JPH11505603A

JPH11505603A - Immunoassays and reagents containing suspended carbon labeled bioaffine particles

Info

Publication number: JPH11505603A
Application number: JP8522207A
Authority: JP
Inventors: レンベルイ，マリア; カールソン，ヤン
Original assignee: フアーマシア・アンド・アツプジヨン・アー・ベー
Priority date: 1995-01-20
Filing date: 1996-01-18
Publication date: 1999-05-21
Also published as: AU4592896A; EP0804733A1; CA2210794A1; SE9500184D0; WO1996022532A1

Abstract

(57)【要約】分析物と、その対応するバイオアフィンと、炭素粒子で標識され、試料中の分析物の量に関係した量で複合体に包含される懸濁性バイオアフィンリアクタント（Ｒ₁）との間の複合体を形成することにより試料中の分析物の存在が確定される分析法。この方法は、測定可能な部分の粒子が沈降することができるということを特徴とする。粒子が炭素粒子であることを特徴とする、粒子で標識され、ＩｇＥ、抗−ＩｇＥ抗体、又はそのＩｇＥ反応性エピトープを含むアレルゲンの群から選ばれる免疫試薬。 (57) Abstract: Suspended bioaffine reactants (R) labeled with an analyte, its corresponding bioaffine, and carbon particles and included in a complex in an amount related to the amount of the analyte in the sample. An analytical method in which the presence of an analyte in a sample is determined by forming a complex with ₁ ). This method is characterized in that a measurable part of the particles can settle. An immunoreagent selected from the group of allergens labeled with particles and comprising IgE, anti-IgE antibodies, or IgE-reactive epitopes thereof, wherein the particles are carbon particles.

Description

【発明の詳細な説明】免疫測定法および懸濁性炭素標識バイオアフィン粒子を含む試薬技術分野および公知の技法この分析は、試料の分析物含有量を、その対応するバイオアフィン（bioaffin e）を用い、対応物と分析物間の複合体を形成することにより、定性的または定量的のいずれかで測定することに関する。分析物を測定するために、分析的に示すことのできる基（＝標識）で標識され複合体中に含有されるバイオアフィンリアクタント（Ｒ₁）を用いる。試料の分析物濃度を、次いで、複合体結合および／または非複合体結合標識リアクタント（それぞれＲ₁′およびＲ₁″）の量から測定することができる。本発明は、懸濁性炭素粒子を標識として用いる。バイオアフィニティが、抗体および抗原／ハプテンに関する場合、免疫測定または免疫化学的測定について述べている。バイオアフィニティが、相補的なオリゴ／ポリヌクレオチドに関する場合、ハイブリダイゼーション法について述べている。本発明は、特に免疫測定に用いる。生物特異的親和性に基づく分析法に用いられる多数の標識が、当業界で知られている。粒子は、このような状況においては重要である。公知の技法によれば、これらの粒子は、第一にコロイド次元のゾルの形態である（即ち、通常１−２００ｎｍで球形で単分散している）。周知の微粒子の標識基は、金属粒子、非金属粒子(例えば、ＳｉＯ₂および炭素、ラテックスならびに死滅した赤血球および細菌)である。バイオアフィン対の個々の構成員、例えば、ビオチンもしくは（ストレプト）アビジン、ハプテンもしくは抗体、抗体中のクラス特異的決定基等のような間接的に示すことのできる標識について詳述することもできる。間接的に検出可能な標識は、しばしば、直接的または間接的に検出することのできる標識で標識したそれらのバイオアフィンの対応物により測定または分析する。この点で、分析を行う時、場所および方法ならびに分析しようとする物質に依存して種々の方法論を利用することができる。代表的方法の例は：ａ．不均一系および均一系法。不均一系および均一系という言葉は、標識化リアクタントを測定する以前に、複合体中に存在する標識化リアクタント（Ｒ₁ ′）が、非複合体結合リアクタント（Ｒ₁″）から分離するかどうかに関する。ｂ．競合（阻害）および非競合法。競合法は、分析物および分析物類似体の両方に生物特異的親和性を有するリアクタントの欠乏に対し結合しようと分析物と競い合う分析物類似体を用いる。分析物類似体は、分析媒体中の不溶性相（固相）で標識した又はそれに結合した分析物であってもよい。非競合法の例は、分析物上の相互に一定の距離を保ったエピトープに対する生物特異的親和性を示す２つ以上のリアクタントの間で分析物が複合体を形成するいわゆるサンドイッチ法である。ｃ．前述の複合体形成法に関与するリアクタントで被覆されるコロイド粒子の凝集を含む凝集テスト。ｄ．免疫組織化学法。ｅ．生物特異的親和性（例えば、ＤＡＳＰ）、イオン結合、疎水的相互作用、共有結合等のいずれかを介して複合体結合または非複合体結合標識化リアクタントを選択的に不溶化するリアクタントを用いた沈殿／不溶化処理を含む方法である。前述の方法は、いくらか均質な溶液中で、試験片、多孔性マトリックス上で、試験管、マイクロタイターウェル中で、平らな表面上等で行われてきた。炭素粒子の標識としての使用および粒子標識した免疫試薬による免疫化学的測定用試験片に関する公知の技法。Ａ． Waller等，Laboratory Animal 11（1977）93-97 は、血清試料を India I nk で処理し、続いて試料と Encephalitosooncuniculi 由来の抗原とを接触させる免疫化学的測定法について述べている。India Ink は安定に懸濁したカーボンブラック（ゾル）（Hackns Chemical Dictionary，4th Ed.，Ed．Julius Grant ，McGraw-Hill Book Company，page 346)に基づくインク／製図インクである。Ｂ．ＥＰ３２１，００８(HBT Holland Biotechnology)は、分析物または分析物のバイオアフィンの対応物に結合したコロイド性の単分散した非金属粒子（炭素粒子が言及されている）を用いる免疫化学的方法に関する。この特許は、沈降して沈殿物を形成することのできる粒子が、用いる粒子調製物中に存在しないことを意味する、粒子がゾルの形態で存在するであろうことを強調している。この特許は、不活性な親水性エンベロープ中に非金属性コロイドの一次粒子を包囲することによる又はリアクタントを直接むきだしの粒子に結合させることによるゾルの生成について特に述べている。特許は、粒子サイズが増加するにつれ感受性が増加すること、但し、用いた粒子調製物は、ゾル形態の単分散粒子であることを述べている。Ｃ． Amerongen 等（J．Biotechnol．30（1983）185-189 および Clin．Chim． Acta 229（1994）67-75）は、ゾル形態の炭素粒子を標識として用いる免疫化学的測定に関する。用いるゾルは、ＥＰ３２１，００８により製造する。Ameronge n 等もＥＰ３２１，００８も、使用に適切であると言われる炭素粒子の源、その特徴または製造に関して何ら開示していない。炭素粒子を用いる技法を試験片に供し、コンピューターに基づく画像分析を用いて定量的分析を達成する。ＥＰ３２１，００８の場合と同様に、ゾル形態で存在する粒子調製物の重要性が強調されている。Ｄ． Diverse．U.S．4,318,707(Syva)は、バイオアフィンリアクタントがそれに結合した音吸着粒子（例えば、ゾル）と組み合わせた蛍光標識したリアクタントを用いる均一系免疫化学的測定法について述べている。ＧＢ２，００５，０１９は、不均一系免疫化学的測定法における抗原担体としての炭について述べている。Ｅ．優先年中に、スウェーデンの特許庁は、国際型調査を行った。この報告は、我々の実験部分で用いたものと類似した炭素粒子を標識として用いる免疫測定法について漠然と述べているＧＢ２,２３９,３１４ならびに、その中に炭が含まれる種々の型の粒子を考察するＥＰ２３９,３１８およびＷＯ８９１１１０２に言及している。発明の目的本発明の目的は、標識基として炭素粒子を用いる導入部で明らかにした類の分析法を改良し簡易化することである。図１これは、検出ゾーン（Ｚ₁）に結合した固相結合抗−ＩｇＥ抗体（Ｒ₂）、標識した抗−ＩｇＥ抗体（Ｒ₁）および、固相結合抗−ＩｇＧ抗体（本研究者等の場合、Ｒ₁がマウスモノクローナルであることから抗−マウスＩｇＧ）を含む対照ゾーン（Ｚ₄）を用いるサンドイッチ試験により全ＩｇＥを測定するための本発明の一態様（試験片）を具体的に説明する。試料供試ゾーン（Ｚ₃）は、片の下部に位置しており、試薬Ｒ₁は、片のゾーンＺ₃に供する前に試料と混合する。移動ゾーン(Ｚ₂′およびＺ₂″およびＺ₂′′′)は、それぞれ、試料供試ゾーン（Ｚ₃）と検出ゾーン（Ｚ₁の間、検出ゾーン（Ｚ₁）と対照ゾーン（Ｚ₄）の間および対照ゾーンと吸引体の間に位置する。対照ゾーンの上に残っている片のその部分は、更なる移動ゾーン（Ｚ₂′′′）であと考えてもよい。矢印は、片の流れの方向を示す。異なる型の分析物のために下記で考察するようにリアクタントを置き換えることができる。固相結合抗体Ｒ₂を抗原／ハプテンに置き換えることにより、試験は、抗原／ハプテン特異的ＩｇＥを測定する（以下の実施例参照）。発明本発明は、好ましくは多分散した及び／又は不規則な形状の非コロイド次元の炭素粒子が、標識として機能し、前述の分析法に対し有利な作用を有することさえできるという発見に基づく。不規則な粒子は、球状粒子と比較して１粒子当たりの表面／容積比が大きく、従って、それを標識として用いる分析に対する応答または感受性がより大きい。本発明の１つの態様には、導入で明らかにした類の方法が含まれる。これらの方法には、通常、以下のものが含まれる。ｉ．分析物を含有する試料、おそらく予め処理した試料／分析物と炭素粒子で標識した懸濁性バイオアフィンリアクタント（Ｒ₁）との、Ｒ₁が試料の分析物濃度の定性的または定量的測定に対応する量で存在するバイオアフィン複合体の形成を可能にする条件下での接触、この後ｉｉ．複合体に結合した粒子標識したリアクタント（Ｒ₁′）または非結合リアクタント（Ｒ₁″）の量を、定性的または定量的に測定、ここで、ｉｉｉ．測定した量は、試料中の分析物の量のそれぞれ存在または量のものさしとする。本発明の方法は、炭素粒子の測定可能な量が非常に大きいことから、粒子（粒子標識したバイオアフィンリアクタント（Ｒ₁）の形態）が、＋４℃の測定用緩衝液中で満７日間にわたり沈降するということに特徴づけられる。懸濁液がこの条件を満たすかどうかは、前述の条件下で懸濁液を静置した後の視覚的判断により決定することができる。この書類の実験部分で開示した結果によれば、前述のパラグラフにより沈降することのできる粒子の量と共に感受性が増加する。これは、沈降することのできる粒子の量が、１００％の上限で、しばしば＞０．１％、例えば＞１％、好ましくは＞５０％であることを意味する（全てのパーセンテージは、ｗ／ｗパーセンテージであり、これは、この書類の実験部分中のみだし″沈降可能な粒子の量の関数としての感受性″の下に述べた方法により測定される）。関与する粒子を調製するにあたって、ａ．炭素粒子が、＞０．０５μｍの加重平均粒子サイズ、好ましくは０．２−５ μｍの範囲、更に好ましくは０．２−１μｍの範囲であること；およびｂ．１００％の上限で＞１％（例えば＞５０％）の粒子が０．２−５μｍ、好ましくは０．２−１μｍの範囲にあることが特に好ましい。前述のサイズは、Brookhaben Corporation，U.S.A.から得た装置を用い、Disk Centrifuge Photosedimentometer により測定する。 “Flow-Field-Flow-Fractionation”(=FFF):（Jengthun Li 等，ブロックコポリマー被覆ポリスチレンラテックスの粒径分析，ACS Symposium Series No．472 ，粒子分布 2，Chapter 16，pp.246-262（1991）American Chemical Society）により測定する場合、相当する好ましいサイズは、ａ．粒子分布の最高値が、＞０．１μｍである直径、好ましくは０．２−５μｍの範囲、更に好ましくは０．２−１μｍの範囲の直径であり；およびｂ．１００％の上限で＞１０％または＞５０％のように＞１％の粒子が、＞０．１μｍであり、好ましくは０．２−５μｍの範囲、更に好ましくは０．２−１μ ｍの範囲にある。適切な粒子サイズおよび沈降可能な粒子のパーセンテージは、供する試験方法、分析物、用いるバイオアフィン試薬の親和性および特異性により変化する。主な規則は、より高い分析物濃度に比較して、より低い分析物濃度が、＞２００ｎｍである粒子のより大きい部分を要求するということである。中でも、低濃度の分析物（≦１０^-10Ｍ）は、通常、＞５０％の炭素粒子が０．２−１μｍ（ＦＦＦにより測定した）（“Disk Centrifuge Photosedimentometer”により測定した粒子サイズの対応する限界は、０．２−１μｍより大きい＞２５％の粒子である）の範囲にある粒子調製物を必要とする。高濃度分析物の場合（＞１０^-10Ｍ）、シグナル強度を減少させ試薬の量を増加させる必要があり、これは、とりわけ、＞０．２μｍの粒子部分を、最も低いパーセンテージに近づく水準まで都合よく低下させる（あるいは、平均粒子サイズ（Disk Centrifuge Photosedimento meter）または上位平均値(FFF)を低下させる）ことを意味する。分析物濃度＞１０^-7Ｍ、これらの濃度は、通常、他の手段により測定される。当業者等は、相当する方法で推論することにより、生物特異的親和性反応を用いる他の方法が適する考察した点を適合させることができるが、前述のパラグラフの問題は、主としてラテラル免疫測定クロマトグラフィーに関する。実験部分も参照のこと。従来行われた試験は、安定に結合した、共有結合が最も考えられる、一次炭素団塊（一次粒子）の一次凝集物の形態の商業的に入手可能な炭素粒子調製物を用いて達成されてきた。団塊のサイズは、炭素の質に依存して変化するが、通常５ −２５０ｎｍの範囲、好ましくは２０−１００ｎｍである。それぞれの一次凝集物に含まれる一次団塊の数も、やはり変化し、最も用いうる質に関しては４−２００であり、好ましくは６−７５である。″安定に結合した″とは、凝集物が、普通に生物特異的親和性反応に供することのできる条件下で崩壊しないことを意味する。一次凝集物の形状は、伸びた枝分れした形状からより密集した構造にまで変えることもできる。一次凝集物は、順次、二次的に凝集してより大きな単位を形成することができる。これらの二次凝集物が崩壊に対して安定である場合、それらのサイズが、供した方法に対して有害な作用を及ぼさないならば、これらを本発明の分析法に用いることができる。前述の定義を満たす多数の潜在的に用いうる炭素の質（共有的に結合した一次団塊から成る凝集物）は、Degussa（ドイツ）および他の製造元から商業的に入手可能である。例としては、ファーネスブラック、チャンネルブラック、ランプブラックおよびアセチレンブラックの総称であるカーボンブラックがある。これらの物質の炭素含有量は、通常、８５％以上であり、１００％直前の含有量（９９．９９９％）（ｗ／ｗ）で終わる。製造元は、中でも、カーボンブラックの酸化処理により、炭素含有量を９９−１００％から８５−９９．９％（ｗ／ｗ）まで低下させた。関係する炭素粒子の酸化的に処理した形態が、炭素標識したリアクタントＲ₁を調製する場合、改善された懸濁化能力により本発明の方法に特に使用できることを見い出した。前述の炭素粒子は、重合包容物（エンベロープ）中に封じ込んでもよいし及び／又はバイオアフィンリアクタントもしくは、疎水的相互作用、イオン結合、双極子、双極子結合等に参与することのできる他の基を有してもよい。１個以上の粒子を１つおよび同じ重合包容物または包装材料に封じ込むことができる。バイオアフィンリアクタントＲ₁は、むき出しの凝集物に直接吸着により、または前述のパラグラフによる包容物を介して結合することができる。この後者の場合、共有結合の可能性は明らかであり、むき出しの凝集物への直接の共有結合も潜在的に可能である。バイオアフィンリアクタントは、懸濁した形態である炭素粒子上に最もよく吸着する。好ましい態様によれば、標識したバイオアフィンリアクタントは、試料にとって外因性であり、通常、試料が由来する個体／生物／源にとっても外因性である。試料の前処理の例としては、ａ）試料希釈、ｂ）試料濃縮、ｃ）分析物富化（例えば、妨害物質の除去）、ｄ）ｐＨ調整または他の手段の使用による調整、ｅ）分析物とバイオアフィン対応物との複合体形成、ｆ）ｅ）による複合体形成以外の分析物修飾等がある。上記ｅ）およびｆ）の点は、ｉ−ｉｉｉ段階の分析物が、元の試料中の分析物の修飾バージョンである分析物を指すことを意味する。元の試料中の分析物の量および前処理した試料中の修飾した分析物の量が、相互に明白に関連するように全ての前処理法を行う。温度、濃度、ｐＨ、リアクタントの添加順および加えるリアクタントの選択のような分析条件は、生物特異的親和性反応（免疫化学的測定、ハイブリダイジング法等）を用いる測定に用いた他の標識に関して以前に供された条件と同様である。測定媒体は、通常、水であり、任意に水混和性溶媒と混合する。免疫化学的反応の場合、温度は、０−４０℃の範囲、ｐＨは、４−１０の範囲である。相補的オリゴ／ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを含む反応の場合、温度は、好ましくは０−１００℃の範囲である。実施の好ましい態様不均一系方法論本発明の最も実施しやすい態様は、不均一系方法論、即ち、一方または両方のリアクタントを測定するに先立ち、複合体中に含まれる標識化リアクタントＲ₁ ′が、複合体中に含まれていない標識化リアクタントＲ₁″から物理的に分離されている技法を用いる。ほとんどの場合、これらのリアクタントは、分離を行う前に、複合体に結合した標識化リアクタントのマトリックスへの選択的分配を達成する、測定媒体中で不溶性であり、それへ結合したバイオアフィンリアクタントを有する相（マトリックス）を用いることにより分離する。本発明の不均一系バリアントに用いる不溶性相（マトリックス）は、片、プレート、多孔性連続マトリックス（モノリス）、親水性粒子、好ましくは多孔性粒子、膜、隔膜等の形態を有することができる。標識したリアクタントの関数として分析物を分離、測定および関連付ける必要条件は、本発明による標識基が粒子から成るという事実に適合することを除いては、公知の技法に供することのできるものと同じである。多孔性マトリックス−試験片および他のイムノクロマトグラフィー技法現在最も実施しやすいと考えられる本発明による不均一系法は、粒子充填床の形態またはモノリス（自己密着性マトリックス）の形態のいずれかで多孔性マトリックスを用いる。モノリス型マトリックスは、形成した複合体検出用検出ゾーン（Ｚ₁）を含む試験片または膜を形成することができる。試験片または膜は、通常、試料、リアクタント（例えば、Ｒ₁）、洗浄溶液等のそれぞれの検出ゾーンへ及び／又はそれから移動のための１つ以上のゾーン（例えば、Ｚ₂′およびＺ₂″）、ならびに試料供試ゾーン（Ｚ₃）、ならびに任意に更なるゾーンＺ₄、Ｚ₅等も含む。移動ゾーンＺ₂′ は、試料供試ゾーンと検出ゾーンの間にある。これらのゾーンは、必ずしも同じ材料から成る必要はない。例えば、ゾーンの機能に関する材料を選択することが、しばしば実際的である。下記参照。検出ゾーンＺ₁は、マトリックスに安定に結合し、試料の分析物含有量の関数である一定量の標識化リアクタントＲ₁を捕獲することのできるバイオアフィンリアクタント（Ｒ₂）を含有する。分析物が試料中に存在する場合、検出ゾーンは黒くなる。検出ゾーンの黒色化は、いくつかの方法で、好ましくは可視的に、だが、おそらく更に好ましくは且つ更に信頼できることには、Amerongen 等(J． Biotechnol．30(1983)，pp．185-189，and Clin．Chim．Acta 229(1994)，pp．6 7-75)によるコンピューターに基づく写真または画像分析の媒体を介して、量的に質的にの両方で示すことができる。最も単純な場合においては、ａ．安定に結合したリアクタントＲ₂および標識化リアクタントＲ₁は、両方とも分析物に向けられる（サンドイッチ試験）；またはｂ．検出ゾーンに安定に固定したバイオアフィンリアクタントＲ₂は、分析物およびリアクタントＲ₁（Ｒ₁は、分析物類似体）の両方に存在するエピトープに向けられる（競合試験）。Ｒ₂が検出ゾーンに安定に固定されるという言及は、Ｒ₂が、通過する種々の測定用緩衝液により溶出されないことを意味する。リアクタントＲ₂は、従来の方法、即ち、共有結合または吸着を介した結合（通常、疎水力）で固定される。充填した粒子床の形態またはモノリスの形態の多孔性マトリックスを用いる本発明の最も単純な不均一系バリアントは、只１つの検出ゾーンＺ₁を有し、このゾーンは、試料供試ゾーンとしても機能する。試薬（例えば、Ｒ₁）および洗浄溶液は、検出ゾーンに直接供され、このゾーンを通過した直後マトリックスを去る。単純な更なる展開において、検出ゾーンは、それぞれ検出ゾーンへの及び検出ゾーンからの移動のための１つ又は２つの移動ゾーン（Ｚ₂′およびＺ₂″）と接触する。Ｚ₂″は、液体移動が容易になるように好ましくは吸収性が高い。移動ゾーンＺ₂′が存在する場合、試料供試ゾーンＺ₃をそこに並べる。リアクタントＲ₁は、多数の異なる方法で検出ゾーンと接触することができる。共に検出ゾーン（Ｚ₁）に移動することができるようにリアクタントＲ₁と分析物とを接触させる（インキュベートして）ことが、通常好ましい。１つのバリアントは、試料供試ゾーンへのその供試に先立ち、試料とリアクタントＲ₁とをプレインキュベート／混合することである。Ｒ₁が分析物と共に検出ゾーンＺ₁に移動するように、リアクタントＲ₁を、移動ゾーンＺ₂′、または試料供試ゾーンＺ₃ に予め分配することもできる。考えられる選択肢には、リアクタントＲ₁を、検出ゾーンＺ₁もしくは、今までに述べたゾーンから物理的に離れているゾーンに予め分配すること、又はそこに分析物を結合させた後に検出ゾーンＺ₁に直接供することが含まれる。本発明のあるバリアントにおいて、検出ゾーンに安定に結合している生物特異的リアクタントＲ₂は、分析物に直接結合することができない。例えば試料または検出ゾーンＺ₁または移動ゾーンＺ₂′を、分析物とＲ₂間の結合を創出することのできる二官能性親和性試薬と共に予めインキュベートすることがあっても良い。マトリックスを初めにかなりの程度まで乾燥させる場合、試料は、異なるゾーンから検出ゾーンへ毛管力により移動することができる。あるいは、吸引体を、移動ゾーンＺ₂′の近く（検出ゾーンからの移動）に含ませてもよい。また、移動は、電場により達成することもできる。試料供試ゾーンが、検出ゾーンより高い水準に位置する場合、移動は、特に、膜の形態の多孔性マトリックスの場合、静水圧により達成することができる。異なる試薬を供した後、検出ゾーンの洗浄は、しばしば、検出ゾーンの下流の位置で過剰の液体吸収能力を必要とする。これは、移動ゾーンＺ₂″の容積を増加させることにより、又はそれと接触する液体の流れに高吸収性マトリックスを配することにより成し遂げることができる。試料供試ゾーンＺ₃は、しばしば、良好な水保持特性を有すると同時に、分析処理中に移動ゾーンＺ₂′に水をうまく放出することのできる多孔性マトリックスの形態を有する。マトリックスは、液体の移動を可能にするのに十分親水性であってもよい。マトリックスは、炭素粒子が試料供試ゾーンから検出ゾーンへと移動することを可能にする多孔度を有する。ガイドラインにより、孔の径は、炭素粒子の径より大きいということが言える。孔の径は、親水性マトリックスの許容される機能を得るために、好ましくは０．４−１００μｍの範囲である。この出願の優先日に、移動ゾーンの多孔性ナイロンマトリックスおよび多孔性ニトロセルロースマトリックスを試験するのに成功した。ナイロン、ニトロセルロースおよびセルロース（ペーパー）を、検出ゾーンに用いた。共有的に固定されたリアクタントＲ₂にはナイロンおよびセルロースを用い、吸着により固定されたリアクタントＲ₂にはニトロセルロースを用いた。試料供試ゾーンに用いた材料は、液体貯蔵用としてのセルロースフィルターおよび／またはガラス繊維フィルターと任意に組み合わせて、移動ゾーンに用いる材料と同じであった。粒子サイズ、多孔度および疎水性は、容易な方法での簡単な実験により相互に関して最適化することができる。実験部分参照。多孔性マトリックスの場合の幾何学的に最も好ましい態様は、試料供試ゾーン、移動ゾーンおよび検出ゾーンを、その間の液体移動の可能性があるように順々に側面に配置する試験片である。過剰の標識化リアクタントＲ₁が検出ゾーンＺ₁ から移動ゾーンＺ₂″に移動する態様の場合、Ｒ₁が通過を余儀なくされる対照ゾーン（Ｚ₄）を検出ゾーンの下流に置くことが有利である。対照ゾーンが、Ｒ₁に結合するバイオアフィンリアクタントを含有する場合、対照ゾーンは、負の試料に応答して（および正の試料にも応答して）黒くなり、それによって機能のコントロールを提供する。マトリックスは、ブラックカーボン粒子と良好なコントラストを提供する他の色の薄い微妙な色合いをたとえ許容できるとしても、好ましくは白色である。試験片の構築およびそれと関係する材料の選択の更に詳細な説明のために、特に、WO 8808534(Unilever)、U.S．5,120,643(Abbott Labs)、 U.S．4,954,452(A bbott Labs)、 Amerongen 等(J．Biotechnol．30(1983)，pp．185-189，Clin．C him．Acta 229(1994)，pp．67-75)、およびコロイド粒子の形態の標識基の使用をやはり扱っているその他を参照する。特に好ましい不均一系技法不均一系サンドイッチ技法によれば、Ｒ₁およびＲ₂は、少なくとも２つのエピトープを有する抗原またはハプテンである分析物上の物理的に距離を保ったエピトープに対して向けられる抗体であってもよい。この技法は、主として、蛋白質のような高分子量の生物の有機分子、例えば、所定のクラスのＩｇ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）を測定するのに用いる。別のサンドイッチバリアントにおいて、Ｒ₁およびＲ₂の内一方は、抗原／ハプテンであり、他方は、クラス特異的決定基に対して向けられる抗体（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）である。この後者のバリアントは、所定のクラスの抗原特異的抗体（分析物）を測定する。Ｒ₁が抗−ＩｇＥ抗体でありＲ₂が抗原である場合、ＰＡＳＴ −型ＲＡＳＴ−試験（アレルギー試験；ＰＡＳＴ＝Particle Allergy Sorbent T est)が得られる。サンドイッチ技法は、非常に高度の感受性を提供し、従って、特に低濃度分析物に適している。最も好ましい競合技法において、Ｒ₁は分析物類似体であり、Ｒ₂は、分析物および分析物類似体の両方に対して向けられる抗体である。この技法は、主として低分子量の生物有機分子に向けられ、ＩｇＥのような高分子量蛋白質を測定するのに用いることができる。本発明の方法は、主として、アレルギー診断の目的で全ＩｇＥおよびアレルゲン特異的ＩｇＥの血清／血漿水準を測定、ならびに他のＩｇのクラスに関連した対応する方法のために開発されてきた。この出願の優先日において、この型の使用法のＩｇＥ濃度の範囲は、それぞれ、１０^-10−１０^-7Ｍ全ＩｇＥ／ｌ血清および１０^-12−１０^-9Ｍアレルゲン特異的ＩｇＥ／ｌ血清（即ち、全ＩｇＥおよびアレルゲン特異的ＩｇＥの両方とも低濃度分析物である）であった。本明細書で用いる場合の抗体には、そのままの（intact）抗体および抗原結合抗体断片が含まれる。本明細書で用いる場合の抗原には、抗原自体、ハプテンおよび抗体結合活性を示す抗原断片が含まれる。本発明の他の態様本発明の他の態様は、粒子で標識される、ＩｇＥ結合エピトープを含む、ＩｇＥ、抗−ＩｇＥ抗体およびアレルゲンから成る群から選ばれる免疫試薬である。この態様は、粒子が炭素粒子であることに特徴づけられる。好ましい態様の場合、粒子は、本発明の方法で用いるものと同じ方法で定義される。発明の利用分野本発明は、前述の粒子の範囲が直接供することのできる、また多くの場合に必要な、臨床診断（治療監視過程を含む）に用いることができる。代表的な試料は：脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、涙液、尿、血液（血漿および血清）等である。特別な目的の診断領域は、治療を追跡（監視）するため及び、喘息のような種々の炎症症状、およびアレルギー関連症状、および持続性アルコール過剰消費を診断するために分析物を測定する測定である。適切な分析物の例としては、異なるクラスの抗原／アレルゲン特異的抗体（特に、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）、それぞれのＩｇクラスの全レベル、好酸性陽イオン性蛋白質（ＥＣＰ）、好酸性蛋白質Ｘ（ＥＰＸ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ヒト好中性リポカリン（ＨＮＬ）、リゾチーム、トリプターゼ、インターロイキン類（ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、オステオカルシン等がある。アルコール過剰消費にとって、炭水化物欠乏トランスフェリン類（ＣＤＴ；特にアシアロトランスフェリンおよびジシアロトランスフェリン）は、重要な分析物である。これは、当然のことながら、本発明の方法が、癌、ホルモン性疾患等のような他の疾患の診断には供することができないことを意味するものではない。また、本発明は、生物特異的親和性を示す物質の生産における品質制御と連結して供することもできる。この後者の文脈において、濃度は、しばしば、かなり高く、感受性および特異性に対して完全に異なる必要条件が提起される。また、炭素粒子に対して提起される要求は、懸濁化能がしばしば十分であることを意味して相応じて低い。これは、特に、ＩｇＥ、抗−ＩｇＥ抗体、アレルゲンおよび、抗体（特にＩｇＥ）に結合するアレルゲンエピトープ（＝アレルゲン由来のハプテン）ならびに他の前述の分析物およびそれらに向けられる抗体に供する。また、本発明は、環境分析、例えば、大気中のアレルゲンの存在を測定するために供することもできる。アレルゲンは、通常、花粉、ダニ、ネコ等に由来し、しばしば、蛋白構造を有する。本発明は、主として、完全に又は部分的に１０^-10未満にわたる範囲、即ち、低濃度に属する１−１０ｘ１０^-10以内の濃度を測定する分析物を意味する低濃度分析物を測定するために開発された。この範囲は、それがその自然の環境（ＣＳＦ、血漿、血清、全血、尿、涙液、唾液等）に存在するような分析物の濃度を指す。多数の実施例により本発明を更に詳細に具体的に説明するが、本発明は、これらに制限されるものではない。本発明は、以下の特許請求の範囲で明らかにされる。実験部分標識された試薬の調製炭素懸濁液（母液）：約５００ｍｇの炭素粒子を、ｐＨ８．５の５ｍＭの硼酸緩衝液５０ｍｌに懸濁し、３０分間超音波にかけた。炭素粒子上の蛋白質の吸着に先立ち、懸濁液を１ｍｇ／ｍｌに希釈し、更に３分間超音波にかけた。用いた炭素の質は、以下のそれぞれの試験の説明から明白である。炭素粒子（凝集物）を用いた抗−ＩｇＥ抗体の標識化：上記による決められたマイクログラム数の母液（Ｘμｇの炭素；それぞれの応用参照）および５０μｇの抗−ＩｇＥ抗体（５ｍＭの硼酸緩衝液中、ｐＨ８．５）を、５ｍＭの硼酸緩衝液ｐＨ８．５で最終容量１ｍｌに希釈した。この溶液を室温で３時間静置した後、各１ミリリットルにつき１０ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加え、混合物を更に３０分間インキュベートした。混合物を、次いで、１％ＢＳＡおよび０．０５％ＮａＮ₃を含有する０．１Ｍの硼酸緩衝液ｐＨ８．５で３回、その間に１６，０００ｘｇで遠心分離をしながら洗浄した。最後の洗浄終了後、沈殿物を硼酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．５，１％ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ₃）で５００μｇ／ｍｌの炭素含有量になるように希釈した。用いる量を、抗−ＩｇＥ抗体濃度が最終溶液で２５−５０μｇ／ｍｌになるように適合させた。遠心分離時間は、異なる型の炭素と共に変化させた。炭素粒子（凝集物）を用いたカゼインの標識化：２５０μｇの炭素（ｓｐ１００、Degussa）および１００μｇのカゼインを含有する母液を、５ｍＭの硼酸緩衝液ｐＨ８．５で最終容量１ｍｌに希釈した。抗体−ＩｇＥ抗体の標識化は、他の点では同様である。試験片の作成試験片１：ニトロセルロース膜（Schleicher and Schuell，ドイツ、８μｍ）を、硬い予めゴムをぬったポリエステルシートにのせた。次いで、抗−ＩｇＥ抗体溶液を、シートの一方の側と平行な線（検出ゾーン）でシート上に噴霧し、抗− ＦｃマウスＩｇＥ抗体溶液を、初めの線から十分距離をあけてそれと平行な線（対照ゾーン）でシート上に噴霧した。膜を、乾燥させ、次いで、０．８ｃｍ×４ｃｍの寸法の片に切った（抗体の線が片の短い端と平衡になっている）。濾紙（ Whatman セルロース１７ＣＨｒ、英国、寸法０．８ｃｍ×０．８ｃｍ（試料供試ゾーン））を、検出ゾーンと同じ側の片の短い端（片の底）に置いた。吸引フィルター（Whatman セルロース１７ＣＨｒ、２ｃｍ×２ｃｍ）を、片の他方の端（片の一番上）においた。対照ゾーンは、特定の試験では省いた。正確な測定は、場合により僅かに変化した。試験片２：ダニアレルゲンが共有的に結合（ＣＮＢｒカップリング）したセルロースペーパー片（幅３ｍｍ）から検出ゾーンが成り、ダニディスク（ｄｌアレルゲンディスク）、Kabi Pharmacia Diagnostics AB，スウェーデン）から片を切り取ったことを除いては、試験片２は、試験片１と同様であった。ニトロセルロース膜を、検出ゾーンの位置で切り離し、反対の端を重複させて（検出ゾーンのより低い部分（流れる方向に面する部分）の一番上に膜および下にダニ片）上部でも同様にしてダニ片を試験片に糊付けした。試験片３：ナイロン膜。抗−ＩｇＥ抗体、カンバアレルゲンまたはカゼインを、検出ゾーンに共有的に結合させた。ラテラル免疫測定タロマトグラフィー用標準プロトコール全ＩｇＥ：３部の標準溶液／試料（６％ＢＳＡ、５０ｍＭ燐酸緩衝液ｐＨ７．５、０．０５％ＮａＮ₃中の含量を変えたＩｇＥ）と抗−ＩｇＥ抗体が前述のように吸着した１部の炭素(Ｘ＝３９０μｇ炭素、ｓｐ１００(Degu ssa))懸濁液（約０．１μｇ炭素／μｌ）との混合物３０−８０μｌを、試験片１上の試料供試ゾーンに供し、検出ゾーンへの移動を開始した。緩衝液（０．１Ｍ硼酸緩衝液ｐＨ８．９５、０．０５ＮａＮ₃中の１％ＢＳＡ）で湿らせたガラス繊維フィルターを、次いで、試料供試ゾーンにおいた。ＩｇＥを含有する試料では１０分以内に検出ゾーンに暗いバンドを検出することができた。シグナルは、ＩｇＥを含有していない試料で得られる結果とは容易に識別することができた。片の黒色化を、ズーム顕微鏡(Askania MZM-1)に搭載したビデオカメラ(Kappa ，CF 8/1)で測定し、画像分析プログラムで算定した。ダニ特異的ＩｇＥ：１２５ｋＵ／Ｌのダニ特異的ＩｇＥを含有する陽性ヒト血清またはブランクの試料（正常なヒト血清＜０．３５ｋＵＩｇＥ／Ｌ）３８μｌを、その表面に抗−ＩｇＥが前出により吸着した１２μｌの懸濁炭素粒子（２．３μｇ炭素）(Ｘ＝２５０μｇ炭素、Ｐｒ１５０Ｔ(Degussa))と混合し、試験片２の試料供試ゾーンに直接供した。次いで、４０ μｌの０．１Ｍ硼酸緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ₃を含有した、ｐＨ８．５）を供することにより洗浄を開始し、液２０μｌで更に洗浄した。陽性の試料は、検出ゾーンが明白な黒色化を呈した。ブランクの試料では黒色化は、全く得られなかった。カゼイン特異的ＩｇＥ：４５μｌの陽性ヒト血清（カゼインに関してＲＡＳＴ陽性）を、正常なヒト血清で１リットル当たり２０ｋＵ／Ｌのカゼイン特異的ＩｇＥに希釈し、これとまたは４５μｌのブランク試料（ヒト血清＜０．３５ｋＵＩｇＥ／Ｌ）と、カゼインが前述により吸着された炭素粒子の懸濁液７．５μｌ（５μｇ炭素）とを混合し、次いで、試験片１の試料供試ゾーンに直接供した。試料のゾーンへの吸着後、全ＩｇＥと同じ方法で洗浄を開始した。陽性の試料は、検出ゾーンの明白な黒色化が見られた。ブランクの試料の場合、黒色化は、全く観察されなかった。沈降可能な粒子（凝集物）の量の関数としての感受性凝集物標識化抗−ＩｇＥ抗体：ＣｈｌｏｒａｍｉｎｅＴ−法により標識した¹² ⁵ −抗−ＩｇＥ抗体で試験を行った。標識した抗体を、次いで、上記方法により炭素粒子(ｓｐ１００(Degussa、ドイツ)に吸着させた。母液を、＋４℃の冷蔵庫で貯蔵し、満２日後、全ての粒子が沈降したことを見い出した。吸着した抗体を含有する懸濁液を、異なるＧ数で遠心分離して異なるサイズの画分を（ペレットおよび上澄の形態で）得た。それぞれの画分中の沈降可能な粒子のパーセンテージ：それぞれのペレットを、再懸濁し、室温で満１１日間にわたって沈降させた。また、上澄も同じ条件下で沈降させた。沈殿物の放射能を測定し、それぞれの画分中の沈降可能な粒子の割合／パーセンテージの尺度とした。結果を、下記の表１に示す。膜（孔サイズ８μｍ）中で移動する能力：再懸濁した沈殿物、上澄または遠心分離していない懸濁液を、試験片１の試料供試ゾーンにおき、検出ゾーンへと移動させた。いくらかの炭素粒子が試料供試ゾーンにとどまったために、ある程度の黒色化がこのゾーンに残った。試料供試ゾーンに残っている放射能の程度を、移動することのできない粒子の尺度とした。結果を表１に示す。炭素凝集物のサイズの関数としてのシグナル強度：供した手法は、ラテラル免疫測定クロマトグラフィーの標準プロトコールによる。用いた試料は、ＩｇＥ−標準（０．５−５０ｋＵＩｇＥ／Ｌ、６％ＢＳＡ、５０ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ７．５、０．０５％ＮａＮ₃）であった。アレルゲン特異的ＩｇＥを試験する場合、低い測定範囲が最も必要な範囲であることから、シグナル強度は、０．５ｋＵＩｇＥ／Ｌで比較した。シグナル強度を相対的測定値（シグナル強度：平均シグナル）に変換した。画分を３つの群に分けた：上澄（数３）、遠心分離していない懸濁液（数２）およびペレット、沈殿物（数３）。結果を表１に示す。まとめると、以下のことが分かった：１．最も小さい粒子サイズ（上澄）を有する画分（ペレット）は、低ＩｇＥ水準の弱いシグナルが生じた。２．＋４℃から＋８℃で満２日間測定用緩衝液（０．１Ｍ硼酸緩衝液、１％ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ₃、ｐＨ８．５）中で貯蔵した場合に沈降した（＞９５％）遠心分離していない懸濁液は、より低い沈降傾向がある粒子に関して強化した画分より良好な試験結果であった。３．沈殿物における増加の大部分が試料供試ゾーンに残るという事実により、大きい粒子（ペレット、沈殿物）を含有する画分は、同じ炭素種の遠心分離していない懸濁液と同じくらいの感受性であった。異なる炭素の質に対するシグナル強度依存性約２０の異なる型のカーボンブラック(Degussa)、特にチャンネルブラックおよびファーネスブラックおよび特定の特別なブラック型を、試験（ラテラル免疫測定クロマトグラフィー）でＩｇＧ（¹²⁵Ｉ−抗−ＩｇＥ抗体）の吸着およびそれらの機能に関して調査した。用いたいくつかのカーボンブラックからは懸濁液を作ることは不可能であることが分かった。それでも特定の型の炭素から理想的とはいえない懸濁液ができたが、この問題は、多くの場合、抗体と混合した炭素に超音波をかけることにより解決した。前出による全ＩｇＥのための方法を、ラテラル免疫測定クロマトグラフィー用標準プロトコールとして用いた。用いた試料は、０．５−１２５ｋＵＩｇＥ／Ｌを含有するＩｇＥ標準であった。小さいパーセンテージのものだけは、低い尺度範囲で強いシグナルが生じたが、試験した全ての炭素種は、５ｋＵＩｇＥ／Ｌ以上の領域で陽性のシグナルが生じた。黒色化度は、全ての炭素種でＩｇＥレベルと関連した。対照ゾーンは、調査した全ての炭素種で黒色化した。アレルゲン特異的ＩｇＥを試験する場合、より低いＩｇＥ範囲部分を最も目的とすることから、シグナル強度は、複数の炭素種で０．５−１ｋＵ／Ｌで比較した。測定値を相対値（シグナル強度：平均シグナル）に変換した。測定における低ＩｇＥ値の関数に依存して、炭素種を各群につき６−７炭素種の３つの群に分けた。抗−ＩｇＥ抗体が吸着して懸濁液から沈降(＋４℃で１ケ月間)した炭素粒子の傾向を、凝集物サイズの尺度とした。全ての炭素粒子が沈降して完全な沈殿物を提供した懸濁液に４＋の値を与え、一方、無沈殿物の懸濁液には０＋値を与えた。結果を下記の表ＩＩに示す。まとめると、以下のことが分かった：１．全ての炭素種が、抗−ＩｇＥ抗体（¹²⁵Ｉ−抗−ＩｇＥ抗体）を吸着した。２．ラテラル免疫測定クロマトグラフィーの場合、炭素種は、明らかに異なるパフォーマンスを示し、より高い沈降傾向は、増加した試験感受性となった。ｓｐ１００およびｓｐ４(Degussa)での比較試験試験プロトコールは、全ＩｇＥで用いたものと同じであった。２つの異なる炭素種（それぞれｓｐ４およびｓｐ１００）の同じ量の炭素で２種の分析シリーズを行った。試料のＩｇＥ含量は、１、５、２０および１００ｋＵ／Ｌであった。それぞれの炭素種の標準曲線は、低ＩｇＥ濃度の場合、ｓｐ１００はｓｐ４より高いシグナルが生じるが、モルベースではｓｐ４はより多くの試薬を担持し、より高い濃度でより高いシグナルを与えた。異なる膜に対して相当する比較を行った場合も、より強いシグナルが生じるより大きい粒子／凝集物の傾向が観察された。ｓｐ１００は：０．５ｋＵ／ＬＩｇＥでｓｐ４で生じたシグナルより２．６倍高いシグナル。１．０ｋＵ／ＬＩｇＥでｓｐ４で生じたシグナルより２．４倍高いシグナル。５．０ｋＵ／ＬＩｇＥでｓｐ４で生じたシグナルより１．７倍高いシグナル。２０ｋＵ／ＬＩｇＥでｓｐ４で生じたシグナルより１．３倍高いシグナルが生じた。炭素粒子（一次凝集物）のサイズの測定ｓｐ１００およびｓｐ４(Degussa)の凝集物の直径のサイズを下記により測定した：１． (Flow-Field-Flow-Fractionation)(=FFF)：(Jengthun Li 等，ブロックコポリマー被覆ポリスチレンラテックスの粒径分析，ACS Symposium Series No．4 72，粒子分布 2，Chapter 16，pp．247-262（1991）American Chemical Societ y)．炭素ｓｐ１００およびｓｐ４（Degussa）の直径を測定した。粒子分布のピーク値は、ｓｐ１００で２８０ｎｍの直径であり、ｓｐ４で１４０ｎｍの直径である。結果を下記の表ＩＩＩに示す：（Disk Centrifuge Photosedimentometer (=DCP)：Brookhaven Corp.，U.S.A.の装置を用いて測定処理を行った。結果を下記の表ＩＶに示す：荷重平均値は、ｓｐ１００で２００ｎｍおよびｓｐ４で８５ｎｍである。炭素粒子サイズを、その沈降能力から間接的に、及びＦＦＦおよびＤＣＰにより直接的に測定した。ＦＦＦおよびＤＣＰは、粒子幾何学の異なる面に焦点を合わせる分析方法である。得られた結果（表ＩＩＩおよびＩＶ）は、粒子が複雑な幾何学的形状で不規則で非球形である結果である相違を具体的に説明する。優先年中に得られた実験結果優先年中に、本発明の試験片モードのパフォーマンスを改良してきた。本研究者等の最近の知見は、少なくともサンドイッチ不均一技法に関しては、抗体をＦｃ部分に欠ける断片の形態で免疫試薬として用いるのが好ましいことを支持する。これは、少なくとも標識化リアクタントＲ₁に当てはまる。添加の順番に関しては、連続モード、即ち、分析物／試料および標識したリアクタントＲ₁が、この順番で移動ゾーン（Ｚ₂′）の少なくとも一部を通って移動するように配置するモードが好ましい。好ましくは、これは、別々に片に、例えば、異なる時間に供試ゾーンに加える（下記の実施例１、Ｒ₁の前に試料）か又はより好ましくは、供試ゾーンと検出ゾーン間の移動ゾーンの異なる位置（下記実施例２、供試ゾーンへの試料の添加後、移動ゾーンＺ２′の始まりの部分にＲ₂ ）で加えることを意味する。１．全ＩｇＥ、連続モード３０μｌの緩衝液中のＩｇＥ（６％ＢＳＡ、５０ｍＭの燐酸緩衝液ｐＨ７．５、０．０５％ＮａＮ₃中の異なるＩｇＥ濃度）を、寸法５ｘ３０ｍｍのポリエステル支持ニトロセルロース膜(８μｍ、Whatham，UK)の一方の端（液体供試ゾーン）に供した。膜は、供した液体が膜表面に広がるのを阻止するために、供試ゾーンから約７ｍｍ下流に接着した薄いポリエステル片を有した。抗−ＩｇＥ(Pharmacia Diagnostics，Uppsala，Sweden)を、供試末端から２ｃｍの細い線（１ｘ５ｍｍ）（検出ゾーン）に予め吸着させておいた。吸引セルロースパッド（５ｘ１５ｍｍ Whatham セルロース17Chr）を、ニトロセルロース膜の上、吸着した抗−ＩｇＥの下流においた。試料が膜に移動した時点で、３０μｌの洗浄用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％ウシガンマグロブリン、０．１Ｍの硼酸緩衝液ｐＨ８．５、０．９％ＮａＣｌ、１０％蔗糖、０．０５％ＮａＮ₃）を、供試ゾーンに供した。この洗浄工程後、３０μｌの炭素標識した抗−ＩｇＥｆａｂ′２（洗浄用緩衝液中の６μｇのＳｐ１００＋０．６μｇの抗−ＩｇＥｆａｂ′２から前述の実施例と同様に標識した抗−ＩｇＥｆａｂ′２）を、供試ゾーンにおいた。この懸濁液の吸着後、液体供試ゾーンに０．１ｍｌの洗浄用緩衝液（上記参照）を含有するセルロースパッドを供することにより最終洗浄工程を実施した。試料供試の１０分後、液体供試ゾーンから２ｃｍ下流の反応ゾーン上に黒いバンドが徐々に見えてきた。バンドの強度は、供した試料中のＩｇＥの量に関係した。強度を、ズーム顕微鏡に搭載したＣＣＤカメラで測定し、コンピューター画像プログラムで算定した。２．ヒト血漿中のアレルゲン（カゼイン）特異的ＩｇＥ、連続モード３０μｌの患者試料（陰性の血漿中に希釈した、下記表参照）を、寸法５×３０ｍｍのポリエチレン支持ニトロセルロース膜(８μｍ、Whatham ，UK)の一方の端（液体供試ゾーン）に供した。ニトロセルロース膜の上に載せた濾過膜(Cytosep 1661，Gelman，USA)を介して供試した。膜は、供した液体が膜表面に広がるのを阻止するために、供試ゾーンからそれぞれ約約７ｍｍおよび１３ｍｍ下流のニトロセルロース膜に接着した２つの薄い接着ポリエステル片を有した。カゼインを、予め、供試末端から２ｃｍの細い線（１×５ｍｍ、検出ゾーン）に吸着させておいた。吸引セルロースパッド(５×１５ｍｍ Whatham セルロース 17Chr)を、吸着したカゼインの下流のニトロセルロース膜の上においた。試料が膜に移動した時点で、３０μｌの洗浄用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％ウシガンマグロブリン、０．１Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７．５、０．９％ＮａＣｌ、１０％蔗糖、０．０５％ＮａＮ₃）を供試ゾーンに供した。この洗浄工程後、３０μｌの炭素標識した抗−ＩｇＥｆａｂ′２（洗浄用緩衝液中の６μｇのＳｐ１００＋０.６μｇの抗−ＩｇＥｆａｂ′２から前述の実施例と同様に標識した）を、ポリエステル片間のゾーンにおき、続いてすぐに供試ゾーンに３０μｌの洗浄用緩衝液を供した。試料供試の１５分後、液体供試ゾーンから２ｃｍ下流に位置する検出ゾーン上に黒いバンドが徐々に見えてきた。バンドの強度は、供した試料中のカゼイン特異的ＩｇＥの量に関係した。強度を、ズーム顕微鏡に搭載したＣＣＤカメラで測定し、コンピューター画像プログラムで算定した。表ＶおよびＶＩに示した結果は、少なくとも１０^-12の低さの濃度は測定することができることを具体的に示している。添加の順番は、炭素標識した抗−ＩｇＥｆａｂ′２（Ｒ₁）の添加前に、分析物が、炭素標識した抗−ＩｇＥｆａｂ′２（Ｒ₁）のための供試部分を通過していたことを保証した。これは、更に、炭素標識した抗−ＩｇＥｆａｂ′２（Ｒ₁）が供試ゾーンに移動するのを阻止した。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Immunoassays and suspended carbon labeling Reagents containing bioaffine particles Technical fields and known techniques This analysis determines the analyte content of a sample by its corresponding bioaffin (bioaffin). qualitatively or quantitatively by forming a complex between the counterpart and the analyte using e) It relates to measuring either quantitatively. Analytically indicated to determine the analyte Bioaffine labeled in the complex labeled with a group that can be Actant (R₁) Is used. The analyte concentration of the sample is then determined for complex binding and And / or non-complex bound labeled reactant (each R₁'And R₁″) Can be measured. The present invention uses suspended carbon particles as labels. When bioaffinity involves antibodies and antigens / haptens, immunoassays Or immunochemical measurements. Bio-affinity is complementary In the case of go / polynucleotides, please describe the hybridization method I have. The invention finds particular use in immunoassays. Numerous labels used in assays based on biospecific affinity are known in the art. ing. Particles are important in such situations. According to known techniques, These particles are primarily in the form of a sol of colloidal dimensions (i.e., typically 1-20 It is spherical and monodisperse at 0 nm). The labeling groups of well-known microparticles are metal particles, non-metallic Particles (e.g., SiO_TwoAnd carbon, latex and dead red blood cells and cells Fungus). Individual members of a bioaffine pair, such as biotin or ( Trept) avidin, hapten or antibody, class-specific determinants in antibody Such labels which can be indirectly indicated can also be described in detail. Indirectly A detectable label is often a label that can be detected directly or indirectly. Are measured or analyzed by their bioaffine counterparts labeled with. In this regard, when conducting the analysis, it depends on the location and method and the substance to be analyzed. There are various methodologies available. Examples of typical methods are: a. Heterogeneous and homogeneous methods. The terms heterogeneous and homogeneous are labeled Prior to measuring the reactant, the labeled reactant (R₁ ') Is the non-complex bound reactor Tanto (R₁″). b. Competitive (inhibition) and non-competitive methods. Competition methods involve the analysis of analytes and analyte analogs. Analyte attempts to bind against the lack of a reactant with both biospecific affinities Use an analyte analog that competes with. The analyte analog is the insoluble phase (solid) in the analytical medium. The analyte may be labeled or bound to phase). An example of a non-competitive method is Demonstrates biospecific affinity for epitopes at a fixed distance from each other on the precipitate A so-called sandwich in which the analyte forms a complex between two or more reactants Is the law. c. Colloidal particles coated with reactants involved in the above-described complex formation method Agglutination test including agglutination. d. Immunohistochemistry. e. Biospecific affinity (eg, DASP), ionic binding, hydrophobic interactions Conjugated or non-conjugated labeled reactor via any of covalent bonds, etc. A precipitation / insolubilization treatment using a reactant that selectively insolubilizes is there. The method described above, on a test piece, a porous matrix, in a somewhat homogeneous solution, It has been performed in test tubes, microtiter wells, on flat surfaces, and the like. Use of carbon particles as labels and immunochemical measurements with particle-labeled immunoreagents. Well-known technique for test specimens. A. Waller et al., Laboratory Animal 11 (1977) 93-97, nk, followed by the sampleEncephalitosooncuniculiContact with the antigen of origin It describes an immunochemical assay method. India Ink is stably suspended carbon Black (sol) (Hackns Chemical Dictionary, 4th Ed., Ed. Julius Grant , McGraw-Hill Book Company, page 346). B. EP 321 008 (HBT Holland Biotechnology) Monodispersed non-metallic particles (charcoal) bound to their bioaffine counterparts Elementary particles are mentioned). The patent settles Particles that can form a precipitate upon precipitation are not present in the particle preparation used. And that the particles will be present in the form of a sol. this Patent encloses primary particles of non-metallic colloid in an inert hydrophilic envelope By connecting the reactant directly to the bare particles It specifically mentions the generation of files. Patent increases particle size As the sensitivity increases, provided that the particle preparation used is monodisperse in sol form States that it is a particle. C. Amerongen et al. (J. Biotechnol. 30 (1983) 185-189 and Clin. Chim. Acta 229 (1994) 67-75) describes an immunochemical method using sol-form carbon particles as a label. Related to quantitative measurement. The sol used is produced according to EP 321,008. Ameronge Neither n nor EP 321 008 are sources of carbon particles which are said to be suitable for use. No disclosure is made regarding features or manufacture. Technique using carbon particles for test pieces To achieve quantitative analysis using computer-based image analysis. EP3 As in 21,008, the importance of particle preparations present in sol form was emphasized. Have been. D. Diverse. U.S. 4,318,707 (Syva) is a bioaffine reactant -Labeled reactants combined with sound-adsorbing particles (eg, sols) bound to This document describes a homogeneous immunochemical assay method using an immunoassay. GB2,005,01 9 describes charcoal as an antigen carrier in a heterogeneous immunochemical assay. You. E. FIG. During the priority year, the Swedish Patent Office conducts an international search. Was. This report labeled carbon particles similar to those used in our experimental part. GB2,239,314 which vaguely describes the immunoassay to be used, and EP 239,318 and WO discussing various types of particles containing charcoal therein 8911102. Purpose of the invention The object of the present invention is to classify the classes identified in the introduction using carbon particles as labeling groups. It is to improve and simplify the analysis method. FIG. This is because the detection zone (Z₁) Bound to a solid-phase bound anti-IgE antibody (R_Two), Sign Anti-IgE antibody (R₁) And solid phase-bound anti-IgG antibodies (for the If R₁Containing anti-mouse IgG) because it is a mouse monoclonal Zone (Z_Four) For measuring total IgE by sandwich test using One mode (a test piece) will be described in detail. Sample test zone (Z_Three) Under the piece And the reagent R₁Is one zone Z_ThreeMix with sample before subjecting to. Transfer Motion zone (Z_Two'And Z_Two″ And Z_Two′ ″) Is the sample test zone ( Z_Three) And detection zone (Z₁During the detection zone (Z₁) And contrast zo (Z_Four) And between the control zone and the aspirator. Left above control zone That part of the strip is further moved to the zone of movement (Z_Two'' '') . Arrows indicate the direction of flow of the piece. Consider below for different types of analytes You can replace reactants like this. Solid phase binding antibody R_TwoTo antigen / hapten The test measures antigen / hapten-specific IgE by replacing See Examples below). invention The present invention preferably provides non-colloidal dimensions of polydisperse and / or irregular shapes. The carbon particles function as labels and have a beneficial effect on the aforementioned analytical methods. Based on the discovery that it can be done. Irregular particles hit one particle compared to spherical particles Surface / volume ratio is large and therefore responds to assays using it as a label Or greater sensitivity. One embodiment of the present invention includes a class of methods identified in the introduction. these The method typically includes the following. i. For samples containing analytes, possibly pre-treated samples / analytes and carbon particles Labeled suspended bioaffine reactants (R₁) And R₁Is the analyte concentration of the sample Qualitative or quantitative measurement of the degree Under conditions that allow the formation of bioaffine complexes present in corresponding amounts Contact, after this ii. The particle-labeled reactant bound to the complex (R₁′) Or unbound Actant (R₁)) Is measured qualitatively or quantitatively, where iii. The measured amount is the presence or amount of each of the analytes in the sample. And The method of the present invention is based on the fact that the measurable amount of carbon particles is very large. Labeled bioaffine reactant (R₁Form)), but for measurement at + 4 ° C It is characterized by sedimentation in the impingement liquid for a full 7 days. The suspension Whether or not the conditions are satisfied is determined by visual judgment after the suspension is allowed to stand under the conditions described above. Can be determined. According to the results disclosed in the experimental part of this document, Sensitivity increases with the amount of particles available. It can settle Particles at an upper limit of 100%, often> 0.1%, for example> 1%, preferably Or> 50% (all percentages are w / w percent And this is the experimental part of this document. Only by the method described under "Sensitivity as a function of the amount of sedimentable particles" Measured). In preparing the particles involved, a. The carbon particles have a weighted average particle size of> 0.05 μm, preferably 0.2-5 μm, more preferably 0.2-1 μm; and b. At the upper limit of 100%> 1% (eg> 50%) particles are 0.2-5 μm, preferably More preferably, it is in the range of 0.2-1 μm. The above size was measured using a device obtained from Brookhaben Corporation, U.S.A. Measure with a Centrifuge Photosedimentometer. “Flow-Field-Flow-Fractionation” (= FFF): (Jungthun Li, etc. Particle size analysis of limmer-coated polystyrene latex, ACS Symposium Series No. 472 , Particle distribution 2, Chapter 16, pp.246-262 (1991) American Chemical Society) The corresponding preferred size when measured by a. Diameter where the highest value of the particle distribution is> 0.1 μm, preferably 0.2-5 μm , More preferably 0.2-1 μm. The diameter of the enclosure; and b. Particles> 1%, such as> 10% or> 50% at the upper limit of 100%, have> 0. 1 μm, preferably in the range of 0.2-5 μm, more preferably 0.2-1 μm. m. The appropriate particle size and percentage of sedimentable particles are determined by the test method provided. , The analyte and the affinity and specificity of the bioaffine reagent used. main A good rule is that lower analyte concentrations are> 200 n compared to higher analyte concentrations. That is, it requires a larger portion of the particles to be m. Above all, low concentration Analyte (≦ 10^-TenM) typically means that> 50% of carbon particles are 0.2-1 μm (FF F) (measured by “Disk Centrifuge Photosedimentometer”) The corresponding limit on the particle size is> 25% of particles larger than 0.2-1 μm. Particle preparation). For high concentration analytes (> 10^-TenM ), It is necessary to reduce the signal intensity and increase the amount of reagent, which The particle fraction> 0.2 μm to a level approaching the lowest percentage Reduce well (or use Disk Centrifuge Photosedimento meter) or lower the higher average (FFF) Means that. Analyte concentration> 10^-7M, these concentrations are usually determined by other means. Measured. Those skilled in the art can use the bio-specific affinity reaction by inferring in a corresponding manner. Although other considerations may be appropriate, other methods may be adapted, The problem is mainly related to lateral immunoassay chromatography. Experimental part See also Previous studies have shown that stable, covalent bonds are most likely Using commercially available carbon particle preparations in the form of primary aggregates of nodules (primary particles) Has been achieved. The size of the nodules will vary depending on the quality of the carbon, It is in the range of -250 nm, preferably 20-100 nm. Primary aggregation of each The number of primary nodules in an object also varies, and 4-2 for the most usable quality 00, preferably 6-75. "Stably bound" means that the aggregates are It does not degrade under conditions that can normally be subjected to biospecific affinity reactions. To taste. The shape of primary agglomerates can range from elongated, branched shapes to more compact structures. Can be changed with. Primary aggregates, in turn, aggregate secondary to form larger units. Can be achieved. If these secondary agglomerates are stable to collapse, If these sizes do not have a detrimental effect on the method provided, remove them. It can be used in the analysis method of the invention. Many potential carbon qualities (covalently linked primary Agglomerates consisting of nodules) are commercially available from Degussa (Germany) and other manufacturers. It is possible. Examples are furnace black, channel black, lamps Carbon black is a generic term for black and acetylene black. this The carbon content of these substances is usually 85% or more, and the carbon content just before 100% (9 9.999%) (w / w). Manufacturers include, among others, carbon black acids Carbonization from 99-100% to 85-99.9% (w / w) And lowered. The oxidatively processed form of the carbon particles involved is Cantant R₁Are particularly suitable for the process according to the invention due to the improved suspending capacity. I found that it can be used. The aforementioned carbon particles may be encapsulated in a polymer envelope (envelope), and / Or bioaffine reactants or hydrophobic interactions, ionic binding, Participate in poles, dipole coupling, etc. It may have other groups that can be used. One or more particles in one and the same polymer package Can be enclosed in a container or packaging material. Bioaffine Reactant R₁Is directly adsorbed on the exposed aggregates, Alternatively, they can be linked via inclusions according to the preceding paragraph. This latter In some cases, the possibility of covalent bonding is clear, and direct covalent bonding to bare aggregates Is also potentially possible. Bioaffine reactants are produced in suspended form Adsorbs best on elementary particles. According to a preferred embodiment, the labeled bioaffine reactant is applied to the sample. Exogenous and usually also exogenous to the individual / organism / source from which the sample is derived . Examples of sample pretreatment include a) sample dilution, b) sample concentration, c) analyte enrichment ( E.g., removal of interfering substances), d) adjustment by using pH adjustment or other means, e. ) Complex formation between the analyte and the bioaffine counterpart, f) There are external analyte modifications and the like. The points e) and f) above refer to the analyte in the i-iii stage. Refers to an analyte that is a modified version of the analyte in the original sample. The amount of analyte in the original sample and the amount of modified analyte in the pretreated sample Explicitly related to All pretreatment methods are performed as described above. Temperature, concentration, pH, order of addition of reactants and selection of reactants to be added Such analytical conditions include biospecific affinity reactions (immunochemical measurements, hybrididin Conditions similar to those previously provided for the other labels used in the measurements using You. The measuring medium is usually water, optionally mixed with a water-miscible solvent. Immunochemical For the reaction, the temperature is in the range of 0-40 ° C and the pH is in the range of 4-10. Complement For reactions involving hybridization between specific oligos / polynucleotides, The degree is preferably in the range of 0-100 ° C. Preferred modes of implementation Heterogeneous methodology The most feasible embodiment of the present invention is a heterogeneous methodology, i.e., one or both Prior to measuring the reactant, the labeled reactant R contained in the complex₁ Is the labeled reactant R not contained in the complex₁Physically separated from ″ Use the techniques that have been used. In most cases, these reactants will separate Prior to achieving selective partitioning of the complex-bound labeled reactant into the matrix. Is insoluble in the measurement medium, Using a phase (matrix) with a bioaffine reactant attached to it To separate them. The insoluble phase (matrix) used in the heterogeneous variant of the invention may be Sheet, porous continuous matrix (monolith), hydrophilic particles, preferably porous particles It can have the form of elements, membranes, diaphragms, and the like. Need to separate, measure and associate analytes as a function of labeled reactants The conditions are the same except that the labeling groups according to the invention consist of particles. Are the same as those that can be subjected to known techniques. Porous matrices-test strips and other immunochromatographic techniques The heterogeneous method according to the invention, which is currently considered to be the most feasible to implement, is based on Porous matrices in either form or monolith (self-adhesive matrix) form Use Rix. The monolith-type matrix is used as a detection zone (Z₁)including A test strip or membrane can be formed. The specimen or membrane is usually Cantant (for example, R₁), And / or to the respective detection zone of the washing solution, etc. Move from For one or more zones (eg, Z_Two'And Z_Two″) And sample test zone (Z_Three), And optionally further zones Z_Four, Z_FiveAnd so on. Moving zone Z_Two′ Is between the sample test zone and the detection zone. These zones need not necessarily be of the same material. For example, in the zone It is often practical to choose a material for the function. See below. Detection zone Z₁Is a function of the analyte content of the sample, which binds stably to the matrix A certain amount of labeled reactant R₁Bioaffine that can capture Reactant (R_Two). Detection zone if analyte is present in sample Turns black. The blackening of the detection zone can be achieved in several ways, preferably visually, But perhaps even more preferably and more reliably, Amerongen et al. Biotechnol. 30 (1983), pp. 185-189, and Clin. Chim. Acta 229 (1994), pp. 6 7-75) via computer-based photographic or image analysis media. Can be shown both qualitatively to In the simplest case, a. Reactant R stably coupled_TwoAnd labeling reactor R₁Are both directed to the analyte (sandwich test); or b. Bioaffine reactant R stably fixed in detection zone_TwoIs the analyte And reactant R₁(R₁Corresponds to an epitope present in both Directed (competition test). R_TwoIs stably fixed in the detection zone._TwoThe various measurements that pass It is not eluted by the buffer solution. Reactant R_TwoIs the traditional one It is immobilized by a method, ie a bond via covalent or adsorption (usually hydrophobic). Books using a porous matrix in the form of a packed particle bed or in the form of a monolith The simplest heterogeneous variant of the invention has only one detection zone Z₁And this The zone also functions as a sample test zone. Reagents (eg, R₁) And wash The solution is applied directly to the detection zone, where it leaves the matrix immediately after passing through this zone. You. In a simple further development, the detection zones are respectively assigned to the detection zone and to the detection zone. One or two travel zones (Z_Two'And Z_Two″) Touch. Z_Two"" Is preferably highly absorbent to facilitate liquid transfer. zone Z_Two′, The sample test zone Z_ThreeLine up there. Reactant R₁Can contact the detection zone in a number of different ways . Both detection zones (Z₁) So that it can be moved to reactant R₁And analysis It is usually preferred to contact (incubate) with the object. One barrier Prior to its test into the sample test zone, the sample and reactant R₁And Reincubation / mixing. R₁Is the detection zone Z with the analyte₁Moved to Reactant R to move₁To the movement zone Z_Two', Or sample test zone Z_Three Can also be distributed in advance. Possible options include Reactant R₁The inspection Out Zone Z₁Or, in a zone that is physically far from the zones mentioned so far Detection zone Z after pre-dispensing or after binding the analyte thereto₁Directly to For example. In certain variants of the invention, biospecifics stably bound to the detection zone Reactant R_TwoCannot bind directly to the analyte. For example, sample or Is the detection zone Z₁Or travel zone Z_Two'With the analyte and R_TwoCreate a connection between May be pre-incubated with a bifunctional affinity reagent No. If the matrix is first dried to a considerable extent, the sample will From the probe to the detection zone by capillary force. Alternatively, the suction body Moving zone Z_Two′ (Movement from the detection zone). Also, Motion can also be achieved by an electric field. Sample test zone is higher than detection zone When located at a high level, movement is particularly significant in the case of a porous matrix in the form of a membrane. This can be achieved by hydrostatic pressure. After providing different reagents, washing of the detection zone is often performed downstream of the detection zone. Requires excessive liquid absorption capacity at the location. This is the movement zone Z_Two″ Volume Or by adding a superabsorbent matrix to the liquid stream in contact therewith. This can be achieved by placing them. Sample test zone Z_ThreeOften have good water retention properties and Moving zone Z during processing_TwoPorous matrix capable of releasing water well Have the form of The matrix is sufficiently hydrophilic to allow the transfer of liquid There may be. The matrix allows the carbon particles to move from the sample test zone to the detection zone. It has a porosity that allows it to move. According to the guidelines, the pore size should be Larger than the diameter of elementary particles I can say. The pore size is preferred to obtain the acceptable function of the hydrophilic matrix. Or in the range of 0.4-100 μm. On the priority date of this application, the transfer zone porous nylon matrix and porosity The nitrocellulose matrix has been successfully tested. Nylon, nitrocell Loin and cellulose (paper) were used for the detection zone. Sharedly fixed Reactant R_TwoNylon and cellulose are used for Reactant R_TwoNitrocellulose was used. Used for sample test zone The material may be a cellulose filter and / or glass fiber filter for liquid storage. The materials used for the transfer zone, optionally in combination with filters, were the same. The particle size, porosity and hydrophobicity can be mutually exclusive by simple experiments in an easy way Can be optimized for See experimental part. The most geometrically preferred embodiment for a porous matrix is the sample test zone. The transfer zone and the detection zone in order to allow for liquid movement between them This is a test piece placed on the side. Excess labeled Reactant R₁Is the detection zone Z₁ Travel zone Z from_TwoIn the mode of moving to ", R₁Is forced to pass Control zone (Z_FourIs advantageously located downstream of the detection zone. Control zone , R₁When containing a bioaffine reactant that binds to In response to the negative sample (and also to the positive sample), it turns black, Provide control of Noh. The matrix is black carbon particles and other that provide good contrast It is preferably white, even if a subtle shade of light color is acceptable. For a more detailed explanation of the construction of the specimen and the selection of the materials involved, WO 8808534 (Unilever), U.S. Pat. 5,120,643 (Abbott Labs), U.S. 4,954,452 (A bbott Labs), Amerongen et al. (J. Biotechnol. 30 (1983), pp. 185-189, Clin. C. him. Acta 229 (1994), pp. 67-75), and the use of labeling groups in the form of colloidal particles See also others that also deal with. Particularly preferred heterogeneous techniques According to the heterogeneous sandwich technique, R₁And R_TwoHas at least two episodes Physically distanced epithelium on analytes that are antigens or haptens with tope It may be an antibody directed against the tope. This technique is mainly used for protein like Organic molecules of high molecular weight organisms, for example Igs of certain classes (IgA, IgD, I gE, IgG and IgM). Another sandwich variant In the₁And R_TwoOne is antigen / hapten and the other is class Antibodies directed against specific determinants (IgA, IgD, IgE, IgG and IgM). This latter variant is a class of antigen-specific antibodies (Deposit) is measured. R₁Is an anti-IgE antibody and R_TwoIf is an antigen, PAST -Type RAST- test (allergy test; PAST = Particle Allergy Sorbent T est) is obtained. Sandwich techniques offer a very high degree of sensitivity and therefore Particularly suitable for low concentration analytes. In the most preferred competitive technique, R₁Is an analyte analog and R_TwoIs the analyte And antibodies directed against both the analyte analog. This technique is primarily Measures high molecular weight proteins, such as IgE, directed at low molecular weight bioorganic molecules Can be used for The method of the present invention is mainly used for the diagnosis of all IgE and allergens for the purpose of allergy diagnosis. Serum / plasma levels of immunoglobulin-specific IgE as well as related to other Ig classes Developed for the corresponding way It has been. At the priority date of this application, the range of IgE concentrations for this type of usage is , Each 10^-Ten-10^-7M whole IgE / l serum and 10^-12-10^-9M-are Rugen-specific IgE / l serum (ie total IgE and allergen-specific IgE) Both are low concentration analytes). Antibodies as used herein include intact antibodies and antigen binding Antibody fragments. As used herein, the term antigen itself, hapten and hapten And antigen fragments exhibiting antibody binding activity. Other aspects of the invention Another embodiment of the present invention relates to an Ig-containing IgE-binding epitope labeled with a particle. E, an immunoreagent selected from the group consisting of anti-IgE antibodies and allergens. This aspect is characterized in that the particles are carbon particles. In a preferred embodiment , Particles are defined in the same way as used in the method of the invention. Field of application of the invention The present invention provides that the aforementioned particle ranges can be provided directly and in many cases are necessary. It can be used for important clinical diagnosis (including the treatment monitoring process). A typical sample is : Cerebrospinal fluid (CSF), saliva Fluids, tears, urine, blood (plasma and serum) and the like. Special-purpose diagnostic areas are for tracking (monitoring) treatment and for species such as asthma. Various inflammatory symptoms, and allergy-related symptoms, and persistent alcohol overuse A measurement that measures an analyte to make a diagnosis. Examples of suitable analytes include different Classes of antigen / allergen specific antibodies (especially IgA, IgD, IgE, Ig G and IgM), all levels of the respective Ig class, eosinophilic cationic proteins (ECP), acidophilic protein X (EPX), myeloperoxidase (MPO), Human neutrophil lipocalin (HNL), lysozyme, tryptase, interleukin (IL-5, IL-6, IL-8), hyaluronic acid (HA), osteocal There are Shin etc. Carbohydrate-deficient transferrins for alcohol overconsumption (CDT; especially asialotransferrin and disialotransferrin) Is an important analyte. This means, of course, that the method of the present invention can It means that it cannot be used for diagnosis of other diseases such as monotic diseases Not something. In addition, the present invention relates to quality control and linkage in the production of a substance having biospecific affinity. It can also be served. In this latter context Concentration is often quite high and completely different for sensitivity and specificity. Requirements are raised. The requirements raised for carbon particles are Performance is correspondingly low, which often means that it is sufficient. This is especially true for IgE, Anti-IgE antibodies, allergens and allergens that bind antibodies (especially IgE) Epitopes (= haptens from allergens) and other aforementioned analytes and their Subject to antibodies directed against them. The present invention also provides for environmental analysis, such as measuring the presence of allergens in the atmosphere. It can also be served. Allergens are usually derived from pollen, mites, cats, etc. Often have a protein structure. The present invention relates primarily to a wholly or partially^-TenRange, ie, 1-10x10 belonging to low concentration^-TenLow concentration means analyte within which concentration is measured Developed for measuring analytes. This range indicates that it is in its natural environment (C SF, plasma, serum, whole blood, urine, tears, saliva, etc.) Point. The present invention will be described in more detail by way of a number of examples. It is not limited to them. The present invention provides the following In the claims. Experimental part Preparation of labeled reagent Carbon suspension (mother liquor): Approximately 500 mg of carbon particles were dissolved in 5 mM boric acid buffer at pH 8.5. The suspension was suspended in 50 ml of the buffer and sonicated for 30 minutes. For protein adsorption on carbon particles Prior to this, the suspension was diluted to 1 mg / ml and sonicated for a further 3 minutes. Charcoal used Raw quality is evident from the description of each test below. Labeling of anti-IgE antibodies with carbon particles (aggregates): Microgram number of mother liquor (X μg carbon; see respective application) and 50 μg Anti-IgE antibody (5 mM in borate buffer, pH 8.5) was added to 5 mM borate buffer. Diluted to a final volume of 1 ml at pH 8.5. After leaving this solution at room temperature for 3 hours, Add 10 mg of bovine serum albumin (BSA) per milliliter and mix. The material was incubated for a further 30 minutes. The mixture is then mixed with 1% BSA and 0% . 05% NaN_ThreeThree times with 0.1 M borate buffer pH 8.5 containing Washing was performed while centrifuging at 16,000 × g. After the last wash, precipitate With borate buffer (0.1 M, pH 8.5, 1% BSA, 0.05% NaN_Three) To give a carbon content of 500 μg / ml Diluted. The amount used should be such that the anti-IgE antibody concentration is 25-50 μg / ml in the final solution. Adapted. Centrifugation times were varied with different types of carbon. Labeling of casein with carbon particles (aggregates): 250 μg of carbon (sp100 , Degussa) and a mother liquor containing 100 μg of casein, in 5 mM borate buffer. The solution was diluted to a final volume of 1 ml with pH 8.5. Labeling of antibody-IgE antibody It is similar in point. Preparation of test specimen Test piece 1: Nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Germany, 8 μm) And placed on a hard, pre-rubbed polyester sheet. Then, an anti-IgE antibody The solution is sprayed onto the sheet in a line parallel to one side of the sheet (detection zone) and The Fc mouse IgE antibody solution is drawn at a sufficient distance from the first line and parallel to it ( (Control zone). The membrane was dried and then 0.8 cm × 4 Cut into pieces of cm size (the antibody line is in equilibrium with the short end of the piece). filter paper( Whatman cellulose 17CHr, UK, size 0.8cm x 0.8cm (sample test zone) detected Placed on the short end of the strip (bottom of strip) on the same side as the zone. Suction filter (Whatman Slurry 17CHr, 2cm x 2cm) at the other end of the piece (top of piece) Was. The control zone was omitted for certain tests. Accurate measurements may vary slightly It has become. Test piece 2: Cellulose covalently bound to mite allergen (CNBr coupling) The detection zone consists of a piece of paper (3 mm wide) and a tick disk (dl allele) Gendisk) and Kabi Pharmacia Diagnostics AB, Sweden) Specimen 2 was similar to Specimen 1 except that it was stripped. Nitrocellulo The membrane is cut off at the location of the detection zone and the opposite ends overlap (the The upper part of the lower part (the part facing the flow direction) and the upper part of the mite piece below) However, the mite pieces were similarly glued to the test pieces. Test piece 3: Nylon film. An anti-IgE antibody, birch allergen or casein, Covalently bound to the detection zone. Standard Protocol for Lateral Immunoassay Talmatography Total IgE: 3 parts standard solution / sample (6% BSA, 50 mM phosphoric acid Buffer pH 7.5, 0.05% NaN_ThreeIgE) and anti-IgE with different contents One part of the carbon (X = 390 μg carbon, sp100 (Degu ssa)) 30-80 μl of the mixture with the suspension (about 0.1 μg carbon / μl) The sample was supplied to the sample test zone on No. 1 and started to move to the detection zone. Buffer solution (0.1 M borate buffer pH 8.95, 0.05NaN_ThreeGala moistened with 1% BSA) The fiber filter was then placed in the sample test zone. Sample containing IgE A dark band could be detected in the detection zone within 10 minutes. The signal is , Could be easily distinguished from the results obtained with samples without IgE . A video camera (Kappa) mounted on a zoom microscope (Askania MZM-1) , CF 8/1) and calculated with an image analysis program. Tick-specific IgE: positive human serum containing 125 kU / L of tick-specific IgE Or 38 μl of blank sample (normal human serum <0.35 kU IgE / L) Was added to 12 μl of suspended carbon particles (2. 3μg carbon) (X = 250μg carbon, Pr 150T (Degussa)) Sample 2 was directly applied to the sample test zone. Then 40 μl of 0.1 M borate buffer (1% BSA, 0.05% NaN_ThreeContaining, pH 8.5) to start the washing by providing Further washing was performed with 20 μl of the solution. Positive samples had a distinct blackening of the detection zone . No blackening was obtained with the blank sample. Casein-specific IgE: 45 μl of positive human serum (RAST positive for casein) G) was determined to be 20 kU / L casein-specific Ig per liter in normal human serum. E and then or 45 μl of blank sample (human serum <0.35 kU IgE / L) and 7.5 μl of a suspension of carbon particles to which casein has been adsorbed as described above. (5 μg carbon), and then directly supplied to the sample test zone of the test piece 1. After adsorption of the sample to the zone, washing was started in the same way as for all IgE. Positive samples , Obvious blackening of the detection zone. For blank samples, the blackening It was not observed well. Sensitivity as a function of the amount of sedimentable particles (aggregates) Aggregate-labeled anti-IgE antibody: labeled by Chloramine T-method¹² ^Five The test was carried out with an anti-IgE antibody. Marked The antibody is then adsorbed on carbon particles (sp100 (Degussa, Germany) by the method described above. I let it. The mother liquor was stored in a refrigerator at + 4 ° C, and after 2 days, all particles had settled. And found. The suspension containing the adsorbed antibodies is centrifuged at different G numbers Different size fractions (in the form of pellets and supernatant) were obtained. Percentage of sedimentable particles in each fraction: Each pellet was resuspended and sedimented at room temperature for a total of 11 days. The supernatant was settled under the same conditions. Measure the radioactivity of the precipitate and A measure of the fraction / percentage of sedimentable particles in a minute. The results are shown in the table below. It is shown in FIG. Ability to migrate in membrane (pore size 8 μm): resuspended sediment, supernatant Alternatively, place the suspension, which has not been centrifuged, in the sample test zone of test piece 1 and place it in the detection zone. Moved to Because some carbon particles stayed in the sample test zone, Some blackening remained in this zone. Of radioactivity remaining in the sample test zone Degree was a measure of particles that could not move. Table 1 shows the results. Signal intensity as a function of carbon aggregate size: Standard protocol for measurement chromatography by. The sample used was an IgE-standard (0.5-50 kU IgE / L, 6% B SA, 50 mM phosphate buffer, pH 7.5, 0.05% NaN_Three)Met. That When testing Rugen-specific IgE, the lower measurement range is the most needed range Therefore, the signal intensity was compared at 0.5 kU IgE / L. Signal strength Converted to paired measurements (signal intensity: average signal). Divide the fractions into three groups : Supernatant (number 3), suspension without centrifugation (number 2) and pellet, sediment (Equation 3). Table 1 shows the results. In summary, we found the following: 1. The fraction (pellet) with the smallest particle size (supernatant) is low IgE water A quasi-weak signal resulted. 2. Measurement buffer (0.1 M borate buffer, 1% B SA, 0.05% NaN_Three, PH 8.5) when sedimented (> 95). %) Non-centrifuged suspensions are enhanced for particles that have a lower tendency to settle. The test results were better than the fractions obtained. 3. Due to the fact that most of the increase in sediment remains in the sample test zone, Fractions containing large particles (pellets, sediments) should be centrifuged with the same carbon species. As sensitive as no suspension. Signal intensity dependence on different carbon qualities About 20 different types of carbon black (Degussa), especially channel black And furnace black as well as certain special black types IgG (measurement chromatography)¹²⁵I-anti-IgE antibody) We investigated these features. A suspension from some of the carbon blacks used Proved impossible to make. Still ideal from certain types of carbon Although a poor suspension was formed, the problem was often that carbon was mixed with the antibody. The problem was solved by applying ultrasonic waves. A method for total IgE according to Used as a standard protocol for lateral immunoassay chromatography. Trial used The charge was an IgE standard containing 0.5-125 kU IgE / L. Only a small percentage produced a strong signal in the lower scale range, , All the tested carbon species have a positive signal in the region of 5 kU IgE / L or more. occured. The degree of blackening was associated with IgE levels for all carbon species. The control zone is All the carbon species investigated turned black. When testing for allergen-specific IgE, the lower part of the IgE range is most targeted Therefore, the signal intensity is compared at 0.5-1 kU / L for a plurality of carbon species. did. The measured values were converted to relative values (signal intensity: average signal). In measurement Carbon species into three groups of 6-7 carbon species per group, depending on the function of low IgE values divided. Carbon that adsorbs anti-IgE antibody and precipitates from suspension (1 month at + 4 ° C) Particle tendency was a measure of aggregate size. All carbon particles settle and complete settling Suspensions providing deposits are given a value of 4+, while suspensions without sediment are given a 0+ value. Gave. The results are shown in Table II below. In summary, we found the following: 1. All carbon species are anti-IgE antibodies (¹²⁵I-anti-IgE antibody) . 2. In lateral immunoassay chromatography, carbon species are distinctly different Performance was indicated, with a higher sedimentation tendency leading to increased test sensitivity. Comparative test with sp100 and sp4 (Degussa) The test protocol was the same as that used for all IgE. Two different charcoal Two analytical series with the same amount of carbon of the base species (sp4 and sp100 respectively) Was done. The IgE content of the samples was 1, 5, 20, and 100 kU / L . The standard curve for each carbon species shows that sp100 is better than sp4 at low IgE concentrations. Higher signal, but on a molar basis, sp4 carries more reagent, Higher concentrations gave higher signals. Perform comparable comparisons for different membranes Also stronger A tendency for larger particles / aggregates where a signal occurs was observed. sp100 is: Signa 2.6 fold higher than the signal generated with sp4 at 0.5 kU / L IgE Le. Signa 2.4 fold higher than the signal generated with sp4 at 1.0 kU / L IgE Le. Signa 1.7 fold higher than the signal generated at sp4 at 5.0 kU / L IgE Le. Signal 1.3 fold higher than signal generated with sp4 at 20 kU / L IgE Occurred. Measurement of size of carbon particles (primary aggregates) The size of the diameter of the aggregates of sp100 and sp4 (Degussa) is determined by: did: 1.(Flow-Field-Flow-Fractionation) (= FFF)： (Jengthun Li, etc. Particle size analysis of polymer-coated polystyrene latex, ACS Symposium Series No. Four 72, particle distribution 2, Chapter 16, pp. 247-262 (1991) American Chemical Societ y). The diameter of carbon sp100 and sp4 (Degussa) was measured. Particle distribution The peak value is a diameter of 280 nm at sp100 and at sp4 140 nm diameter. The results are shown in Table III below: (Disk Centrifuge Photosedimentometer (= DCP): Brookhaven Corp., U.S.A. The measurement process was performed using the apparatus. The results are shown in Table IV below: The weighted average value is 200 nm for sp100 and 85 nm for sp4. The carbon particle size is indirectly determined from its settling capacity and by FFF and DCP. It was measured directly. FFF and DCP focus on different aspects of particle geometry. This is an analysis method that can be used. The results obtained (Tables III and IV) show that the particles are complex The differences resulting from the irregular and non-spherical geometric shapes are illustrated. Experimental results obtained during the priority year Improve the performance of the test strip mode of the present invention during priority years I've been. Our recent findings at least relate to sandwich heterogeneity techniques. Therefore, it is preferable to use the antibody in the form of a fragment lacking the Fc portion as an immunoreagent. I support you. This means that at least the labeled reactant R₁Applies to As for the order of addition, the continuous mode, ie, analyte / sample and labeled reactor Tanto R₁But in this order, the movement zones (Z_Two′) Move through at least part of Is preferable. Preferably, this is done separately in pieces, for example , Added to the test zone at different times (Example 1, R₁Before the sample) or More preferably, the different positions of the movement zone between the test zone and the detection zone (see below) Example 2, after the sample was added to the test zone, R was added to the beginning of the moving zone Z2 '._Two ) Means to add. 1. All IgE, continuous mode IgE in 30 μl buffer (6% BSA, 50 mM phosphate buffer pH 7.5) , 0.05% NaN_ThreeDifferent IgE concentrations in the sample) One end of a tel-supported nitrocellulose membrane (8 μm, Whatham, UK) ). The membrane should be tested to prevent the applied liquid from spreading on the membrane surface. A thin piece of polyester glued about 7mm downstream from the I had. Anti-IgE (Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden) was injected 2c from the test end. It was previously adsorbed on a thin line (1 × 5 mm) (detection zone). Suction cellulo Sorbose pad (5 x 15mm Whatham cellulose 17Chr) with nitrocellulose membrane Above and downstream of the adsorbed anti-IgE. Once the sample has been transferred to the membrane, 30 μl of wash buffer (1% BSA, 0.05% % Bovine gamma globulin, 0.1 M borate buffer pH 8.5, 0.9% NaCl , 10% sucrose, 0.05% NaN_Three) Was provided to the test zone. After this washing step , 30 μl of carbon labeled anti-IgE fab′2 (6 μg in wash buffer) From Sp100 + 0.6 μg of anti-IgE fab′2, Anti-IgE fab'2) was placed in the test zone. After adsorption of this suspension Cellulose containing 0.1 ml of wash buffer (see above) in the liquid test zone A final cleaning step was performed by providing a spud. 10 minutes after sample test, liquid Black bands gradually appeared on the reaction zone 2 cm downstream from the body test zone. The intensity of the band was related to the amount of IgE in the sample provided. Strength, zoom microscope Mounted on Measured with a CCD camera and calculated with a computer imaging program. 2. Allergen (casein) -specific IgE in human plasma, continuous mode 30 μl patient sample (diluted in negative plasma, see table below) With a polyethylene-supported nitrocellulose membrane of dimensions 5 × 30 mm (8 μm, Whatham , UK) at one end (liquid test zone). Place on nitrocellulose membrane The test was performed through a filtration membrane (Cytosep 1661, Gelman, USA). The membrane is About 7 mm each from the test zone and about Two thin pieces of adhesive polyester bonded to a nitrocellulose membrane 13 mm downstream I had. Casein was previously thinned by 2 cm from the test end (1 x 5 mm, detection zone). Was adsorbed. Suction cellulose pad (5 x 15mm Whatham cellulose 17 Chr) was placed on the nitrocellulose membrane downstream of the adsorbed casein. Once the sample has been transferred to the membrane, 30 μl of wash buffer (1% BSA, 0.05% % Bovine gamma globulin, 0.1 M phosphate buffer pH 7.5, 0.9% NaCl, 10% sucrose, 0.05% NaN_Three) Was provided to the test zone. After this washing step, 3 0 μl of carbon labeled anti-IgE fab′2 (6 μg of Sp in wash buffer) Labeling from 100 + 0.6 μg anti-IgE fab'2 as in the previous example. Was placed in the zone between the polyester pieces, and immediately thereafter, 30 μl was added to the test zone. Wash buffer did. 15 minutes after the sample test, the detection zone located 2 cm downstream from the liquid test zone A black band gradually appeared on the screen. The intensity of the band Related to the amount of specific IgE. CCD camera mounted on a zoom microscope with intensity And calculated with a computer imaging program. The results shown in Tables V and VI are at least 10^-12Low concentration to measure It shows that it can be done. The order of addition was determined by carbon-labeled anti-IgE fab'2 (R₁) Before addition The precipitate was a carbon-labeled anti-IgE fab'2 (R₁Pass the test part for Guaranteed that you were. This This was further achieved by using a carbon-labeled anti-IgE fab'2 (R₁) Moves to test zone Was prevented from doing so.

Claims

[Claims] 1. Between the analyte, its bioaffine counterpart, and a suspended bioaffine reactant (R ₁ ) labeled with carbon particles and incorporated into the complex in an amount related to the amount of the analyte in the sample. An assay in which the presence of an analyte in a sample is determined by forming a complex, wherein a measurable percentage of particles can settle out of suspension. 2. The method according to claim 1, wherein the particles have a stable primary particle aggregate morphology. 3. 3. The method according to claim 1, wherein each agglomerate comprises 4-200 primary particles. 4. Method according to any of claims 2-3, characterized in that the primary particles have a size in the range 5-250 nm, preferably in the range 20-100 nm. 5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the carbon particles are carbon black. 6. 6. The method according to claim 1, wherein the carbon particles are selected from the group consisting of furnace black, channel black, lamp black and acetylene black. 7. Carbon particles prior to bonding to R _1, characterized by treating the carbon particles oxidatively A method according to any one of claims 1-6. 8. Method according to any of the preceding claims, characterized in that the carbon content of the particles is between 85 and 99.99% (w / w). 9. 1) subject the analyte to the sample test zone (Z ₃ ) and transfer the analyte to the detection zone (Z ₁ ) containing the stably immobilized bioaffine reactant R ₂ capable of binding the analyte is allowed; specific presence and subsequent 2) analyte bound at the detection zone, the zone comprising the step of determining the reactant R ₁ forms of blackened sample test zone (Z _3), the detection zone (Z ₁₎ and, located therebetween, characterized by the use of a porous matrix comprising a transfer zone for moving the analyte and the liquid in the detection zone _{_{(Z 1) (Z 2 '}} ), according to claim 1-8 The method according to claim 1. 10. Before moving to the detection zone, the labeled reactant R ₁ and analyte, characterized by incubating each other, The method of claim 9. 11. 11. The method according to claim 8, wherein R ₁ is an antibody against the analyte, R ₂ is an antigen or vice versa, and the analyte is an antigen-specific antibody. Or the method of claim 1. 12. R ₁ is an anti--IgA, anti -IgD, anti -IgE, anti -IgG and anti - characterized in that it is a class-specific antibody selected from the group consisting of IgM antibodies, in particular anti -IgE antibody according to claim 11 The method described in. 13. That R ₁ and R ₂ are antibodies to physically spaced epitopes on the analyte; the analyte is a multi-epitope antigen; preferably, R ₁ and R ₂ are anti-antigens 10. The method according to any one of claims 8-9, wherein the method is an IgE antibody and the analyte is IgE. 14． 13. The method according to any one of claims 8 to 12, characterized in that the porous matrix has the form of a coupon which is continuous and the zones are arranged laterally. 15. An immunoreagent selected from the group of allergens labeled with particles and containing an IgE, anti-IgE antibody, or an IgE-reactive epitope thereof, wherein the particles are carbon particles. 16. Method according to the preceding claim, characterized in that the particles are defined in the same way as defined in claims 1-7.