JPWO1999053057A1

JPWO1999053057A1 - 筋細胞の分化に関係するタンパク質および遺伝子

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Publication number: JPWO1999053057A1
Application number: JP2000-543605A
Authority: JP
Inventors: レヌーワダワ; スニールシーカウル; ロジャーアールリデル
Original assignee: 株式会社中外分子医学研究所; 工業技術院長
Priority date: 1998-04-10
Filing date: 1999-04-09
Publication date: 2002-10-29

Abstract

(57)【要約】不死化細胞に特異的に存在するタンパク質に対する抗体を用いた抗体スクリーニングを行い、不死化細胞に特異的に発現している遺伝子の単離を試みたところ、偶然にも、所期の目的とは異なる新規な遺伝子を単離するに至った。この単離した遺伝子はデーターベース上に有意な相同性を示す遺伝子が存在しない新規な遺伝子であり、骨格筋および未分化の細胞に強く発現した。さらに該遺伝子がコードするタンパク質は、筋芽細胞の筋管への分化を抑制する活性を有し、また、腫瘍の抑制に関与する転写因子であるｐ５３のトランスアクチベーション機能を抑制した。

Description

【発明の詳細な説明】技術分野筋細胞の分化に関係する新規なタンパク質および該タンパク質をコードするＤ
ＮＡに関する。背景技術筋肉クレアチンキナーゼ，トロポニン，カベオリン３，α−アクチン及びミオ
シンといった遺伝子は、骨格筋内で優位に発現するものとして報告されている。
筋肉に特異的な遺伝子の発現を制御しているｍｙｏＤ，ミオゲニン，ｍｙｆ−５
及びＭＲＦ−４／ヘルクリン／ｍｙｆ−６のような筋肉に特異的な転写要因のフ
ァミリーもすでにクローン化されている。これらは、二量体化とＤＮＡへの結合
に必要とされるヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）モチーフを含むリ
ン酸化された核タンパク質であり、細胞に特異的な分化プログラムを決定してい
るらしい（ＯｌｓｏｎａｎｄＫｌｅｉｎ，（１９９４）Ｇｅｎｅｓ＆Ｄ
ｅｖ．８，１−８）。これらの因子の一つが非筋原性細胞に導入されると、成熟
筋肉細胞への分化が始まる（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂｅｔａｌ．，（１９９１）
Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：７６１−７６６）。転写因子であるｍｙｏＤファミリ
ーは、筋形成を指令し、増殖を抑制し、分化を活性化し、そして収縮性の表現型
を誘導することが明らかにされた。ｍｙｏＤ及びｍｙｆ−５が増殖している筋芽
細胞内で発現しているのに対して、ミオゲニンとＭＲＦ−４は、筋芽細胞がマイ
トジェンの消失に応じて細胞周期から離脱するまで発現しない。そのために、ｍ
ｙｏＤ及びｍｙｆ−５が筋芽細胞を増殖させる役割を持つものとして考えられて
いるのに対して、ミオゲニン及びＭＲＦ−４は筋肉の遺伝子の発現を活性化し、
維持することが明らかにされた（Ｅｍｅｒｓｏｎ，（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ
ｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．３，２６５−２７４）。その他に、ＲＢ（Ｓｈｉｉ
ｏｅｔａｌ．，（１９９６）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１２，１８３７−１８４５
、Ｗａｎｇｅｔａｌ，，（１９９７）ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５
７，３５１−３５４），ｐ２１（Ｇｕｏｅｔａｌ．，（１９９５）Ｍｏｌ．
ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１５，３８２３−３８２９），サイクリンＤ，ｃｄｋ２，
ｃｄｋ４（Ｋｉｅｓｓｅｔａｌ．，（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１０，
１５９−１６６）や腫瘍抑制遺伝子ｐ５３（Ｓｏｄｄｕｅｔａｌ，（１９９
６）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１３４，１９３−２０４）のような細胞周期調節
タンパク質が、筋肉の分化プログラムと関係づけられている。また、最近になっ
て、カベオリン−３（Ｓｏｎｇｅｔａｌ．，（１９９６）Ｊ．ＣｅｌｌＢ
ｉｏｌ．２７１，１５１６０−１５１６５），α−ディストログリカン（Ｋｏｓ
ｔｒｏｍｉｎｏｖａａｎｄＴａｎｚｅｒ，（１９９５）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉ
ｏｃｈｅｍ．５８，５２７−５３４）及びＤＮＡメチル基転移酵素（Ｔａｋａｇ
ｉｅｔａｌ．，（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３１，２８２
−２９１）もまた、筋原性の分化に積極的な役割を果たしていることが判明した
。発明の開示本発明は、筋細胞の分化に関係する新規なタンパク質および遺伝子、並びにそ
れらの製造および用途を提供することを課題とする。本発明者等は、不死化細胞に特異的に存在するタンパク質に対する抗体を用い
た抗体スクリーニングを行い、不死化細胞に特異的に発現している遺伝子の単離
を試みたところ、偶然にも、所期の目的とは異なる新規な遺伝子を単離するに至
った。本発明者等は、この単離した遺伝子につき解析を行ったところ、該遺伝子
はデーターベース上に有意な相同性を示す遺伝子が存在しない新規な遺伝子であ
り、骨格筋および未分化の細胞に強く発現することを見いだした。さらに本発明
者等は該遺伝子がコードするタンパク質につき解析を進めたところ、該タンパク
質が筋芽細胞の筋管への分化を抑制する活性を有することを見いだした。さらに
、該タンパク質が腫瘍の抑制に関与する転写因子であるｐ５３と相互作用し、ｐ
５３のトランスアクチベーション機能を抑制することを見いだした。即ち、本発明は、筋芽細胞の筋管への分化を抑制する活性を有する新規なタン
パク質およびその遺伝子、並びにそれらの製造および用途に関し、より具体的に
は、（１）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または該タン
パク質中のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、若し
くは付加したアミノ酸配列を有し、筋芽細胞の筋管への分化を抑制する活性を有
するタンパク質、（２）配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤ
ＮＡがコードするタンパク質であって、筋芽細胞の筋管への分化を抑制する活性
を有するタンパク質、（３）（１）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、（４）配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤ
ＮＡであって、筋芽細胞の筋管への分化を抑制する活性を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡ、（５）（３）に記載のＤＮＡを含むベクター、（６）（３）に記載のＤＮＡを発現可能に保持する形質転換体、（７）（６）に記載の形質転換体を培養することを特徴とする、（１）または
（２）に記載のタンパク質の生産方法、（８）（１）または（２）に記載のタンパク質に結合する抗体、（９）（１）または（２）に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニ
ング方法であって、（ａ）該タンパク質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、（ｂ）該タンパク質またはその部分ペプチドと被検試料との結合活性を検出する
工程、（ｃ）該タンパク質またはその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選
択する工程、を含む方法、（１０）（９）に記載の方法により単離されうる、（１）または（２）に記載の
タンパク質に結合する化合物、（１１）（１）または（２）に記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化
合物のスクリーニング方法であって、（ａ）被検試料の存在下で、筋芽細胞に（１）または（２）に記載のタンパク質
を接触させる工程、（ｂ）該細胞の筋管細胞への分化を検出する工程、（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、（１）または（２）に記載
のタンパク質による該分化の抑制を増強または減弱する化合物を選択する工程、を含む方法、（１２）（１）または（２）に記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化
合物のスクリーニング方法であって、（ａ）該タンパク質を発現するベクター、ｐ５３を発現するベクター、およびｐ
５３に応答してレポーター遺伝子を発現するベクターが導入されたｐ５３欠損細
胞を提供する工程、（ｂ）該細胞に被検試料を接触させる工程、（ｃ）該細胞におけるレポーター活性を検出する工程、および（ｄ）被検試料を細胞に接触させない場合（対照）と比較して、該レポーター活
性を低下または増加させる化合物を選択する工程、を含む方法、（１３）（１１）または（１２）に記載の方法により単離しうる、（１）または
（２）に記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物、（１４）配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡと特異的にハイブリダ
イズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するＤＮＡ、に関する。本発明は、筋芽細胞の筋管への分化を抑制する活性を有する新規なタンパク質
「ストリアミン（ｓｔｒｉａｍｉｎ）」に関する（本発明者らは、原出願（特願
平１０−１１５９７５）において、該タンパク質をストリアチン（ｓｔｒｉａｔ
ｉｎ）と称していたが、その後、同一名称の他のタンパク質の存在を確認したた
め、ストリアミン（ｓｔｒｉａｍｉｎ）への名称の変更を行った）。マウス由来
のストリアミンｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、該ｃＤＮＡによりコード
されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。配列番号：１に示すよ
うに、マウス由来のストリアミンｃＤＮＡは、１４９アミノ酸からなるタンパク
質をコードするＯＲＦを有する。ストリアミンタンパク質のインビトロ翻訳産物
の免疫沈降解析（図２Ａ）および組み換えストリアミンタンパク質のウェスタン
ブロット解析（図２Ｂ）において、マウス由来のストリアミンタンパク質は約１
８ｋＤａの分子量を示した。また、ノーザンブロット解析によりストリアミン遺伝子は、未分化の細胞にお
いて発現し、筋芽細胞が筋管へ分化する間その発現が抑制されていることが示さ
れた（図４Ｃ）。さらに、該遺伝子の高発現により、実際に筋芽細胞の筋管への
分化が抑制された（図５）。これら事実からストリアミンタンパク質は、細胞の
未分化状態の維持に関係していると考えられる。また、ストリアミンタンパク質の発現は、筋分化の間その発現が正の調節を受
けていることが知られている転写因子「ｐ５３」のトランスアクチベーション機
能を阻害した（図７、８）。さらに、ストリアミンタンパク質は、ｐ５３とＩｎ
ｖｉｖｏおよびＩｎｖｉｔｒｏにおいて、相互作用することが示された（図
９、１０）。試験管内筋形成の過程でｐ５３活性が顕著に増加することが報告さ
れているが、ストリアミンによるｐ５３活件の抑制は、筋形成におけるストリア
ミンのダウンレギュレーションとよく符合する。これらの事実はストリアミンが
ｐ５３との直接的な相互作用によって筋形成に影響していることを示唆している
。本発明のストリアミンタンパク質は、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタ
ンパク質として、また天然のタンパク質として調製することができる。組換えタ
ンパク質は、例えば、後述するようにストリアミンタンパク質をコードするＤＮ
Ａで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。一方、
天然のタンパク質は、当業者に周知の方法、例えば、後述のストリアミンタンパ
ク質に結合する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うことによ
り、骨格筋などの組織から単離することが可能である。抗体は、ポリクローナル
抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体であれ
ば、例えば、ストリアミンタンパク質をウサギなどの小動物に免疫し血清を得て
、これを、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイ
オン交換クロマトグラフィー、ストリアミンタンパク質をカップリングしたアフ
ィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。また、
モノクローナル抗体であれば、ストリアミンタンパク質をマウスなどの小動物に
免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞にし、マウス
ミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これによ
りできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、これらタンパク質に対する抗体
を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔
内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例え
ば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマ
トグラフィー、ストアリアチンタンパク質をカップリングしたアフィニティーカ
ラムなどにより精製することで調製することが可能である。なお、得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療など）で使用する場合に
は、免疫原性を低下させるため、ヒト型化抗体またはヒト抗体を用いると有効で
ある。抗体をヒト型化する方法としては、モノクロナール抗体生産細胞から抗体
遺伝子をクローニングし、その抗原決定部位を既存のヒト抗体に移植するＣＤＲ
グラフト法などが知られている。また、免疫系をヒトのものと入れ換えたマウス
を免疫して、通常のモノクロナール抗体と同様に直接ヒト抗体を作製こともでき
る。また、当業者であれば、天然型のストリアミンタンパク質のみならず、公知の
方法を用いてタンパク質中のアミノ酸の置換などを適宜行い、天然型のタンパク
質と同等の機能（例えば、筋芽細胞の筋管への分化の抑制、ｐ５３との結合活性
、ｐ５３のトランスアクチベーション機能の抑制など）を有する改変タンパク質
を調製することが可能である。また、タンパク質のアミノ酸の変異は自然界にお
いても生じることがある。このようにアミノ酸の置換、欠失、付加などにより天
然型のタンパク質に対してアミノ酸配列が異なるタンパク質であって、天然型の
タンパク質と同等の機能を有するタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれ
る。当業者に公知のアミノ酸を改変する方法としては、例えば、ＰＣＲによる部
位特異的変異誘発システム（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，
Ｍａｒｙｌａｎｄ）、オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異誘発法（Ｋｒａ
ｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄＦｒｉｔｚ，ＨＪ（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌ．，１５４：３５０−３６７）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６（１９８８））などが挙げられる
。アミノ酸の置換は、通常、１０アミノ酸以内であり、好ましくは６アミノ酸以
内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内である。調製したタンパク質における筋芽細胞の筋管への分化の抑制活性は、例えば、
マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞株の培養系（マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞株は、無血清
もしくは２％ウマ血清含有ＤＭＥＭ培地で培養すると、多核の筋管細胞へと分化
する）を利用し、被検タンパク質の存在下でＣ２Ｃ１２筋芽細胞株を培養した際
の多核の筋管細胞への分化能の測定などの方法で検出することができる（実施例
６参照）。また、調製したタンパク質におけるｐ５３との結合活性は、例えば、
ＩｎｖｉｔｒｏまたはＩｎｖｉｖｏで両タンパク質を接触させ、抗ｐ５３抗
体、調製したタンパク質に対する抗体、あるいはこれらタンパク質にタグを付加
した場合にはタグに対する抗体を用いた免疫沈降およびそれに続くウェスタンブ
ロッティングにより検出することができる（実施例１０、１１参照）。調製した
タンパク質におけるｐ５３のトランスアクチベーション機能の抑制は、例えば、
ｐ５３発現ベクターおよびｐ５３に応答してレポーター遺伝子を発現するベクタ
ーが導入された細胞内に、調製したタンパク質を発現するベクターを導入し、レ
ポーター活性を測定し、該レポーター活性を対照（調製したタンパク質を発現す
るベクターを導入しない場合）と比較することにより検出することができる（実
施例８、９参照）。また、当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ
ｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄｅｄ．９．４７−
９．５８，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９
８９）などを用いて、マウス由来のストリアミンタンパク質をコードするＤＮＡ
（配列番号：１）またはその一部を基に、これと相同性の高いＤＮＡを単離して
、該ＤＮＡからマウス由来のストリアミンタンパク質（配列番号：２）と同等の
機能を有するタンパク質を得ることも通常行いうることである。このようにマウ
ス由来のストリアミンタンパク質をコードするＤＮＡとハイブリダイズするＤＮ
Ａがコードするタンパク質であって、同等の機能を有するタンパク質（例えば、
実施例５において検出されたヒト由来の３．１ｋｂの転写産物によりコードされ
るタンパク質）も本発明のタンパク質に含まれる。ハイブリダイズするＤＮＡを
他の生物から単離する場合には、これらに制限されないが、例えば、ヒト、ラッ
ト、ウサギ、ウシなどが用いられ、特に骨格筋などの組織が単離に適している。
これにより単離されるマウス由来のストリアミンタンパク質と同等の機能を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡは、通常、マウス由来のストリアミンタンパク
質をコードするＤＮＡ（配列番号：１）と高い相同性を有する。高い相同性とは
、アミノ酸レベルにおいて少なくとも４０％以上、好ましくは６０％以上、さら
に好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。
タンパク質の相同性を決定するには、文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄＬ
ｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８
３）８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。このような相同性の高いＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条
件の例を示せば、以下の如くである。即ち、「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＨｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎＳｏｌｕｔｉｏｎ」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、５
５℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを
添加し、３７℃から５５℃で１時間以上保温することによりハイブリダイゼーシ
ョンを行う。その後、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３
回、次いで、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を１回行う
。より好ましい条件としては、「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＨｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎＳｏｌｕｔｉｏｎ」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、６０℃で３０分
以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、６０
℃で１時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、２
ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、次いで、１ｘＳＳＣ
、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行う。さらに好ましい条件と
しては、「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＳｏｌｕｔｉ
ｏｎ」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、６８℃で３０分以上プレハイブリダイ
ゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、６８℃で１時間以上保温す
ることによりハイブリダイゼーションを行う。その後、２ｘＳＳＣ、０．１％Ｓ
ＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、次いで、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
中、５０℃で２０分の洗浄を２回行う。また、本発明は、上記本発明のストリアミンタンパク質をコードするＤＮＡに
関する。本発明のＤＮＡは、上記本発明のストリアミンタンパク質をコードしう
る限り、ｃＤＮＡの他、ゲノムＤＮＡや合成ＤＮＡなども含まれる。本発明のＤ
ＮＡは、例えば、組換えタンパク質の生産に利用しうる。即ち、本発明のＤＮＡ
（例えば、配列番号：１）を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な
細胞に導入して得た形質転換体を培養し、発現させたタンパク質を精製すること
により組換えタンパク質を調製することが可能である。組換えタンパク質の生産
に用いる細胞としては、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞な
どの哺乳類細胞、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、酵母細胞、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ
）が挙げられるが、これらに制限されない。また、細胞内で組換えタンパク質を
発現させるためのベクターは、宿主細胞に応じて変動するが、例えば、哺乳類細
胞のベクターとしてはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）やｐＥＦ−Ｂ
ＯＳ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３
２２）などが、昆虫細胞のベクターとしては「ＢＡＣ−ｔｏ−ＢＡＣｂａｃｕ
ｌｏｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ」（ＧＩＢＣＯＢＲＬ
社製）などが、酵母細胞のベクターとしては「ＰｉｃｈｉａＥｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎＫｉｔ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などが、大腸菌のベクターとし
てはｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ
ｓｙｓｔｅｍ」（Ｑｉａｇｅｎ社製）などが挙げられる。宿主細胞へのベクタ
ーの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニ
ックリポソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレ
クロポレーション法、塩化カルシウム法などの方法を用いて行うことができる。
また、形質転換体の培養は、形質転換体の性質に応じて、当業者に公知の方法で
行うことができる。得られた形質転換体からの組換えタンパク質の精製は、例え
ば、文献「ＴｈｅＱｉａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｑ
ｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ」記載の方法を用いて行うことが可
能である。また、本発明のＤＮＡは、その変異に起因する疾患の遺伝子治療に用いること
も考えられる。遺伝子治療に用いる場合には、本発明のＤＮＡをアデノウイルス
ベクター（例えば、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えば、ｐ
ＺＩＰｎｅｏ）などに挿入して、生体内に投与する。投与方法は、ｅｘｖｉｖ
ｏ法であっても、ｉｎｖｉｖｏ法であってもよい。本発明はまた、本発明のストリアミンタンパク質をコードするＤＮＡまたは該
ＤＮＡと相補的なＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖
長を有するＤＮＡに関する。「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイ
ブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件下で、他のタンパク質をコードするＤＮＡとのクロスハイブリダイゼー
ションが有意に生じないことを意味する。このようなＤＮＡには、本発明のタン
パク質をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡと相補的なＤＮＡと特異的にハイブリダ
イズし得るプローブやプライマー、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例え
ばアンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム等）が含まれる。本発明は、例えば、配列番号：２に示される塩基配列中のいずれかの箇所にハ
イブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。このアンチセンスオ
リゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：２に示される塩基配列中の連続する
少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
である。さらに好ましくは、前記連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチド
が翻訳開始コドンを含む、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用す
ることができる。このような修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエ
チルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエ
ート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。ここでいう「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの
所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補的である
もののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが配列番号：２
に示される塩基配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌク
レオチドのミスマッチが存在していてもよい。このようなＤＮＡとしては、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド配列領
域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％
、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有するものを示す。なお
、相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すれば
よい。このようなＤＮＡは、後述の実施例に記載するように本発明のタンパク質
をコードするＤＮＡを検出若しくは単離するためのプローブとして、又は増幅す
るためのプライマーとして有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、本発明のタンパク質の産
生細胞に作用して、該タンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合するこ
とにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、
本発明のタンパク質の発現を抑制することにより、結果的に本発明のタンパク質
の作用を抑制する効果を有する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、それらに対して不活性な
適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無
痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注
射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法
にしたがって調製することができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用する
か、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用
する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いること
もできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール
、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態に応
じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、０．１〜１００ｍ
ｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明のタンパク質の発現を阻害
し、従って本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することにおいて有用であ
る。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現阻害剤は、
本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することが可能である点で有用である
。また、本発明は、本発明のタンパク質を利用する、本発明のタンパク質に結合
する化合物のスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法は、（ａ）
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、（ｂ
）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドと被検試料との結合活性を検出す
る工程、（ｃ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドに結合する化合物を
選択する工程、を含む。スクリーニングに用いられる本発明のタンパク質は組換えタンパク質であって
も、天然由来のタンパク質であってもよい。また部分ペプチドであってもよい。
被験試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微
生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製タンパク質、ペ
プチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物などが挙げられる
。本発明のタンパク質を用いて、これに結合するタンパク質をスクリーニングす
る方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このよ
うなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的に
は、以下のように行うことができる。本発明のタンパク質をコードする遺伝子を
、ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐｃＤＮＡＩ，ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のプロモ
ーターの下流に挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に
用いるプロモーターとしてはＳＶ４０ｅａｒｌｙｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｒｉｇ
ｂｙＩｎＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ（ｅｄ．），ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｐ．
８３−１４１（１９８２）），ＥＦ−１ α Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＫｉｍらＧ
ｅｎｅ９１，ｐ．２１７−２２３（１９９０）），ＣＡＧｐｒｏｍｏｔｅｒ
（Ｎｉｗａｅｔａｌ．Ｇｅｎｅ１０８，ｐ．１９３−２００（１９９１）
），ＲＳＶＬＴＲｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＣｕｌｌｅｎＭｅｔｈｏｄｓｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５２，ｐ．６８４−７０４（１９８７），ＳＲ α
ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅｅｔａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．８，ｐ．４６６（１９８８）），ＣＭＶｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ
ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＳｅｅｄａｎｄＡｒｕｆｆｏＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，ｐ．３３６５−３３６９（１９８７）），ＳＶ
４０ｌａｔｅｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＧｈｅｙｓｅｎａｎｄＦｉｅｒｓＪ
．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，ｐ．３８５−３９４（１９８２）），Ａ
ｄｅｎｏｖｉｒｕｓｌａｔｅｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋａｕｆｍａｎｅｔａ
ｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，ｐ．９４６（１９８９）），ＨＳＶＴ
Ｋｐｒｏｍｏｔｅｒ等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いて
もよい。動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、
エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔａｌ．Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲ
ｅｓ．１５，１３１１−１３２６（１９８７））、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅ
ｎ，ＣａｎｄＯｋａｙａｍａ，Ｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，２７
４５−２７５２（１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ，Ｍ．
Ａ．ｅｔａｌ．Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２，５７０７−５７１７（
１９８４）；Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄＭｉｌｍａｎ，Ｇ．Ｍｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４２−１６４３（１９８５））、リポフェクチン法
（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，Ｂ．Ｃｅｌｌ７，１０２５−１０３７（１９９４）；Ｌ
ａｍｂ，Ｂ．Ｔ．ｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ５，２２−３
０（１９９３）；Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５９，２３０−２３４（１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によっ
てもよい。特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピト
ープ）を本発明のタンパク質のＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクロ
ーナル抗体の認識部位を有する融合タンパク質として本発明のタンパク質を発現
させることができる。用いるエピトープー抗体系としては市販されているものを
利用することができる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。マルチク
ローニングサイトを介して、βーガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質
、グルタチオンＳートランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などと
の融合タンパク質を発現することができるベクターが市販されている。融合タンパク質にすることにより本発明のタンパク質の性質をできるだけ変化
させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ
部分のみを導入して、融合タンパク質を調製する方法も報告されている。例えば
、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍ
ｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖タンパ
ク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７ｇｅｎｅ１０タンパク質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒ
ト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノク
ローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクロ
ーナル抗体を、本発明のタンパク質に結合するタンパク質のスクリーニングのた
めのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学１３，８５−９０（１９
９５））。免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した
細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体は本
発明のタンパク質、それと結合能を有するタンパク質、および抗体からなる。上
記エピトープに対する抗体を用いる以外に、本発明のタンパク質に対する抗体を
利用して免疫沈降を行うことも可能である。本発明のタンパク質に対する抗体は
、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクター
に導入して大腸菌内で発現させ、発現させたタンパク質を精製し、これをウサギ
やマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる
。また、合成した本発明のタンパク質の部分ペプチドを上記の動物に免疫するこ
とによって調製することもできる。免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ
ＡＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎＧＳｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈
降させることができる。また、本発明のタンパク質を、例えば、ＧＳＴなどのエ
ピトープとの融合タンパク質として調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、
本発明のタンパク質の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させるこ
とができる。免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎ
ｄＬａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙｐｕｂｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８８））記載の方法に従って、または準じて行え
ばよい。免疫沈降されたタンパク質の解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当
な濃度のゲルを用いることでタンパク質の分子量により結合していたタンパク質
を解析することができる。また、この際、一般的には本発明のタンパク質に結合
したタンパク質は、クマシー染色や銀染色といったタンパク質の通常の染色法で
は検出することは困難であるので、放射性同位元素である^３５Ｓ−メチオニンや
^３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のタンパク質を標
識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。タンパク質
の分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的のタンパク
質を精製し、その配列を決定することもできる。また、本発明のタンパク質を用いて、該タンパク質に結合するタンパク質を単
離する方法としては、例えば、ウエストウエスタンブロッティング法（Ｓｋｏｌ
ｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０）を用
いて行うことができる。すなわち、本発明のタンパク質と結合する結合タンパク
質を発現していることが予想される細胞、組織、臓器（例えば、筋芽細胞、ＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞など）よりファージベクター（λｇｔ１１，ＺＡＰなど）を用いた
ｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルタ
ーに発現させたタンパク質を固定し、標識して精製した本発明のタンパク質と上
記フィルターとを反応させ、本発明のタンパク質と結合したタンパク質を発現す
るプラークを標識により検出すればよい。本発明のタンパク質を標識する方法と
しては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、本発明のタンパク質又は
本発明のタンパク質に融合したペプチド又はポリペプチド（例えばＧＳＴなど）
に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又
は蛍光を利用する方法等が挙げられる。また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた２−ハ
イブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ａｎｄＳｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ
．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２）を用いて
行う方法が挙げられる。「ｔｗｏハイブリッドシステム」（「ＭＡＴＣＨＭＡＲ
ＫＥＲＴｗｏ−ＨｙｂｒｉｄＳｙｓｔｅｍ」，「ＭａｍｍａｌｉａｎＭＡ
ＴＣＨＭＡＫＥＲＴｗｏ−ＨｙｂｒｉｄＡｓｓａｙＫｉｔ」，「ＭＡＴＣ
ＨＭＡＫＥＲＯｎｅ−ＨｙｂｒｉｄＳｙｓｔｅｍ」（いずれもＣｌｏｎｔｅ
ｃｈ社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰＴｗｏ−ＨｙｂｒｉｄＶｅｃｔｏｒＳｙ
ｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、文献「ＤａｌｔｏｎＳ，ａｎｄ
ＴｒｅｉｓｍａｎＲ（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ
ＳＡＰ−１，ａｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｒｕｉｔｅｄｂｙｓｅｒｕｍｒｅ
ｓｐｏｎｓｅｆａｃｔｏｒｔｏｔｈｅｃ−ｆｏｓｓｅｒｕｍｒｅｓ
ｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ６８，５９７−６１２」）においては
、本発明のタンパク質をＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域と融合させて酵
母細胞の中で発現させ、本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現してい
ることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合す
る形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製する。これを上記酵母細胞に
導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵
母細胞内で本発明のタンパク質と結合するタンパク質が発現すると、両者の結合
によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。さらに
該ｃＤＮＡを大腸菌に導入してタンパク質を発現させることができる。これによ
り、本発明のタンパク質に結合するタンパク質またはその遺伝子を調製すること
も可能である。レポーター遺伝子としては、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝
子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を用いることがで
きる。本発明のタンパク質と結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティクロ
マトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、本発明のタンパク質をアフ
ィニティーカラムの担体に固定し、ここに本発明のタンパク質と結合するタンパ
ク質を発現していることが予想される被験試料を適用する。この場合の被験試料
としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被験試料を適用した
後、カラムを洗浄し、本発明のタンパク質に結合したタンパク質を調製すること
ができる。得られたタンパク質は、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡ
を合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングす
ることにより、該タンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモ
ン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン
共鳴現象を利用したバイオセンサーは本発明のタンパク質と被検化合物との間の
相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共
鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏ
ｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサ
ーを用いることにより本発明のタンパク質と被験化合物との結合を評価すること
が可能である。また、タンパク質に限らず、本発明のタンパク質に結合する化合物を単離する
方法としては、例えば、固定した本発明のタンパク質に、合成化合物、天然物バ
ンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ
、本発明のタンパク質に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナト
リアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（
ＷｒｉｇｈｔｏｎＮＣ；ＦａｒｒｅｌｌＦＸ；ＣｈａｎｇＲ；Ｋａｓｈｙ
ａｐＡＫ；ＢａｒｂｏｎｅＦＰ；ＭｕｌｃａｈｙＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ
ＤＬ；ＢａｒｒｅｔｔＲＷ；ＪｏｌｌｉｆｆｅＬＫ；ＤｏｗｅｒＷＪ．，
Ｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅｓａｓｐｏｔｅｎｔｍｉｍｅｔｉｃｓｏｆ
ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｈｏｒｍｏｎｅｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ２６１９９６，２７
３ｐ４５８−６４、ＶｅｒｄｉｎｅＧＬ．，Ｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｏｒ
ｉａｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡ
ＮＤ）Ｎｏｖ７１９９６，３８４ｐ１１−１３、ＨｏｇａｎＪＣＪｒ
．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎ
ａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ７１９９６，３８４ｐ１７−９）が
当業者に公知である。また、本発明は、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物をス
クリーニングする方法に関する。本発明のタンパク質は、筋芽細胞の筋管細胞へ
の分化を抑制する活性を有することから、この活性を指標に、本発明のタンパク
質の活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングすることが可能である。
即ち、該スクリーニングは、（ａ）被検試料の存在下で、筋芽細胞に本発明のタ
ンパク質を接触させる工程、（ｂ）該細胞の筋管細胞への分化を検出する工程、
（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、本発明のタンパク質による
該分化の抑制を増強または減弱する化合物を選択する工程、を含む方法により実
施することができる。スクリーニングに用いられる本発明のタンパク質としては、天然由来のタンパ
ク質であっても、組み換えタンパク質であってもよい。また、精製されたタンパ
ク質であっても、細胞培養上清（タンパク質が細胞から分泌される場合）であっ
てもよい。被験試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵
微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製タンパク質、
ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。
また、上記の本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニングで得られた
化合物を被検試料として用いることも可能である。筋管細胞への分化を検出する筋芽細胞としては、例えば、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞
を好適に用いることができるが、これに制限されない。筋管細胞への分化は、例
えば、実施例に記載のマウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞株の培養系（マウスＣ２Ｃ１２
筋芽細胞株は、無血清もしくは２％ウマ血清含有ＤＭＥＭ培地で培養すると、多
核の筋管細胞へと分化する）を利用し、被検試料および本発明のタンパク質の存
在下でＣ２Ｃ１２筋芽細胞株を培養した際の多核の筋管細胞への分化能の測定な
どの方法で検出することができる。本発明において、本発明のタンパク質がｐ５３の転写因子活性を抑制すること
が示された。従って、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物の
スクリーニングは、また、該転写因子活性を指標に行うことができる。即ち、該
スクリーニングは、（ａ）該タンパク質を発現するベクター、ｐ５３を発現する
ベクター、およびｐ５３に応答してレポーター遺伝子を発現するベクターが導入
されたｐ５３欠損細胞を提供する工程、（ｂ）該細胞に被検試料を接触させる工
程、（ｃ）該細胞におけるレポーター活性を検出する工程、および（ｄ）被検試
料を細胞に接触させない場合（対照）と比較して、該レポーター活性を低下また
は増加させる化合物を選択する工程、を含む方法により実施することが可能であ
る。具体的には、実施例８または９に記載された、ストリアミンによるｐ５３転写
因子活性の抑制を検出する系に被検試料を添加して、レポーター活性を検出し、
該活性を変化させる化合物を選択すればよい。被験試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵
微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製タンパク質、
ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。
また、上記の本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニングで得られた
化合物を被検試料として用いることも可能である。ストリアミン発現ベクターとしては、完全長ストリアミンを発現するベクター
であっても、ｐ５３の転写因子活性を抑制しうるストリアミンの部分ペプチド（
例えば、Ｃ末端ストリアミン）を発現するベクターであってもよい。ｐ５３発現ベクターとしては、ｐ５３の発現を誘導的に調節しうるベクターで
あることが好ましい。このようなベクターとしては、例えば、温度感受性ｐ５３
発現ベクターが挙げられる。ｐ５３に応答してレポーターを発現するプラスミドは、ｐ５３応答配列の下流
にレポーター遺伝子が連結しているベクターである。ｐ５３応答配列としては、
「ＡＴＧＣＴＴＧＣＣＣ」を用いることができる。レポーター遺伝子としては、
検出可能であれば特に制限はなく、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラク
トシダーゼ遺伝子が挙げられる。ベクターを導入する細胞としては、内因性のｐ５３によりレポーター遺伝子が
発現しないようにするために、ｐ５３欠損細胞が好ましい。ｐ５３欠損細胞とし
ては、例えば、ｐ５３−／−マウス胎児性繊維芽細胞が挙げられる。本スクリーニングにおけるレポーター活性の検出の結果、被検試料を細胞に接
触させない場合（対照）と比較して、該レポーター活性を低下させれば、用いた
被検試料は、本発明のタンパク質の活性を促進する化合物である（または該化合
物を含む）と判定され、一方、該レポーター活性を増加させれば、用いた被検試
料は、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物である（または該化合物を含
む）と判定される。なお、本発明におけるスクリーニングにおいて「本発明のタンパク質の活性を
促進または阻害する化合物」とは、本発明のタンパク質からのシグナル伝達を促
進または阻害するものであれば制限はなく、本発明のタンパク質に直接作用して
、その活性を促進または阻害する化合物に限られない。本発明のタンパク質から
のシグナル伝達の下流に作用して、該シグナル伝達を促進または阻害する化合物
も含まれる。本発明のスクリーニングにより得られる化合物は、本発明のタンパク質が関連
する疾患において、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害するための薬剤
や、本発明のタンパク質からのシグナル伝達を促進または阻害する薬剤の候補と
なる。本発明のスクリーニング方法を用いて得られる、本発明のタンパク質に結
合する活性を有する化合物の構造の一部を、付加、欠失及び／又は置換により変
換される物質も、本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物に含まれ
る。本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物をヒトや他の哺乳動物、
例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、
ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合には、
単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により
製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠
剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは
水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注
射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒
体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、
安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、
一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製
剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の
適当な容量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、
コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロ
ースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、
ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、シヨ糖、乳糖又はサッカリンのよう
な甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる
。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液
状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のよう
なベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含
む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化
ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタ
ノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０
と併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジ
ル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝
液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例え
ばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された
注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻
腔内的、経気管支的、筋内的、または経口的に当業者に公知の方法により行いう
る。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であ
れば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡに
よりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、
遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、
症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。例えば、本発明のタンパク質と結合する化合物や本発明のタンパク質の活性を
促進または阻害する化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場
合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から
１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２
０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投
与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとし
て）においては、１日あたり約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から
２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与する
のが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与
することができる。発明を実施するための最良の形態以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制
限されるものではない。［実施例１］細胞培養タンパク質及びクローニングの研究の比較に用いた、マウスのＣＤ１−ＩＣＲ
株由来の正常なマウスの初期繊維芽細胞（ＣＭＥＦ），ＣＭＥＦから確立された
不死化クローン（ＲＳ−４），及びＮＩＨ３Ｔ３細胞を、文献（Ｗａｄｈｗａ
ｅｔａｌ．，（１９９１）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．１３．２５６，２４３−２
５４）の記載に従って培養した。一過性の形質転換に用いるＣＯＳ７細胞を１０
％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル最小必要培地で培養した。［実施例２］ｃＤＮＡのクローニングとシーケエンス正常なマウス細胞（ＣＭＥＦ）と不死化細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）由来のＴｒｉ
ｔｏｎＸ−１００可溶性原形質膜画分の比較により、ほぼ３３−ｋＤａのタン
パク質がＮＩＨ３Ｔ３には存在するが、ＣＭＥＦには存在しないことが明らか
となった（Ｗａｄｈｗａｅｔａｌ．，（１９９１）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．１
３．２５６，２４３−２５４）。このタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ルから分離し、ポリクローナル抗体の作成に用いた。作成した抗ｐ３３抗体を、
ラムダＺＡＰＩＩベクターで構築したＲＳ−４細胞由来のｃＤＮＡライブラリー
の免疫スクリーニングによるｃＤＮＡクローニングに用いた。この結果、５つの
クローンが得られ、それらをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＴ３及びＴ７プ
ライマーを用いた部分的な配列決定により特徴づけた。５つのクローンのうち３
つはすでに知られている遺伝子、すなわちＦｕｓｃｈｏｐ（Ｒａｂｂｉｔｔｓ
ｅｔａｌ．，（１９９３）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４，１７５−１８０、Ｋｕｒ
ｏｄａｅｔａｌ．，（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７，１２２
１−１２２７）、Ｇ−ウトロピン（Ｂｌａｋｅｅｔａｌ．，（１９９５）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２，３６９７−３７０１）及
びディストロピン（Ｌｏｖｅｅｔａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３３
９，５５−５８）と同一性が示されたのに対して、２つのクローンはＤＮＡ配列
データーベース内に一致するものを見いだせなかった。しかしながら、２つの新
規なクローンのインビトロにおける翻訳産物は抗−ｐ３３抗体で沈降しなかった
。この事実は、これら２つのクローンが最初にＳＤＳポリアクリルアミドゲル上
で不死化細胞から同定された３３−ｋＤａのタンパク質と関連性がないことを示
している。本発明者らは、単離したクローンの１つである＃３３６の特徴づけを
行った。なお、ｃＤＮＡクローンの配列はジデオキシチェーンターミネーション
法により決定し、反応をＡＢＩ３７７自動配列塩基決定機で分析した。＃３３６と称する２．４ｋｂのｃＤＮＡクローンの全配列は３’末端からのエ
キソヌクレアーゼＩＩＩを用いた方法（ＴＡＫＡＲＡキロシークエンス用デレー
ションキット、宝酒造）及びプライマー歩行によって得た。さらにクローンの５
’末端は、プライマーに特異的な３つのアンチセンス遺伝子、すなわちＳＰ１（
配列番号：３／ＴＧＴＣＡＣＴＧＣＣＡＣＧＣＣＴＴＣＴＣＧＧＴＧＣＧＣＡＧ
）、ＳＰ２（配列番号：４／ＴＣＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＴＴＴＧＧＣＣＣＡＴＣ
ＴＴＧＴＣＣＣ）、ＳＰ３（配列番号：５／ＴＧＡＧＡＡＡＧＣＧＴＴＡＧＡＣ
ＧＣＴＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＴ）を用いることによって、マウスの骨格筋ｃＤＮ
Ａ上の５’マラソンＲＡＣＥポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得た。５
’マラソンＲＡＣＥＰＣＲは「Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭｃＤＮＡ
ｋｉｔ（ｍｏｕｓｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ，ｃａｔａｌｏｇｕｅ
＃７４５６−１）（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）のプロトコルに従って行った。これにより得られたストリアミンｃＤＮＡの全配列を図１および配列番号：１
に示す。得られた全長ｃＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列データーバンク内に相同性が
見いだせなかった。得られたｃＤＮＡは１４９アミノ酸の長さのタンパク質（ｐ
Ｉ−１０．２）をコードし、タンパク質データーベース内に有意に一致するもの
が見いだせなかった。ＢＬＡＳＴ，ＰＲＯＳＩＴＥ，ＧＣＧ及びＰＳＯＲＴプロ
グラムによるｃＤＮＡ配列の解析により、その機能の予測が可能な既知のモチー
フは見いだせなかった。しかしながら、ストリアミンの５’非コード配列には「
Ｃ／ＧＡＡＡＡ」の繰り返しが存在し、３’非コード領域には「ＧＴ」の繰り返
しが存在することが見出された。また、０．５の標準的な疎水性および０．７４
の脂肪族指数を有するタンパク質の可溶性の特性を、ＰｒｏｔＰｒａｍ解析プロ
グラムを用いて予測した。二つのプロテインキナーゼＣリン酸化部位、即ち、４
５−４７アミノ酸残基における「ＳＤＲ（アミノ酸一文字表記）」および７８−
８０アミノ酸残基における「ＳＰＫ（アミノ酸一文字表記）」、一つのカゼイン
キナーゼＩＩリン酸化部位、即ち、１２−１５アミノ酸残基における「ＳＧＬＤ
（アミノ酸一文字表記／配列番号：６）」、および二つのミリスチン酸化部位、
即ち、１１１−１１６アミノ酸残基における「ＧＮＹＹＣＣ（アミノ酸一文字表
記／配列番号：７）」および１２０−１２５アミノ酸残基における［ＧＴＲＷＡ
Ｋ（アミノ酸一文字表記／配列番号：８）」をＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅプログラ
ムにより予測した。タンパク質の他の興味深い特徴は高度の正の電荷、多くのセ
リン、ロイシン、プロリン残基、および４つのシスチンの存在であろう。さらに
、ストリアミンは、ｃＤＮＡやタンパク質の配列の解析に基づいて、公知の遺伝
子ファミリーのいずれのメンバーとしても特徴づけられなかった。［実施例３］Ｉｎｖｉｔｒｏにおける転写と翻訳予想されるＯＲＦをｐＢＳＳＫ内でクローン化し、与えられた配列内のＯＲＦ
の存在を確認するためにインビトロトランスレーションを行った。具体的には、
ＯＲＦを、ＲＳ−４細胞由来の逆転写ポリメラーゼ鎖反応により、センスプライ
マー（配列番号：９／ＧＡＡＲＲＣＡＴＧＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＣＧＡ
Ｇ）及びアンチセンスプライマー（配列番号：１０／ＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＧＴ
ＣＡＣＴＧＣＣＡＣＧＣＣＴＴＣＴＣＧ）を用いて増幅し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔプラスミドにクローン化した。ｐＢＳＳＫ／ストリアミンを、Ｌ−［３５Ｓ］
メチオニンを添加したウサギの網状赤血球溶解物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）
を用いてインビトロで１時間、転写し（ＴｒａｓｐｒｏｂｅＴｋｉｔ，Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社製）、翻訳した。翻訳産物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
で分離し、オートラジオグラフィーで可視化した。インビトロで翻訳した産物は
また、抗−ｐ３３抗体を用いて免疫沈降させた。その結果、ほぼ１８ｋＤａの大
きさのタンパク質が検出され、これは＃３３６配列内のＯＲＦ由来のタンパク質
の予想される大きさとよく一致していた（図１）。［実施例４］組み換えストリアミンタンパク質の調製ストリアミンｃＤＮＡのオープンリーディングフレームを、ＢａｍＨＩ部位を
持つセンス（配列番号：１１／ＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧ
ＧＣＧＡＧ）及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を持つアンチセンス（配列番号：１２／Ａ
ＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＣＡＣＴＧＣＣＡＣＧＣＣＴＴＣ）プライマーを用いた
、ｐＢＳＳＫ／ストリアミンのＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲで増幅した０．
５ｋｂフラグメントは、まずｐＧＥＭ−Ｔベクター内にクローン化し、その正確
な配列を確認した。そして、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを用いて切除し、最終
的に、Ｈｉｓ−Ｔａｇｇｅｄタンパク質を産出するｐＱＥ３０ベクター（Ｑｉａ
ｇｅｎ社製）内にクローン化した。ｐＱＥ３０／ストリアミン構築物をＭ１５細
菌に導入し、ＯＤ５８０＝０．６にまで生育した細胞をイソプロピル−ｂ−チオ
ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（０．２ｍＭ）を用いて３７℃下で５時間誘導
した。この細菌の溶解物（ＩＰＴＧで誘導してないものと誘導したもの）をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで分析し、続いて抗−Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製）および抗ｐ
３３抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した。その結果、約１８
ｋＤａのタンパク質が合成された（図２）。組み換えタンパク質の大きさは、ｃ
ＤＮＡクローンをインビトロで翻訳した場合と同様に、分子の推定の大きさから
予期されたものと同じであった。［実施例５］ノーザンブロット解析レーン当たり２μｇのポリＡ＋ＲＮＡを含むマウス及びヒトの多様な組織のノ
ーザンブロットは、「ＣｌｏｎｅｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌ
ｏＡｌｔｏ，ＣＡ」から購入した。ノーザンブロット解析は、それぞれの細胞
系から調製した全ＲＮＡから１５μｇを用いて行った。＃３３６プラスミドのＢ
ａｍＨＩの消化によって得られた１．４ｋｂ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）フラグ
メントをプローブとして用いた。ハイブリダイゼーションはＳＳＣ−Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔｓ−ＳＤＳバッファー中において６５℃下で行った。メンブレンは、２Ｘ
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む２ＸＳＳＣ、１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
を含む１ＸＳＳＣ中でそれぞれ１０分間、２回づつ洗浄し、オートラジオグラ
フィーで可視化した。ブロット上のＲＮＡ量はβ−アクチンあるいは１８Ｓリボ
ソームのプローブを用いたハイブリダイゼーションによって決定した。ノザンブ
ロッティンダによる多数のマウス及びヒトの多くの組織におけるストリアミンの
発現の解析により、マウスとヒトの骨格筋における単一な３．０ｋｂ転写産物に
対する強い反応性が示された（図３Ａおよび図３Ｂ）。マウスの心臓においても
、同じ大きさの転写産物が発現することが判明した（図３Ａ）。次に本発明者ら
は、それが筋繊維型特異性を示すかどうか試験した。４つの繊維の表現型、即ち
、速収縮筋型２Ａ、２Ｂ、２Ｘ、および遅筋型Ｉは、ミオシン重鎖イソフォーム
の型の発現に基づき定義されている（ＰｅｔｔｅａｎｄＳｔａｒｏｎ，（１
９９０）Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１
６，１−７６）。ストリアミン発現は、遅筋（ヒラメ筋）よりも速筋（大腿四頭
筋）で顕著であった（図４Ａ）。大腿四頭筋（９５％速収縮筋繊維２Ｂ、４％速
収縮筋繊維２Ｘ；ＨａｍａｌａｉｎｅｎａｎｄＰｅｔｔｅ（１９９３）Ｊ．
Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４１，７３３−７４３）、長指伸筋（
６０％速収縮筋繊維２Ｂ、２８％速収縮筋繊維２Ｘ、１２％速収縮筋繊維２Ａ；
Ｌｅｆｅｒｏｖｉｃｈｅｔａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎ
ｃｅ１５，５９６−６０３）、腓腹筋表層（１００％速収縮筋繊維２Ｂ；Ｚａ
ｒｄｎｎｎａｎｄＰａｒｒｙ，（１９９４）Ｍｕｓｃｌｅ＆Ｎｅｒｖｅ
１７，１３０８−１３１６）、横隔膜（５７％速収縮筋繊維２Ｘ、３４％速収
縮筋繊維２Ａ、７％遅収縮筋繊維；ＺａｒｄｎｎｎａｎｄＰａｒｒｙ，（１
９９４）Ｍｕｓｃｌｅ＆Ｎｅｒｖｅ１７，１３０８−１３１６）、および
ヒラメ筋（４５％速収縮筋繊維２Ａ、５５％遅収縮筋繊維；Ｌｅｗｉｓｅｔ
ａｌ．，（１９８２）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３２５，３９３−４０１）のような
速繊維および遅繊維の含有量が異なるマウス骨格筋のノーサン解析により、スト
リアミンが速い解糖作用を有する（ｆａｓｔｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ）２Ｂ繊維
に主として発現しているとが明らかとなった（図４Ｂ）。本発明者らは次にＣ２Ｃ１２筋芽細胞のインビトロにおける筋形成の間のスト
リアミンの発現につき解析した。４日間の分化培地での培養後は、非分化培養や
一日の分化培養と比較して、ストリアミンの発現はごく僅かであった（図４Ｃ）
。［実施例６］発現クローニングと生物学的活性ストリアミンのＯＲＦはＨｉｎｄＩＩＩ部位を持つセンス（配列番号：１３／
ＧＧＴＡＡＧＣＴＴＡＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＣＴＡＣＣＴ）及びＢａｍＨＩ
部位を持つアンチセンス（配列番号：１４／ＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＴＧＡＣＣＴ
ＡＡＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＣＡ）プライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。
はじめに増幅したフラグメントは最初にｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローン化し、
その配列を確認した。挿入部分はＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩで切断し、哺乳動
物発現ベクターであるＬＫ４４４内に挿入した。このベクターは、構成的発現の
ためのβ−アクチンプロモーター及びｎｅｏマーカーを持ち、Ｇ４１８を添加し
た哺乳動物細胞の生育培地中で本質的に発現し、選抜される（Ｇｕｎｎｉｎｇ
ｅｔａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．８４，４８３１−４８３５）。マウスの筋芽細胞系Ｃ２Ｃ１２の形質転換は
リポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を用いて行い、形質転換体をＧ４
１８（７００μｇ／ｍｌ）を含む培地中で選抜した。Ｇ４１８耐性クローンのイ
ンビトロでの筋管への分化については、２％のウマの血清を添加した培地中で分
析した。その結果、ベクターで形質転換した細胞は分化培地中で分化し、筋管の形成が
見られたが、選抜した＃３３６で形質転換した８つのクローン中７つからは同程
度の筋管の形成が見られなかった（図５）。この結果から、＃３３６の過剰発現
によりインビトロにおけるＣ２Ｃ１２細胞の分化が阻害されうることが明らかと
なった。［実施例７］ストリアミンの細胞内局在ストリアミンのＯＲＦは、ｐＥＧＦＰＣ１ベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製
）におけるＧＦＰＯＲＦのＣ末端のフレーム内に挿入した。ＧＦＰ−ストリア
ミン融合タンパク質をコードするこのプラスミドをカバーガラス上で生育してい
るＣＯＳ７細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）
を用いて導入した。カバーグラスを核染色液であるＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（
Ｓｉｇｍａ社製）（培養液中５−１０μｇ／ｍｌで、細胞固定前に１０分間）、
メタノール／アセトン（１：１）で固定した。ＰＢＳで３回洗浄後、カバーグラ
スにＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）をのせた。細胞は、エピフルオ
レッセンス光学系のオリンパスＢＨ−２顕微鏡、またはＣｅｌｌｓｃａｎＳｙ
ｓｔｅｍ（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ社、米国）装備ツアイヌＡｘｉｏｐｈｏｔ顕
微鏡で観察した。その結果、形質転換細胞では、同じ細胞において核染色液であ
るＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８とオーバーラップした明確な緑色蛍光が観察された
（図６Ａ）。また、ｐＧＦＰＣ１／ストリアミン、ｐＧＦＰＣ１／ストリアミンＮ末端７５
アミノ酸、ｐＧＦＰＣ１／ストリアミンＮ末端７４アミノ酸の顕微注入は、エッ
ペンドルフ顕微注入器を用いニコン倒立顕微鏡を利用して、カバーガラス上で生
育しているＮＩＨ３Ｔ３細胞の核に対して直接行った。上記したように、細胞を
固定し、ストリアミンの細胞内局在を解析した。その結果、ｐＥＧＦＰＣ１−ス
トリアミンにおいてはストリアミンの明確な緑色核蛍光が検出されたが、ストリ
アミンＮ７５およびストリアミンＣ７４の双方は細胞質に留まっていた（図６Ｂ
）。ストリアミンが何ら公知の核局在シグナルを含まないというデーターおよび
事実は、そのアミノ酸組成から予想されたように、高い正の電荷を有する完全な
自然の状態のタンパク質のコンフォメーションが核局在の原因であるかもしれな
い。［実施例８］ストリアミンによるｐ５３活性に与える影響の解析（ルシフェ
ラーゼによる解析）野生型ｐ５３は、細胞分化の間に働いていることが実証されている（Ａｌｏｎ
ｉ−Ｇｒｉｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，（１９９５）ＥＭＢＯＪ．１４，１
３９２−１４０１）。この裏付けとなる証拠は、Ｉ）外因性のｐ５３の過剰発現
または細胞への放射線照射がいくつかの腫瘍細胞の分化を部分的に回復させるこ
とができること（Ｈａｌｅｖｙｅｔａｌ．，（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６７，１０１８−１０２１）、ｉｉ）Ｃ２分化の間のｐ５３ｍＲＮＡの正の調
節、ｉｉｉ）内因性野生型ｐ５３の阻害が、造血または筋肉の細胞分化を阻害す
ること（Ｓｏｄｄｕｅｔａｌ．，５（１９９６）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．
１３４，１９３−２０４）である。Ｃ２分化におけるｐ５３の役割は、細胞周期
におけるその活性とは独立であることが示されている（Ｓｏｄｄｕｅｔａｌ
，，（１９９６）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１３４，１９３−２０４）。この報
告の視点、および核への局在や筋原性の分化の抑制というストリアミンの特徴か
ら、本発明者らはストリアミンがｐ５３活性に影響を与えているのではないかと
考えた。そこで、本発明者らは、ストリアミンがｐ５３の活性を阻害できるかを
検討した。四回の独立した実験において検討した。温度感受性ｐ５３発現プラスミド（ｐＭＳＶｐ５３Ｖａｌ１３５）およびｐ５
３反応性ルシフェラーゼレポーター（ＰＧ−１３ｌｕｃ）プラスミドと、各種ス
トリアミン発現プラスミド［ＬＫ４４４／完全長ストリアミン−Ｓ、Ｎ末端側７
５アミノ酸残基（ＬＫ４４４／Ｎ−ストリアミン−Ｓ）、Ｃ末端側７４アミノ酸
残基（ＬＫ４４４／Ｃ−ストリアミン−Ｓ）のいずれかを発現するプラスミド］
、完全長ストリアミンｃＤＮＡに対するアンチセンスＲＮＡを発現するプラスミ
ド（ＬＫ４４４／ストリアミン−ＡＳ）、または対照プラスミド（ＬＫ４４４ベ
クター（Ｇｕｎｎｉｎｇｅｔａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，４８３１−４８３５））をｐ５３−／−マ
ウス胎児性繊維芽細胞（ＭＥＦ）に導入した。図７に示すように、完全長ストリアミン（センス）は、対照と比較してｐ５３
活性が４．６分の１に減少した。その一方、ストリアミンのアンチセンスは、対
照と比較してｐ５３活性を１．６倍に上昇させた。Ｃ−ストリアミンのｐ５３活
件の阻害効果は完全長ストリアミンと同等であった。しかしながら、Ｎ−ストリ
アミンでは、ｐ５３活性の阻害効果は認められなかった。この結果は、ストリア
ミンがｐ５３の転写因子活性を抑制することができることを示している。［実施例９］ストリアミンによるｐ５３活性に与える影響の解析（β−ガラ
クトシダーゼによる解析）ｐ５３−／−マウス胎児性繊維芽細胞に、それぞれ０．１μｇ／μｌのｐＭＳ
Ｖｐ５３Ｖａｌ１３５，ｐ５３反応性β−ｇａｌレポーターｐＲＧＣｆｏｓ−
ｌａｃＺ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１９９８ｖｏｌ１６３３１７−３３２２）と
、ＬＫ４４４（対照）、ＬＫ４４４／完全長ストリアミン、またはＬＫ４４４／
ストリアミン−ＡＳとをマイクロインジェクトした。また、ＤＮＡが注入された
細胞を同定するために、コントロールＩｇＧも上記プラスミドと共に細胞にマイ
クロインジェクトした。一晩、３２．５度で培養した後、細胞を４％ホルムアル
デヒドデ固定し，氷上で０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含んだＰＢＳで５
分間処理する事により高分子物質が細胞内に浸透できるようにした後，三回ＰＢ
Ｓで洗浄した。その後、ＤＮＡが導入された細胞の特定のために、ＦＩＴＣ−結合坑−ウサギ
ＩｇＧで細胞を染色した（図上）。染色された細胞は、下図において矢印で示し
た。一方、ストリアミンによるｐ５３活性への影響の検出（β−ガラクトシダーゼ
の発現）は、β−ｇａｌ染色キットで（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ
ｍ）を使用して行った。細胞は、顕微鏡（Ｐｒｏｒｉｓ（ＡＸ７０）、オリンパ
ス社製）で観察した。全ての青く発色している細胞をｂ−ｇａｌ発現陽性とした
。その結果、対照プラスミド（ＬＫ４４４）とアンチセンスストリアミンプラス
ミド（ＬＫ４４４／ストリアミン−ＡＳ）を導入した細胞では、それぞれ８６％
及び８８％がβ−ｇａｌ陽性を呈したのに対して、ストリアミンセンスプラスミ
ド（ＬＫ４４４／完全長ストリアミン）を導入した細胞では、５％の陽性細胞し
か検出されなかった（図８）。従って、本実験からもストリアミンによってｐ５
３の活性が抑制されることが裏付けられた。この事実はストリアミンの発現がＣ
２Ｃ１２細胞の分化に伴って低下することと符合する。［実施例１０］試験管内におけるストリアミンとｐ５３の相互作用ｐ５３の転写活性化機能におけるストリアミンの効果は二つの蛋白の相互作用
の可能性を示唆している。そこで、まず、試験管内においてストリアミンとｐ５
３が相互作用するか否かを、免疫沈降およびそれに続くウェスタンブロティング
により検討を行った。（１）ヒスチジンタグが付加された各種ストリアチン（融合タンパク質）の調
製完全長ストリアミン、Ｎ末端側ストリアミン（７５アミノ酸残基）、Ｃ末端
側ストリアミン（７４アミノ酸残基）をコードするＤＮＡを大腸菌における発現
ベクターであるｐＱＥ３０（キアゲン社製）に挿入し、ｐＱＥ３０／完全長スト
リアミン、ｐＱＥ３０／Ｎ−ストリアミンとｐＱＥ３０／Ｃ−ストリアミンを作
製した。これらプラスミドを大腸菌に導入し、発現せしめた後、組み換えタンパ
ク質の精製を行った。具体的には、まず、細胞を遠心し、そのペレットを、バッ
ファーＡ（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭＮａＣｌ，
２０ｍＭイミダゾール，６Ｍ尿素，および５ｍＭｂ−メルカプトエタノール
）に浮遊せしめ、氷上で二分間超音波処理した後、室温で３０分撹拌した。抽出
物を１５，０００ｇで２０分間遠心し、０．５ｍｌのニッケル−ＮＴＡ−アガロ
ースアフィニティーレジン（Ｑｉａｇｅｎ社製）に上清を加え、室温にて２時間
混和した。この混合物をカラムに充填し、２０ｍｌのＴＢＳ（１０ｍＭＴｒｉ
ｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）および０．５ＭＮａＣｌ（ＴＢＳ））で洗浄した。ア
フィニティーレジンに吸着したタンパク質はＴＢＳに０．５Ｍイミダゾールを加
えた溶液で溶出せしめた後、ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）によ
ってイミダゾールを除去した。得られた各種ストリアミンは使用するまで−２０
度で保存した。精製物の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥと坑Ｈｉｓ抗体を用いたウェス
タンブロット解析にて確認した。（２）各種ストリアミンとｐ５３との結合解析上記（１）で精製された各種タンパク質（２−５μｇ）をＧＳＴまたはＧＳＴ
−ｐ５３（１μｇ，ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）とＮＰ４０−溶解バッファー（
５００μｌ）中で混合した。２時間後にグルタチオン−セファロースビーズ（２
０μｌ）を加え、４℃で１時間、回転させながら混合した。ビーズを遠心によっ
て沈降させ、ＴＢＳで三回洗浄後、ＳＤＳサンプルバッファーで煮沸した。その
後、各種サンプルにつきＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、坑ヒスチジンタグ抗体を用い
たウェスタンブロッティングにより、ヒスチジンが結合した各種ストリアミンの
検出を行った。なお、併せて、坑ｐ５３抗体を用いたウエスタンブロットにより
、ｐ５３の検出も行った。その結果、グルタチオン−セファロースビーズを用いたＧＳＴ−ｐ５３の沈降
において、ヒスチジンが結合した各種ストリアミンも沈降することが示された（
図９、レーン７から９）。即ち、完全長のストリアミン、Ｎ−ストリアミン、お
よびＣ−ストリアミンのいずれもがｐ５３と相互作用を示した。なお、対照として、各種ストリアミンが発現されていることを確認するために
、ＧＳＴを添加せずにそのまま、ウェスタンブロット解析を行った（レーン１か
ら３）。各種ストリアミンは、確かに発現していた。また、ストリアチンが直接ＧＳＴに結合しているのではないことを証明するため
に、ＧＳＴ−ｐ５３に代えてＧＳＴを添加して同様に検出を行った（レーン４か
ら６）。ストリアチンは直接ＧＳＴに結合していなかった。［実施例１１］生体内におけるストリアミンとｐ５３の相互作用高いトランスフェクション効率を持つＣＯＳ７細胞（内因性のｐ５３を発現し
ている）に、ＧＦＰと各種ストリアミンとの融合タンパク質を発現させるための
プラスミド（ｐＥＧＦＰＣ１／全長ストリアミンｐＥＧＦＰＣ１／Ｎ−ストリア
ミンまたはｐＥＧＦＰＣ１／Ｃ−ストリアミン）または対照（ｐＥＧＦＰＣ１ベ
クター（社製））をトランスフェクションし、４８時間後に細胞抽出液を調製し
た。細胞抽出液の調製においては、ＮＰ−４０細胞溶解液で溶解したタンパク質
画分と、ＮＰ−４０細胞溶解液で溶解しなかった画分に０．５％ＳＤＳを添加し
て煮沸し、これにより溶解した画分を得た。これら画分に対し、それぞれ坑ｐ５３抗体（ＣＭ−１，Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＬｔｄ．）を添加して４℃で一晩孵置した後、プ
ロテインＡ／Ｇ−セファロースを添加して、４℃で３０分反応させ、免疫沈降（
遠心；５０００ｒｐｍ，１分）を行った。得られた免疫複合体に対し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、坑ＧＦＰモノクローナ
ル抗体（＃８３６２−１，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いたウエスタンブロッテ
ィングを行った。また、抗ｐ５３モノクローナル抗体（Ａｂ−１，Ｃａｌｂｉｏ
ｃｈｅｍ社製）を用いたウエスタンブロッティングにより、ｐ５３の検出を併せ
て行った。その結果、抗ｐ５３ポリクローナル抗体（ＣＨ−１、Ｎｏｖａｃａｓｔｒａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）を用いた内因性ｐ５３の沈降において、
ＧＦＰが結合した各種ストリアミンも共に沈降することが示された（図１０右）
。特に、ＳＤＳ可溶性画分において、各種ストリアミンが検出された（図１０右
、レーン６から８）。即ち、ストリアミンがＣＯＳ細胞内でｐ５３と相互作用す
ることが示された。なお、内因性ｐ５３は、ＧＦＰ自体とは結合しなかった（図
１０右、レーン５）。なお、坑ｐ５３抗体に代えて、対照ＩｇＧを用いて免疫沈降を行い、坑ＧＦＰ
モノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った場合には、スト
リアミンは検出されなかった（図１０中央）。また、坑ｐ５３抗体を用いた免疫
沈降を行わないで、細胞溶解液自体（免疫沈降に用いた蛋白量の１０％）に対し
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、坑ＧＦＰモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロ
ットを行った結果、ＧＦＰおよびＧＦＰに結合したストリアミンのバンドが検出
された（図１０左）。［実施例１２］染色体上の配置＃３３６に特異的なセンスプライマー（配列番号：１５／ＴＧＧＴＡＴＴＣＴ
ＴＡＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＣＴＡＡＣＴＡ）及びアンチセンスプライマー（
配列番号：１６／ＧＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＴＧＡＣＣＴＡＡＴＧＴＴＴＣＡＴＧ
ＴＣＡ）を用いたＰ１バクテリオファージマウスゲノムライブラリーのＰＣＲス
クリーニングにより、マウスのＰ１ゲノムクローンを得た。単離したＰ１クロー
ンを、その遺伝子の３’ＵＴＲ領域とのハイブリダイゼーションにつき試験し、
続いて、蛍光インシチュハイブリダイゼション（ＦＩＳＨ）により染色体におけ
る局在性を調べるために使用した。マウスのＰ１クローン由来のＤＮＡをニック
トランスレーションによりジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを用いて標識した。標識し
たプローブを、切断したマウスのＤＮＡと結合させ、５０％ホルムアミド，１０
％デキストラン硫酸，２ＸＳＳＣを含む溶液中でマウスの初期繊維芽細胞由来
の分裂中期染色体とハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたスライドグラ
スを、蛍光標識した抗ジゴキシゲニン抗体中でインキュベートし、さらに４’６
’ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いたカウンター染色に
よりハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出した。その結果、最初の
実験では、ＤＡＰＩ染色に基づき染色体１２と考えられている中程度のサイズの
染色体が、特異的に標識された。第二の実験では、染色体１２の動原体領域に特
異的なプローブはＰ１クローンとコハイブリダイズした。ストリアミンＰ１及び
染色体１２は同一の染色体上に局在していた（図８）。総数８０の分裂中期細胞
が解析され、そのうち７１が特異的に標識された。特に染色体１２とハイブリダ
イズした１０個の測定値から、ストリアミンはヘテロクロマチン−ユーロクロマ
チン境界から染色体１２のテロメア、すなわちバンド１２Ｃ３（ヒト染色体１４
ｑ２１−２２に対応する）と関連した領域方向へ５７％の距離の位置にあること
が明らかとなった。産業上の利用の可能性本発明により、筋芽細胞の筋管への分化を抑制する活性を有するストリアミン
タンパク質およびその遺伝子が提供された。本発明のストリアミンタンパク質お
よびその遺伝子は、培養細胞の未分化状態の維持に関与していると考えられるた
め、例えば、癌の治療への応用が期待される。また、マウスおよびヒト由来の遺
伝子は、組織レベルでは心臓や骨格筋に特に強い発現を示すことから、心臓や筋
肉に関連する疾患の治療への応用も考えられる。さらに、マウスおよびヒト由来
の遺伝子は、筋繊維の速収縮筋繊維に特異的に発現する。遅及び速筋繊細の表現
型の仕組みに関してはこれまでほとんど解明されておらず、本発明の遺伝子を解
析することにより、運動への応用の可能性も期待される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

図１は、ストリアミンのヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を示す。マウス
の骨格筋ｃＤＮＡ上の５’ＲＡＣＥＰＣＲにより得られた配列のフレームコド
ン内の５’上流までアンダーラインで示した。図２は、Ａ．Ｔ３プロモーター下流にストリアミンＯＲＦを配置したプラスミ
ドｐＢＳ／ストリアミンのｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系での産物を示す。ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで１８ｋＤのタンパク質（矢印）として検出される。Ｂ．ＩＰＴＧ誘導し
たｐＱＥ３０／ストリアミンで形質転換した大腸菌による組換えストリアミンタ
ンパク質の抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタン・ブロッティングを示す。約１８ｋ
Ｄの位置にシグナルが検出される（矢印）。図３は、ノーザン解析によって分析したマウス（Ａ）およびヒト（Ｂ）におけ
るストリアミンの発現の組織特異性を示す。図４は、Ａ．各種筋肉でのストリアミン発現のノーザン分析による検出を示す
。発現は、速収縮型繊維（四頭筋、レーン１）には検出されるが、遅収縮型繊維
（ヒラメ筋、レーン２）には検出されない。Ｂ．いろいろな割合で速収縮／遅収縮繊維を含む筋繊維からのＲＮＡでのノー
ザン分析を示す。レーン１；四頭筋（９５％速収縮繊維２Ｂ、４％速収縮繊維２
Ｘ）、レーン２；長指伸筋（６０％速収縮繊維２Ｂ、２８％速収縮繊維２Ｘ、１
２％速収縮繊維２Ａ）、レーン３；腓腹筋表層（１００％速収縮繊維２Ｂ）、レ
ーン４；横隔膜（５７％速収縮繊維２Ｘ、３４％速収縮繊維２Ａ、７％遅収縮繊
維）、レーン５；ヒラメ筋（４５％速収縮繊維２Ａ、５５％遅収縮繊維）。スト
リアミンは解糖機能を有する速収縮繊維２Ｂによく発現する。対照として１８Ｓ
リボゾームＲＮＡを用いた。Ｃ．ｉｎｖｉｔｒｏで分化するＣ２Ｃ１２細胞でのストリアミンの発現を示
す。レーン１；低細胞密度での分裂中の筋芽細胞のＲＮＡ、レーン２；中程度細
胞密度での分裂中の筋芽細胞のＲＮＡ、レーン３；Ｃ２Ｃ１２細胞を分化用培地
で１日培養した細胞からのＲＮＡ、レーン４；Ｃ２Ｃ１２細胞を分化用培地で４
日間培養した細胞で多くの筋管が形成された細胞からのＲＮＡ。対照として１８
ＳリボゾームＲＮＡを用いた。図５は、ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＣ２Ｃ１２細胞分化に与えるストリアミン
の影響を示す。ストリアミンで形質転換した細胞は、分化用培地で７２時間培養
しても筋管の形成は認められない（Ｂ）が、対照（Ａ）では認められた。図６は、ストリアミンの細胞内局在を示す。ｐＥＧＦＰＣ１−ストリアミンを
トランスフェクトしたＣＯＳ７細胞ではＧＦＰ−ストリアミン融合タンパク質に
よる緑色蛍光を核内に確認できる（Ａ）。ヘキスト染色（Ｂ）によるＡの細胞核
は矢印で示した。ｐＥＧＦＰＣ１−ストリアミン（ａ）、ｐＥＧＦＰＣ１−ストリアミンＮ７５
（ｂ）、ｐＥＧＦＰＣ１−ストリアミンＣ７４（ｃ）をＮＩＨ３Ｔ３細胞にマイ
クロインジェクションすると、それぞれ核内、核周辺、細胞質に局在することが
示された。図７は、ストリアミンとｐ５３の相互作用をルシフェラーゼをレポーターとし
て検出した結果を示す。ｐ５３発現プラスミド、ｐ５３応答性ルシフェラーゼ発
現プラスミド、および各種ストリアミン発現プラスミドをｐ５３−／−マウス胎
児性繊維芽細胞（ＭＥＦ）に導入し、ルシフェラーゼ活性を検出した。図中の「
１」および「２」の数値はそれぞれのプラスミド（０．５μｇ／μｌ）の使用量
を示している。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。図８は、ストリアミンとｐ５３の相互作用をβ−ガラクトシダーゼをレポータ
ーとして検出した結果を示す。ｐ５３発現プラスミド、ｐ５３応答性β−ガラク
トシダーゼ発現プラスミド、および各種ストリアミン発現プラスミドをｐ５３−
／−マウス胎児性繊維芽細胞（ＭＥＦ）に導入し、β−ガラクトシダーゼ活性を
検出した（ｄ，ｅ，ｆ）。また、ＤＮＡが注入された細胞を同定するために、コ
ントロールＩｇＧも上記プラスミドと共に細胞にマイクロインジェクトし、ＦＩ
ＴＣ結合抗ウサギＩｇＧで検出した（ａ，ｂ，ｃ；矢印）。対照；（ａ，ｄ）センスベクター；（ｂ，ｅ）、アンチセンスベクター；（ｃ
，ｆ）図９は、試験管内におけるストリアミンとｐ５３の相互作用を検出した結果を
示す。ヒスチジンが結合した各種ストリアミンとＧＳＴが結合したｐ５３をインビトロ
で反応させ、グルタチオンセファローズビーズで免疫沈降を行い、抗ヒスチジン
タグ抗体および抗ｐ５３抗体を用いてウェスタンブロット解析を行った（図中の
「ＧＳＴ−ｐ５３ｐｕｌｌ」）。図中の「Ｉｎｐｕｔ」は、ＧＳＴを添加せず、そのままウェスタンブロット
解析を行った結果であり、「ＧＳＴ−Ｐｕｌｌ」は、ＧＳＴ−ｐ５３に代えてＧ
ＳＴを添加して、免疫沈降を行い、ウェスタンブロット解析した結果である。「
ＧＳＴ−ｐ５３Ｐｕｌｌ」は、ＧＳＴ−ｐ５３を添加して、免疫沈降を行い、
ウェスタンブロット解析した結果である。図１０は、生体内におけるストリアミンとｐ５３の相互作用を検出した結果を
示す。ＧＦＰが結合した各種ストリアミンを発現するベクターをＣＯＳ７細胞に遺伝
子導入し、組み換えタンパク質を細胞内で発現させて、内因性ｐ５３と反応させ
た。該細胞の細胞抽出液をＮＰ−４０細胞溶解性画分とＳＤＳ溶解性画分に分け
、坑ｐ５３抗体とインキュベート後、プロテインＡ／Ｇ−セファロースを添加し
て免疫沈降を行った。得られた免疫複合体に対し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、坑
ＧＦＰモノクローナル抗体および抗ｐ５３モノクローナル抗体を用いたウェス
タンブロッティングを行った（図中「ｐ５３ＩＣ」）。また、坑ｐ５３抗体に代えて、対照ＩｇＧを用いて免疫沈降を行って検出を行
った（図中「ＣｏｎｔｒｏｌＩｇＧＩＣ」）。また、坑ｐ５３抗体を用いた
免疫沈降を行わないで、細胞溶解液自体（免疫沈降に用いた蛋白量の１０％）に
対しＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、坑ＧＦＰモノクローナル抗体を用いて検出を行っ
た（図中「Ｉｎｐｕｔ」）。図１１は、マウス中期染色体におけるストリアミンの染色体上の配置を示す。
ストリアミンと染色体１２に特異的なプローブは矢印のところに緑の蛍光として
見られた。ストリアミンは１２Ｃ３領域上に局在していた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者カウルスニールシー茨城県つくば市東１丁目１番３通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者リデルロジャーアールオーストラリア国エヌエスダブリュ2145 ウエストミードホークスバリーロード 214 チルドレンズメディカルリサーチインスティチュート内（注）この公表は、国際事務局（ＷＩＰＯ）により国際公開された公報を基に作成したものである。なおこの公表に係る日本語特許出願（日本語実用新案登録出願）の国際公開の効果は、特許法第１８４条の１０第１項（実用新案法第４８条の１３第２項）により生ずるものであり、本掲載とは関係ありません。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または
該タンパク質中のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失
、若しくは付加したアミノ酸配列を有し、筋芽細胞の筋管への分化を抑制する活
性を有するタンパク質。
【請求項２】配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズ
するＤＮＡがコードするタンパク質であって、筋芽細胞の筋管への分化を抑制す
る活性を有するタンパク質。
【請求項３】請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズ
するＤＮＡであって、筋芽細胞の筋管への分化を抑制する活性を有するタンパク
質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】請求項３または４に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項６】請求項３または４に記載のＤＮＡを発現可能に保持する形質転換
体。
【請求項７】請求項６に記載の形質転換体を培養することを特徴とする、請求
項１または２に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項８】請求項１または２に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項９】請求項１または２に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリ
ーニング方法であって、（ａ）該タンパク質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、（ｂ）該タンパク質またはその部分ペプチドと被検試料との結合活性を検出する
工程、（ｃ）該タンパク質またはその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選
択する工程、を含む方法。
【請求項１０】請求項９に記載の方法により単離されうる、請求項１または２に
記載のタンパク質に結合する化合物。
【請求項１１】請求項１または２に記載のタンパク質の活性を促進または阻害す
る化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）被検試料の存在下で、筋芽細胞に該タンパク質を接触させる工程、（ｂ）該細胞の筋管細胞への分化を検出する工程、（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、該タンパク質による該分化
の抑制を増強または減弱する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１２】請求項１または２に記載のタンパク質の活性を促進または阻害す
る化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）該タンパク質を発現するベクター、ｐ５３を発現するベクター、およびｐ
５３に応答してレポーター遺伝子を発現するベクターが導入されたｐ５３欠損細
胞を提供する工程、（ｂ）該細胞に被検試料を接触させる工程、（ｃ）該細胞におけるレポーター活性を検出する工程、および（ｄ）被検試料を細胞に接触させない場合（対照）と比較して、該レポーター活
性を低下または増加させる化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１３】請求項１１または１２に記載の方法により単離しうる、請求項１
または２に記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物。
【請求項１４】配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡと特異的にハイブ
リダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するＤＮＡ。