JPH1128091A - 新規なタンパク質ｏｐｆう１６及びその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【解決手段】骨髄細胞からヒドロキシアパタイト分解能
を持つ細胞への分化誘導活性を有するＯＰＦう１６及び
該ＯＰＦう１６の類似タンパク質、これらのタンパク質
のペプチド断片、抗体、これらのタンパク質を有効成分
とする医薬、これらのタンパク質をコードする遺伝子、
該遺伝子の発現ベクター、該発現ベクターを導入した形
質転換体、該形質転換体を用いる組換えタンパク質の生
産方法、前記遺伝子の導入及び欠損に係るトランスジェ
ニック動物、あるいは骨髄細胞からヒドロキシアパタイ
ト分解能を持つ細胞への分化誘導活性に対する阻害剤の
スクリーニングにおける、前記タンパク質の用途。 【効果】新規なタンパク質ＯＰＦう１６は、骨髄細胞か
らヒドロキシアパタイト分解能を持つ細胞への分化誘導
活性を有することから、該機能を発揮することにより治
療される幅広い疾患への応用が可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なタンパク質
ＯＰＦう１６及びその遺伝子に関する。さらに詳しく
は、骨髄細胞からヒドロキシアパタイト分解能を持つ細
胞への分化誘導活性を有するＯＰＦう１６及び該ＯＰＦ
う１６の類似タンパク質、またはこれらのタンパク質の
ペプチド断片、抗体、これらのタンパク質を有効成分と
する医薬、あるいはこれらのタンパク質をコードする遺
伝子、該遺伝子の発現ベクター、該発現ベクターを導入
した形質転換体、該形質転換体を用いる組換えタンパク
質の生産方法、前記遺伝子の導入及び欠損に係るトラン
スジェニック動物、さらには骨髄細胞からヒドロキシア
パタイト分解能を持つ細胞への分化誘導活性に対する阻
害剤のスクリーニングにおける、前記タンパク質の用途
に関する。

【０００２】

【従来の技術】血中カルシウムの代謝調節は生命維持の
骨幹を成す非常に重要なものであり、その濃度は極めて
厳密に一定の値が保たれている。何らかの原因により血
中カルシウム濃度が上昇すると、高血圧症、動脈硬化
症、糖尿病、心筋梗塞、高カルシウム血症等の種々の疾
患が引き起こされる。逆に、血中カルシウム濃度が低下
すると、低カルシウム血症等の疾患が引き起こされる。
また、大量出血や放射線被爆などによる血中カルシウム
の大量減少が原因となり、死に到る場合もある。このよ
うな、生体において極めて重要な血中カルシウムの濃度
調節を行っている細胞としては、現在、破骨細胞が知ら
れている。破骨細胞は、骨（骨基質）を溶解して血中に
カルシウムを放出することにより、血中カルシウム濃度
を直接調節していると考えられている。しかし、破骨細
胞は哺乳類では生体内でわずか 5万個程度しかなく、一
方、カルシウムを蓄えた石灰化硬組織に埋め込まれた骨
細胞は、１mm³ の骨中にさえ約 2万 5千個もあることか
ら、血中カルシウムの濃度調節を行うには破骨細胞のみ
では少なすぎると考えられている（久米川ら, Molecula
r Medicine，30, p1254 (1993)および小沢ら, 日本臨床
vol.52, No.9, p2246 (1994）) 。

【０００３】また、大理石骨病のモデル動物であるop/o
pマウスには破骨細胞が存在していないため、破骨細胞
本来の作用である骨のリモデリングが殆ど起こらない。
しかし破骨細胞が存在していないにもかかわらず、血中
のカルシウム濃度は正常に保たれている（Molecular Me
dicine Vol.30,No.10,p1240 (1993)) 。このことは、破
骨細胞による血中カルシウム濃度の調節はあくまでも補
助的なものであり、破骨細胞以外に血中カルシウム濃度
の調節を中心的に行っている、何か別の細胞が存在して
いることを示唆している。該細胞は未だ同定されていな
いが、該細胞を増殖させる因子、あるいは該細胞への分
化を誘導する因子が発見されれば、因子そのもの或いは
その阻害剤が、上述の如き血中カルシウム濃度の異常に
起因する種々の疾患に対し、治療薬となることが考えら
れる。このような観点から該因子の同定が望まれている
が、未だクローニングされたという報告はない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、骨髄細胞からヒドロキシアパタイト分解能
を持つ細胞への分化誘導活性を有する新規なタンパク質
ＯＰＦう１６及びその遺伝子を提供することにある。さ
らに詳しくは、骨髄細胞からヒドロキシアパタイト分解
能を持つ細胞への分化誘導活性を有するＯＰＦう１６及
び該ＯＰＦう１６の類似タンパク質、またはこれらのタ
ンパク質のペプチド断片、抗体、これらのタンパク質を
有効成分とする医薬、あるいはこれらのタンパク質をコ
ードする遺伝子、該遺伝子の発現ベクター、該発現ベク
ターを導入した形質転換体、該形質転換体を用いる組換
えタンパク質の生産方法、前記遺伝子の導入及び欠損に
係るトランスジェニック動物、さらには骨髄細胞からヒ
ドロキシアパタイト分解能を持つ細胞への分化誘導活性
に対する阻害剤のスクリーニングにおける、前記タンパ
ク質の用途を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは従来より、
骨転移細胞であるＢＷ５１４７細胞から発現クローニグ
法により破骨細胞分化促進因子を探索していた。すなわ
ち、ＢＷ５１４７細胞から単離したｍＲＮＡをアフリカ
ツメガエル卵母細胞に注入して翻訳させ、得られた翻訳
産物（タンパク質）をマウス骨髄細胞に作用させ、骨髄
細胞から破骨細胞が分化誘導されるか否かを指標に、該
因子の探索を行っていた。具体的には、（１）ＴＲＡＰ
染色性、（２）象牙の分解活性、（３）骨中のカルシウ
ムの結晶であるヒドロキシアパタイトに対する分解活性
の、破骨細胞の公知の３つの特性を有する細胞を「破骨
細胞」と認定し、骨髄細胞から該破骨細胞へと分化誘導
する作用を持つ因子を、「破骨細胞分化促進因子」と認
定することとした。

【０００６】我々は、この発現クローニングを進める途
中において、上記破骨細胞分化促進因子とは異なる性質
を有する新規なタンパク性因子を発見した。すなわち該
因子により分化誘導された細胞は、上記（１）〜（３）
のうち（３）のヒドロキシアパタイト分解活性は有する
が（１）、（２）の活性は有さないというものである。
このように（３）の活性のみを有するということから、
該因子は、破骨細胞分化促進因子とは異なる別の因子で
あり、しかも（３）の活性−すなわち骨中のカルシウム
の結晶であるヒドロキシアパタイトを分解する細胞（よ
り詳しくは、ヒドロキシアパタイトを分解してカルシウ
ムを放出する細胞）へと骨髄細胞を分化誘導する活性を
有することから、未だ同定されていない血中カルシウム
濃度の調節細胞への分化誘導因子（以下、単に血中カル
シウム濃度の調節因子と略すこともある）であることが
考えられる。我々は、この新規なタンパク性因子をＯＰ
Ｆう１６と命名し、さらに研究を重ねて本発明を完成す
るに至った。

【０００７】即ち本発明の要旨は、（１） 以下の
（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタン
パク質 （ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列のうち１若し
くは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された
アミノ酸配列からなり、かつ骨髄細胞からヒドロキシア
パタイト分解能を持つ細胞への分化誘導活性を有するタ
ンパク質 （２） 配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮ
Ａ、又はそのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつ骨髄細胞からヒドロキシアパタイト
分解能を持つ細胞への分化誘導活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡ、（３） 前記（１）又は（２）記
載のＤＮＡがコードするタンパク質、（４） 配列番
号：２に記載のアミノ酸配列からなる、前記（３）記載
のタンパク質、（５） 前記（１）又は（２）記載のＤ
ＮＡを含有する発現ベクター、（６） 前記（５）記載
の発現ベクターによって形質転換された形質転換体、
（７） 前記（６）記載の形質転換体を、前記（５）記
載の発現ベクターの発現可能な条件下で培養することを
特徴とする、組換えタンパク質の生産方法、（８） 前
記（３）又は（４）記載のタンパク質を有効成分として
含有する医薬、（９） 前記（３）又は（４）記載のタ
ンパク質の、少なくとも６アミノ酸以上の部分よりなる
ペプチド断片、（１０） 前記（３）又は（４）記載の
タンパク質、あるいは前記（９）記載のペプチド断片
の、いずれかに対する抗体、（１１） 前記（３）又は
（４）記載のタンパク質を用いることを特徴とする、骨
髄細胞からヒドロキシアパタイト分解能を持つ細胞への
分化誘導活性に対する阻害剤のスクリーニング方法、
（１２） 前記（１１）記載のスクリーニング方法によ
り得られる、骨髄細胞からヒドロキシアパタイト分解能
を持つ細胞への分化誘導活性に対する阻害剤、（１３）
前記（９）記載のペプチド断片又は前記（１０）記載
の抗体からなる、前記（１２）記載の阻害剤、並びに
（１４） 前記（１）又は（２）記載のＤＮＡを人為的
に染色体中に導入するか、あるいはいずれかを染色体中
から欠損させたトランスジェニック動物、に関する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明においてＤＮＡとは、ＯＰ
Ｆう１６のＤＮＡ、あるいは該ＯＰＦう１６ＤＮＡに類
似のＤＮＡであって骨髄細胞からヒドロキシアパタイト
分解能を持つ細胞への分化誘導活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡであれば特に限定されないが、例え
ば、配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、又
は配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク
質をコードするＤＮＡが挙げられる。さらに、配列番
号：２に記載のアミノ酸配列のうち１若しくは複数のア
ミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列
からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは配列
番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、骨髄細
胞からヒドロキシアパタイト分解能を持つ細胞への分化
誘導活性を有するタンパク質をコードする限り、本発明
のＤＮＡに含まれる。以下、これらのＤＮＡにつき順次
説明する。

【０００９】１）ＯＰＦう１６をコードするＤＮＡ 上記ＤＮＡのうち、「配列番号：１に記載の塩基配列か
らなるＤＮＡ、又は配列番号：２に記載のアミノ酸配列
からなるタンパク質をコードするＤＮＡ」とは、本発明
のＯＰＦう１６をコードするＤＮＡである。該ＤＮＡ
は、例えば以下に示す「発現クローニング法」により得
ることができる。すなわち、まず骨転移細胞から全ＲＮ
Ａを調製し、続いて全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する。
ここで使用する骨転移細胞としては、例えばマウスＢＷ
５１４７細胞株が挙げられる。全ＲＮＡは、AGPC法( ac
id guanidium thiocyanate-phenol-chloroform method
; Tuji, Nakamura :実験医学 9, p99 (1991)) 等の常
法により調製することができる。また、ｍＲＮＡはオリ
ゴｄＴセルロースカラムを用い、例えば Molecular Clo
ning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989) 等に記載の方法により調製することができる。
次に、得られたｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡライブラリー
を調製する。ｃＤＮＡライブラリーは、全ｍＲＮＡをも
とに調製してもよいし、全ｍＲＮＡの一部からなるｍＲ
ＮＡ画分をもとに調製してもよい。このｍＲＮＡ画分
は、たとえばショ糖密度勾配遠心法等の常法により分画
されたｍＲＮＡのうち、骨髄細胞からヒドロキシアパタ
イト分解能を持つ細胞への分化誘導活性の存在する画分
およびその前後の画分のみを集めることにより調製する
こともできる（該活性の測定法については後述する）。
ｃＤＮＡライブラリーは、たとえば Gubler&Hoffman 法
(Gene, 25, p263 (1983)) 等の常法により調製すること
ができる。

【００１０】次に、上記ｃＤＮＡライブラリーを複数の
プールに分ける。ここで、１プール当たりのｃＤＮＡク
ローンの数は、ｃＤＮＡライブラリーを構成するインデ
ィペンデントクローン数によって任意に決定することが
できるが、たとえば 6×10⁵個程度のインディペンデン
トクローンからなるｃＤＮＡライブラリーの場合、 1×
10⁴クローンを 1プールとする60プール程度に分けるの
が、後の操作上適当であろう。続いて各プールより常法
によりＤＮＡを調製し、このＤＮＡをテンプレートに用
いてｃＲＮＡを調製する。ｃＲＮＡは、たとえば市販の
ｍＲＮＡ cappingキット(Stratagene 社) を用いて容易
に調製することができる。次に、各プール毎のｃＲＮＡ
をアフリカツメガエル卵母細胞に注入することにより、
ｃＲＮＡからタンパク質への翻訳を行う。卵母細胞への
注入は、たとえば以下の方法により行うことができる。
すなわち、体長10cm程度のメスのアフリカツメガエルか
ら卵母細胞の卵塊を取り出し、顕微鏡下で卵母細胞を一
つずつ切り離し、ステージＶかＶＩの傷のない生細胞を
選別し、この卵母細胞にデジタルマイクロディスペンサ
ー等を用いてキャピラリーよりｃＲＮＡを注入する。卵
母細胞 1個当たりの注入量は50nl以下が望ましい。その
後数日間培養した後、培養上清を採取する。ｃＲＮＡか
ら翻訳された翻訳産物（タンパク質）は培養上清中に存
在するため、この培養上清をアッセイ用のサンプルとす
ることができる。次に、この培養上清サンプルを用い、
以下のアッセイを行う。

【００１１】まずアッセイ用の細胞としては、骨髄細胞
を使用する。具体的には、たとえば6〜12週令のマウス
の大腿骨および脛骨の骨端を切り落とし、両端から１回
づつ２６Ｇの針を付けたシリンジで１ｍｌのα−ＭＥＭ
培地で骨髄細胞を押し出したものをピペッティングし、
沈殿した骨残渣を除いた上清部分を骨髄細胞として使用
することができる。この調製された骨髄細胞を、活性型
ビタミンＤを含む培養液中に懸濁させ、適当な濃度( 例
えば 2×10⁶ 個細胞/ml ) に調製してプレート( 例えば
96穴プレート) 上にまき、そこへ上述のアフリカツメガ
エル培養上清サンプル（アッセイ用サンプル）を加え、
以下に示すようなアッセイを行う。すなわち破骨細胞の
同定法として、（１）ＴＲＡＰ染色法、（２）象牙の分
解活性測定法（以下、象牙を用いたｐｉｔ形成法とも言
う）、（３）ヒドロキシアパタイト分解活性測定法（以
下、Osteologicウエルを用いたｐｉｔ形成法とも言う）
が知られているが、これらの同定法のうち、３）のヒド
ロキシアパタイト分解活性のみを有するプールを選別す
る。ここで（１）のＴＲＡＰ染色は、例えばEndocrinol
ogy, 122, p1373(1988)等に従い、まず上記の如くアッ
セイ用サンプルで処理された骨髄細胞をアセトン−クエ
ン酸緩衝液で固定した後、酒石酸存在下で基質（Naphth
ol AS-Mxphosphate)と色素（Fastredviolet LB salt）
を３７℃で１時間程度反応させることにより、検出する
ことができる。また、（２）の象牙を用いたｐｉｔ形成
測定は、例えば、あらかじめ直径6mm、1mm厚程度の象牙
質スライスを96穴ウエルプレートのウエル底に敷いたも
のを用意し、このウエル上で、上記の如きアッセイ用サ
ンプルによる骨髄細胞の処理を行い、適当な期間の後、
象牙質スライス上の細胞を先のＴＲＡＰ染色し、0.25％
トリプシン−0.02％ＥＤＴＡで一晩処理し、スライス上
の細胞をシリコンスクレイパーで削り取った後、象牙質
スライス上のｐｉｔ（吸収窩）を顕微鏡下で観察し、そ
の数を数えることにより測定することができる。また、
（３）のOsteologicウエルを用いたｐｉｔ形成測定は、
例えばヒドロキシアパタイトをコーティングしたウエル
（商品名Osteologic : MILLENIUMBIOLOGIX社）中で、上
記の如きアッセイ用サンプルによる骨髄細胞の処理を行
い、適当な期間の後、２０％次亜塩素酸で5分間処理し
て細胞を除去し、ウエル上のｐｉｔをｐｉｔ当たりのメ
ッシュ数として換算することにより、測定することがで
きる。

【００１２】上記同定法のうち（３）のみに陽性を示し
たプールをさらにサブプールに分け、同様の操作を繰り
返すことにより、最終的に、本発明のＯＰＦう１６をコ
ードするクローンを得ることができる。以上の如き発現
クローニング法によりクローニングされたＯＰＦう１６
ｃＤＮＡは、例えば Auto Read Sequencing キット( フ
ァルマシア社製) を用いてシークエンサーにより塩基配
列を決定することもできるし、ジデオキシ法を用いる B
caBEST Sequencing キット(TAKARA 社製) により、RIを
使用して塩基配列を決定することもできる。なお、この
ような「発現クローニング法」によらなくとも、本発明
のＯＰＦう１６ｃＤＮＡの塩基配列の公開に伴い、該ｃ
ＤＮＡの全部あるいは一部をプローブあるいはＰＣＲプ
ライマーに用いて、本発明のＯＰＦう１６ｃＤＮＡをク
ローニングすることができる。該クローニングは、例え
ばMolecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor La
boratory Press(1989)等に従い、当業者ならば容易に行
うことができる。

【００１３】２）ＯＰＦう１６の改変タンパク質あるい
はアレル変異体等をコードするＤＮＡ 前記ＤＮＡのうち、「配列番号：２に記載のアミノ酸配
列のうち１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／
又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ骨髄細胞か
らヒドロキシアパタイト分解能を持つ細胞への分化誘導
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ」とは、人
為的に作製したいわゆる改変タンパク質や、生体内に存
在するアレル変異体等のうち、骨髄細胞からヒドロキシ
アパタイト分解能を持つ細胞への分化誘導活性を有する
タンパク質をコードするＤＮＡを指す。該タンパク質を
コードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異誘発 ( Met
hods in Enzymology, 100, p468 (1983))やＰＣＲ法(Mo
lecular Cloning 2nd Edt.15章、Cold Spring Harbor L
aboratory Press(1989))等の手法により、当業者ならば
容易に作製することができる。なおここで、欠失、置換
及び／又は付加されるアミノ酸残基の数は、上記部位特
異的変異誘発等の周知の方法により欠失、置換及び／又
は付加できる程度の数を指す。

【００１４】ここで「骨髄細胞からヒドロキシアパタイ
ト分解能を持つ細胞への分化誘導活性」は、例えば前述
のようにして調製した骨髄細胞に対し、本発明の改変タ
ンパク質（本発明の改変タンパク質をコードするＤＮＡ
を周知の発現ベクターに連結し、適当な宿主に導入して
得られた発現産物）等を作用させた後、前述の測定法の
うち（３）のOsteologicウエルを用いたｐｉｔ形成活性
を調べることにより、容易に測定することができる。そ
の際、他の測定法、すなわち上記（１）のＴＲＡＰ染色
法及び（２）の象牙を用いたｐｉｔ形成法に本発明の改
変タンパク質を供した場合は陰性を示すことについても
確認する必要がある。これらの測定法については、具体
的には上記１）の項、あるいは実施例の２．３．１〜
２．３．３を参照されたい。これらの測定法に種々の改
変タンパク質等を供することにより、骨髄細胞からヒド
ロキシアパタイト分解能を持つ細胞への分化誘導活性を
有する改変タンパク質等を、容易に選別することができ
る。

【００１５】３）ＯＰＦう１６ＤＮＡとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ 前記ＤＮＡのうち、「配列番号：１に記載の塩基配列か
らなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、かつ骨髄細胞からヒドロキシアパタイト分解能
を持つ細胞への分化誘導活性を有するタンパク質をコー
ドするＤＮＡ」とは、すなわちヒト、ラット等の脊椎動
物全てのＯＰＦう１６ｃＤＮＡのような、配列番号：１
に記載の塩基配列からなるマウスＯＰＦう１６ＤＮＡに
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
を指す。

【００１６】ここで、「ストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば標準的なハイブ
リダイゼーションの条件（ホルムアミド濃度：５０％、
塩濃度：５×ＳＳＣ、温度：４２℃）において配列番
号：１のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡを指す。こ
れらＤＮＡは、例えば配列番号：１に記載のＤＮＡとの
ハイブリダイゼーション等によりクローニングされるも
のであるが、具体的なｃＤＮＡライブラリーの作製、ハ
イブリダイゼーション、ポジティブコロニーの選択、塩
基配列の決定等の操作はいずれも公知であり、例えばMo
lecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Labora
tory Press(1989)等を参照して容易に行うことができ
る。ｃＤＮＡライブラリーとしては、例えばヒトの肺、
腎臓、あるいは精巣由来のｃＤＮＡライブラリーが挙げ
られる。またハイブリダイゼーションに用いるプローブ
としては、例えば配列番号：１に記載の塩基配列を有す
るＤＮＡが挙げられる。

【００１７】本発明においてタンパク質とは、上記した
本発明の種々のＤＮＡがコードするタンパク質であり、
かつ骨髄細胞からヒドロキシアパタイト分解能を持つ細
胞への分化誘導活性を有するものである。具体例として
は、例えば配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する
本発明のタンパク質、ＯＰＦう１６が挙げられる。これ
らタンパク質は、たとえば本発明のＤＮＡを、ｐＢＫ−
ＣＭＶ等の公知の発現ベクターに連結した後、適当な宿
主に導入して発現・生産することにより、得ることがで
きる。宿主としては、原核性生物細胞または真核性生物
細胞のいずれでもよく、例えば大腸菌株や動物細胞株
は、とくに記載のない限り既に広く普及しており入手は
容易である。例えば動物細胞宿主としては、ＣＯＳ−
１、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ細胞が挙げられる。発現プラス
ミドを用い適当な動物細胞宿主を形質転換するには、LI
POFECTIN法（Felgner P.L., et al, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 84, p7413 (1987))等の公知の方法を用いれ
ばよい。形質転換された細胞の培養上清は、適当な希釈
によりそのまま種々のアッセイに使用され得る程度の発
現タンパク質を含んでいるため、該培養上清を用いて骨
髄細胞からヒドロキシアパタイト分解能を持つ細胞への
分化誘導活性を測定することができる（活性測定法につ
いては前記参照）。培養上清中に産生された上記発現タ
ンパク質は、亜鉛キレートアガロース、コンカナバリン
Ａアガロース、セファデックスＧ−１５０等を用いる公
知の方法によって、容易に精製することができる。

【００１８】本発明のタンパク質はまた、医薬の有効成
分として使用することができる。前述したように本発明
のタンパク質は、骨中のカルシウムの結晶であるヒドロ
キシアパタイトを分解してカルシウムを放出する細胞へ
と、骨髄細胞を分化誘導する活性を有していることか
ら、これらの薬剤を投与することにより、血中カルシウ
ム濃度を上昇させることができる。従って、本発明のタ
ンパク質を有効成分として含有する「医薬」は、例えば
「従来の技術」の項にも記載したように、低カルシウム
血症等の疾患、あるいは大量出血や放射線被爆などに伴
う血中カルシウムの大量減少に対する有効な治療薬とな
ることができる。

【００１９】このような破骨細胞分化促進剤の患者への
投与方法としては、静脈注射による投与が好ましいが、
経口投与、坐薬としての投与、皮下注射、筋肉注射、局
所注入、腹腔内投与などが行える。本発明の破骨細胞分
化促進剤は、上記の投与方法に依存して、種々の単位投
与形態で投与することができる。例えば静脈投与のため
には、本発明のタンパク質を、医薬として許容され得る
担体、好ましくは水性担体の中に溶解または懸濁させて
用いることができる。水性担体としては、例えば、水、
緩衝化水、０．４％の生理的食塩水などを使用すること
ができる。このようにして作製された水溶液は、そのま
ま包装するか、あるいは凍結乾燥することができ、凍結
乾燥した調製物は投与前に無菌の水溶液と組み合わせ
る。以上の調製物は、医薬として許容される補助剤、例
えば、ph調節剤あるいは緩衝剤、張度調節剤、浸潤剤な
どを、より具体的には、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナ
トリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシ
ウム、ソルビタンモノラウレート、テリエタノールアミ
ンオレエートなどを含有することができる。経口的投与
のためには、本発明のタンパク質を、粉末、錠剤、ピ
ル、カプセル剤及び糖剤の単位投与形態にして用いるこ
とができる。また局所投与のためには、例えばエアゾー
ルを包含する単位投与形態をとることができる。皮下注
射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与のためには、本発
明のタンパク質を水性または油担体の中に溶解または懸
濁させて用いることができる。あるいは、コラーゲン等
の生体親和性の材料を用いて、徐放性製剤として投与す
ることもできる。以上のような破骨細胞分化促進剤の投
与量は、一日量 0.0001 〜100mg 程度を症状が改善され
るまで投与することが可能である。

【００２０】本発明においてペプチド断片とは、本発明
のタンパク質の有するアミノ酸配列のうち、少なくとも
６アミノ酸以上の部分よりなるペプチド断片を指す。こ
こで、「少なくとも６アミノ酸以上」との限定は、安定
な構造をとり得る最小のサイズが６アミノ酸であること
によるが、好ましくは８アミノ酸以上の長さよりなるペ
プチドが、より好ましくは１０〜２０アミノ酸程度の長
さよりなるペプチドが挙げられる。なお該ペプチドは、
１０〜２０個程度の短いものであればペプチド合成装置
により合成することができるし、長いものであれば通常
の遺伝子工学的手法により（たとえば制限酵素処理等に
より）調製されたＤＮＡを、動物細胞等に発現させるこ
とにより得ることができる。なお、このようにして作製
されたペプチドを、通常の方法により修飾することも可
能である。これらペプチド断片は、後述のように医薬へ
の応用が可能である他、抗体作製のためにも使用するこ
とができる。

【００２１】本発明において抗体とは、本発明のタンパ
ク質又はエピトープを構成し得るペプチド断片のいずれ
かに対する抗体である。該抗体は、例えば新細胞工学実
験プロトコール p210 秀潤社(1993)に記載された方法を
用いてウサギ等を免疫することにより、容易に作製する
ことができる。また、例えば分子生物学研究のためのタ
ンパク実験法 第４章 羊土社(1994)に述べられている
手法を用いることで、容易にモノクローナル抗体を作製
することができる。さらには、特開昭62-296890により
擬人化抗体とすることもできる。該抗体の用途として
は、アフィニティークロマトグラフィー、ｃＤＮＡライ
ブラリーのスクリーニング、診断薬・実験用試薬等が挙
げられる。さらには後述のように、医薬として使用する
こともできる。

【００２２】本発明のタンパク質はまた、骨髄細胞から
ヒドロキシアパタイト分解能を持つ細胞への分化誘導活
性に対する阻害剤のスクリーニングのためにも使用でき
る。ここで、「骨髄細胞からヒドロキシアパタイト分解
能を持つ細胞への分化誘導活性に対する阻害剤」とは、
本発明のタンパク質の有する骨髄細胞からヒドロキシア
パタイト分解能を持つ細胞への分化誘導活性を、阻害す
る薬剤を指す。そして「骨髄細胞からヒドロキシアパタ
イト分解能を持つ細胞への分化誘導活性に対する阻害剤
のスクリーニング方法」は、先に述べた骨髄細胞からヒ
ドロキシアパタイト分解能を持つ細胞への分化誘導活性
の測定系（Osteologicウエルを用いたｐｉｔ形成測定
系）に、被験物質である阻害剤候補物質を添加すること
によって実施することができる。すなわち前記の如くOs
teologicウエル中で、マウス骨髄細胞に対し、本発明の
タンパク質及び阻害剤候補物質を添加、作用させる。そ
の際、阻害剤候補物質に阻害作用があれば、ｐｉｔが形
成されない。このｐｉｔの形成を指標に、容易に阻害剤
をスクリーニングすることができる。

【００２３】本発明において骨髄細胞からヒドロキシア
パタイト分解能を持つ細胞への分化誘導活性に対する阻
害剤とは、上記スクリーニング方法により見出されるも
のであり、前記したように、本発明のタンパク質の有す
る骨髄細胞からヒドロキシアパタイト分解能を持つ細胞
への分化誘導活性を阻害する薬剤を意味する。このよう
な、骨髄細胞からヒドロキシアパタイト分解能を持つ細
胞への分化誘導活性に対する阻害剤の具体例としては、
例えば上記で作製された本発明のペプチド断片のうち阻
害効果を有するもの、あるいは本発明の抗体のうち中和
活性を有するものが挙げられる。このような、骨髄細胞
からヒドロキシアパタイト分解能を持つ細胞への分化誘
導活性に対する阻害剤は、「従来の技術」にも記載した
ように、血中カルシウム濃度の上昇を伴う疾患である高
血圧症、動脈硬化症、糖尿病、心筋梗塞、あるいは高カ
ルシウム血症等に対する有効な治療薬となることが考え
られる。本発明のタンパク質は、骨中のカルシウムの結
晶であるヒドロキシアパタイトを分解する細胞への分化
誘導活性を有していることから、上記の如く血中のカル
シウム濃度を上昇させると同時に、骨（骨の無機成分で
あるヒドロキシアパタイト）を溶解する作用をも有して
いると言える。従って、このような本発明のタンパク質
の阻害剤は、骨の溶解を伴う疾患である骨粗鬆症、慢性
関節リウマチ、癌の骨転移に伴う骨破壊、あるいはぺー
ジェット病等に対する有効な治療薬ともなることが考え
られる。

【００２４】このような、本発明の骨髄細胞からヒドロ
キシアパタイト分解能を持つ細胞への分化誘導活性に対
する阻害剤の、患者への投与方法及び投与形態として
は、前記した本発明のタンパク質を有効成分として含有
する医薬と同様の投与法及び投与形態が考えられる。ま
た投与量は、一日量 0.0001 〜100mg 程度を症状が改善
されるまで投与することが可能である。

【００２５】本発明においてトランスジェニック動物と
は、本発明のＤＮＡを人為的に染色体中に導入した、い
わゆるトランスジェニック動物や、染色体中から欠損さ
せた、いわゆるノックアウト動物を指す。これらトラン
スジェニック動物は、例えば疾患モデルマウス：Molecu
lar Medicine臨時増刊号 中山書店（1994）等に基づ
き、当業者ならば容易に作製することができる。該トラ
ンスジェニック動物は、例えば高血圧症や骨粗鬆症等の
医薬品開発のためのモデル動物として、あるいは該医薬
品のスクリーニング用の動物として、非常に有用であ
る。

【００２６】

【実施例】以下、本発明の一例として実施例により本発
明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例
によりなんら限定されるものではない。

【００２７】実施例１マウスｃＤＮＡライブラリーの構築 １．１ マウスＢＷ５１４７細胞からのｍＲＮＡの単離 １．１．１ 全ＲＮＡの単離 マウスＢＷ５１４７細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８
８）１×１０⁸個をＡＧＰＣ法（acid guanidium thio
cyanate-phenol-chloroform method；実験医学 9, 15,
p99 (1991)）に従い全ＲＮＡを分離した。即ち、ま
ず、細胞のペレットに４Ｍのグアニジンイソチオシアネ
ート１０ｍｌを加え、直ちに激しく振とうし、その溶液
を１８Ｇニードル中を５往復通過させることでＤＮＡを
部分剪断した。この溶液に２Ｍ酢酸ナトリウム１ｍｌ、
水飽和フェノール１０ｍｌ及びクロロホルム−イソアミ
ルアルコール（４９：１）２ｍｌを順次加え、添加ごと
に混和した。その後激しく振とうし、１５分間氷冷した
後、４℃で１０，０００ｇ、２０分間遠心した。その水
層を分取し、等量のイソプロパノールを加えて良く混和
した。これを−２０℃に１時間置いた後、４℃で１０，
０００ｇ、１０分間遠心した。遠心後、ＲＮＡの沈殿に
４Ｍグアニジンチオシアネート３ｍｌを加えて完全に溶
解させ、等量のイソプロパノールを加え、−２０℃で１
時間放置した。その後、４℃で１０，０００ｇ、１５分
間遠心した後、上清を捨て、ＲＮＡの沈殿を７５％エタ
ノールで洗浄することにより全ＲＮＡを得た。

【００２８】１．１．２ ｍＲＮＡの単離 上記の方法を数回繰り返すことで全ＲＮＡを１５ｍｇ集
め、溶離緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、１ｍＭＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳ）５ｍｌに溶
解し、６５℃で２分間加熱し、直ちに室温まで急冷し
た。５ＭＮａＣｌを０．５５ｍｌ添加後、その溶液を洗
浄緩衝液（０．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳ）
で平衡化したオリゴｄＴセルロース（タイプ７、ファル
マシアバイオテク）０．５ｇのカラムに添加し、通過液
をさらに２回、カラムに添加することによりｍＲＮＡを
カラムに結合させた。カラムを洗浄緩衝液１５ｍｌで洗
浄した後、結合したＲＮＡを溶離緩衝液４ｍｌで溶出し
た。溶出液を６５℃で２分間加熱し、その後冷却し、
０．５ＭＮａＣｌに調節し、再平衡カラムに再度添加し
て、同様に溶出操作を行った。その溶出液からエタノー
ル沈殿によりｍＲＮＡを回収し、７５％エタノールで洗
浄した。

【００２９】１．１．３ ショ糖密度勾配遠心によるｍ
ＲＮＡの分画 ジエチルピロカーボネイトで処理した密度勾配フラクシ
ョネータ（日立；ＤＧＦ−Ｕ）と遠心チューブ、２種類
の濃度のＲＮａｓｅフリーのショ糖溶液（５％と２０％
（ｗ／ｖ）ショ糖）、０．１ＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％
ＳＤＳを用意し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１Ｔｉ用チュ
ーブに密度勾配フラクショネータでショ糖勾配を作り、
２時間以上室温に放置して、勾配の不連続性をなくし
た。次に、ｍＲＮＡを２００μｌのＴＥ溶液（９９％ジ
メチルスルホキサイド、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）に溶解
し、３７℃で５分間処理し、４００μｌの５ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％Ｓ
ＤＳを加えて６５℃で１０分間熱処理をすることによ
り、その非特異的な会合を解離させた。その後急冷し、
ショ糖密度勾配にのせ、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１Ｔｉ
ローターで２５℃、２０，０００ｒｐｍ、１４時間遠心
を行った。遠心後、チューブより０．５ｍｌずつ密度勾
配フラクショネータで分画し、エタノール沈殿した。ｍ
ＲＮＡの沈殿は最低３回、７５％エタノールで洗浄し
た。

【００３０】１．１．４ ｍＲＮＡの同定 ５０画分に分画したｍＲＮＡは、その一部を後述の２．
１．３の方法に従いアフリカツメガエルの卵母細胞に注
入し、タンパク質に翻訳させた。この翻訳産物を含む培
養上清を、後述の２．２．２の方法によりアッセイ用の
マウス骨髄細胞に添加して培養した後、２．３．１のＴ
ＲＡＰ染色法により、破骨細胞が分化形成されたか否か
（すなわち、どのｍＲＮＡ画分中に破骨細胞分化促進活
性を有する因子が含まれているか）を同定した。その結
果、活性のピークは、２７番目の分画と３２番目の画分
に存在していた。

【００３１】１．２ ｃＤＮＡライブラリーの作製 活性のピーク画分の２７番目から３３番目を活性画分と
して集め、この画分に対するｃＤＮＡライブラリーを、
Ｇｕｂｌｅｒ＆Ｈｏｆｆｍａｎ法（Gene, 25,p263 (198
3）) の変法にて調製した。即ち、この活性画分のｍＲ
ＮＡ２μｇをもとに、ＸｈｏＩサイトを持つオリゴｄＴ
プライマーを用いて、Ｍ−ＭｕＬＶの逆転写酵素により
ファーストストランドを合成した。続いて DNA Polymer
ase I によりセカンドストランドを合成し、ＥｃｏＲＩ
アダプターとのライゲーションおよびＸｈｏＩ消化を行
った。その後、アダプターとプライマーをゲル濾過（Se
phacryl Spin Column；ファルマシア社）により除い
た。以上のｃＤＮＡ合成ステップはStratagene社のＺＡ
ＰｃＤＮＡ合成キットを用い、逆転写酵素はＢＲＬ社の
スーパースクリプトＩＩを用いて行った。次に、Ｅｃｏ
ＲＩ、ＸｈｏＩ切断済みＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ^TMベク
ターを先に作製したｃＤＮＡとライゲーションした後、
Gigapack II Gold packing extract（ｍｃｒＡ^- 、ｍｃ
ｒＢ^- 、ｍｍｒ^- ；Stratagene社）を用いてパッケージ
ングを行い、大腸菌ＰＬＫ−Ｆ^' 株に感染させた。その
結果、平均長２．２６ｋｂ、インディペンデントクロー
ン数６．３×１０⁵ 個のｃＤＮＡライブラリーが得られ
た。

【００３２】実施例２発現クローニング 概要 １．２で作製したｃＤＮＡライブラリーを、１０，００
０個／プールとして計６３プールに分け、後述の２．
１．２〜２．１．３の方法にて各プールのｃＲＮＡをア
フリカツメガエルの卵母細胞に注入し、タンパク質に翻
訳させた。この翻訳産物を含む培養上清を、後述の２．
２．２の方法によりアッセイ用のマウス骨髄細胞に添加
して後述の各アッセイ法に供し、陽性と判断されたプー
ルを選別した。更に、その陽性プールを１０のサブプー
ルに分け、同様にしてｃＲＮＡを調製し、卵母細胞中で
発現させ、その活性を測定して陽性プールを選別するこ
とを繰り返し、最終的に単一クローンを得た。

【００３３】すなわち具体的アッセイとしては、１次ス
クリーニングは後述の２．３．１のＴＲＡＰ染色法にて
破骨細胞分化促進活性を判定し、６３プールから陽性プ
ールを３プール選別した。２次スクリーニング以降は、
後述の２．３．１のＴＲＡＰ染色法、２．３．２の象牙
を用いたｐｉｔ形成法、２．３．３のOsteologicウエル
を用いたｐｉｔ形成法の、３種類の破骨細胞分化促進活
性測定法の全てに陽性反応を示すプールを選別すること
にし、まず、上述の３プールをそれぞれ１０のサブプー
ル（１０００クローン／プール）に分けて各アッセイを
行った。その結果、陽性反応の強さの順に上位３プール
を選び、更にこの３プールをそれぞれ１０のサブプール
（２００クローン／プール）に分けて３次スクリーニン
グを行った。その結果、陽性反応の強さの順に３つの陽
性プールを選択し、これを各々１０のサブプール（２４
クローン／プール）に分けて、さらに４次スクリーニン
グを行った。スクリーニングの結果、３つのアッセイ
全てに陽性を示したプールと、Osteologicウエルを用
いたｐｉｔ形成活性のみに陽性を示し、他の２つのアッ
セイには陽性を示さなかったプールに分かれた。このう
ち、のOsteologicウエルを用いたｐｉｔ形成活性のみ
に陽性を示したプールのうち、活性上位のプール２個を
シングルクローン化して５次スクリーニングを行い、上
位８個のクローンを陽性クローンとした。これら８個の
クローンについて、上記３つのアッセイを行い、Osteol
ogicウエルを用いたｐｉｔ形成のみに陽性を示したクロ
ーンのうちの一つを、ＯＰＦう１６と命名した。なおＯ
ＰＦう１６の各アッセイ結果は、後述の（結果）の項に
記した。

【００３４】２．１ アッセイ用サンプルの調製 ２．１．１ ＤＮＡの調製 大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに各プールのラムダファージ１
×１０⁴ pfuを感染させ、１５ｃｍシャーレにまき、プ
ラークを形成させた。このプレートに１３ｍｌのＳＭ緩
衝液を加え、プレートライセートを調製した。このファ
ージライセートにＤＥ５２（ＤＥＡＥセルロース；ワッ
トマン社）を加えてファージＤＮＡ以外を吸着させ、遠
心後の上清に再度ＤＥ５２を加え、その上清中のファー
ジＤＮＡを回収した。このＤＮＡをフェノールとフェノ
ール−クロロホルム（１：１）で１回ずつ抽出し、エタ
ノール沈殿にて回収し、ファージＤＮＡとした。調製し
たＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、１／５０量を１
％アガロース電気泳動にて定量した。

【００３５】２．１．２ ｃＲＮＡの合成 ２．１．１で調製した各プールのファージＤＮＡの少な
くとも１μｇをプロテイナーゼＫ（Stratagene社）で３
７℃１時間処理し、フェノール−クロロホルム処理後、
エタノール沈殿により回収することによりテンプレート
ＤＮＡを調製した。このＤＮＡを用いて、ｍＲＮＡcapp
ingキット（Stratagene社）に従いｃＲＮＡを合成し
た。これをフェノール−クロロホルム処理、エタノール
沈殿に供することによりｃＲＮＡを回収し、１／１０量
を１％アガロースゲル電気泳動により定量した。その
後、１μｇ／μｌの濃度に調製してマイクロインジェク
ション用ｃＲＮＡとした。

【００３６】２．１．３ アフリカツメガエル卵母細胞
による発現 体長１０ｃｍ程度のメスのアフリカツメガエルから卵母
細胞の卵塊を取り出し、ＭＢＳ（＋Ｃａ²⁺；８８．０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１．０ｍＭ ＫＣｌ、２．４ｍＭ Ｎａ
ＳＯ₃、０．３ｍＭ Ｃａ（ＮＯ₃ ）₂ ４Ｈ₂ Ｏ、０．
４１ｍＭ ＣａＣｌ₂ ４Ｈ₂ ０、０. ８２ｍＭ ＭｇＳ
Ｏ₄ ７Ｈ₂ ０、１０μｇ／ｍｌペニシリン、１０μｇ／
ｍｌ ストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍｌニスタチン、
１５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ ７．６））を入れたシ
ャーレに移し、実体顕微鏡下精密用鋏とピンセットで卵
母細胞を一つずつ切り放し、ステージＶかＶＩの傷のな
い生きている細胞を選別した。これらの卵母細胞に１０
μｌデジタルマイクロディスペンサー（Drummond社）を
用いて、キャピラリーより、卵母細胞１個当たり５０ｎ
ｌのｃＲＮＡを注入した。その後、死んだり傷ついた細
胞を除き、２％ＦＣＳを含むＭＢＳにて３日間、２０℃
で培養した。その培養上清を遠心し、更に０．２２μｍ
のフィルターを通し、残査を除くと同時に除菌した。そ
の上清をアッセイ用サンプルとした。

【００３７】２．２ アッセイ ２．２．１ マウス骨髄細胞の調製 ６〜１２週令のマウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ；日本クレア）
の大腿骨及び脛骨を無菌的に取り出し、その骨端を切り
落とし、両端から１回づつ２６Ｇの針を付けたシリンジ
で１ｍｌのα−ＭＥＭ培地（１０％牛胎児血清、１００
単位/ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ/ｍｌストレプトマ
イシンを含む）で骨髄細胞を押し出し、良くピペッティ
ングした後骨残査が沈殿するまで待ち、その上清を回収
した。それを更に新鮮な培地で１〜２回洗い、アッセイ
用の骨髄細胞を調製した。

【００３８】２．２．２ 破骨細胞分化形成法 上記の骨髄細胞を１０^-8Ｍの活性型ビタミンＤ〔１、２
５（ＯＨ）₂ Ｄ₃〕を含むα−ＭＥＭ培地中にけん濁さ
せ、２×１０⁶ 個細胞／ｍｌの濃度に調製し、９６穴プ
レートに１８０μｌと２．１．３で調製したアッセイ用
サンプルを２０μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ₂ 下、１ま
たは２週間培養した。その間、３−４日間隔で培地の３
／４を新しい培地と交換し、新たにアッセイ用サンプル
を同量添加した。

【００３９】２．３ 破骨細胞の同定法 ２．３．１ ＴＲＡＰ染色法 破骨細胞のマーカー酵素であるＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性
酸性フォスファターゼ）を基質で染色した。即ち２．
２．２の培養骨髄細胞をアセトン─クエン酸緩衝液で固
定した後、酒石酸存在下で基質（Naphthol AS ─MXphos
phate）と色素（Fastredviolet LB salt）を３７℃で１
時間反応させることにより、染色した（Endocrinolog
y，122，p1373,(1988)）。 （結果）ＯＰＦう１６は、既知の破骨細胞分化形成因子
であるＩＬ─１β（５０ｎｇ／ｍｌ）やＬＩＦ（２５Ｕ
／ｍｌ）で骨髄細胞を処理し、破骨細胞を分化形成させ
たポジティブコントロールのＴＲＡＰ染色性と比較し
て、陰性と判断した。

【００４０】２．３．２ 象牙を用いたｐｉｔ形成法 象牙より直径６ｍｍ、１ｍｍ厚の象牙質スライスを作製
し、それを８０％アルコール中で超音波処理することに
より滅菌した。α−ＭＥＭ培地で洗浄した後、各スライ
スを９６ウエルプレートのウエル底に移し、その上で
２．２．２の方法に従って骨髄細胞から破骨細胞を分化
誘導した。１または２週間後、象牙質スライス上の破骨
細胞を２．３．１のＴＲＡＰ染色法にて染色し、０．２
５％トリプシン─０．０２％ＥＤＴＡで一晩処理し、ス
ライス上の細胞をシリコンスクレイパーで削り取った。
象牙質スライス上のｐｉｔ（吸収窩）を顕微鏡下で観察
し、その数またはｐｉｔあたりのメッシュ数を測定する
ことにより骨髄細胞より分化誘導された細胞の骨吸収活
性（骨分解活性）を調べた。 （結果）ＯＰＦう１６により形成された細胞の象牙質ス
ライス上のｐｉｔ形成数は、ＬＩＦ（２５Ｕ／ｍｌ）の
１／１０〜１／５と、ｐｉｔ形成活性は僅かであること
が判明した。

【００４１】２．３．３ Osteologicウエルを用いたｐ
ｉｔ形成法 ヒドロキシアパタイトをコーティングしたウエル（商品
名Osteologic：MILLENIUMBIOLOGIX社）中で２．２．２
の方法に従って骨髄細胞から破骨細胞を分化誘導した。
１週間後、２０％次亜塩素酸で５分間処理して、細胞を
除去し、ウエル上のｐｉｔをｐｉｔ当たりのメッシュ数
として換算することにより骨髄細胞より分化誘導された
細胞の骨吸収活性（骨分解活性）を測定した。 （結果）ＯＰＦう１６により形成された細胞のOsteolog
icウエル上のpit数は、ウエル当たり平均３００個以上
であった。これは、ネガティブコントロール（アフリカ
ツメガエル卵母細胞にｃＲＮＡではなく蒸留水を導入
し、その培養上清を骨髄細胞に添加したもの）の結果
（＝平均１５〜２０個）よりも多く、またポジティブコ
ントロールであるＬＩＦ（２５Ｕ／ｍｌ）によるｐｉｔ
の結果（５０個）よりも多かったため、ｐｉｔ形成活性
は陽性と判定した。 （結論）以上３通りの同定法で、全てに陽性とはなら
ず、Osteologicウエルを用いたｐｉｔ形成活性のみ陽性
を示したことから、ＯＰＦう１６により分化形成された
細胞は破骨細胞ではない別の細胞で有り、かつヒドロキ
シアパタイト分解活性を有する細胞であることが分かっ
た。

【００４２】実施例３組換えファージＤＮＡのファージミドＤＮＡへの変換 ＺＡＰ ExpressベクターはインサートＤＮＡをｐＢＫ
−ＣＭＶへin vivoexcisionすることでサブクローニン
グすることができる。ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’大腸菌
にＺＡＰ ExpressファージとExAssistヘルパーファー
ジを感染させることで、ｐＢＫ−ＣＭＶファージミドを
産生させ、元の大腸菌を熱処理することで死滅させ、新
たにＸＬＯＬＲ大腸菌に感染させた。これに培地を加
え、４５分間培養後、ＬＢプレートにプレーティング
し、培養した。

【００４３】実施例４プラスミドＤＮＡの調製 陽性コロニーを爪楊枝で拾い２ｍｌのＬＢ（カナマイシ
ン１００μｇ／ｍｌ）で一晩培養後、アルカリ−ＳＤＳ
法によりプラスミドを調製した。このプラスミドＤＮＡ
を適当な制限酵素で切断し、１％アガロースゲル中で電
気泳動し、ＯＰＦう１６ｃＤＮＡのベクターへの挿入を
確認した。

【００４４】実施例５ＯＰＦう１６ｃＤＮＡの塩基配列決定 実施例４で得られたＯＰＦう１６ｃＤＮＡの塩基配列の
決定は、Ｓａｎｇｅｒらによって開発されたダイデオキ
シ法によって行った（AutoRead Sequencing kit, Pharm
acia Biotech社製）。その結果、配列表の配列番号：１
に記載の１９７０ｂｐからなるｃＤＮＡが得られ、また
２２７アミノ酸からなる配列番号：２のアミノ酸配列が
決定された。なお、上記の塩基配列決定後、本発明の新
規なタンパク質ＯＰＦう１６のｃＤＮＡを発現ベクター
ｐＢＫ−ＣＭＶに組み込んだプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９株に導入し、保存用の形質転換体である
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ＯＰＦｕ１６）を調製し
た。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ＯＰＦｕ１６）は、茨
城県つくば市東１丁目１番３号、工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されている（微生物の表示：Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ＪＭ１０９（ＯＰＦｕ１６）；受領日：平成９
年７月４日；受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１６３０６）。

【００４５】実施例６ＯＰＦう１６の遺伝子発現のノーザンブロット解析 種々の組織由来のポリＡ⁺ＲＮＡが既にブロッティング
されたＭＴＮブロットメンブレンを用いて、ノーザンブ
ロット解析を行った。プローブは、ＯＰＦう１６のｃＤ
ＮＡ全長（約２．０Ｋｂｐ）を³²Ｐで標識して用いた。

【００４６】上記プローブを５０％（ｖ／ｖ）ホルムア
ルデヒド／５×ＳＳＣ／５×デンハルト／１％（ｗ／
ｖ）ＳＤＳ／０．０１％（ｗ／ｖ）変性サケ精子ＤＮＡ
中でフィルターに固定したＲＮＡに４２℃でハイブリダ
イズさせ、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、５０℃中で、
次に０．１％ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、５０℃中で洗浄
した。水気を除いた後、−８０℃で１−３日間オートラ
ジオグラフィーを行った。使用したＸ線フィルムはコダ
ックＳＢ５またはフジＡＩＦ,ＲＸを増感スクリーンの
存在下で用いた。

【００４７】（結果）図１には、マウス各組織（２μｇ
ＲＮＡ）のノーザンブロットの結果を示す。ＯＰＦう１
６ｃＤＮＡをプローブとするｍＲＮＡのバンドは、調べ
た範囲では、肺、腎臓及び精巣で強く発現していた。Ｏ
ＰＦう１６ｍＲＮＡには異なる４種類のサイズが存在
し、ＯＰＦう１６ｃＤＮＡのサイズに相当するｍＲＮＡ
は、精巣で強い発現が見られた。

【００４８】

【発明の効果】本発明により、骨髄細胞からヒドロキシ
アパタイト分解能を持つ細胞への分化誘導活性を有する
ＯＰＦう１６及び該ＯＰＦう１６の類似タンパク質、ま
たはこれらのタンパク質のペプチド断片、抗体、これら
のタンパク質を有効成分とする医薬、あるいはこれらの
タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子の発現ベクタ
ー、該発現ベクターを導入した形質転換体、該形質転換
体を用いる組換えタンパク質の生産方法、前記遺伝子の
導入及び欠損に係るトランスジェニック動物、さらには
骨髄細胞からヒドロキシアパタイト分解能を持つ細胞へ
の分化誘導活性に対する阻害剤のスクリーニングにおけ
る、前記タンパク質の用途が提供される。

【００４９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１９７０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GCGCTCTGCC CGAGCTGCAG GAGCAGGTGC GCGGCTGCGT GCCGAGAAGG CGCGGCTACT 60 GGCCGGGCGC GTGCAGCCAG AACAAGAAGT AGAGATCGAG GCGCGCCCAG ACAAGCTCGC 120 CCAGCTTCGG CGCCTCACCG AGCGTCTGGC CACCTCGGAT CGTGGAGTGC GCTCCAGGGC 180 TAGCCCCCGG GCAGAGGATC CCGACGGGTT GGCTGCCAGG CGCAGCGAAG GAGCGCTGCA 240 GGTGCTCGAC CCGGGGTCTA GGACACCCG ATG GGG AAC CCC GGA CTC GGG AGA 293 Met Gly Asn Pro Gly Leu Gly Arg 5 CGG GCA CCG AAG TCG TGC CTG AGA CCC GAG AGG TGG ATG CCC AGG CAG 341 Arg Ala Pro Lys Ser Cys Leu Arg Pro Glu Arg Trp Met Pro Arg Gln 10 15 20 TAC CCG AGA CAG GGG GAG GCT GGA GTG GAG GTG GTC CCT GAG ACC GTT 389 Tyr Pro Arg Gln Gly Glu Ala Gly Val Glu Val Val Pro Glu Thr Val 25 30 35 40 GAG GTG GAC ACG TGG GTG ACT GAG GAG CTC CTA GGG TTG CCT GAG GCT 437 Glu Val Asp Thr Trp Val Thr Glu Glu Leu Leu Gly Leu Pro Glu Ala 45 50 55 GCA GAG CGT GAG CTG GAG CTG CTC CGC ACC AGC TTG GAG CAT CAG CGA 485 Ala Glu Arg Glu Leu Glu Leu Leu Arg Thr Ser Leu Glu His Gln Arg 60 65 70 GGG GTG AGC GAA CTC TTG CGG GGC CGA TTG AGG GAG TTG GAG GAG GCC 533 Gly Val Ser Glu Leu Leu Arg Gly Arg Leu Arg Glu Leu Glu Glu Ala 75 80 85 CAC GAG GCC GCA GTG ACC AGG CCT CAG TCT CGC GAC GTT GCT GCC CAG 581 His Glu Ala Ala Val Thr Arg Pro Gln Ser Arg Asp Val Ala Ala Gln 90 95 100 ACT ACA TTG GGT TGC ACT GAG AAA ACC ACA CAG ACA GAG CTG CCA GTG 629 Thr Thr Leu Gly Cys Thr Glu Lys Thr Thr Gln Thr Glu Leu Pro Val 105 110 115 120 GAG AAC CAG CCC AGA CCC ACG GCT GGA GAC GAG ATG GCC CCT GTT GGC 677 Glu Asn Gln Pro Arg Pro Thr Ala Gly Asp Glu Met Ala Pro Val Gly 125 130 135 ATC CTC AAA TCC ATC ATG AAG AAG AAA GAT GGT ATT CCA GGT GCA CAA 725 Ile Leu Lys Ser Ile Met Lys Lys Lys Asp Gly Ile Pro Gly Ala Gln 140 145 150 TCC AGT CAG GGA CCC AAG AGT CTG CAG TTC GTT GGG GTC CTC AAC GGA 773 Ser Ser Gln Gly Pro Lys Ser Leu Gln Phe Val Gly Val Leu Asn Gly 155 160 165 GAG TAT GAG AGT TCC TCC AGT GAG GAT GGC AAC AGC GAT GAT GAA GAT 821 Glu Tyr Glu Ser Ser Ser Ser Glu Asp Gly Asn Ser Asp Asp Glu Asp 170 175 180 GGT GTT GCT GAA CAC CCC AGG AGT AGC TCT TCT GGA TCA GAT GAT AGC 869 Gly Val Ala Glu His Pro Arg Ser Ser Ser Ser Gly Ser Asp Asp Ser 185 190 195 200 AGT GGG GGA TCT GAC GCT GGA ACC CCT GGC CCC CAC AAT GAC AAA GAT 917 Ser Gly Gly Ser Asp Ala Gly Thr Pro Gly Pro His Asn Asp Lys Asp 205 210 215 GCT GGG GAC TGC GAG CTT GAG ACA CTC CAG AGC TGACGGCAGG GAGAGAAGGG 970 Ala Gly Asp Cys Glu Leu Glu Thr Leu Gln Ser 220 225 AGGTGTGAAC TGAACCCCCT TTGAGGGAGG CTTGCATTGC TCTGAATCAG CAGCTGAACC 1030 GGCCACGTGG AGTCACCAGC AGAGATGGCA ATGCAGCACG CCTTGTGGCC CAGGAATGGT 1090 TTCGAGTGTC CAGCCAAAAA CGCTCTCAGG CAGAGTCTGT GGCTGGGGTT CTTCGAGGGG 1150 TGAAAAGCCT GGGGCCTGAG CTGCTGGCTT ATGTGGTGAA CCTGGCTGAT GGCAATGGAA 1210 ACACAGCTCT GCATTACAGC GTGTCTCATG GGAATCTCGC CATTTCCAGC CTGCTACTGG 1270 ATACAGGGGT CTGTGATGTG AATCACCAGA ATAGAGCTGG CTACTCTGCC CTCATGTTGG 1330 CTGCACTCAC TTCTGTAGGA CAAGAGGAGG AAGACATGGC TGTGGCCCAG AGACTTTTCA 1390 GTATGGGTGA TGTCAATGCC AAGGCTAGCC AGACTGGACA GACAGCCCTC ATGCTGGCCA 1450 TCAGCCATGG CCACCAGGAC ATGGTAGCTG CCTTGCTAGA ATGCGGGGCT GATGTCAATG 1510 TACAGGATGC TGATGGGGCC ACAGCACTGA TGTGTGCCAG CGAGTATGGA CGCCTTGATA 1570 CAGTTCAATT GTTGTTGGCC CAGCCAGGTT GTGACCTAAC CATCTTAGAC AATGAGGGCA 1630 CAAGTGCTGG CCATTGCACT GGAGGCTGAA CAGGATGAGG TGGCTGCACT GCTCCATGCC 1690 CACCTGACAT CAAACCACCA GGGACAGTCT TCCAGAGGGT CTCCCACTGC AAAGGAATGC 1750 AATGACAAAT GAGGAACCTC TACCTCTGTG AGCTGCTAAC TACATCTAGA CTCTCTCTGC 1810 TGTCTGAATC ACAGCAGGGC ACCTTGAGAA GATGCTCCCT CTAGCTTGTT AGGATGCTGA 1870 GGGGAAAGAG TGAGGCAAAG CCTGGGTAAT GCCATATCCC TCAACTCACT TCATGAAACA 1930 TCCTAATAAA AGTATTTCTA CTAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1970

【００５０】配列番号：２ 配列の長さ：２２７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Gly Asn Pro Gly Leu Gly Arg Arg Ala Pro Lys Ser Cys Leu Arg 5 10 15 Pro Glu Arg Trp Met Pro Arg Gln Tyr Pro Arg Gln Gly Glu Ala Gly 20 25 30 Val Glu Val Val Pro Glu Thr Val Glu Val Asp Thr Trp Val Thr Glu 35 40 45 Glu Leu Leu Gly Leu Pro Glu Ala Ala Glu Arg Glu Leu Glu Leu Leu 50 55 60 Arg Thr Ser Leu Glu His Gln Arg Gly Val Ser Glu Leu Leu Arg Gly 65 70 75 80 Arg Leu Arg Glu Leu Glu Glu Ala His Glu Ala Ala Val Thr Arg Pro 85 90 95 Gln Ser Arg Asp Val Ala Ala Gln Thr Thr Leu Gly Cys Thr Glu Lys 100 105 110 Thr Thr Gln Thr Glu Leu Pro Val Glu Asn Gln Pro Arg Pro Thr Ala 115 120 125 Gly Asp Glu Met Ala Pro Val Gly Ile Leu Lys Ser Ile Met Lys Lys 130 135 140 Lys Asp Gly Ile Pro Gly Ala Gln Ser Ser Gln Gly Pro Lys Ser Leu 145 150 155 160 Gln Phe Val Gly Val Leu Asn Gly Glu Tyr Glu Ser Ser Ser Ser Glu 165 170 175 Asp Gly Asn Ser Asp Asp Glu Asp Gly Val Ala Glu His Pro Arg Ser 180 185 190 Ser Ser Ser Gly Ser Asp Asp Ser Ser Gly Gly Ser Asp Ala Gly Thr 195 200 205 Pro Gly Pro His Asn Asp Lys Asp Ala Gly Asp Cys Glu Leu Glu Thr 210 215 220 Leu Gln Ser 225

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、マウス各組織におけるＯＰＦう１６対
応ｍＲＮＡの発現分布を、ノーザンブロット解析により
調べた結果の電気泳動写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 21/08 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＤ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を
   コードするＤＮＡ。 （ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタン
   パク質 （ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列のうち１若し
   くは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された
   アミノ酸配列からなり、かつ骨髄細胞からヒドロキシア
   パタイト分解能を持つ細胞への分化誘導活性を有するタ
   ンパク質
2. 【請求項２】 配列番号：１に記載の塩基配列からなる
   ＤＮＡ、又はそのＤＮＡとストリンジェントな条件下で
   ハイブリダイズし、かつ骨髄細胞からヒドロキシアパタ
   イト分解能を持つ細胞への分化誘導活性を有するタンパ
   ク質をコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載のＤＮＡがコードす
   るタンパク質。
4. 【請求項４】 配列番号：２に記載のアミノ酸配列から
   なる、請求項３記載のタンパク質。
5. 【請求項５】 請求項１又は２記載のＤＮＡを含有する
   発現ベクター。
6. 【請求項６】 請求項５記載の発現ベクターによって形
   質転換された形質転換体。
7. 【請求項７】 請求項６記載の形質転換体を、請求項５
   記載の発現ベクターの発現可能な条件下で培養すること
   を特徴とする、組換えタンパク質の生産方法。
8. 【請求項８】 請求項３又は４記載のタンパク質を有効
   成分として含有する医薬。
9. 【請求項９】 請求項３又は４記載のタンパク質の、少
   なくとも６アミノ酸以上の部分よりなるペプチド断片。
10. 【請求項１０】 請求項３又は４記載のタンパク質、あ
    るいは請求項９記載のペプチド断片の、いずれかに対す
    る抗体。
11. 【請求項１１】 請求項３又は４記載のタンパク質を用
    いることを特徴とする、骨髄細胞からヒドロキシアパタ
    イト分解能を持つ細胞への分化誘導活性に対する阻害剤
    のスクリーニング方法。
12. 【請求項１２】 請求項１１記載のスクリーニング方法
    により得られる、骨髄細胞からヒドロキシアパタイト分
    解能を持つ細胞への分化誘導活性に対する阻害剤。
13. 【請求項１３】 請求項９記載のペプチド断片又は請求
    項１０記載の抗体からなる、請求項１２記載の阻害剤。
14. 【請求項１４】 請求項１又は２記載のＤＮＡを人為的
    に染色体中に導入するか、あるいはいずれかを染色体中
    から欠損させたトランスジェニック動物。