JPH1121285A - 化学発光性１，２−ジオキセタン化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 各種検定方法のレポーター分子として有用で
ある、酵素によって開裂可能な、改良された化学発光性
１，２−ジオキセタン化合物を提供する。 【解決手段】 式： 【化１４】 〔式中、Ｒ₁ は、−Ｏ（ＣＨ₂)_n ＣＨ₃ （ｎ＝０〜１
９）であり、Ｒ₂ は、−ＯＺ（Ｚは、ホスフェート、ガ
ラクトシドなどである）で置換されたフェニルまたはナ
フチルである〕で示される１，２−ジオキセタン化合
物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、改良された化学発
光性の１，２−ジオキセタン化合物に関する。さらに詳
しくは、本発明は、酵素によって除去可能な不安定基を
有する、改良された、酵素によって開裂可能な化学発光
性１，２−ジオキセタン化合物に関する。そのような不
安定基は、適当な酵素を添加して不安定基を除くまで、
分子が分解して適当な器具によって検知しうる光を生じ
るのを防ぐ。

【０００２】１つの酵素分子は、触媒作用によってその
対応する不安定基を、酵素によって開裂可能な化学発光
性１，２−ジオキセタン分子から除去する。これは、対
応する不安定基を各ジオキセタン分子から除くのに化学
開裂剤１分子を必要とする化学的に開裂可能な化学発光
性１，２−ジオキセタンの場合とは、著しく対照的であ
る。例えば、３−（２′−スピロアダマンタン）−４−
メトキシ−４−（３″−ヒドロキシ）フェニル−１，２
−ジオキセタンのフェニル基上のヒドロキシ置換基から
１モルの水素イオンを開裂するのに、水酸化ナトリウム
が１モル必要であり、一方、１秒当たり１，０００〜
５，０００モルの３−（２′−スピロアダマンタン）−
４−メトキシ−４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニ
ル−１，２−ジオキセタン 二ナトリウム塩のホスホリ
ルオキシ基を開裂するのに、わずか１モルのアルカリホ
スファターゼ（ＡＰ）が必要なだけである；ジャブロン
スキー（Jablonski)の「伝染病の場合のＤＮＡプローブ
（ＤＮＡ Probes for Infectious Diseases)」（Boca R
aton, Fla. : CRC Press, 1989, p22)参照。

【０００３】酵素によって開裂可能な、光を生じる１，
２−ジオキセタン化合物は、通常、安定化基、例えばジ
オキセタン環の３−炭素原子にスピロ結合したアダマン
チリデン基を有し、これは、酵素によって開裂可能な不
安定基が、分子の残分に結合している結合を意図的に開
裂する前は、ジオキセタン化合物が室温（約２５℃）で
実質的に分解するのを妨げる手助けをしている。安定化
のためにスピロアダマンチル基を用いる考え方は、ウイ
ーリンガ（Wierynga）等の Tetrahedron Letters, 169
(1972)及びマキャプラ（McCapra)等の J. Chem. Comm.
Soc. Chem. Comm, 944 (1977) によって１，２−ジオキ
セタン化学に導入された。したがって、これらの安定化
基は、そのようなジオキセタンが実質的な分解を生じる
ことなく、約４ないし約３０℃もの温度で、使用前の許
容される長期間、例えば約１２カ月ないし約１２年間も
の間、の貯蔵を可能にする。

【０００４】本発明はさらに、ジオキセタン分子を、当
業界で知られている免疫学的アッセイ、化学的アッセイ
及び核酸プローブアッセイに用いることに関し、そして
様々な高分子、合成重合体、タンパク質、核酸、触媒性
抗体等の分子構造及び顕微鏡組織の研究にこれらを直接
的な化学的／物理的プローブとして用いて、アナライト
の存在、量又は構造を測定する化学又は生物物質の確認
又は定量を可能にすることに関する。

【０００５】

【従来の技術】近年、特にブロンスタイン（Bronstein)
の１９８６年７月２４日付け米国特許出願第８８９，８
２３号；ブロンスタイン等の１９８７年１２月３１日付
け米国特許出願第１４０，０３５号；エドワーズ（Edwa
rds)の特開平２−７２４号及びエドワーズ等の１９８８
年６月３０日付け米国特許出願第２１３，６７２号に記
載の、酵素によって開裂可能な化学発光性１，２−ジオ
キセタンが出現してから、化学発光性１，２−ジオキセ
タンはますます重要な化合物になってきた。

【０００６】酵素によって開裂可能な１，２−ジオキセ
タンとは著しく対照的に、これまでの公知の様々な化学
的に開裂しうる１，２−ジオキセタンは、何かの分析法
のリポーター分子としての用途があったとしても、それ
はほんの少しであり、バイオアッセイでは用いられてい
なかったのは確かである。その理由は、公知の化学的に
開裂しうる化合物は、大部分が水不溶性−水及び有機溶
媒にいくらか可溶性である特定のアセトキシ−置換１，
２−ジオキセタン以外−であり、したがって、抗体のよ
うな生物成分と結合できる基又は置換基をこれらに付加
することによって変性して、そのような化学的に結合し
た開裂可能な１，２−ジオキセタンを化学的に活性化し
た化学発光性標識として用いることができるようにしな
ければ、生物学的アッセイには有用ではないからであ
る。

【０００７】適当な酵素の存在下、発光を伴って分解す
る、酵素によって開裂可能な代表的な化学発光性１，２
−ジオキセタン−例えば、アダマンチルを付加した酵素
によって開裂可能な１，２−ジオキセタン、例えば３−
（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，
２′−トリシクロ〔３．３．１．１^3,7 〕デカン〕−４
−イル）フェニルホスフェート及びその塩（例えばナト
リウム塩）は、水溶性であるので、水性媒体中で行われ
る各種の分析法、特に生物学的アッセイにおけるリポー
ターとして用いるのに大変適している。これらの化合物
は以後、次のように略記する：アダマンチリデン−メト
キシフェノキシホスホリル化ジオキセタン（ＡＭＰＰ
Ｄ）、並びに３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオ
キセタン−３，２′−トリシクロ〔〔３．３．１．１
^3,7 〕デカン〕−４−イル）フェニルオキシ−３″−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド及びその塩（ＡＭＰＧＤ）。

【０００８】ＡＭＰＰＤは、水溶液中、及び／又は化学
発光促進剤、例えばポリ〔ビニルベンジル（ベンジルジ
メチルアンモニウムクロリド）〕（ＢＤＭＱ）及び他の
ヘテロ極性重合体〔ボイタ（Voyta)等の１９８８年６月
１日付け米国特許出願第２０３，２６３号参照〕のよう
な重合体の四級アンモニウム、ホスホニウム又はスルホ
ニウム塩の存在下で、一定の発光特性に達した最適時間
がより長いことが観察された（「ｔ_1/2 」は、一定の定
常状態の発光レベルにおける最高化学発光強度の１／２
に達するのに要する時間と定義する；この発光半減期
は、様々な環境におけるジオキセタンオキシアニオンの
安定性によって変わる）。

【０００９】統計学的には、定常状態の発光特性に達す
るのに、約７ｔ_1/2 の時間が必要である。ＢＤＭＱの存
在下、pH９．５の水溶液中、２×１０^-5M を越える濃度
のＡＭＰＰＤのｔ_1/2 は７．５分であることが分かっ
た。ＢＤＭＱの不存在下、４×１０^-3M では、ｔ_1/2 は
約３０〜６０分であり、一方、水溶液中、２×１０^-5M
で、ＡＭＰＰＤのｔ_1/2 は２．５分であることが分かっ
た。

【００１０】酵素によって開裂可能な化学発光性１，２
−ジオキセタンをリポーター分子として用いる急速生物
学的アッセイでは、アッセイにおけるエンドポイントを
検出するためにできるだけ速く定常状態の発光特性に達
するのが好ましい。また、化学発光強度は定常状態に達
する前に測定することができるが、定常状態の発光特性
の前に正確なデータを得ることを望むのならば、最新の
熱制御発光測定装置を使用しなければならない。

【００１１】さらに、ＢＤＭＱは、化学発光促進剤の存
在下及び不存在下の、緩衝剤を加えた水溶液中で、より
強い熱的な及び他のものによる非酵素活性化発光、すな
わちノイズ発光を示す。そのようなノイズは、アダマン
タノンの励起状態からの発光、及びＡＭＰＰＤ分子の芳
香族部分から誘導されたメチル ｍ−オキシベンゾエー
トアニオンの発光によるものである。ＡＭＰＰＤの測定
ノイズレベルは、標準ルミノメーターにおける暗流より
約２桁大きいので、このノイズは検出レベルを制限し、
したがって最終的な感度を表すことを妨げる。

【００１２】アルカリホスファターゼを用いたＡＭＰＰ
Ｄの酵素による開裂を行うと、アニオン性脱燐酸化ＡＭ
ＰＰＤ−アダマンチリデン−メトキシメチルフェノレー
トジオキセタン、すなわちＡＭＰ^- Ｄ−も生じる。この
フェノレートアニオンはまた、加水分解によって少量形
成されることもあり、バックグラウンド化学発光シグナ
ルを引き起こす。これは、組織化された分子集合体、例
えばミセル、リポソーム、層板状層、薄膜、脂質二重
層、リポソーム小胞、逆ミセル、ミクロエマルジョン、
ミクロゲル、ラテックス、膜又は重合体表面において、
及びＢＤＭＱのような化学発光促進剤によって生じた疎
水性環境において、強力な増強されたレベルの発光を生
じ、このため、高いバックグラウンドシグナルが生じ、
ＡＭＰＰＤの酵素による加水分解から生じるシグナルの
動的範囲をかなり低下させることになる。

【００１３】上記の観察に基づき、我々は以下のメカニ
ズムを仮定した。ＢＤＭＱのような促進重合体の存在下
では：

【００１４】

【化４】

【００１５】１）「ＣＬ」は化学発光を表す。 ２）ＡＭＰＰＤの緩衝剤を加えた水溶液には、脱燐酸化
及び加水分解を行った１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＨ
Ｄ）が少量含まれる。溶液のｐＨが十分に高い（約９．
５より上）と、脱燐酸化ジオキセタンはＡＭＰ^- Ｄとし
てアニオン状態で存在しうる。 ３）「ＣＬ₁ 」及び「ＣＬ₂ 」はバックグラウンド化学
発光を表す。 ４）「Ａ＊」は励起エネルギー状態のアダマンタノンを
表す。

【００１６】促進重合体の不存在下でも、ＡＭＰＰＤは
凝集体として水溶液中に存在する：

【００１７】

【化５】

【００１８】上記のメカニズムでは、ｎ＞＞＞ｍであ
る；ｎ及びｍは促進重合体の存在下又は不存在下及びＡ
ＭＰＰＤ濃度によって変わる。

【００１９】凝集体の形のアダマンタノン一重項の励起
状態（ｎ又はｍ＞１）は、凝集していないアダマンタノ
ンの励起エネルギー状態よりも、シグナルをより多く発
し、またここでは特に、ＢＤＭＱのような化学発光促進
剤を存在させることによって安定化しても、より多くの
光を放出する。これはおそらく、前者の一重項状態が後
者より低いため、項間交差の生じるのがより少ないか、
又は項間交差の速度がより遅いためであるか、あるいは
まだ知られていない他のファクターによるためであろ
う。ルミノメーターは、一般にこれらのエネルギーすな
わちこれらの波長に関係なく、放出される全ての光子を
検出するように設計されているので、４１５nm及び４７
７nmの化学発光は共にバックグラウンドノイズ発光とし
て検出される。同様に、写真又はＸ線フィルムを用いて
化学発光を記録するとき、異なる波長の発光間の識別は
容易に行うことができず、したがって検出感度はバック
グラウンドノイズによって制限される。

【００２０】最後に、上記の条件下で観察されるＡＭＰ
ＰＤの凝集は、ＡＭＰＰＤ又はそのフェノレートアニオ
ン及び以下のような分子：

【００２１】

【化６】

【００２２】の両親媒性の性質による。

【００２３】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、分析、特に酵素によって開裂可能な化学発光性
の１，２−ジオキセタンをレポーター分子として用いる
生物学的アッセイに要する時間を減少させることであ
る。

【００２４】また、本発明の目的は、アッセイ、特に生
物学的アッセイにおけるレポーター分子として用いたと
き、検定を完了するのに要する時間が少ない、新規で改
良された酵素によって開裂可能な化学発光性の１，２−
ジオキセタンを提供することである。

【００２５】別の本発明の目的は、酵素に基づいたアッ
セイ、特に生物学的アッセイの基質として用いる、新規
で改良された、酵素によって開裂可能な化学発光性の
１，２−ジオキセタンを提供することであり、この化合
物は、バックグラウンドに対して改良されたシグナルを
提供し、そしてしたがって、改良された検出レベルを提
供する。

【００２６】本発明のこれらのそして他の目的並びに性
質、範囲及び用途は、以下の記載及び請求の範囲から、
当業者には容易に明らかになるであろう。

【００２７】

【課題を解決するための手段】本発明は、水性媒体中、
例えば溶液に生物液を加えた試料中で、又は固体表面
上、例えばナイロン膜のような膜表面上で、酵素、又は
特定の結合対で変性した酵素と反応させて、光学的に検
出しうるエネルギーを放出することができる、新しい種
類の安定で、酵素によって開裂可能な化学発光性の３−
（置換アダマント−２′−イリデン）−１，２−ジオキ
セタン化合物を提供するものである。

【００２８】水性媒体中で、これらの変性アダマンチリ
デンジオキセタンを用いて分析を行うことができ、分析
ではこれらの化合物はリポーター分子として用いられ、
ＡＭＰＰＤを用いてこれまで行ってきた分析よりも速く
かつよりすぐれた感度で行うことができる。

【００２９】我々はいかなるメカニズム又は理論と結び
付けて、この予想外に優れた効果を説明することは望ま
ないが、アダマンチリデン部分上又はその中の上記種類
の置換基の存在が、ジオキセタン分子が効率的に働くの
を妨げ、したがってこれらがミセル状の又は他の凝集状
態の安定化した組織化集合体が形成されるのを妨げるの
かもしれない。これらの置換基のあるものはまた、水自
体を含めた水性環境中で、他の物質に水素結合し、これ
によってさらに凝集体が形成されるのを妨げている。ま
た、ｔ_1/2 がより短くなったり、バックグラウンドノイ
ズがより小さくなることから分かるように、電子的及び
双極子効果がこの現象に寄与している可能性もある。

【００３０】本発明の新規な化学発光性１，２−ジオキ
セタン化合物は一般式（Ｉ）：

【００３１】

【化７】

【００３２】〔式中、Ｒ₁ は、−Ｏ（ＣＨ₂)_n ＣＨ₃ で
あって、ｎは０〜１９の整数であり；Ｒ₂ は、次式：

【００３３】

【化８】

【００３４】（式中、Ｚは、ホスフェート、ガラクトシ
ド、アセテート、１−ホスホ−２，３−ジアシルグリセ
リド、１−チオ−Ｄ−グルコシド、アデノシントリホス
フェート、アデノシンジホスフェート、アデノシンモノ
ホスフェート、アデノシン、α−Ｄ−グルコシド、β−
Ｄ−グルコシド、α−Ｄ−マンノシド、β−Ｄ−マンノ
シド、β−Ｄ−フルクトフラノシド、β−Ｄ−グルコシ
ドウロネート、ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニ
ンエステル及びｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニ
ンアミドからなる群から選択される残基である）で示さ
れる〕で表すことができる。

【００３５】Ｒ₁ は特にメトキシ基であるのが好まし
い。Ｒ₂ は、光を放出するいくつかの発蛍光団形成蛍光
性発色基である。Ｒ₂ のフェニル基又はナフチル基の置
換基ＯＺの酵素によって除去可能な基Ｚは、好ましくは
ホスフェート基、特に一般式（III)：

【００３６】

【化９】

【００３７】（式中、Ｍ⁺ は例えばナトリウム又はカリ
ウムのようなアルカリ金属のような陽イオン、アンンモ
ニウム又はＣ₁ −Ｃ₇ アルキル、アラルキル又は芳香族
四級アンモニウム陽イオン、Ｎ（Ｒ₇)₄ ⁺（各Ｒ₇ はアル
キル、例えばメチル又はエチル、アラルキル、例えばベ
ンジルであるか、又は複素環式環系、例えばピリジニウ
ムを形成する）で表されるホスフェートエステル基であ
る。二ナトリウム塩が特に好ましい。そのようなホスフ
ェートエステル基は、アルカリホスファターゼのような
酵素を用いて開裂を行うと、酸素アニオンで置換された
基を生じ、つまりジオキセタンを不安定化し、その酸素
−酸素結合を切断して発光しうる。そのようなホスフェ
ートエステル基の四級アンモニウムカチオンはまた、そ
れらの四級基の１つによって重合体主鎖に、すなわち以
下の式（IV）：

【００３８】

【化１０】

【００３９】（式中、ｎは１より大きい）のように接続
することができるか、あるいは四級アンモニウム塩重合
体、すなわちイオネン重合体の一部にもなりうる。

【００４０】別の好ましい酵素によって除去可能な基
は、β−Ｄ−ガラクトシド基であり、これは、酵素β−
Ｄ−ガラクトシダーゼで開裂してジオキセタンフェノラ
ートの共役酸を生じ、加圧下で化学発光する。

【００４１】用い得る酵素によって開裂可能な置換基に
はまた、酵素によって開裂しうるアルカノイルオキシ
基、例えばアセテートエステル基、酵素によって開裂し
うるオキサカルボキシレート基、１−ホスホ−２，３−
ジアシルグリセリド基、１−チオーＤ−グルコシド基、
アデノシントリホスフェート類基、アデノシンジホスフ
ェート類基、アデノシンモノホスフェート類基、アデノ
シン類基、α−Ｄ−ガラクトシド基、β−Ｄ−ガラクト
シド基、α−Ｄ−グルコシド基、β−Ｄ−グルコシド
基、α−Ｄ−マンノシド基、β−Ｄ−マンノシド基、β
−Ｄ−フラクトフラノシド基、β−Ｄ−グルコシドウロ
ネート基、ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニンエ
ステル基又はｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニン
アミド基がある。Ｒ₁ は−Ｏ（ＣＨ₂)_n ＣＨ₃ （ｎ＝０
〜１９、好ましくはｎ＝０〜５）である。

【００４２】これらの３−（置換アダマント−２′−イ
リデン）１，２−ジオキセタンの全体にわたる合成は、
前記ブロンスタイン及びエドワーズの出願並びにエドワ
ーズ等の１９８９年９月６日付け米国特許出願第２７
９，１７６号に記載の方法によって実施することができ
る。したがって、例えばＲ₁ がメトキシ基、そしてＲ₂
がホスホリルオキシ基で置換されたフェニル基、好まし
くはメタ−ホスホリルオキシ塩で置換されたフェニル基
である１，２−ジオキセタンは、米国特許出願第２７
９，１７６号に記載の方法に従って、以下の図に示す反
応工程で合成することができる。

【００４３】

【化１１】

【００４４】以下に詳しく例示するように、必要なら
ば、ＨＣ（＝Ｏ）−φ−ＯＲ₉ 出発物質をオルトフォー
メート、例えばトリメチルオルトフォーメート、メタノ
ール及びｐ−トルエンスルホン酸と反応させて、中間
体：

【００４５】

【化１２】

【００４６】を得ることができる。この中間体を（Ｒ₈
Ｏ)₃Ｐ及びルイス酸と反応させると、ホスホネートエス
テル中間体：

【００４７】

【化１３】

【００４８】が得られる。

【００４９】上記の反応工程では、Ｒ₈ は低級アルキル
基、例えばメチル、エチル又はブチルである。Ｒ₉ は炭
素原子数２〜１４のアシル基、例えばアセチル、プロピ
オニル、メシトイル又はピバロイルであり、Ｑはハロゲ
ン、例えばクロロもしくはブロモ、又はＯＲ₈ であり、
そしてＭは個々にプロトン、金属陽イオン、例えばＮａ
⁺ もしくはＫ⁺ 、又はアンモニウム、置換アンモニウ
ム、四級アンモニウム又は（Ｈ⁺)ピリジニウム陽イオン
である。エドワーズの米国特許出願第２１３，１９７号
に記載のチオレート開裂は、Ｒ₉ が低級アルキル、低級
アルケニル又はアラルキル基、例えばメチル、アリル又
はベンジルである、上記反応工程５のＯＲ₉ の塩基開裂
の代わりに用いることができる。塩基又はチオレート開
裂の生成物は、Ｒ₉ の代わりに、水素又はアルカリ金属
陽イオン、例えばリチウム、ナトリウム又はカリウムを
有する。

【００５０】Ａｄ＝Ｏ で表される上記の中間体は公知の化合物である。

【００５１】メイジャーの学位論文、グロニンゲン大
学、ザ・ネザーランズ (1982) ；ニューマン等の J. Or
g. Chem., 43, 2232 (1978) ；及びフォークナー等の
J. Chem. Soc., Chem. Comm., 3906 (1971)には、前記
反応工程４及びその後の適当なホスホネート安定化カル
バニオンとの反応の出発物質としての４−メチレンアダ
マンタン−２−オンへ近づく方法が記載されている。エ
キソメチレン機能の代わりのエノールエーテルに対する
一重項酸素の反応性の差によって、３−（４−メトキシ
スピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２′−（４′−メ
チレン）トリシクロ〔３．３．１．１^3,7 〕−４−イ
ル）フェニル燐酸二ナトリウムが光酸素付加生成物とし
て確実に得られるようになる。

【００５２】選択的開裂が可能なピバロイルオキシアリ
ールエノールエーテルが、ホスフェートエステル基のよ
うな酵素によって除去可能な基を付加する直前のいずれ
かの反応で得られるならば、ヒドロキシアリールエノー
ルエーテルの分離を避けるのがより好都合である。これ
は、ピバロイルエステルをメタノール中にて１当量のナ
トリウムメトキシドで直接分離し、そしてナトリウムア
リールオキシド成分を反応終了時に全揮発成分を除去す
ることによって乾燥固体として分離することにより行う
ことができる。そのような場合、前記反応工程６はルイ
ス塩基を用いずに、ジメチルホルムアミドのような乾燥
極性非プロトン性溶媒中のこの予備形成塩を用いて行
い、無機塩副生成物は工程７又は工程８の処理時に除去
する。

【００５３】工程７の２−シアノエチルホスフェートジ
エステル生成物は、ベータ脱離して工程８のホスフェー
トモノエステルにする。工程８では、ジエステル誘導体
を、アンモニアのような揮発性アミンと又は“ＤＢＵ”
（１，８−ジアザビシクロ〔５．４．０〕ウンデセ−７
−エン）のような溶媒に可溶性の有機アミンと、メタノ
ールのようなアルコール溶媒中で反応させるのが好まし
い。過剰の塩基は真空中、反応終了時点で簡単に揮発さ
せるので、大気圧以上の圧力及び周囲温度でアンモニア
を用いるのが特に有利である。

【００５４】前記反応工程９のエノールエーテルホスフ
ェートの酸化は、前記のように、ハロゲン化溶媒、例え
ばクロロホルムのようなハロゲン化炭化水素中での一重
項酸素(¹Ｏ₂)との反応によって光化学的に行うことがで
きる。上記溶媒はまた補助溶媒、例えばメタノールのよ
うな低級アルカノールを含有していてもよい。一重項酸
素は、重合体が結合したローズベンガル（ポリサイエン
シーズ社）、メチレンブルー又は５，１０，１５，２０
−テトラフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィン（ＴＰ
Ｐ）のような光増感剤を用いて発生させることができ
る。

【００５５】あるいは、前記反応工程７で得られた粗２
−シアノエチルホスフェートジエステルを一重項酸素で
それらの１，２−ジオキセタンに酸化することもでき
る。三重項酸素の存在下でのトリエチルシリルヒドロト
リオキシド、ホスフェートオゾニド又はトリアリールア
ミンラジカル陽イオンが介在する、電子酸化を用いた方
法を含む、１，２−ジオキセタンの化学的製法も用いる
ことができる。

【００５６】上記のように本発明はまた、化学発光性で
あり、酵素によって開裂可能な置換１，２−ジオキセタ
ンを、試料中の酵素を検出するための分析を含めた当業
界で公知のアッセイに用いること、そのようなアッセイ
に用いるキット、及びそれらの使用方法及び手段に関す
る。

【００５７】例えば、本発明を試料中の酵素の検出に用
いるとき、試料を、検出する酵素によって開裂可能な基
を持つジオキセタンと接触させる。酵素は、ジオキセタ
ンの酵素によって開裂可能な基を開裂して、ジオキセタ
ンに結合した負に荷電した置換基（例えば、酸素アニオ
ン）を形成する。この負に荷電した置換基は次にジオキ
セタンを不安定化し、ジオキセタンを分解して、光エネ
ルギーを放出する蛍光発色団基を形成する。酵素の存在
を示すものとして検出されるのは、この発色団基であ
る。発光強度を測定することによって、試料中の酵素の
濃度を測定することもできる。

【００５８】可視的に検出ししうる手段を用いて、試料
中の特定の物質の存在又は濃度を測定する、上記とは異
なる様々な分析法がある。上記のジオキセタンはこれら
のどの分析法にも用いることができる。そのような分析
法の例には、抗体又は抗原、例えばδ−又はβ−ｈＣＧ
を検出する、免疫学的アッセイ；酵素アッセイ；例えば
カリウム又はナトリウムイオンを検出する化学アッセ
イ；例えばウイルス（例えば、ＨＴＬＶIII もしくはサ
イトメガロウイルス）、又はバクテリア（例えば、Ｅ．
ｃｏｌｉ）及び特定の細胞機能（例えば、受容体結合部
位）を検出する核酸アッセイ等がある。

【００５９】検出物質が抗体、抗原又は核酸であると
き、ジオキセタンの酵素によって開裂可能な基を開裂し
うる酵素を、検出物質に対して特異的な親和性を有する
物質（すなわち、検出物質に特異的に結合する物質）、
例えば抗原、抗体又は核酸プローブに結合させるのが好
ましい。一般的な方法、例えばカルボジイミドカップリ
ングでは、酵素を特異的に親和性の物質に結合させて用
いる；好ましくはアミド結合を通して結合する。

【００６０】一般に、分析は次のようにして行う。検出
物質を含むと思われる試料を、検出物質に対して特定的
な親和性を有する物質に結合した酵素を含有する緩衝剤
を加えた溶液と接触させる。得られた溶液をインキュベ
ートして、検出物質を特異的な親和性を有する酵素化合
物の特異的な親和性部分に結合させる。次に、過剰な、
特異的親和性を有する酵素化合物を洗い去り、特異的親
和性を有する酵素化合物の酵素部分によって開裂可能な
基を有するジオキセタンを加える。酵素は、酵素によっ
て開裂可能な基を開裂して、ジオキセタンを２つのカル
ボニル化合物（例えば、エステル、ケトン又はアルデヒ
ド）に分解する。酵素によって開裂可能な基が結合した
発色団はこれによって励起し、発光する。発光は（例え
ばキュベット、又はカメラルミノメーターの感光性フィ
ルム、又は光電池又は光電子増倍管を用いて）、試料中
の検出物質の存在を示すものとして検出する。発光強度
を測定して、物質の濃度を決定する。

【００６１】具体的な分析例は以下の通りである。

【００６２】Ａ．ヒトＩｇＧのアッセイ ９６穴マイクロタイタープレートにヒツジの抗ヒトＩｇ
Ｇ（Ｆ（ａｂ）特異フラグメント）を塗布する。次に、
ヒトＩｇＧを含む血清試料を穴に加え、室温で１時間イ
ンキュベートする。インキュベーション期間の後、血清
試料を穴から取り出し、穴を、０．１５M−ＮａＣｌ、
０．０１M 燐酸塩及び０．１％ウシ血清アルブミンを含
有する水性バッファー溶液（pH７．４）で４回洗浄す
る。抗ヒトＩｇＧに結合したアルカリホスファターゼを
各穴に加え、１時間インキュベートする。次に、穴を上
記緩衝液で４回洗浄し、本発明のホスフェート含有ジオ
キセタンの緩衝液を加える。ジオキセタンの酵素による
分解によって得られる発光を、ルミノメーター、又はカ
メラルミノメーターの写真フィルムを用いて検出する。

【００６３】Ｂ．ｈＣＧのアッセイ ウサギの抗−α−ｈＣＧをナイロン−メッシュ膜上に吸
収させる。ｈＣＧを含む試料溶液、例えば妊娠した婦人
の尿、を膜を通して吸い取り、その後、膜を０．１５M
−ＮａＣｌ、０．０１M 燐酸塩及び０．１％ウシ血清ア
ルブミンを含有する緩衝液１ml（pH；７．４）で洗浄す
る。アルカリホスファターゼ標識抗ｐ−ｈＣＧを膜に加
え、膜を再び上記緩衝液２mlで洗浄する。次に、膜をル
ミノメーターのキュベット又はカメラルミノメーターに
入れ、本発明のホスフェート含有ジオキセタンと接触さ
せる。次に、ジオキセタンの酵素による分解から生ずる
発光を検出する。

【００６４】Ｃ．血清アルカリホスファターゼのアッセ
イ ０．８M の２−メチル−２−アミノプロパノールを含有
する水性緩衝液２．７mlを１２×７５mmのパイレックス
試験管に入れ、アルカリホスファターゼを含有する血清
試料０．１mlを加える。次に、溶液を３０℃の平衡状態
にする。本発明のホスフェート含有ジオキセタン０．２
mlを加え、試験管を直ちにルミノメーターに入れて、生
じる発光を記録する。発光レベルはアルカリホスファタ
ーゼ活性率に比例する。

【００６５】Ｄ．核酸ハイブリダイゼーションアッセイ サイトメガロウイルスを含むと思われる脳脊髄液（ＣＳ
Ｆ）試料を集め、ナイロン又はニトロセルロース膜のよ
うな膜の上に置く。次に、試料を尿素又はグアニジニウ
ムイソチオシアネートで化学処理して、細胞壁を破り、
ウイルスＤＮＡ以外の全ての細胞成分を分解する。この
ようにして得たウイルスＤＮＡのストランドを分離し、
ニトロセルロースフィルターに結合させる。ウイルスＤ
ＮＡに対して特異的なそしてアルカリホスファターゼで
標識したＤＮＡプローブをフィルターに供給し；プロー
ブを相補的ウイルスＤＮＡストランドでハイブリダイズ
する。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを０．
２M −ＮａＣｌ及び０．１mMトリス−ＨＣｌを含有する
水性緩衝液（pH＝８．１０）で洗浄して、過剰のプロー
ブ分子を除く。本発明のホスフェート含有ジオキセタン
を加え、ジオキセタンの酵素による分解から生じる発光
をルミノメーターで測定するか、又は写真フィルムで検
出する。

【００６６】Ｅ．ガラクトシダーゼのアッセイ 上記のアッセイ及び以下の実施例において、α−又はβ
−ガラクトシダーゼによって開裂可能なα−Ｄ−又はβ
−Ｄ−ガラクトシド（ガラクトピラノシド）基をそれぞ
れ含有するジオキセタンを加えてもよく、発色団からの
糖部分の酵素による開裂から生じる発光をルミノメータ
ーで測定するか、又は写真フィルムで検出する。

【００６７】Ｆ．電気泳動 電気泳動は、電界中におけるゲル支持体上のタンパク質
と核酸の複合体混合物をそれらの分子の大きさ及び構造
に従って分離するものである。この方法はまた、タンパ
ク質の加水分解後のタンパク質フラグメントの、あるい
は制限エンドヌクレアーゼによる切断後の核酸フラグメ
ントの分離（ＤＮＡ配列決定におけるような）にも用い
られる。ゲル中の成分の電気泳動分解の後、又は分離成
分のゲルから膜への移動の後、結合をリガンドに結合し
た酵素で調べる。例えば、ペプチドフラグメントは、ア
ルカリホスファターゼに共有結合した抗体で調べる。別
の例の場合、ＤＮＡ配列決定において、アルカリホスフ
ァターゼ／アビジンをビオチニル化ヌクレオチド塩基に
結合する。その後、本発明のＡＭＰＰＤ類似物をゲル又
は膜フィルターに加える。短時間インキュベートした
後、ジオキセタンが酵素によって活性化されて発光成分
が形成された結果、発光が生じる。発光をＸ線又はイン
スタント写真フィルムで検出するか、又はルミノメータ
ーで調べる。同時に２つ以上のフラグメントを調べる多
重アッセイを用いると、さらに改良される。

【００６８】Ｇ．固体状態のアッセイ 固体状態のアッセイでは、非特異的結合部位を、ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）又はゼラチンのような非特異的
タンパク質で予備処理することによって、マトリックス
への非特異的結合をブロックすることが好ましい。ＢＳ
Ａの市販製剤には、ＡＭＰＰＤから好ましくないバック
グラウンド化学発光を生じるホスファターゼ活性を示す
少量の物質を含むものがあることを見い出した。しかし
ながら、特定の水溶性合成高分子物質がジオキセタンを
用いる固体状態のアッセイにおける非特異的結合の十分
なブロッカーであることも見い出した。そのような物質
の中で好ましいのは、水溶性重合体四級アンモニウム
塩、例えばＢＤＭＱ、ポリ〔ビニルベンジル（トリメチ
ルアンモニウムクロリド）〕（ＴＭＱ）及びポリ〔ビニ
ルベンジル（トリブチルアンモニウムクロリド）〕（Ｔ
ＢＱ）である。

【００６９】Ｈ．ヌクレオチダーゼのアッセイ 酵素ＡＴＰアーゼのアッセイを２工程で行う。第１工程
では、酵素を最適なｐＨ（一般にpH７．４）で、末端ホ
スホエステル結合を経て発色団が置換した１，２−ジオ
キセタンに共有結合したＡＴＰよりなる物質と反応させ
て、ホスホリル−発色団置換１，２−ジオキセタンを得
る。第２工程では、第１工程の生成物に酸を加えてpHを
６未満、好ましくは２〜４にすることによって分解し、
生じる光をルミノメーターで測定するか、又はクロマト
グラフフィルムで検出する。同様な２工程法で、ＡＤＰ
アーゼのアッセイを、基質として本発明の発色団で置換
された１，２−ジオキセタンのＡＤＰ誘導体を用いて行
い、そして５′−ヌクレオチダーゼのアッセイを、基質
として本発明の発色団で置換された１，２−ジオキセタ
ンのアデニル酸誘導体を用いて行う。第２工程はまた、
酵素アルカリホスファターゼを加えて、ホスホリル−発
色団で置換された１，２−ジオキセタンを分解すること
によって行うことができる。

【００７０】Ｉ．核酸配列決定 配列決定法で製造したＤＮＡ又はＲＮＡフラグメント
は、本発明の化学発光性１，２−ジオキセタンを用いて
電気泳動分離を行った後、検出することができる。ＤＮ
Ａ配列決定はジデオキシ連鎖停止反応〔サンガー，Ｆ．
等, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 74: 5463 (1977)〕
によって行うことができる。簡単に言えば、４つの配列
決定反応のそれぞれの場合、一重鎖鋳型ＤＮＡをジデオ
キシヌクレオチド及びビオチニル化プライマーストラン
ドＤＮＡと混合する。アニールの後、クレノウ酵素及び
デオキシアデノシントリホスフェートを４つの配列決定
反応混合物それぞれとインキュベートし、追跡デオキシ
ヌクレオチドトリホスフェートを加え、インキュベート
を続ける。その後、反応混合物中のＤＮＡフラグメント
を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分
離する。フラグメントを膜、好ましくはナイロン膜に移
し、そして好ましくは短波長のＵＶ光を照射することに
よってフラグメントを膜に架橋させる。

【００７１】非特異的結合部位を重合体、例えばヘパリ
ン、カゼイン又は血清アルブミンでブロックした後、膜
上のＤＮＡフラグメントを、用いる本発明の個々の１，
２−ジオキセタン基質の酵素によって開裂可能な基に特
異的な酵素に共有結合した、アビジン又はストレプトア
ビジンと接触させる。アビジン又はストレプトアビジン
はビオチンに貪欲に結合するので、ビオチニル化された
ＤＮＡフラグメントは酵素で標識される。アビジン又は
ストレプトアビジンはホスファターゼ又はガラクトシダ
ーゼなどと結合する。ＤＮＡフラグメント−ビオチン−
アビジン（又はストレプトアビジン）−酵素の複合体を
適当な１，２−ジオキセタンと、アルカリ性のｐＨ値、
例えば約pH８．５で接触させることによって発光させた
後、ＤＮＡフラグメントを感光性フィルム、例えばＸ線
又はインスタントフィルム上に、あるいは光電ルミノメ
ーター装置で可視化する。

【００７２】上に略記した検出法は、チャーチ等〔チャ
ーチ，Ｇ．Ｍ．等, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 81:
1991 (1984)〕のゲノムＤＮＡ配列決定法に適用するこ
ともできる。化学的に開裂し、電気泳動で分離したＤＮ
Ａ〔マキサム，Ａ．Ｍ．等,Proc. Nat. Acad. Sci. (US
A), 74: 560 (1977) 〕を膜、好ましくはナイロン膜に
移し、ラダーをＵＶ光で膜に架橋した後、特異的ＤＮＡ
配列は、ハイブリダイゼーションプローブとしてのビオ
チニル化オリゴヌクレオチド；本発明の酵素によって開
裂可能な化学発光性１，２−ジオキセタンに対して特異
的な酵素に共有結合したアビジン又はストレプトアビジ
ン；及び適当な１，２−ジオキセタンを順次加えること
によって検出する。（ＰＡＧＥによって製造された）配
列ラダーのイメージは上記のようにして得られる。

【００７３】配列ラダーの連続的リプロービング（repr
obing)は、まず、膜を洗浄剤の加熱溶液、例えば約０．
５〜約５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を約８０
〜約９０℃の水に加えたもの、と接触させることによっ
て膜からハイブリダイゼーションプローブ及び化学発光
性物質をまずストリップし、約５０〜約７０℃に冷却
し、裸のＤＮＡフラグメントを別のビオチニル化オリゴ
ヌクレオチドプローブでハイブリダイゼーションして、
異なる配列を得、次に上記のようなイメージ化学発光を
生じさせることによって行うことができる。

【００７４】同様な検出法を、ＲＮＡ配列決定法によっ
て生じるＲＮＡフラグメントに適用することができる。

【００７５】当業者が本発明をさらに詳しく理解できる
ように、以下に実施例を示す。これらの実施例は説明の
ために示したにすぎない。ＴＬＣ溶媒混合物が容量／容
量である以外は、部及びパーセントの全ては断りがなけ
れば重量／容量である。

【００７６】実施例Ｉ ２００ｇ（１．６４mol)の３−ヒドロキシベンズアルデ
ヒド及び２７０ml（１．９３mol)のトリエチルアミン
を、氷浴中の、塩化メチレン１リッターを含有するフラ
スコに入れた。得られた褐色の溶液を機械撹拌し、２１
２ml（１．７２mol)の塩化トリメチルアセチルを１５分
間にわたって滴下漏斗から細流状に加えた。得られたス
ラリーをさらに１５分間撹拌し、氷浴を除き、反応をさ
らに２時間進めた。ＴＬＣ（Ｋ５Ｆ；２５％アセトン−
ヘキサン）から、出発物質及び単一の高Ｒ_f 生成物は存
在しないことが分かった。反応混合物を分離漏斗に移
し、２５０mlの１M 塩酸と混合した。次に、有機相を水
（２×４００ml）で抽出し、最後に硫酸ナトリウムで乾
燥した。乾燥溶液をシリカゲルプラグに通し、回転蒸発
させ、次いで真空下（１．０mmHg）でポンプしたとこ
ろ、３４８ｇの緑色がかった褐色の油：３−ピバロイル
オキシベンズアルデヒドが得られた。これをアルゴン雰
囲気下に置いた。

【００７７】実施例II ２５mlのメタノールに溶解したｐ−トルエンスルホン酸
４００mgを撹拌しながら、実施例Ｉの３−ピバロイルオ
キシベンズアルデヒドに加えた。次に、トリメチルオル
トフォーメート（２２４ml；２．０５モル）を滴下し
た。発熱が少しあるがそのまま進め、混合物を１時間撹
拌した。１／２ｇの炭酸水素ナトリウムを加え、フラス
コを回転蒸発器（浴温４０℃）に入れて、揮発性成分を
全て除いた。得られた油を窒素圧の下で短いシリカゲル
カラムに通して、オレンジ−褐色油を得、これを撹拌し
ながら真空下（１．０mmHg）で吸引したところ４２６ｇ
の粗３−ピバロイルオキシベンズアルデヒドジメチルア
セタールが得られた。赤外アッセイではアルデヒドカル
ボニルの吸収（１，６９５cm^-1）は見られなかった。

【００７８】実施例III 実施例IIの粗３−ピバロイルオキシベンズアルデヒドジ
メチルアセタールを、３リッターのフラスコ中で、アル
ゴン雰囲気下、Ｐ₂ Ｏ₅ から新しく蒸留した１リッター
の塩化メチレンに溶解した。次に、３４７ml（２．０３
mol)のトリエチルホスファイトを全部一度に加えた。フ
ラスコに濾体入り口アダプターを取り付け、少しのアル
ゴン圧の下でドライアイス／アセトン浴中で冷却した。
三フッ化ホウ素エーテル錯化合物（２４９ml；２．０３
mol)を、激しく撹拌しながら、注射器で数回に分けて加
えた。得られた反応混合物を−５５℃で２時間撹拌し、
次いで−２０℃にて一晩フリーザーに貯蔵した。次に、
フラスコを室温に温め、その内容物を４時間撹拌した。
このオレンジ−褐色溶液を、８００mlの水に１７０ｇの
炭酸水素ナトリウムを含む激しく撹拌したスラリーに、
激しく泡立つことがないような速度で、注意深く注い
だ。２相混合物を１時間激しく撹拌した後、分液漏斗で
層を分離し、水性層を再び塩化メチレン（２×２５０m
l）で抽出した。合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウム
で乾燥し、濃縮し、真空蒸留して、５３５ｇのジエチル
１−メトキシ−１−（３−ピバロイルオキシフェニル）
メタンホスフェートを透明で淡黄色の油（０．２５mmHg
で沸点１５８〜１６１℃）を得た。これは実施例Ｉ−II
I の全工程に対して９１％の収率であった。¹ H NMR(400MHz; CDCl₃):δ 1.21 及び1.25(6H,２つのt,
7Hz, OCH₂CH ₃); 3.37(3H, s, ArCHOCH ₃); 3.80(3H, s,
ArOCH ₃); 3.9-4.10(4H, m, OCH ₂CH₃); 4.46(1H, d, 1
5.6Hz, ArCHPO); 6.85(1H, m); 7.00(2H, m); 7.26(1H,
m)。IR （ニート）: 2974, 1596, 1582, 1480, 1255(P=O), 1
098, 1050, 1020, 965cm^-1。

【００７９】実施例IV さらに以下に挙げた促進重合体の存在下で、本発明の化
合物によって得られる化学発光が（ＡＭＰＰＤからの発
光と比べて）増加することを、下記の方法で証明した。
１mM塩化マグネシウム、０．０２％アジ化ナトリウム及
び０．１％の促進剤重合体を含有する０．１M ジエタノ
ールアミン（pH１０．０、基質用バッファー）中に、比
較する４種の１，２−ジオキセタンのうちの１種の０．
４mM水溶液４５０μl をそれぞれ含む３本の管を４組準
備し、各管からのバックグラウンドシグナルを、ベルソ
ールドＬＢ ９５２Ｔルミノメーター（ベルソールド・
インスツルメンツ；ドイツ連邦共和国、ワイルドバッ
ド）を用いて測定した。１mM塩化マグネシウム、０．０
２％アジ化ナトリウムを含有する０．１M ジエタノール
アミン（pH１０．０）に２．８３×１０^-12Mのアルカリ
ホスファターゼを含む水溶液５０μl(最終酵素濃度２．
８３×１０^-13M) を各管に加え、化学発光シグナルを５
及び２０分においてルミノメーターで測定した。

【００８０】用いた促進重合体は下記の通りである： 記号 促進重合体 SAPPHIRE BDMQ TMQ ポリ〔ビニルベンジル（トリメチルアンモニウムクロリド）〕 S/TMQ スチレン／TMQ 共重合体 DAA/TMQ ジアセトンアクリルアミド／TMQ 共重合体 DMQ/TEQ ポリ〔ビニルベンジル（ドデシルジメチルアンモニウムクロリ ド）〕／TEQ 共重合体 TEQ ポリ〔ビニルベンジル（トリエチルアンモニウムクロリド）〕 TBQ ポリ〔ビニルベンジル（トリブチルアンモニウムクロリド）〕 MPB ポリ〔ビニルベンジル（Ｎ−メチルピペリジニウムクロリド） 〕 BAEDM ポリ〔ビニルベンジル（（２−ベンゾイルアミノエチル）ジメ チルアンモニウムクロリド）〕 BZ ベンザル媒染剤 DMEB ポリ〔ビニルベンジル（ジメチルエチルアンモニウムクロリド ）〕 DME(OH)B ポリ〔ビニルベンジル（ジメチル（２−ヒドロキシエチル）ア ンモニウムクロリド）〕 EMERALD サファイア及びフルオレセイン TBQ/FLUOR TBQ 及びフルオレセイン

【００８１】以上、主に本発明の好ましい具体例及び実
施例について述べた。当業者であれば、請求の範囲に記
載の本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発
明を変更することは容易に行うことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/533 Ｇ０１Ｎ 33/533 (72)発明者 エドワーズ，ブルックス アメリカ合衆国マサチューセッツ州02138, ケンブリッジ，ヒューロン・アベニュー 269 (72)発明者 ジュオ，ロー−ロン アメリカ合衆国マサチューセッツ州02134, オーストン，ホルマン・ストリート 28

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（Ｉ）： 【化１】 〔式中、Ｒ₁ は、−Ｏ（ＣＨ₂)_n ＣＨ₃ であって、ｎは
   ０〜１９の整数であり；Ｒ₂ は、次式： 【化２】 （式中、Ｚは、ホスフェート、ガラクトシド、アセテー
   ト、１−ホスホ−２，３−ジアシルグリセリド、１−チ
   オ−Ｄ−グルコシド、アデノシントリホスフェート、ア
   デノシンジホスフェート、アデノシンモノホスフェー
   ト、アデノシン、α−Ｄ−グルコシド、β−Ｄ−グルコ
   シド、α−Ｄ−マンノシド、β−Ｄ−マンノシド、β−
   Ｄ−フルクトフラノシド、β−Ｄ−グルコシドウロネー
   ト、ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニンエステル
   及びｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニンアミドか
   らなる群から選択される残基である）で示される〕で表
   される、酵素によって開裂可能な不安定な置換基が分子
   に結合しており、該結合を意図的に開裂する前は室温で
   実質的に安定で、分解時に光エネルギーを生じうる、酵
   素によって開裂可能な化学発光性１，２−ジオキセタン
   化合物。
2. 【請求項２】 Ｒ₁ がメトキシ基であり、Ｒ₂ が 【化３】 （Ｍはアルカリ金属又はアンモニウム基を表す）である
   請求項１記載の１，２−ジオキセタン化合物。