電極間に電気泳動液を充填した後、前記混合液を電気泳動により移動することが好ましい。前記流路は、例えば、カートリッジに設けられていることが好ましく、カートリッジとしては、μＴＡＳ等のマイクロチップが好ましい。
また、前記細孔は、例えば、連結する液槽を隔てる隔壁に設けられた貫通孔（オリフィス）であってもよい。この場合、例えば、一方の前記液槽に、前記試料および前記分析試薬を注入し、他方の前記液槽に生理食塩水を充填する。ついで、前記他方の液槽に連結した減圧ポンプにより、前記液槽内を減圧し、前記試料と前記分析試薬との前記混合液を前記他方の液槽に移動させる。これにより、前記白血球を、前記細孔を通過させ、前記混合液を前記細孔を通過させる際に発生する信号を測定する。
前記細孔の大きさは、特に限定されず、使用する分析装置に応じて、適宜設定できる。例えば、前記分析装置として、前記μＴＡＳを使用した場合、前記混合液の移動方向に対して垂直方向における、前記細孔の断面形状は、特に限定されず、例えば、矩形、円形等があげられる。前記断面形状が矩形の場合、前記細孔は、特に限定されないが、例えば、その幅が、１０〜２００μｍの範囲であり、その深さが、１０〜２００μｍの範囲であり、好ましくは、その幅が、５０〜１００μｍの範囲であり、その深さが、５０〜１００μｍの範囲である。前記断面形状が円形の場合、前記細孔の孔径（直径）は、例えば、１０〜２００μｍの範囲であり、好ましくは、５０〜１００μｍの範囲である。また、前記細孔の前記移動方向における長さは、特に限定されないが、例えば、１０〜２００μｍの範囲であり、好ましくは、５０〜１００μｍの範囲である。
前記細孔が、例えば、前記隔壁の貫通孔（オリフィス）の場合、前記混合液の移動方向に対して垂直方向における、前記貫通孔の断面形状は、特に限定されず、例えば、矩形、円形等があげられる。前記断面形状が矩形の場合、前記細孔は、特に限定されないが、例えば、その幅が、１０〜２００μｍの範囲であり、その高さが、１０〜２００μｍの範囲であり、好ましくは、その幅が、５０〜１００μｍの範囲であり、その高さが、５０〜１００μｍの範囲である。前記断面形状が円形の場合、前記細孔の孔径（直径）は、例えば、１０〜２００μｍの範囲であり、好ましくは、５０〜１００μｍの範囲である。また、前記細孔の前記移動方向における長さは、特に限定されないが、例えば、１０〜２００μｍの範囲であり、好ましくは、５０〜１００μｍの範囲である。
前記細孔通過時に検出する信号としては、特に限定されず、例えば、ＤＣインピーダンス、ＲＦインピーダンス等のインピーダンス、前方散乱光、側方散乱光、蛍光等があげられる。
前記信号を測定する方法としては、特に制限されず、例えば、電圧または電流値を測定する電気化学的方法、光や色素の強度を測定する光学的方法等があげられる。
前記インピーダンスは、例えば、前記細孔を、血球を含む溶液が通過する際における、電極間のインピーダンスである。具体的には、例えば、電極と電極との間に配置した細孔に、前記両電極間に電流を流した状態で、前記溶液を通過させた際に生じるインピーダンスである。前記溶液中に浮遊した白血球等の血球が、前記細孔を通過する際には、インピーダンスが変化するため、インピーダンスを測定し、その変化を検出することで、前記試料中に含まれる白血球を分析できる。電流として直流電流を流した場合のインピーダンスは、ＤＣインピーダンスであり、通常、血球の容積に応じて変化する。また、電流として高周波電流を流した際のインピーダンスは、ＲＦインピーダンスであり、通常、血球の容積および内部状態に応じて変化する。本発明において、前記血球を含む溶液は、本発明の分析試薬と試料とを含む混合液である。前記分析試薬または前記血球を含む溶液（すなわち前記混合液）は、その導電率は、特に限定されないが、例えば、１１〜２０ｍＳ／ｃｍの範囲、好ましくは、１３〜１８ｍＳ／ｃｍの範囲である。
また、前記散乱光および蛍光の検出方法は、特に制限されず、例えば、通常の方法が採用でき、フローサイトメーターを使用して、前記細孔を通過する血球に光を照射し、検出してもよい。前記光の光源としては、特に限定されず、例えば、水冷高出力レーザー、低出力空冷レーザー、ダイオードレーザー、キセノンランプ等があげられる。
前記白血球の分類および計数は、特に制限されず、例えば、前記信号の情報から分析可能な方法を用いて、適宜実施できる。前記信号として、例えば、前記ＤＣインピーダンスを測定する場合には、検出されたパルス（インピーダンス変化）の大きさから、白血球をサイズ別に分類し、前記パルスの頻度から、前記白血球のサイズ別の比率を算出できる。前記白血球は、一般に、好中球、好酸球および好塩基球等の顆粒球、リンパ球および単球の単核細胞等があげられる。本発明において、白血球の分類種は、特に制限されないが、例えば、顆粒球と単核細胞の２種類（いわゆる白血球の２分類）、リンパ球、単球および顆粒球の３種類（いわゆる白血球の３分類）、好中球、好酸球、好塩基球、単球およびリンパ球の５種類（いわゆる白血球の５分類）があげられる。本発明の分析方法において、前記白血球の分類は、特に制限されないが、好ましくは、３分類である。
本発明の分析方法は、その他の血液分析と同時に実施してもよい。前記その他の血液分析の対象としては、特に限定されず、例えば、赤血球、ヘモグロビン、血小板等があげられる。
つぎに、本発明の分析方法について、例をあげて説明する。ただし、本発明の分析方法は、下記の例に制限されるものではない。
（実施形態１）
以下に、μＴＡＳであるカートリッジを使用した、本発明の分析方法の一形態を説明する。まず、図１に、本形態における前記カートリッジの一例を示す。本例のカートリッジは、分析装置（図示せず）に装着可能な、ディスポーザブルタイプのカートリッジである。図１（Ａ）は、前記カートリッジの平面図であり、図１（Ｂ）は、前記カートリッジの斜視図である。図１（Ａ）および（Ｂ）において、同一部分には同一符号を付している。両図は、わかりやすくするための概略図であり、各構成要素の大きさや比率等は、これに制限されず、異なってよい。両図に示すように、前記カートリッジ１は、下基板３と上基板２とコネクタ７とを有し、前記下基板３の上に前記上基板２が積層された積層体の一側面に、コネクタ７が配置されている。前記下基板３には、配線パターン（図示せず）が形成されている。
以下に、μＴＡＳであるカートリッジを使用した、本発明の分析方法の一形態を説明する。まず、図１に、本形態における前記カートリッジの一例を示す。本例のカートリッジは、分析装置（図示せず）に装着可能な、ディスポーザブルタイプのカートリッジである。図１（Ａ）は、前記カートリッジの平面図であり、図１（Ｂ）は、前記カートリッジの斜視図である。図１（Ａ）および（Ｂ）において、同一部分には同一符号を付している。両図は、わかりやすくするための概略図であり、各構成要素の大きさや比率等は、これに制限されず、異なってよい。両図に示すように、前記カートリッジ１は、下基板３と上基板２とコネクタ７とを有し、前記下基板３の上に前記上基板２が積層された積層体の一側面に、コネクタ７が配置されている。前記下基板３には、配線パターン（図示せず）が形成されている。
前記上基板２には、５つの貫通孔が形成されている。前記５つの貫通孔の底部が、前記下基板３により封止されることにより、５つの液槽が形成されている。前記５つの液槽は、それぞれ、試料導入部４１、ドレイン４５、ドレイン５５、ドレイン５８およびドレイン６５である。また、前記上基板２の底面には、大小４つの凹部が形成されている。前記４つの凹部のうち、２つの凹部の開口面が、前記下基板３により封止されることで、２つの液槽が形成されている。前記２つの液槽は、それぞれ、試薬槽５１および希釈槽５９である。前記試薬槽５１には、分析試薬が封入されている。前記希釈槽５９には、撹拌子（図示せず）が封入されている。前記４つの凹部のうち、残りの２つの凹部の開口面が、前記下基板３により封止された空隙には、前記配線パターン中の配線に接続した電極６１および６２が、それぞれ配置される。前記空隙は、電極配置部である。同図において、６１および６２は、前記電極であり、前記電極配置部でもある。さらに、前記上基板２の底面には、複数の溝が形成されている。前記複数の溝の開口面が、前記下基板３により封止されることで、前記５つの貫通孔および前記２つの凹部により形成された７つの液槽および２つの前記電極配置部を連通する流路が形成されている。
前記試料導入部４１は、試料導入流路４２、分岐部４３、オーバーフロー流路４４を順に介して、前記ドレイン４５に連通している。また、前記試料導入部４１は、前記分岐部４３から、試料計量流路４６を介して、前記希釈槽５９にも連通している。前記試料導入部４１の開口部は、分析対象となる試料をカートリッジに導入するための導入口である。そして、前記試料計量流路４６の前記希釈槽５９側の端部には、流路断面積の狭いオリフィス４７が形成されている。
前記カートリッジ１は、例えば、つぎのようにして、前記試料を計量し、希釈槽５９内に導入することができる。まず、前記試料導入部４１に試料導入後、前記ドレイン４５に連結した減圧ポンプ等（図示せず）によりエアを吸引し、前記ドレイン４５に連通する流路内を減圧して、前記試料導入部４１から試料を導入する。前記吸引により、前記分岐部４３および前記オリフィス４７間の前記試料計量流路４６の容積を超える前記試料が、オーバーフロー流路４４に流出する。つづいて、前記ドレイン４５を閉じ、前記試料導入部４１に連結した加圧ポンプ等（図示せず）によりエアを吐出して、前記試料導入部４１に連通する流路内を加圧する。これにより、前記試料計量流路４６の容積に相当する試料が、前記希釈槽５９に導入される。このため、前記導入量は、例えば、前記試料計量流路４６の容積に設定され、計量導入が可能となる。
前記試薬槽５１は、試薬導入流路５２、分岐部５３、オーバーフロー流路５４を順に介して、前記ドレイン５５に連通している。また、前記試薬槽５１は、前記分岐部５３から、試薬計量流路５６を介して、前記希釈槽５９にも連通している。前記試薬槽５１には、分析試薬（図示せず）が封入されている。前記試薬計量流路５６は、その前記希釈槽側の端部と前記希釈槽５９との間で分岐し、その分岐末端に、前記ドレイン５８が形成されている。前記試薬槽５１、試薬導入流路５２、分岐部５３、オーバーフロー流路５４、ドレイン５５、試薬計量流路５６、ドレイン５８および希釈槽５９により、希釈部５が構成されている。なお、前記試薬計量流路５６の前記希釈槽側部分には、テーパー部５７が形成されている。
前記希釈部５では、つぎのようにして、前記分析試薬を計量して、前記希釈槽５９内に導入することができる。まず、前記ドレイン５５およびドレイン６５を閉状態とし、前記ドレイン５８を開状態とし、前記試薬槽５１に連結した加圧ポンプ（図示せず）等によりエアを吐出して、前記試薬槽５１に連通する流路内を加圧する。これにより、前記試薬計量流路５６に前記分析試薬が充填される。さらに、前記ドレイン５８を閉じ、前記ドレイン６５を開状態とし、前記ドレイン５５に連結した加圧ポンプ（図示せず）等によりエアを吐出し、前記ドレイン５５に連通した流路内を加圧する。これにより、前記試薬計量流路５６の容積に相当する分析試薬が、前記希釈槽５９に導入される。このため、前記導入量は、例えば、前記試料計量流路５６の容積に設定され、計量導入が可能となる。さらに、前述のように、前記試料を前記希釈槽５９に導入する。そして、マグネティックスターラー（図示せず）により、前記希釈槽５９内の前記撹拌子（図示せず）を回転させることにより、前記試料と前記分析試薬とを混合することができる。なお、本例において、前記分析試薬は、溶血処理可能なように、界面活性剤が添加されてもよい。
前記希釈槽５９と前記ドレイン６５を連通する流路上には、細孔６３が形成されている。そして、前記細孔６３の両端の流路には、前記電極配置部６１および６２（２つの凹部）が形成されている。前記電極配置部６１および６２（凹部）には、それぞれ、前記電線を介して電気抵抗検出器（図示せず）と接続する前記電極６１、６２が配置されている。また、前記細孔６３および前記２つの電極６１、６２を介して、前記ドレイン６５側には、流量計測流路６４が形成されている。前記電極６１および６２、細孔６３、流量計測流路６４およびドレイン６５により、分析部６が構成されている。
前記カートリッジ１において、前記上基板２の長さおよび幅は、特に限定されず、例えば、１０〜２００ｍｍの範囲であり、好ましくは、２０〜１００ｍｍの範囲である。また、前記上基板２の厚みは、特に限定されず、例えば、０．１〜１０ｍｍの範囲であり、好ましくは、１〜５ｍｍの範囲である。
前記カートリッジ１において、前記下基板３の長さおよび幅は、特に限定されず、例えば、前記上基板２の長さおよび幅と同様である。前記下基板３の厚みは、特に限定されず、例えば、０．１〜１０ｍｍの範囲であり、好ましくは、１〜５ｍｍの範囲である。
前記カートリッジ１において、前記上基板２および下基板３の材質は、例えば、前記吸光度の測定に支障のないものであれば、特に限定されない。前記上基板２および下基板３の材質としては、例えば、ガラス、ポリマー材料等から形成されたものが使用できる。前記ガラス材料としては、特に制限されないが、例えば、合成石英ガラス、溶融シリカ、ホウケイ酸ガラス等があげられる。前記ポリマー材料としては、特に制限されないが、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等のアクリル樹脂、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、エポキシ樹脂、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）等があげられる。また、前記下基板３は、前記材質で形成された複数の基板が積層されている。前記複数の基板間には、銅箔等からなる配線パターンが形成されている。
前記カートリッジ１において、前記試料導入部４１の直径および深さは、特に限定されず、例えば、直径が、０．１〜１０ｍｍの範囲であり、深さが、０．１〜１０ｍｍの範囲であり、好ましくは、直径が、１〜５ｍｍの範囲であり、深さが、１〜５ｍｍの範囲である。
前記カートリッジ１において、前記試薬槽５１の直径および深さは、特に限定されず、例えば、直径が、０．５〜５０ｍｍの範囲であり、深さが、０．１〜１０ｍｍの範囲であり、好ましくは、直径が、１〜２０ｍｍの範囲であり、深さが、１〜５ｍｍの範囲である。
前記カートリッジ１において、前記希釈槽５９の直径および深さは、特に限定されず、例えば、直径が、０．５〜５０ｍｍの範囲であり、深さが、０．１〜１０ｍｍの範囲であり、好ましくは、直径が、１〜１０ｍｍの範囲であり、深さが、１〜５ｍｍの範囲である。
前記カートリッジ１において、前記ドレイン４５、５５、５８および６５の直径および深さは、特に限定されず、例えば、それぞれ、直径が、０．１〜１０ｍｍの範囲であり、深さが、０．１〜１０ｍｍの範囲であり、好ましくは、それぞれ、直径が、１〜５ｍｍの範囲であり、深さが、１〜５ｍｍの範囲である。
前記カートリッジ１において、前記試料導入部４１、前記試薬槽５１、前記希釈槽５９ならびに前記ドレイン４５、５５、５８および６５の液槽の形状は、円柱状であるが、本発明は、これに限定されない。本発明において、各液槽の形状は、特に制限されず、例えば、円柱状、四角柱状、四角錐状、円錐状等があげられる。前記各液槽の形状は、全て同じであってもよいし、異なっていてもよく、特に制限されない。
前記カートリッジ１において、前記試薬計量流路５６の流路の幅および深さは、特に限定されず、断面積の最大部分において、例えば、幅が、０．１〜１０ｍｍの範囲であり、深さが、０．１〜１０ｍｍの範囲であり、好ましくは、幅が、０．５〜５ｍｍであり、深さが、０．１〜５ｍｍである。
前記カートリッジ１において、前記オリフィス４７の幅および深さは、特に限定されず、例えば、幅が、１〜２００μｍの範囲であり、深さが、０．１〜１０ｍｍの範囲であり、好ましくは、幅が、１０〜１００μｍであり、深さが、０．１〜５ｍｍである。
前記カートリッジ１において、前記細孔６３の幅、深さおよび長さは、前述のとおりである。
前記カートリッジ１においては、前記試薬計量流路５６、前記オリフィス４７および細孔６３以外の流路の幅および深さは、特に限定されず、例えば、幅が、１０〜１０００μｍの範囲であり、深さが、０．１〜１０ｍｍの範囲であり、好ましくは、幅が、１００〜５００μｍであり、深さが、０．１〜５ｍｍである。
前記カートリッジ１において、前記カートリッジ全体の最大厚みは、前記上基板２および前記下基板３の厚みの合計となる。前記上基板２および前記下基板３の厚みは、前述の通りである。
前記カートリッジ１の製造方法は、特に限定されず、例えば、従来公知の方法を採用できる。
つぎに、前記カートリッジ１を使用した本例の白血球の分析方法について、説明する。
まず、前記カートリッジ１を、コネクタ７を介して分析装置（図示せず）に装着する。また、前記試料として、ヒトの全血を、前述と同様にして、前記試料導入部４１から導入する。そして、前述のように、前記試料計量流路４６の容量相当量のヒト全血を計量し、前記希釈槽５９に導入する。さらに、前述と同様にして、前記試薬計量流路５６の容量相当量の前記分析試薬を計量し、前記希釈槽５９に導入する。導入した前記試料および前記分析試薬を、前記希釈槽５９で混合し、前記撹拌子（図示せず）を前記マグネティックスターラー（図示せず）で回転させて撹拌し、前記試料中の前記白血球および赤血球と前記分析試薬とを反応させる。
つぎに、前記電極６１および６２間に電圧を印加し、前記ドレイン６５に連結した減圧ポンプ等（図示せず）によりエアを吸引し、前記ドレイン６５に連通する流路内を減圧する。これにより、前記試料および前記分析試薬を混合した溶液（混合液）を、前記細孔６３を通過させ、さらに前記流量計測流路６４に流出させる。前記混合液が前記細孔６３を通過する際に発生するパルス（インピーダンス変化）を、電気抵抗検出器（図示せず）により測定し、前記パルスの大きさおよび頻度を二軸にとったヒストグラムを作成する。作成した前記ヒストグラムの変曲状態から白血球をサイズ別に三分類し、前記分類毎のパルス頻度を積算する。前記積算したパルス頻度を、前記流量計測流路６４に流出した流量で除し、前記試料中の前記三分類された白血球の比率を算出する。なお、前記三分類された白血球は、パルスの小さい順に、リンパ球、単球および顆粒球である。
（実施形態２）
つぎに、本発明の分析方法のその他の形態を説明する。まず、図２に、本形態の分析方法に使用する白血球分析装置の一例を示す。図２は、前記白血球分析装置の断面図である。同図は、わかりやすくするための概略図であり、各構成要素の大きさや比率等は、これに制限されず、異なってよい。
つぎに、本発明の分析方法のその他の形態を説明する。まず、図２に、本形態の分析方法に使用する白血球分析装置の一例を示す。図２は、前記白血球分析装置の断面図である。同図は、わかりやすくするための概略図であり、各構成要素の大きさや比率等は、これに制限されず、異なってよい。
図２に示すように、前記白血球分析装置８は、主槽９および副槽１０の２つの槽、吸引部１１、電極１２および電極１３の２つの電極および分析部（図示せず）から構成される。前記主槽９と前記副槽１０は、隔壁により隔てられて配置されている。前記隔壁には、細孔１４となる貫通孔が形成され、前記２つの槽の内部を連通している。前記主槽９は、上面が開口している。前記副槽１０は、前記隔壁と異なる側面に貫通孔が形成されており、前記貫通孔を介して、前記吸引部１１が連通している。前記吸引部１１の他端には、ポンプ（図示せず）が配置されている。また、前記電極１２および１３は、前記主槽９および前記副槽１０に、それぞれ配置されている。前記電極１２および１３は、前記分析部（図示せず）に連結する電線（一部のみ図示）の末端に配置されている。
前記主槽９および前記副槽１０の材質としては、例えば、前述のカートリッジの上基板と同様の材質等を使用できる。前記主槽９および前記副槽１０の形状は、特に限定されず、例えば、直方体、円筒状等があげられる。前記主槽９および前記副槽１０の形状は、全く同じであってもよいし、異なっていてもよく、特に制限されない。また、前記主槽９は、前述のように、例えば、上面が開放されていてもよい。
前記細孔１４は、例えば、直径が、１〜５００μｍの範囲であり、長さが、１〜２００μｍの範囲であり、好ましくは、直径が、１０〜１００μｍの範囲であり、長さが、１０〜１００μｍの範囲の貫通孔である。なお、前記直径は、例えば、前記細孔１４の貫通方向に垂直な断面の直径であり、前記長さは、前記細孔１４の貫通方向の長さであり、前記主槽９と前記副槽１０を隔てる前記隔壁の厚さである。
前記吸引部１１の材質としては、特に限定されず、例えば、前述の２つの槽と同様の材料等を使用できる。前記吸引部１１の形状は、特に限定されず、例えば、円筒状である。
本例の白血球分析装置８の製造方法は、特に限定されず、例えば、従来公知の方法を適宜用いればよい。
つぎに、前記白血球分析装置８を使用した本例の白血球の分析方法について、説明する。
まず、前記主槽９および前記副槽１０に、本発明の分析試薬を注入する。そして、前記試料として、ヒトの全血を、前記主槽９に添加して３０秒間混合する。つぎに、２つの前記電極間に電圧を印加し、前記吸引部１１に連結した前記ポンプにより吸引し、前記副槽１０内を減圧する。これにより、前記混合液を、前記細孔１４を通過させ、前記主槽９から前記副槽１０へ移動させる。前記混合液が、前記細孔１４を通過時に発生するパルス（インピーダンス変化）を、前記分析部（図示せず）を使用して測定する。実施形態１と同様に、ヒストグラムを作成し、白血球を分類および計数し、分類された白血球の比率を算出する。
（実施形態３）
つぎに、本発明の分析方法のさらにその他の形態を説明する。まず、図７に、本形態の分析方法に使用する白血球分析装置の一例を示す。図７は、前記白血球分析装置の断面図である。同図は、わかりやすくするための概略図であり、各構成要素の大きさや比率等は、これに制限されず、異なってよい。
つぎに、本発明の分析方法のさらにその他の形態を説明する。まず、図７に、本形態の分析方法に使用する白血球分析装置の一例を示す。図７は、前記白血球分析装置の断面図である。同図は、わかりやすくするための概略図であり、各構成要素の大きさや比率等は、これに制限されず、異なってよい。
図７に示すように、前記白血球分析装置８８は、主槽部９０、副槽部１００、撹拌部１６０、吸引部１１、電極１２および１３を含む。また、前記撹拌部１６０は、基板部１６および撹拌パイプ１８を含む。前記吸引部１１は、吸引パイプ１９およびシリンジ（図示せず）を含む。
前記主槽部９０は、基板９１ａおよび基板９１ｂの２枚の基板が並列に重ね合わせられた二層体からなり、上方が開口した、液体を収容可能な空隙部９を備える。この空隙部が、主槽９となる。前記主槽部９０において、前記主槽９の側面である基板９１ａと基板９１ｂには、それぞれ、前記主槽９の内部と連通する貫通孔２２ａと貫通孔２２ｃが形成されている。前記貫通孔２２ｃには、前記撹拌パイプ１８の一端が連結されている。前記主槽９内には、電極１２が配置されている。前記電極１２は、電線を介して、電圧器に連結されている（図示せず）。
前記副槽部１００は、基板１０１ａおよび基板１０１ｂの２枚の基板が並列に重ね合わせられた二層体からなり、前記主槽部９０と隣接して配置されている。前記副槽部１００は、その内部に、液体を導入可能な空隙部１０を備える。この空隙部が、副槽１０となる。前記副槽部１００において、前記副槽１０の側面である基板１０１ａには、前記副槽１０の内部と連通する３つの貫通孔が縦方向に形成されている。前記３つの貫通孔のうち、真ん中の貫通孔２２ｂは、隣接する前記主槽部９０の貫通孔２２ａと連結している。これにより、前記主槽部９０の内部と、前記副槽部１００の内部とが連通する。なお、本例の白血球分析装置８８においては、前記副槽部１００の貫通孔２２ｂと前記主槽部９０の貫通孔２２ａとの連結部分が、細孔１４となる。前記３つの貫通孔のうち、上方の貫通孔２１ａおよび下方の貫通孔２１ｂは、それぞれ導入口２１ａおよび導入口２１ｂとなっている。前記導入口２１ａには、吸引パイプ（図示せず）の一端が連結されており、前記吸引パイプの他端には、前記シリンジ（図示せず）が連結されている。また、前記導入口２１ａおよび２１ｂは、開閉可能としてもよいし、前記副槽部１００内に導入された溶液を排出するための溶液槽と連結してもよい。前記空隙部１０のうち、前記導入口２１ａから前記貫通孔２２ｂを連通する空隙部分は、例えば、定量部１５としても使用できる。前記副槽１０内には、電極１３が配置されている。前記電極１３は、電線を介して、前記電圧器に連結されている（図示せず）。
図８に、前記白血球分析装置８８の前記細孔１４部分のその他の例を示す。図８は、図７中の点線で囲んだ部分のその他の例を示す拡大図である。図８に示すように、前記主槽部９０の貫通孔２２ａと前記副槽部１００の貫通孔２２ｂとが連通する領域に、貫通孔を有する弾性体８４０が配置されてもよい。この場合、前記弾性体８４０に形成された前記貫通孔が、前記細孔８４となる。前記弾性体８４０の材質は、特に制限されないが、例えば、シリコーンゴム等があげられる。
前記基板部１６は、基板１６１ａおよび基板１６１ｂの２枚の基板が並列に重ね合わせられた二層体からなり、その内部に液体を収容可能な空隙部１７を備える。この空隙部が、撹拌槽１７となる。前記基板部１６において、前記撹拌槽１７の側面である基板１６１ｂには、前記撹拌槽１７の内部と連通する２つの貫通孔２２ｄおよび２２ｅが、縦方向に形成されている。前記貫通孔２２ｄには、前記吸引パイプ１９の一端が連結されており、前記吸引パイプ１９の他端には、前記シリンジ（図示せず）が連結されている。前記貫通孔２２ｅには、前記撹拌パイプ１８の一端が連結されており、前記撹拌パイプ１８の他端は、前述のように、前記主槽部９０の前記貫通孔２２ｃと連結している。この撹拌パイプ１８によって、前記基板部１６と前記主槽部９０の内部が連通している。
本例の白血球分析装置８８において、前記基板９１ａ、９１ｂ、１０１ａ、１０１ｂ、１６１ａおよび１６１ｂの材質としては、特に制限されないが、例えば、前述のガラス、ポリマー材料等があげられる。
前記主槽部９０の大きさは、特に制限されず、例えば、その高さは、３〜１００ｍｍの範囲、その幅は、３〜５０ｍｍの範囲、その厚みは、３〜５０ｍｍの範囲である。また、前記主槽９の体積は、特に制限されないが、例えば、１０〜５０００μＬの範囲であり、好ましくは、１００〜１０００μＬである。
前記副槽部１００の大きさは、特に制限されず、例えば、その高さは、１０〜２００ｍｍの範囲、その幅は、３〜５０ｍｍの範囲、その厚みは、３〜５０ｍｍの範囲である。また、前記副槽１０の体積は、特に制限されないが、例えば、１０〜５０００μＬの範囲であり、好ましくは、１００〜１０００μＬである。また、前記貫通孔２２ｂから前記導入口２１ａまでの空隙部は、定量部１５とすることができ、この場合、前記定量部１５は、定量に適した所望の体積に設定することが好ましい。
前記基板部１６の大きさは、特に制限されず、例えば、その高さは、３〜２００ｍｍの範囲、その幅は、３〜５０ｍｍの範囲、その厚みは、３〜５０ｍｍの範囲である。また、前記撹拌槽１７の体積は、特に制限されないが、例えば、１００〜１０００μＬが好ましい。
前記細孔１４の大きさは、例えば、直径が、１〜５００μｍの範囲であり、長さが、１〜２００μｍの範囲であり、好ましくは、直径が、１０〜２００μｍの範囲であり、長さが、１０〜１００μｍの範囲である。なお、前記直径は、例えば、前記細孔１４の貫通方向に垂直な断面の直径であり、前記長さは、前記細孔１４部分における前記基板９１ｂおよび前記基板１０１ａの厚さの合計である。また、図８においても、細孔８４の大きさは、例えば、同様である。
前記導入口２１ａおよび２１ｂの直径は、例えば、０．１〜２ｍｍの範囲であり、好ましくは、０．５〜１ｍｍの範囲である。前記貫通孔２２ｃ、２２ｄおよび２２ｅの直径は、例えば、０．１〜２ｍｍの範囲であり、好ましくは、０．５〜１ｍｍの範囲である。
前記撹拌パイプ１８および前記吸引パイプ１９の材質としては、特に限定されず、例えば、ステンレス鋼等を使用できる。前記ステンレス鋼としては、特に限定されないが、例えば、ＳＵＳ等があげられる。前記撹拌パイプ１８および吸引パイプ１９の形状は、特に限定されず、例えば、円筒状である。前記円筒状の場合、前記撹拌パイプおよび前記吸引パイプの内径は、例えば、１〜５００μｍの範囲であり、好ましくは、１０〜２００μｍの範囲である。前記撹拌パイプおよび前記吸引パイプの長さは、特に制限されないが、例えば、１〜５００ｍｍの範囲であり、好ましくは、１０〜２００ｍｍの範囲である。
本例の白血球分析装置８８の製造方法は、特に限定されず、例えば、従来公知の方法を適宜用いればよい。
つぎに、前記白血球分析装置８８を使用した本例の白血球の分析方法について、説明する。
まず、ヒトの全血を、生理食塩水で希釈し、前記試料を調製する。シリンジ（図示せず）を用いて、前記導入口２１ｂから生理食塩水を導入し、前記副槽１０内の前記電極１３の上部まで充填し、前記導入口２１ｂを閉じる。前記試料を、前記主槽９に注入する。前記吸引パイプ１９に連結した前記シリンジ（図示せず）により、前記主槽９に連通する各槽およびパイプを減圧（吸引）する。これにより、前記主槽９内の前記試料を前記撹拌槽１７に導入する。つぎに、前記主槽９に、本発明の分析試薬を注入する。前記シリンジにより、前記主槽９に連通する槽およびパイプを加圧（吐出）する。これにより、前記撹拌槽１７内の前記試料を、前記主槽９に再度導入する。さらに、前記シリンジにより、前記主槽９に連通する槽およびパイプの減圧および加圧を交互に繰り返す。これにより、前記試料と前記分析試薬を混合する。混合終了後、前記試料および前記分析試薬の混合液を、前記主槽９内で静置する。前記電極１２および１３間に電圧を印加し、前記導入口２１ａに連結したシリンジ（図示せず）により吸引し、前記副槽１０および前記主槽９を減圧する。これにより、前記混合液を、前記細孔１４を通過させ、前記主槽９から前記副槽１０へ移動させる。前記試料が、前記細孔１４の通過時に発生するパルス（インピーダンス変化）を、分析部（図示せず）を使用して測定する。実施形態１と同様に、ヒストグラムを作成し、白血球を分類および計数し、分類された白血球の比率を算出する。また、前記副槽部１００の前記空隙部１０において、前記貫通孔２２ｂから前記導入口２１ａの空隙部を定量部１５とするときは、例えば、前記主槽部９０から通過した前記混合液を定量できる。
つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に限定されない。
（実施例１）
本例では、試料として、ヘマトクリット値が３１．４％のヒト全血を用い、以下の手順により、白血球を測定した。なお、本例における白血球の測定には、前述の、図２に示す白血球分析装置８を用いた。前記白血球分析装置８において、前記細孔１４は、直径５０μｍ、長さ６０μｍの貫通孔である。
本例では、試料として、ヘマトクリット値が３１．４％のヒト全血を用い、以下の手順により、白血球を測定した。なお、本例における白血球の測定には、前述の、図２に示す白血球分析装置８を用いた。前記白血球分析装置８において、前記細孔１４は、直径５０μｍ、長さ６０μｍの貫通孔である。
まず、下記表１に示す組成の分析試薬を調製した。なお、前記分析試薬の導電率は、塩化ナトリウムを用いて、１１．３３ｍＳ／ｃｍになるように調整した。
（表１）分析試薬
成分 配合濃度
ＡＤＡ−緩衝液（ｐＨ７．４） ３０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化ラウリルトリメチルアンモニウム ０．７５ｗ／ｖ％
塩化セチルトリメチルアンモニウム ０．１ｗ／ｖ％
サポニン ０．１８ｗ／ｖ％
クエン酸ナトリウム ０．２５ｗ／ｖ％
亜硝酸ナトリウム ０．０５ｗ／ｖ％
スクロースモノラウレート ０．０１２５ｗ／ｖ％
成分 配合濃度
ＡＤＡ−緩衝液（ｐＨ７．４） ３０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化ラウリルトリメチルアンモニウム ０．７５ｗ／ｖ％
塩化セチルトリメチルアンモニウム ０．１ｗ／ｖ％
サポニン ０．１８ｗ／ｖ％
クエン酸ナトリウム ０．２５ｗ／ｖ％
亜硝酸ナトリウム ０．０５ｗ／ｖ％
スクロースモノラウレート ０．０１２５ｗ／ｖ％
つぎに、前記主槽９に、前記分析試薬２４００μＬを入れ、前記副槽１０を、前記分析試薬で満たした。前記主槽９に、全血１００μＬを加えて撹拌し、前記分析試薬と反応させた。本例において、全血の希釈率は２５倍であった。すなわち、本例では、試料希釈率が低希釈率の条件下で、白血球を分析した。つぎに、前記試料と前記分析試薬とを３０秒間反応させた後、前記主槽９および前記副槽１０に設置配置された電極１２および１３間を５Ｖで印加し、吸引部１１のポンプにより、１４μＬ／３０秒の流速で１０秒間吸引した。前記１０秒間に、前記試料と前記分析試薬との混合液が、前記細孔１４を通過するときに発生するパルスを、自作の電気的検出器（図示せず）を用いて計測した。得られたパルス高さを横軸とし、パルス数を縦軸とした、白血球の粒度分布を示すヒストグラムを作成した。前記パルスの高さから、小サイズ（リンパ球)、中サイズ（単球）、大サイズ（顆粒球）の３サイズに、白血球を分類した。なお、前記分類において、前記小サイズは、ヒストグラム左端の電気的ノイズの山の次に現れる１番目の山部分とし、前記大サイズは、前記電気的ノイズの山から数えて、２番目の山部分からヒストグラム右端までの部分とし、中サイズは、前記小サイズの山と前記大サイズの山の間に表れる谷部分とした。前記３サイズのパルス数を各々積算して、全パルス数に占める比率（ｎ）をそれぞれ算出した。
さらに、反応開始６０秒後から１０秒間に得られるパルスを計測する以外は、前述と同様にして、各サイズの白血球の比率（ｍ）を算出した。下記式（１）を用いて、反応時間３０秒および６０秒における各比率の変化率ｋ（％）を算出した。
ｋ（％）＝ｍ／ｎ×１００ ・・・（１）
ｍ＝反応時間を６０秒としたときの各サイズの白血球の比率（％）
ｎ＝反応時間を３０秒としたときの各サイズの白血球の比率（％）
ｍ＝反応時間を６０秒としたときの各サイズの白血球の比率（％）
ｎ＝反応時間を３０秒としたときの各サイズの白血球の比率（％）
（実施例２）
本例では、前記試料として、ヘマトクリット値が３９．２％のヒト全血を用いた以外は、実施例１と同様にして、白血球を測定し、前記比率および前記変化率を算出した。
本例では、前記試料として、ヘマトクリット値が３９．２％のヒト全血を用いた以外は、実施例１と同様にして、白血球を測定し、前記比率および前記変化率を算出した。
実施例１および実施例２における、各白血球の前記比率および前記変化率を、下記表２に示す。また、実施例１における、白血球の粒度分布を示すヒストグラムを、図３に示す。図３（Ａ）は、反応時間を３０秒としたときの白血球の粒度分布を示すヒストグラムであり、図３（Ｂ）は、反応時間を６０秒としたときの白血球の粒度分布を示すヒストグラムであり、図３（Ｃ）は、前記２つのヒストグラムを重ねて表したヒストグラムである。そして、実施例２における、白血球の粒度分布を示すヒストグラムを、図４に示す。実施例１と同様に、図４（Ａ）は、反応時間を３０秒としたときの白血球の粒度分布を示すヒストグラムであり、図４（Ｂ）は、反応時間を６０秒としたときの白血球の粒度分布を示すヒストグラムであり、図４（Ｃ）は、前記２つのヒストグラムを重ねて表したヒストグラムである。図３（Ｃ）および図４（Ｃ）において、（ａ）の実線は、反応時間を３０秒としたときのヒストグラムであり、（ｂ）の実線は、反応時間を６０秒としたときのヒストグラムである。図３および４のヒストグラムにおいて、横軸は、パルス高さであり、縦軸は、パルス数である。また、図３（Ａ）、図３（Ｂ）、図４（Ａ）および図４（Ｂ）のヒストグラムにおいて、パルス高さがａ−ｂ範囲の白血球を前記小サイズ（リンパ球）とし、ｂ−ｃ範囲の白血球を前記中サイズ（単球）とし、ｃ以上（ｃより右側）の範囲の白血球を前記大サイズ（顆粒球）とした。
図３（Ｃ）および図４（Ｃ）に示すように、両実施例共に、反応時間によるヒストグラムの差異は小さく、上記表２に示すように、反応時間による差異を示す前記変化率は、両実施例共に、ほぼ１００％であった。このようにスクロースモノラウレートを含有する分析試薬を使用すると、試料と分析試薬の反応時間による測定結果の差異が小さく、白血球を安定して測定できた。実施例１と実施例２は、ヘマトクリット値が異なる全血を使用したが、両実施例共に、前述のような結果が得られたことから、ヘマトクリット値の影響を回避して、白血球を安定に測定できることがわかった。
（比較例１）
本例では、前記実施例１の分析試薬からスクロースモノラウレートのみを除いた分析試薬を用いた以外は、実施例１と同様にして、白血球を測定し、前記比率および前記変化率を算出した。
本例では、前記実施例１の分析試薬からスクロースモノラウレートのみを除いた分析試薬を用いた以外は、実施例１と同様にして、白血球を測定し、前記比率および前記変化率を算出した。
（比較例２）
本例では、前記試料として、ヘマトクリット値が３９．２％のヒト全血を用いた以外は、比較例１と同様にして、白血球を測定し、前記比率および前記変化率を算出した。
本例では、前記試料として、ヘマトクリット値が３９．２％のヒト全血を用いた以外は、比較例１と同様にして、白血球を測定し、前記比率および前記変化率を算出した。
比較例１および比較例２における、前記比率および前記変化率を、下記表３に示す。また、比較例１における、白血球の粒度分布を示すヒストグラムを、図５に示す。図５（Ａ）は、反応時間を３０秒としたときの白血球の粒度分布を示すヒストグラムであり、図５(Ｂ)は、反応時間を６０秒としたときの白血球の粒度分布を示すヒストグラムであり、図５（Ｃ）は、前記２つのヒストグラムを重ねて表したヒストグラムである。そして、比較例２における、白血球の粒度分布を示すヒストグラムを、図６に示す。比較例１と同様に、図６（Ａ）は、反応時間を３０秒としたときの白血球の粒度分布を示すヒストグラムであり、図６（Ｂ）は、反応時間を６０秒としたときの白血球の粒度分布を示すヒストグラムであり、図６（Ｃ）は、前記２つのヒストグラムを重ねて表したヒストグラムである。図５（Ｃ）および図６（Ｃ）において、（ａ）の実線は、反応時間を３０秒としたときのヒストグラムであり、（ｂ）の実線は、反応時間を６０秒としたときのヒストグラムである。図５および６のヒストグラムにおいて、横軸は、パルス高さであり、縦軸は、パルス数である。また、図５（Ａ）、図５（Ｂ）、図６（Ａ）および図６（Ｂ）のヒストグラムにおいて、前述と同様に、パルス高さがａ−ｂ範囲の白血球を前記小サイズ（リンパ球）とし、ｂ−ｃ範囲の白血球を前記中サイズ（単球）とし、ｃ以上（ｃより右側）の範囲の白血球を前記大サイズ（顆粒球）とした。
比較例１では、図５（Ｃ）に示すように、試料と分析試薬の反応時間によるヒストグラムの差異が大きく、前記表３に示すように、変化率は、６９．２〜１９７．８％とばらつきがみられ、白血球を安定して分析できなかった。一方、比較例２では、比較例１に比べ、図６（Ｃ）に示すように、試料と分析試薬の反応時間によるヒストグラムの差異が小さく、前記表３に示すように、変化率は、８９．０〜１０２．０％とばらつきが小さく、白血球を安定して分析できた。スクロースモノラウレートを含まない分析試薬を使用した比較例１と比較例２は、このように、試料のヘマトクリット値が異なる場合に、測定結果にばらつきが生じたことから、安定して白血球を分析できなかった。
以上の結果より、希釈率が低く、かつ流速が遅い場合でも、実施例１および２のように、スクロースモノラウレートを含む分析試薬を用いると、ヘマトクリット値に影響されず、白血球を安定して分析可能であった。他方、希釈率が低く、かつ流速が遅い場合に、比較例１および２のように、スクロースモノラウレートを含まない分析試薬を用いると、ヘマトクリット値の影響を受け、測定結果にばらつきが生じ、白血球を安定して分析できなかった。
（実施例３）
本例では、下記表４に示す添加試薬を添加した分析試薬を用い、以下の手順により、白血球を測定した。なお、本例の測定では、図７に示す白血球分析装置８８を用いた。前記白血球分析装置８８において、細孔を含む領域は、図８に示すとおりである。なお、前記白血球分析装置８８において、前記主槽９の容積は、約７００μＬであり、前記副槽１０の容積は、約１００μＬであり、前記定量部１５の容積は、約３００μＬであり、前記撹拌槽１７の容積は、約４００μＬであった。また、図８に示す前記細孔８４は、直径が、１００μｍ、長さが、１００μｍの貫通孔であった。前記電極１２および１３は、直径１μｍの白金を用いた。前記電極１２および１３間には、電圧器を用い、３０Ｖの電圧を印加した。そして、前記試料が、前記細孔８４の通過時に発生するパルス（インピーダンス変化）を、３０Ｖ、５ゲインに設定したアンプを使用して測定した。また、血液試料として、ヘマトクリット値が４１．６％のヒト全血を用いた。本例では、前記ヒト全血を、生理食塩水（０．９ｗ／ｖ％、ナカライテスク社製）で１００倍希釈し、希釈試料を調製した。
本例では、下記表４に示す添加試薬を添加した分析試薬を用い、以下の手順により、白血球を測定した。なお、本例の測定では、図７に示す白血球分析装置８８を用いた。前記白血球分析装置８８において、細孔を含む領域は、図８に示すとおりである。なお、前記白血球分析装置８８において、前記主槽９の容積は、約７００μＬであり、前記副槽１０の容積は、約１００μＬであり、前記定量部１５の容積は、約３００μＬであり、前記撹拌槽１７の容積は、約４００μＬであった。また、図８に示す前記細孔８４は、直径が、１００μｍ、長さが、１００μｍの貫通孔であった。前記電極１２および１３は、直径１μｍの白金を用いた。前記電極１２および１３間には、電圧器を用い、３０Ｖの電圧を印加した。そして、前記試料が、前記細孔８４の通過時に発生するパルス（インピーダンス変化）を、３０Ｖ、５ゲインに設定したアンプを使用して測定した。また、血液試料として、ヘマトクリット値が４１．６％のヒト全血を用いた。本例では、前記ヒト全血を、生理食塩水（０．９ｗ／ｖ％、ナカライテスク社製）で１００倍希釈し、希釈試料を調製した。
（表４）
例 添加試薬名 製造会社名
実施例３−１ スクロースラウレート 同仁化学研究所社製
実施例３−２ スクロースモノラウレート 同仁化学研究所社製
実施例３−３ スクロースモノカプレート 同仁化学研究所社製
実施例３−４ ドデシルマルトシド 同仁化学研究所社製
比較例３−１ 未添加
比較例３−２ 塩化ラウリルトリメチルアンモニウム ナカライテスク社製
比較例３−３ ポリオキシエチレンラウリルエーテル（３０％溶液）
（商品名：Ｂｒｉｇ ３５） ナカライテスク社製
例 添加試薬名 製造会社名
実施例３−１ スクロースラウレート 同仁化学研究所社製
実施例３−２ スクロースモノラウレート 同仁化学研究所社製
実施例３−３ スクロースモノカプレート 同仁化学研究所社製
実施例３−４ ドデシルマルトシド 同仁化学研究所社製
比較例３−１ 未添加
比較例３−２ 塩化ラウリルトリメチルアンモニウム ナカライテスク社製
比較例３−３ ポリオキシエチレンラウリルエーテル（３０％溶液）
（商品名：Ｂｒｉｇ ３５） ナカライテスク社製
まず、下記表５に示す組成の基本試薬を調製した。同表において、配合濃度は、分析試薬における各成分の濃度である。また、同表において、最終濃度は、本例の分析試薬と前記試料とを混合した混合液中における濃度である。なお、前記基本試薬の導電率は、塩化ナトリウムを用いて、１８ｍＳ／ｃｍになるように調整した。そして、前記基本試薬に、前記表４記載の各添加試薬を０．１ｗ／ｖ％の濃度になるように添加し、実施例３−１〜３−４および比較例３−１〜３−３の各分析試薬を調製した。なお、本例において、実施例３−１の分析試薬に添加した前記スクロースラウレートは、スクロースモノラウレート（モノエステル）を約８０〜９０体積％含み、スクロースジラウレートまたはスクローストリラウレート（ジエステルまたはトリエステル）を約１０〜２０体積％含む混合物であった。
（表５）基本試薬
成分 配合濃度 最終濃度
（ｍｍｏｌ／Ｌ） （ｍｍｏｌ／Ｌ）
リン酸緩衝液（ｐＨ７．５） ８３ ２５
塩化ラウリルトリメチルアンモニウム ４３ １２．８８
塩化セチルトリメチルアンモニウム ２ ０．６２５
成分 配合濃度 最終濃度
（ｍｍｏｌ／Ｌ） （ｍｍｏｌ／Ｌ）
リン酸緩衝液（ｐＨ７．５） ８３ ２５
塩化ラウリルトリメチルアンモニウム ４３ １２．８８
塩化セチルトリメチルアンモニウム ２ ０．６２５
つぎに、前記主槽９に、前記希釈試料３５０μＬを注入した。前記白血球分析装置８８の前記吸引パイプ１９に連結した前記シリンジ（図示せず）により、吸引速度４００μＬ／秒で減圧（吸引）し、前記試料を前記撹拌槽１７に導入した。つぎに、前記主槽９に、前記各分析試薬１５０μＬを注入した。前記シリンジにより、吐出速度４００μＬ／秒で加圧（吐出）し、前記試料を前記主槽９に導入した。そして、前記シリンジにより、４００μＬ／秒の速度で、３５０μＬ吸引し、ついで３５０μＬ吐出する操作を、２回行った。これにより、前記試料と前記分析試薬とを混合した。この混合液を前記主槽９内で１分間静置した。なお、前記混合液中の前記各添加試薬の濃度（最終濃度）は、それぞれ０．０３ｗ／ｖ％であった。つぎに、前記電極１２および１３間に電圧を印加し、前記シリンジにより吐出し、約２．８μＬ／秒の速度で前記混合液３００μＬを、前記主槽９から前記副槽１０に移動させた。前記試料が、前記細孔８４の通過時に発生するパルス（インピーダンス変化）を、自作の電気的検出器（図示せず）を用いて計測した。パルスデータを７点移動平均し、前記移動平均したパルス高さを横軸とし、前記移動平均したパルス数を縦軸とした、白血球の粒度分布を示すヒストグラムを作成した。前記パルスの高さから、小サイズ（リンパ球)、中サイズ（単球）、大サイズ（顆粒球）の３サイズに、白血球を分類した。なお、前記分類において、前記小サイズは、ヒストグラム左端の電気的ノイズの山の次に現れる１番目の山部分とし、前記大サイズは、前記電気的ノイズの山から数えて、２番目の山部分からヒストグラム右端までの部分とし、中サイズは、前記小サイズの山と前記大サイズの山の間に表れる谷部分とした。前記３サイズのパルス数を各々積算して、全パルス数に占める比率をそれぞれ算出した。
図９、１０および下記表６に、前記表４記載の添加試薬を添加した各分析試薬を用いた白血球の分析結果を示す。図９（Ａ）〜（Ｃ）は、前記各比較例の分析試薬を用いた分析による、白血球の粒度分布を示すヒストグラムである。図９（Ａ）は比較例３−１（基本試薬）、図９（Ｂ）は比較例３−２（塩化ラウリルトリメチルアンモニウム添加分析試薬）、図９（Ｃ）は比較例３−３（ポリオキシエチレンラウリルエーテル添加分析試薬）の分析試薬を用いた分析結果を示すヒストグラムである。また、図１０（Ａ）〜（Ｄ）は、前記各実施例の分析試薬を用いた分析による、白血球の粒度分布を示すヒストグラムである。図１０（Ａ）は実施例３−１（スクロースラウレート添加分析試薬）、図１０（Ｂ）は実施例３−２（スクロースモノラウレート添加分析試薬）、図１０（Ｃ）は実施例３−３（スクロースモノカプレート添加分析試薬）、図１０（Ｄ）は実施例３−４（ドデシルマルトシド添加分析試薬）の分析試薬を用いた分析結果を示すヒストグラムである。図９および図１０のヒストグラムにおいて、横軸は、パルス高さであり、縦軸は、パルス数である。また、前記ヒストグラムにおいて、パルス高さがエリア２の白血球を前記小サイズ（リンパ球）とし、エリア３の白血球を前記中サイズ（単球）とし、エリア４の白血球を前記大サイズ（顆粒球）とした。なお、エリア１は、前記白血球以外の血液成分（ノイズ）であり、主な成分は、例えば、赤血球の溶解物があげられる。また、下記表６は、前記各分析試薬を用いた分析による、前記各エリアのパルス範囲、パルス数およびその比率である。
図９（Ａ）に示すように、比較例３−１の非イオン性界面活性剤未添加の前記基本試薬は、前記エリア１（ノイズ）および前記エリア２（リンパ球）間の谷が小さく、前記エリア１（ノイズ）と前記エリア２（リンパ球）の分離精度が低かった。また、図９（Ｂ）に示すように、前記塩化ラウリルトリメチルアンモニウムを添加した比較例３−２の分析試薬は、前記エリア１（ノイズ）および前記エリア２（リンパ球）間の谷が小さく、かつ、前記エリア４（顆粒球）のピークが、前記基本試薬に比べてさらに小さくなった。図９（Ｃ）に示すように、前記ポリオキシエチレンラウリルエーテルを添加した比較例３−３の分析試薬は、前記エリア１（ノイズ）および前記エリア２（リンパ球）間の谷が小さく、かつ、前記エリア２（リンパ球）のピークが小さくなった。これに対して、図１０（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、前記スクロースラウレート、スクロースモノラウレート、スクロースモノカプレートおよびドデシルマルトシドの非イオン性界面活性剤を添加した実施例３−１〜３−４の分析試薬は、前記比較例３−１の基本試薬と比べて、前記エリア１（ノイズ）および前記エリア２（リンパ球）間の谷が大きくなり、前記エリア２（リンパ球）のピークが減少せず、前記エリア４（顆粒球）のピークが明確になった。すなわち、前記非イオン性界面活性剤の添加により、前記ノイズと前記リンパ球の分離精度が向上し、かつ、前記顆粒球の分離精度が向上した。
（実施例４）
本例では、前記基本試薬中の前記塩化ラウリルトリメチルアンモニウムの最終濃度を１２．３ｍｍｏｌ／Ｌとし、前記スクロースラウレートを、前記表５の基本試薬に添加した各分析試薬を用いた以外は、実施例３と同様にして、白血球を測定した。なお、本例の分析試薬における、前記スクロースラウレートの添加濃度を、下記表７に示す。下記表７において、最終濃度は、本例の分析試薬と試料とを混合した混合液中の前記スクロースラウレート濃度である。
本例では、前記基本試薬中の前記塩化ラウリルトリメチルアンモニウムの最終濃度を１２．３ｍｍｏｌ／Ｌとし、前記スクロースラウレートを、前記表５の基本試薬に添加した各分析試薬を用いた以外は、実施例３と同様にして、白血球を測定した。なお、本例の分析試薬における、前記スクロースラウレートの添加濃度を、下記表７に示す。下記表７において、最終濃度は、本例の分析試薬と試料とを混合した混合液中の前記スクロースラウレート濃度である。
（表７）
例 スクロースラウレート
添加濃度（ｗ／ｖ％） 最終濃度（ｗ／ｖ％）
比較例４（基本試薬） ０（未添加） ０（未添加）
実施例４−１ ０．０１２５ ０．００３８
実施例４−２ ０．０２５ ０．００７５
実施例４−３ ０．０５ ０．０１５
実施例４−４ ０．１ ０．０３
実施例４−５ ０．２ ０．０６
例 スクロースラウレート
添加濃度（ｗ／ｖ％） 最終濃度（ｗ／ｖ％）
比較例４（基本試薬） ０（未添加） ０（未添加）
実施例４−１ ０．０１２５ ０．００３８
実施例４−２ ０．０２５ ０．００７５
実施例４−３ ０．０５ ０．０１５
実施例４−４ ０．１ ０．０３
実施例４−５ ０．２ ０．０６
図１１および下記表８に、比較例４および実施例４−１〜４−５における白血球の分析結果を示す。図１１（Ａ）〜（Ｆ）は、前記スクロースラウレートを前記所定濃度で添加した分析試薬を用いた分析による、白血球の粒度分布を示すヒストグラムである。図１１（Ａ）は比較例４（基本試薬）、図１１（Ｂ）は実施例４−１、図１１（Ｃ）は実施例４−２、図１１（Ｄ）は実施例４−３、図１１（Ｅ）は実施例４−４、図１１（Ｆ）は実施例４−５の分析試薬を用いた分析結果を示すヒストグラムである。図１１（Ａ）〜（Ｆ）のヒストグラムにおいて、横軸は、パルス高さであり、縦軸は、パルス数である。また、前記ヒストグラムにおいて、パルス高さがエリア２の白血球を前記小サイズ（リンパ球）とし、エリア３の白血球を前記中サイズ（単球）とし、エリア４の白血球を前記大サイズ（顆粒球）とした。なお、エリア１は、前記白血球以外の血液成分（ノイズ）である。また、下記表８は、前記各分析試薬を用いた分析による、前記各エリアのパルス範囲、パルス数およびその比率である。
図１１（Ａ）に示すように、前記比較例４の基本試薬は、前記エリア１（ノイズ）および前記エリア２（リンパ球）間の谷が小さく、前記エリア１（ノイズ）と前記エリア２（リンパ球）の分離精度が低かった。これに対して、図１１（Ｂ）〜（Ｆ）に示すように、前記スクロースラウレートを含む分析試薬によれば、前記エリア１（ノイズ）および前記エリア２（リンパ球）間の谷の高さが低くなり、前記ノイズと前記リンパ球の分離精度が向上した。中でも、前記混合液における前記スクロースラウレートの最終濃度が０．００７５〜０．０６ｗ／ｖ％の場合（同図（Ｃ）〜（Ｆ））に、この分離精度はより高くなり、０．０３％の場合（同図（Ｅ））に最も高かった。
このように、親水性部として糖残基を有し、疎水性部として脂肪鎖を有する非イオン性界面活性剤を含む本発明の分析試薬を用いることにより、例えば、試料の希釈率が低い場合や分析時の試料の流速が遅い場合であっても、前記白血球を安定的に測定可能である。また、本発明の分析試薬を用いることにより、例えば、前述の場合であっても、高精度に測定可能である。
本発明の分析方法は、例えば、μＴＡＳ等のように、希釈率が低い場合、または、流速が遅い分析条件下の場合でも、白血球を安定して分析可能である。本発明は、臨床検査、生化学検査、医学研究等の白血球を分析する全ての分野に適用することができ、その用途は限定されず、広い分野に適用可能である。
１ カートリッジ
２ 上基板
３ 下基板
４ 試料計量部
４１ 試料導入部
４２ 試料導入流路
４３ 分岐部
４４ オーバーフロー流路
４５、５５、５８、６５ ドレイン
４６ 試料計量流路
４７ オリフィス
５ 希釈部
５１ 試薬槽
５２ 試薬導入流路
５３ 分岐部
５４ オーバーフロー流路
５６ 試薬計量流路
５７ テーパー部
５９ 希釈槽
６ 分析部
６１、６２ 電極、電極配置部
１４、６３、８４ 細孔
６４ 流量計測流路
７ コネクタ
８、８８ 白血球分析装置
９ 主槽
１０ 副槽
１１ 吸引部
１２、１３ 電極
１５ 定量部
１６ 基板部
１７ 撹拌槽
１８ 撹拌パイプ
１９ 吸引パイプ
２１ａ、２１ｂ 貫通孔、導入口
２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ、２２ｅ 貫通孔
９０ 主槽部
１００ 副槽部
１６０ 撹拌部
９１ａ、９１ｂ、１０１ａ、１０１ｂ、１６１ａ、１６１ｂ 基板
８４０ 弾性体
２ 上基板
３ 下基板
４ 試料計量部
４１ 試料導入部
４２ 試料導入流路
４３ 分岐部
４４ オーバーフロー流路
４５、５５、５８、６５ ドレイン
４６ 試料計量流路
４７ オリフィス
５ 希釈部
５１ 試薬槽
５２ 試薬導入流路
５３ 分岐部
５４ オーバーフロー流路
５６ 試薬計量流路
５７ テーパー部
５９ 希釈槽
６ 分析部
６１、６２ 電極、電極配置部
１４、６３、８４ 細孔
６４ 流量計測流路
７ コネクタ
８、８８ 白血球分析装置
９ 主槽
１０ 副槽
１１ 吸引部
１２、１３ 電極
１５ 定量部
１６ 基板部
１７ 撹拌槽
１８ 撹拌パイプ
１９ 吸引パイプ
２１ａ、２１ｂ 貫通孔、導入口
２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ、２２ｅ 貫通孔
９０ 主槽部
１００ 副槽部
１６０ 撹拌部
９１ａ、９１ｂ、１０１ａ、１０１ｂ、１６１ａ、１６１ｂ 基板
８４０ 弾性体
Claims (21)
- 白血球および赤血球を含む試料と、白血球に反応する界面活性剤を含む分析試薬とを混合する混合工程と、
前記試料と前記分析試薬との混合液を、細孔を通過させ、前記通過時に検出される信号を測定し、前記試料中の白血球を分類および計数する測定工程とを含む白血球の分析方法であって、
前記分析試薬が、さらに、非イオン性界面活性剤を含み、
前記非イオン性界面活性剤が、親水性部として糖残基を有し、疎水性部として脂肪鎖を有することを特徴とする白血球の分析方法。 - 前記糖残基が、二糖の残基である、請求の範囲１記載の白血球の分析方法。
- 前記脂肪鎖が、脂肪酸残基またはアルキル基である、請求の範囲１記載の白血球の分析方法。
- 前記非イオン性界面活性剤が、スクロースモノラウレート、スクロースラウレート、スクロースモノカプレートおよびドデシルマルトシドからなる群から選択される少なくとも一つである、請求の範囲１記載の白血球の分析方法。
- 前記試料と前記分析試薬との前記混合液中の前記非イオン性界面活性剤の濃度が、
０．００１〜５ｗ／ｖ％の範囲である、請求の範囲１記載の白血球の分析方法。 - 前記白血球に反応する界面活性剤が、第四級アンモニウム塩である、請求の範囲１記載の白血球の分析方法。
- 前記試料と前記分析試薬との前記混合液中の、前記白血球に反応する界面活性剤の濃度が、０．０１〜５ｗ／ｖ％の範囲である、請求の範囲１記載の白血球の分析方法。
- 前記分析試薬が、さらに、赤血球に反応する界面活性剤を含む、請求の範囲１記載の白血球の分析方法。
- 前記赤血球に反応する界面活性剤が、サポニンである、請求の範囲８記載の白血球の分析方法。
- 前記試料と前記分析試薬との前記混合液中の前記サポニンの濃度が、０．０５〜５ｗ／ｖ％の範囲である、請求の範囲９記載の白血球の分析方法。
- 前記混合工程において、前記試料（Ｘ）と前記分析試薬（Ｙ）との混合体積比（Ｘ：Ｙ）が、１：０．４〜１：９９の範囲である、請求の範囲１記載の白血球の分析方法。
- 前記測定工程において、前記白血球を、その体積により３種類に分類する請求の範囲１記載の白血球の分析方法。
- 前記測定工程において、
前記細孔を有するカートリッジを使用し、
前記混合液を、前記カートリッジ内の前記細孔を通過させる、請求の範囲１記載の分析方法。 - 前記カートリッジが、微小分析システムである、請求の範囲１３記載の分析方法。
- 請求の範囲１記載の分析方法に使用するための、白血球に反応する界面活性剤を含む分析試薬であって、
さらに、非イオン性界面活性剤を含み、
前記非イオン性界面活性剤が、親水性部として糖残基を有し、疎水性部として脂肪鎖を有することを特徴とする分析試薬。 - 前記糖残基が、二糖である、請求の範囲１５記載の分析試薬。
- 前記脂肪鎖が、脂肪酸残基またはアルキル基である、請求の範囲１５記載の分析試薬。
- 前記非イオン性界面活性剤が、スクロースモノラウレート、スクロースラウレート、スクロースモノカプレートおよびドデシルマルトシドからなる群から選択される少なくとも一つである、請求の範囲１５記載の分析試薬。
- 前記白血球に反応する界面活性剤が、第四級アンモニウム塩である、請求の範囲１５記載の分析試薬。
- 前記分析試薬が、さらに、赤血球に反応する界面活性剤を含む、請求の範囲１５記載の分析試薬。
- 前記赤血球に反応する界面活性剤が、サポニンである、請求の範囲２０記載の分析試薬。
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