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JPH1052185A - 細胞原形質雄性不稔性Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ（キャベツ）及びそのような植物の生産法 - Google Patents

細胞原形質雄性不稔性Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ（キャベツ）及びそのような植物の生産法

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Publication number
JPH1052185A
JPH1052185A JP9142420A JP14242097A JPH1052185A JP H1052185 A JPH1052185 A JP H1052185A JP 9142420 A JP9142420 A JP 9142420A JP 14242097 A JP14242097 A JP 14242097A JP H1052185 A JPH1052185 A JP H1052185A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
oleracea
var
convar
alef
cabbage
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP9142420A
Other languages
English (en)
Inventor
Pieter Barten
バルテン ピーター
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bejo Zaden BV
Original Assignee
Bejo Zaden BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=19762946&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JPH1052185(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bejo Zaden BV filed Critical Bejo Zaden BV
Publication of JPH1052185A publication Critical patent/JPH1052185A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/14—Plant cells

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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 細胞性不捻性雄性ブラシ力を獲得し、オグラ
CMS原形質に代わるものを与える。 【解決手段】プロトプラスト融合により、その細胞原形
質に、少なくともその一部がB. napus由来の DNA を含
み、かつ、細胞原形質雄性不稔性 (CMS) （すなわち、
B. oleracea の細胞原形質雄性不稔性を誘発する）（の
性質）に結合したミトコンドリアを供給され、かつ、そ
の細胞中に、この植物にとって正常な種特異的な核ゲノ
ムを供給されている B. oleracea。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、その主要請求項に
よれば、細胞原形質雄性不稔性 Brassica oleracea（キ
ャベツ）、すなわち、そのような植物の新たな系統の開
発に関する。本発明はさらに、前記雄性不稔性植物の獲
得法と同時に、この新しい系統から得られた種子を交雑
する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】Brassica（ブラシカ、キャベツ）は、食
用野菜として数世紀にわたって栽培されており、一方、
その種子組成物は、各種食品（野菜油、からし等）の生
地として用いられている。
【０００３】1970年以来、各種ブラシカ野菜は、雑種種
子として販売されている。このような種子は、雑種ブラ
シカを稔らせる。この雑種ブラシカは、２つの高度の純
系系統の交差交配品であるので、両者の遺伝的性質を併
せ持っている。もしもいずれかの系統が、または両系統
が、（部分的にも）自家受粉を行なうのであれば、この
ブラシカ交配品を純系に保つためには、自家受粉を防止
する対策を講じなければならない。抗自家受粉法の一つ
として、両系統の一方に、いわゆる自己非適合性を導入
する方法がある。このようにすると、受精花粉が花粉生
産性ブラシカ種そのものの雌ずいを含め、特定植物の雌
ずい内で成長するのが防止される。ただし、この方法の
欠点は、場合によって、自家受粉の起こることがあるこ
とである。その結果、種子収量において、株内受精が高
頻度を占める。両系統のいずれか一方の自家受粉を防止
するもう一つの方法として、細胞原形質雄性不稔性 (Cy
toplasmic male sterility；以下、"CMS"とする)を利用
するやり方がある。大根 (Raphanus sativus) では、雄
性不稔性を誘発する原形質が見出されている。この原形
質は、Ogura （オグラ）CMS 原形質という名で知られて
いる。原形質融合法により、オグラ CMS原形質のミトコ
ンドリアをブラシカ内部に誘導する。この際、核、正常
稔性ブラシカからもたらされる。このようにして、CMS
ブラシカが得られる。オグラ CMS原形質の葉緑体は、こ
の原形質をもつ植物の低温感受性にあずかる DNAを含む
が、融合によってこの葉緑体は取り除かれる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、前述
したような従来技術の欠点を克服した細胞不稔性雄性ブ
ラシカを獲得し、それによって、オグラ CMS原形質に代
わるものを与えることである。この目的を実現するため
に、本植物の細胞原形質には、プロトプラスト融合によ
って、少なくともその一部がブラシカ由来の DNAを含
み、かつ、細胞原形質雄性不稔性（の特性）に結合され
た、言い換えると、ブラシカの細胞原形質性雄性不稔性
を実行するミトコンドリアが供給される。広範な研究に
よって、B. napus (白菜）は通常稔性であるにも拘わら
ず、B. napus由来の適正なトコンドリア DNAを用いる
と、プロトプラスト融合によって、B. oleracea に原形
質性雄性不稔性を効率よく誘発できるという驚くべき事
実が見出され。前述のプロトプラスト融合は、B. napus
（供与体）由来の葉のプロトプラトを一方に、B. olera
cea （受容体）由来の胚軸プロトプラストを他方として
実行するのが好ましい。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明による好ましい実
施態様では、B. oleracea の細胞原形質にはさらに、本
植物に通有な種特異的核ゲノムが供給される。これによ
って、B.oleraceaは100 ％純粋な産物となる。
【０００６】本発明によるさらに別の実施態様では、細
胞はB. napusの種特異的ミトコンドリアを含む。
【０００７】本発明によるさらに別の実施態様では、細
胞体ハイブリダイゼーションにより種特異的ミトコンド
リアが導入される。細胞融合においては、細胞原形質を
受け入れる植物の核内にコードされた遺伝子組成は不変
である（全体が不変であることが好ましい）。したがっ
て、戻し交雑法は不要である。なぜなら、所期の組成を
持った細胞原形質が、一回の操作で獲得されるからであ
る。実際、プロトプラスト融合の後で得られる B. oler
aceaは、しばしば４倍体、または異数倍体であることが
判明した。したがって、C を半数体ゲノムとすると、倍
数レベルは、10×Ｃ以上に増加することがある。非二倍
体ゲノムを持つ植物は成長が通常と異なり、また、雌性
不稔性のみならず、雄性不稔性が見られるという特徴を
持つ。融合によって得られた一群の B. oleraceaの中か
ら、サイトフロメトリーを用いて、非純系二倍体植物を
すべて除去する。この融合後、二倍体植物の分子分析を
行なう。この分析によって、どの植物が、CMS と遺伝的
にきわめて緊密な関係を持つミトコンドリア DNA（また
はその断片）を含むかを求めた。
【０００８】本発明によるさらに別の実施態様において
は、B. oleracea は次のものから成るグループから選ん
だ。すなわち、カリフラワー (B. oleracea L. convar.
botrytis (L.) Alef. var. borytis L.) ，ブロッコリ
ー (B. oleracea L. convar.botrytis (L.) Alef. var.
cymosa Duch.) ，ロマネスコ (B. oleracea L. conva
r. botrytis (L.) Alef. var. botrytis L.)，ブラッセ
ル・スプラウト (B. oleracea L. convar.oleracea va
r. gemnifera DC.) ，ホワイト・キャベツ (B.oleracea
L. convar. capitata (L.) Alef. var. alba DC.) ，
オックスハート(B. oleracea L. convar. capitata
(L.) Alef. var. alba DC.) ，赤キャベツ(B. oleracea
L. convar. capitata (L.) Alef. var. rubra DC.)，
ちりめんキャベツ (B. oleracea L. convar. capitata
(L.) Alef. var. sabauda L.)，かぶらキャベツ (B. ol
eracea L. convar. acephala (DC.) Alef. var. gongyl
oides) ，花キャベツ (B. oleracea L. convar. acepha
la (DC.) Alef. var. sabellica L.) 、及びポルトガ
ル・キャベツ (B. oleracea var. tronchuda syn. cost
ata)である。
【０００９】本発明はまた、本発明による種子または植
物部分に関する。
【００１０】本発明はまた、B. oleracea 植物の一個の
細胞であって、その細胞質に、プロトプラスト融合によ
って、少なくともその一部がB. napus植物由来の DNAを
含み、かつ、細胞原形質雄性不稔性 (CMS ）（という性
質）を備えた（すなわち、B.oleracea の細胞原形質雄
性不稔性を誘発する）ミトコンドリアが供給されている
細胞に関する。その交雑細胞は、細胞原形質雄性不稔性
(CMS ）のキャリヤーであるミトコンドリア DNAを含
む。
【００１１】本発明はさらに、B. oleracea 植物の生産
法に関する。すなわち、その方法は、プロトプラスト融
合によって、B. oleracea の細胞質に、少なくとも一部
が B. napus 由来の DNAを含み、かつ、細胞原形質雄性
不稔性 (CMS ）（という性質）を備えた（すなわち、B.
oleracea の細胞原形質雄性不稔性を誘発する）ミトコ
ンドリアを供給する工程を含む。
【００１２】B. napus (供与体）と B. oleracea (受容
体）両者の種子を消毒し、MS30培地などの上で発芽させ
る。供与体の場合、この培養を照明下で行ない、芽を摘
み取りながら、新鮮培地に交換しながら育成する。受容
体の種子は暗黒野において発芽させ、このようにして得
られたうらなり矮生からの胚軸を用いる。プロトプラス
トは原形質溶解前処理後、葉、及び／又は胚軸材料を、
ペクチネースやセルレースのような細胞壁消化酵素で処
理して分離する。この処理は原形質溶解液の中で行な
う。濾過及び遠心後、供与体から得たプロトプラストに
ガンマ線を照射する。受容体のプロトプラストはIOA で
処理し、その後、両プロトプラスト・グループを融合さ
せる。融合中PEG 剤を用い、凝集を促進する。融合中に
ｐＨを高く維持することは必須である。融合中融合過程
を妨げないよう、プロトプラストを静置する。融合後、
PEG 液を洗い流し、再生培地と交換する。プロトプラス
トの再生は、この培地の中で行なわれる。この際、蔗糖
のような糖、2,4-D, BA, NAAなどのホルモンの存在が決
定的重要性を持つ。再生中、再生培地の浸透圧値は、低
濃度の蔗糖を含む培養液を個々に加えて段階的に下げ
る。発芽した微少カルスを固相の再生培地に移す。2 週
間に 1度、前記カルスを新鮮な再生培地に移す。新たに
成長した芽を根育成培地に置く。この培地では、IAA の
ような植物ホルモンによって根の発達が強化される。葉
標本を採取して、フローサイトメトリーにより再生植物
の倍数体レベルを調べ、かつ、核の相対的 DNA含有量を
定量する。純粋な 2倍体ゲノムを含む植物は保存し、他
の植物は破棄する。残った植物についてさらに、分子法
を用いて分析する。葉標本から分離した DNAと、ミトコ
ンドリア DNAに対して特異的なプローブとを用いて、そ
れらの植物の中に目的のミトコンドリアが存在するかど
うかを調べる。受容体由来の細胞質を含む植物（紛れ込
みと考えられる）は、破棄する。残余の植物について交
差交配を行なって子孫を生ませ、温室や野外で使用でき
るかどうかについて調べた。この際、不稔性、種子形成
及び品質について特別配慮した。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明を、下記の各実施例に基づ
いて詳細に説明する。これらの実施例はすべて本発明に
よる好ましい実施態様である。
【００１４】＜実施例 1：種子の表面滅菌＞キャベツ
(B. oleracea)の種子を濾紙の中に折り重ね、70% エタ
ノール／30%水を含む混合液に 10 秒間浸し、その後55
℃の滅菌液に 5分浸す。この処置の後、さらに、0.3%
(w/v) NaOCl +トゥイーン 80(Tween 80) で 20 分処理
する。最後の処置は、層流槽の中で行なう。
【００１５】この処置の後、種子を包んだパッケージ
を、滅菌水でそれぞれ5 分、5 分、10分で 3回洗浄す
る。
【００１６】＜実施例 2：胚軸プロトプラスト採取用
に、親（出発）材料を播種する＞最後の洗浄工程の後に
種子を包んだパッケージを開き、容器中の 1/2 MS15 培
地に移す。容器を25℃で暗黒野に保存する。約 7日後、
胚軸はプロトプラスト分離に使用できるようになる。
【００１７】＜実施例 3：葉プロトプラスト採取用に、
親（出発）材料を播種する＞滅菌した種子を実施例 2の
要領で播種する。容器を、25℃で照明下に置く。14-28
日後に、植物の葉はプロトプラスト分離に使用できるよ
うになる。この植物の発芽先端を新鮮な BB に置く。容
器を、照明下 で 25 ℃に保存する。プロトプラスト分
離には完全に成長した葉を使用する。
【００１８】＜実施例 4：プロトプラストの分離＞葉と
胚軸材料を小片に切断し、薄層 (12ml) の原形質溶解液
を含むガラス製ペトリ皿（直径 11cm ）、またはTC質ペ
トリ皿（直径 9cm）に移す。前記消化の後、さらに原形
質溶解液 12ml を加える。
【００１９】ペトリ皿をアルミ・フォイルで包み、層流
槽中で少なくとも 1時間保存する。
【００２０】前記 1時間後、原形質溶解液を約 24ml の
新鮮な酵素液と交換する。
【００２１】全体をアルミ・フォイルで包み、25℃で一
晩保存する。胚軸プロトプラストを得るための酵素混合
液を、振動装置に置く。ただし、葉のプロトプラスト採
取用の酵素液の場合はそうしない。振動装置を振幅 15m
m 、速度30rpm にセットする。
【００２２】インキュベーション後、懸濁液を、それぞ
れ 110μm 、53μm の二枚のナイロン・フィルターを備
えたテフロン・フィルター・ホルダーで濾過する。この
フィルターを、1 ／3 容量の CPW16 (±8ml)で繰り返し
すすぐ。
【００２３】この懸濁液を、110gで5 分間遠心する。
【００２４】生じた小さいバンド、これがプロトプラス
トを含んでいるのであるが、これを滅菌したパスツール
・ピペットで吸引し、新しい遠心管に移す。9ml の W5
を慎重に加えた後、プロトプラスト懸濁液を75g で 5分
間遠心する。
【００２５】葉のプロトプラストについてはさらに下記
のように処理する。各種遠心管の上清を傾斜除去し、残
査を1-2ml の W5 中に慎重に再懸濁する。各種遠心管中
の内容を合わせ、W5を加えて全体を 10ml とする。
【００２６】このプロトプラスト（供与体）を含む遠心
管をパラフィンで封印し、アルミニウム・フォイルで包
み、50kRadで照射するまで氷上に放置する。
【００２７】胚軸プロトプラストは、下記のように処理
する。各種遠心管の上清を傾斜除去し、残査を1-2ml の
W5 + 2mM IOA (4℃) 中に再懸濁する。各種遠心管中の
内容を合わせ、さらにW5 + 2mM IOAを添加して全体を 1
0ml とし、その後、冷蔵庫で4℃で10分間インキュベー
トする。
【００２８】この後、この懸濁液を75g で 5分間遠心す
る（したがって、IOA 中における全インキュベーション
時間は 15 分となる）。
【００２９】この残査を1-2ml の W5 中に再懸濁し、こ
の懸濁液に W5 を加え、全体を 10ml とする。その後、
全体を50mlの滅菌フラスコに移す。このフラスコをアル
ミ・フォイルに包み、振動装置（振幅 15mm で、速度約
30rpm）上で25℃でインキュベートする。この間、この
プロトプラストに照射を行なう。この後、フラスコの内
容を遠心管に移す。
【００３０】葉のプロトプラストと胚軸のプロトプラス
トを入れた二本の管を、75g で 5分間遠心し、その後、
残査を 1-3mlの W5 で再懸濁する。
【００３１】このプロトプラスト懸濁液の密度を、血球
計算装置で定量する。
【００３２】＜実施例 5：プロトプラスト融合＞両プロ
トプラスト懸濁液のプロトプラストを、9.105 プロトプ
ラスト／mlの密度で合わせる。
【００３３】40μl ずつの滴を、ミクロリットル・ピペ
ットでペトリ皿に移す。すなわち、直径6cm のペトリ皿
に 40 μｌの滴 11 滴、または直径9cm のペトリ皿に 4
0 μl の滴 25 滴である。
【００３４】皿の上に蓋を置き、その後照明を切り、層
流槽の電源を 15 分間切り、プロトプラスムをペトリ皿
の底に付着させる。
【００３５】層流槽の電源を再びオンにし、60μl のPE
G 液をプロトプラスマの各 1滴に加える。
【００３６】3-5 分後、下記の量の SVIをペトリ皿に加
える。直径6cm の皿には 4ml、直径9cm の皿には 9ml。
【００３７】3-5 分後に溶液を吸引し、SVIIを下記に従
って加える。直径6cm の皿には 4ml、直径9cm の皿には
9ml。
【００３８】3-5 分後に溶液を吸引し、8pを慎重に加え
る。直径6cm の皿には 4ml、直径9cm の皿には 9ml。
【００３９】8p培養液を慎重に加えるのは重要である。
なぜなら、これによって、プロトプラストが皿の底から
余りに早く遊離するのを防ぐことができるからである。
【００４０】3-5 分後に8p培養液を吸引し、新しい 8p
培養液を加える。ここにおいて、プロトプラストは自然
にペトリ皿の底から遊離する。直径6cm の皿には 4ml、
直径9cm の皿には 9ml。ペトリ皿をパラフィンで封印
し、約 500ルックスの照明下に保存する。
【００４１】＜実施例 6：再生＞融合 8日目、8pA を最
初の容量の 3倍量までペトリ皿に加える。すなわち、直
径 6cmの皿には 8ml、直径 9cmの皿には 18ml。これら
ペトリ皿を照明下に置く。融合後 15 日目、皿の底に発
芽した微少カルスを、滅菌メスで丁寧に剥がす。ペトリ
皿の内容を、4 個の遠心管に10mlピペットで分け、75g
で 5分間遠心する。一方、6ml の K3PPS-V培養液を、4
個の新しいペトリ皿にピペットで注ぐ。遠心後に上清を
傾斜除去し、6ml の K3PPS-V培養液を残査に加える。こ
の残査は、分裂細胞及び微少カルスから成り、K3PPS-V
培養液中で簡単に再懸濁される。この培養液と残査を10
mlピペットで吸引し、ペトリ皿に移す。融合 21 日目か
ら分化した微少カルスを、K3PPS-V 培養液からK3PPS-R
培養液に接種する。成長する（微少）カルスを、2 週間
に 1回新鮮な K3PPS-Rに移し替える。
【００４２】カルスが発芽を示したら直ちにK3PPS-R 培
養液を含む容器に移す。芽が十分に大きくなったら直ち
に収集し、根育成培養液 (BB培養液）に移す。
【００４３】＜実施例 7：フローサイトメトリー定量＞
分析の対象となる±1cm2の植物の葉標本を取り、2ml の
DAPI液の中に置く。この標本を鋭いカミソリの刃で小片
に切断し、15μm フィルターで濾過する。この標本を、
ドラート他 (De Laat 他) の方法によって、パルテック
CA-II分析装置を用いて測定する。この植物の相対的 D
NA含量を、融合植物のピーク位置を2 倍体植物のピーク
位置と比較することによって求めた。
【００４４】＜実施例 8：分子測定＞細胞体融合によっ
て得られた細胞原形質雄性不稔性を持つ B. oleracea
は、別の細胞原形質を持つ B. oleracea（ogura, anan
d, polima原形質を持つ別キャベツ種）とは、DNA プロ
ーブによって区別される。このプローブは表現形として
不稔性 (CMS ）であり、大腸菌においてクローンした E
coRIで消化した植物から分離した、ミトコンドリア DNA
断片から成る。そのバンドは、大腸プラスミド DNAをEc
oRI で処理して切り出すことができ、独特のやり方でキ
ャベツのミトコンドリア DNAと交雑するという特徴を持
つ（図１参照）。
【００４５】図１は、B. oleracea, 稔性供与体である
B. napur, オグラ (ogura) 原形質を含む B. oleracea,
アナンド (anand) 原形質を含む B. campestris 、ポ
リマ(polima) 原形質を含む B. napus、及び稔性 B. na
pus 由来のミトコンドリアを含む B. oleracea 由来細
胞原形質のプロット図である。ハイブリダイゼーション
は、DNA プローブを用いて行なった。このプローブは、
表現型として不稔 (CMS) の植物から分離し、大腸菌の
中でクローンした EcoRI で消化したミトコンドリア DN
A から成る。バンドは、E. coli プラスミド DNA から
EcoRI で切り出すことができ、かつ、キャベツのミトコ
ンドリア DNA と独特のやり方でハイブリダイゼーショ
ンするという特徴を持つ。図１において、レーン１は分
子量マーカーであり、上から下に21226bp, 7421bp, 580
4bp, 5643bp, 4878bp, 3530bp(λDNA , EcoRI, ベーリ
ンガー・マンハイム）を示し、レーン 2は稔性供与体
B. napus を、レーン 3はオグラを含む B. oleraceaを
それぞれ示す。また、レーン 4は受容体 B. oleraceaで
あり、上のバンドは、場合によって洗浄工程の厳密性に
よっては見られないことがある。レーン 5はレーン 2
の供与体のパターンとの融合によって形成された CMS
を持つ B. oleraceaであり、レーン 6は融合によって、
レーン 2 の供与体とレーン 4 の受容体との併合パター
ンによって形成された CMS を持つ B. oleraceaであ
り、レーン 7は(B. juncea 系統の）アナンド細胞質を
持つ B. campestris である。更に、レーン 8はポリマ
細胞質を持つ B. napus、レーン 9はオグラ細胞質（＝
レーン 3）を持つ B. oleracea、レーン 10は分子量マ
ーカーであり、上から下に21226bp, 7421bp, 5804bp, 5
643bp, 4878bp, 3530bp (λDNA, EcoRI, ベーリンガー
・マンハイム）を示している。
【００４６】分析の対象となる植物から得た 200mgの葉
試料を試験管に収め、液体窒素で凍結する。この試験管
に750 μl の抽出用バッファーを加え、ホモジェネータ
で処理する。標本を13000gで 10 分間遠心し、緑色の試
料を含む上清を注意深く傾斜除去し、残査に 125μl の
抽出用バッファーを加え、再懸濁後、135 μl の細胞溶
解性バッファーと60μl のラウリル・サルコシン液を加
える。短時間の混合後、この混合液を 65 ℃で20分間加
熱し、375 μl のクロロフォルム／イソアミル・アルコ
ールを加え、この試験管を少なくとも 40 回振動する。
13000gで 10 分間遠心し、上部を新しい試験管に移し、
必要ならCHCl3/IAA 工程をもう一度繰り返す。最後に50
0 μl のイソプロパノールを加え、試験管を 2、3 度振
る。13000gで 5分間遠心する。残査を、500 μl の TE
バッファー中で再懸濁する。
【００４７】制限エンドヌクレアーゼによる DNAの消化
は下記のように実施した。RFLP析には、約 4μg の DNA
が必要である。制限切断を起す最終溶液は、ワン・フォ
ー・オール (One-Phor-All) バッファーPLUS（Pharmaci
a)のような汎用切断バッファー 0.1容量、4 μg DNA 、
4mM スペルミディン及び2 単位の制限酵素から成る。イ
ンキュベーションは、37℃で少なくとも 3時間行なっ
た。
【００４８】反応は、EDTA濃度を保存液の 10mM に変更
して停止した。DNA を-20 ℃保った0.1 容量の 3M NaAc
と、2.5 容量のエタノールによって沈殿させた。その混
合物を -20℃で 2時間放置した。10000gで 10 分間遠心
した後、残査を氷冷の 70%エタノール／水で洗浄、乾燥
し、TEバッファーに溶解した。
【００４９】分離すべき DNA断片のアガロース・ゲル電
気泳導は、下記の要領で実施した。2gのアガロースを秤
量し、250ml の TAEバッファーで煮沸する。ぬるい温度
にまで冷却させた後、臭化エティヂウムを最終濃度が
0.5mg/lとなるように加える。このゲルを注いで、定着
するまで冷却する。標本を搬送バッファーに与え、DNA
断片を分離する。先頭マーカー BFBが、ゲルの頂上から
約 1cm離れた所に達したところで、電気泳動を停止す
る。
【００５０】ブロットの調製のために、ゲルを下記の要
領で処理する。0.25M HC1 (1x) 中で 5 分間、0.5M NaO
H/1.5M NaCl (2x)中で 15 分間、1M NH4Ac/20mM NaOH
(2x) 中で 10 分間。ハイボンド (Hybond) 膜をゲルと
同じ大きさに切り、2x SSCに数秒、その後、1MNH4Ac/20
mM NaOHに浸して濡らす。3 枚のワットマン (Whatman)
濾紙を同じ大きさに切る。4 時間の液体転送によって、
DNA がゲルから膜へ移動するようにセットアップする。
移動は、1M NH4Ac/20mM NaOH中にて行なわれる。膜乾燥
して後、DNA をUV光１分間の照射により、膜の両側に結
合させる。
【００５１】必要な DNAプローブは、下記の要領でラベ
ルする。転送された DNAを、95℃で10分間加熱後、氷上
で急速に冷却して変性させる。下記を反応容器に混ぜ
る。
【００５２】10ng-3μg の DNA 2 μl のヘキサヌクレオチド混合液 2 μl の dNTP （digoxigenine-dUTP) 1 μl のクレノウ・ポリメラーゼ (Klenow polymerase)
【００５３】混合後、37℃で一晩インキュベートする。
DNAを、2 μl の 3M NaAcと、44μl のエタノール（96
% ）を加えて沈殿させた。その混合物を -20℃で 30 放
置した。10000gで 15 分間遠心した後、残査を70% エタ
ノール水溶液 (v/v)で洗浄し、乾燥した残査を50μl の
TEバッファーに溶解する。
【００５４】膜に対する標識断片のハイブリダイゼーシ
ョンは次の通りである。
【００５５】膜を、2x SSC中に数秒間放置する。次に、
膜を、20mlのハイブリダイゼーション前処理液を含むバ
ッグの中に封印する。60-65 ℃において少なくとも 1時
間、膜をインキュベートする。このハイブリダイゼーシ
ョン前処理液を捨て、4mlのハイブリダイゼーション液
と交換し、一晩インキュベートする。インキュベーショ
ン後、膜を洗浄する。すなわち、洗浄液 1において 2分
間 4回、洗浄液 2において 2分間 4回、及び洗浄液 3
（60-65 ℃）において 15 分 2回である。
【００５６】標識バンドの検出は室温で行なう。ブロッ
トを、バッファー 1を流したまますすぎ、次に膜 100cm
2 当たり 10ml のすすぎバッファー 2で封印する。振動
装置上で 30 分間インキュベートした後、すすぎバッフ
ァー 2を、膜 100cm2 当たり15ml の抗ジグ（anti-di
g）液と交換する。振動装置上で 30 分間インキュベー
トした後、膜を洗浄する。すなわち、すすぎバッファー
2中で 10 分間 2から 3回、すすぎバッファー 1中で 1
0 分間 3から 4回、及びすすぎバッファー 3中で1回で
ある。膜を、膜の 100cm2 当たり 10ml の AMPPD液でイ
ンキュベートする。この膜を、頂上にポラロイド・フィ
ルムを置いたカセットに載せる。十分な露出後、フィル
ムを取り出して現像する。
【００５７】＜実施例 9：Brassica napus由来のミトコ
ンドリアを含む細胞原形質雄性不稔性B. oleracea花序
表現型の説明＞ 花序：しべ群の主軸は天辺に向かい、時に短く、また
は、まとめられて束となり、しばしば分枝する。包葉は
めったに見られず、場合によって、翻転、巻き込まれて
いる。葉柄は時に短く、またはまとめられて束となる。
【００５８】花の蕾：多くの場合閉じているが、開いて
いる場合もある。がくの辺縁は互いに触れることなく、
折りたたまれている。表面は滑らかなものから膨隆ま
で、上部は多くの場合内部に巻き込むが、場合によって
尖る。雌ずいは、多くの場合頂上から突き出る。
【００５９】花：がく片は、幅 1-4mm、長さ 4-12mm 、
直立、やや翻転することが多い。辺縁は時に内側に湾曲
し、上辺は内側に湾曲する。蜜腺あり。花弁は 4枚であ
るが、場合によって最高 40 枚までの 4の倍数。幅 4-7
mm、長さ 11-19mm。4 の倍数の場合、内側の花弁は極端
に短くなることが多い。爪は見たところ、まとまり、管
となるように見える。プレートは大体のところ後ろに湾
曲せず、横に大きく巻き込むことが多い。また、時に、
大きく翻転することがある。色は、上辺が白ないし黄 R
HS 2A-3A-2C-3C-4A-5A-5B-6Aであり、底辺は、白ないし
黄 RHS 2A-2B-2C-3A-3C-4B-4C-4Aである。頂上の辺縁
は、滑らかな場合が多いが、ぎざぎざのこともある。雄
ずいは6 から 2本で、その場合は、2×2でまとまること
がある。長さは最大でがく片の半分であるが、がく片と
同じ長さになることもある。葯は小型の三角形である
が、花粉はない。雌ずいは一本であるが、場合によって
最大 3本まであることがあり、その場合、一本が他のも
のよりも長い。おおむね直立であり、受粉しないと約 3
0mm の長さまで成長することが多い。くちばしと雌ずい
は湾曲することがあり、また、やや膨隆することがあ
る。子房は翻転し、巻き込むことが多い。
【００６０】しべ群頂上の花はほとんどがく片、花弁、
雄ずいを持たないことがあり、かつ極端に翻転し、巻き
込んだ子房、または、外見上2×2でまとまった形を取る
ことがある。まとめられた縫い目を縦裂きしてみると、
平行の脈理を備えた包葉に重なる葉に似ている。
【００６１】細胞融合に必要な溶液は次のようになって
いる。
【表１】
【表２】
【００６２】細胞生物学に必要なそれ以外の溶液は次の
通りである。
【００６３】酵素液： K3PPS-I に溶解した1% (w/v) 細胞消化液 R-10 K3PPS-I に溶解した0.1% (w/v) ペクチン消化液 pH = 5.6
【００６４】PEG 溶液： PEG1500 266.7mM グルコース 300mM CaCl2.2H2O 50mM pH = 7.0
【００６５】SVI:50ml の PEG 溶液 + 100ml の原形質
溶解前処理液
【００６６】SVII:20ml の PEG 溶液 + 100ml の原形質
溶解前処理液
【００６７】IOA: （ヨードアセトアミド） W5 に溶解した 2mM IOA、pH = 5.6
【００６８】MilliQ 水に溶解した1% アガロース液
【００６９】(分子生物学用溶液） 抽出用バッファー; 350mM のソルビトール 100mM のトリス塩基 5mM の EDTA 新鮮な 20mM の重亜硫酸ナトリウムを加える
【００７０】細胞溶解液バッファー： 20mM のトリス塩基 50mM の EDTA 2M NaCl 2%(w/v) CTAB
【００７１】N-ラウリル・サルコシン、Na 塩：10%(w/
v) クロロフォルム／イソアミル・アルコール：24:1 (v:v) イソプロパノール TE:10mM の Tris-HCl, pH 8.0 1mM の EDTA 4mM のスペルミジン EDTA 保存液: 1M 3M の NaAc 96% エタノール 70% エタノール／水 v/v 臭化エチヂウム液―10mg/ml の水
【００７２】TAE バッファー： 4.84g トリス塩基／l 1.14ml の酢酸 10mM の EDTA, pH = 8.0
【００７３】搬送液; 24% Ficoll 400 0.1% SDS 0.1% キシレンシアノール 0.1% ブローム・フェノール・ブルー
【００７４】0.25M HCl 0.5M NaOH/1.5M NaCl 1M NH4Ac/20Mm の NaOH
【００７５】2XSSC: 30mM のクエン酸ナトリウム、2H2O; pH 7.2 300mM の NaCl
【００７６】0.2 SSC：10x 希釈 2xSSC 0.1x SSC ：20x 希釈 2xSSC
【００７７】ヘキサヌクレオチド混合物：ベーリンガー
・マンハイム社 (Boehringer Mannheim) dNTPより調製
した 10x 濃縮ヘキサヌクレオチド混合物： 0.1mM の dATP 0.1mM の dCTP 0.1mM の dGTP 0.65mM の dTTP 0.35mM の ジゴキシジェニン-dUTP （ベーリンガー社）
【００７８】停止試薬：ベーリンガー・マンハイム社、
商品番号 1175041
【００７９】ハイブリダイゼーション前処理混合液： 75mM のクエン酸ナトリウム 750mM の NaCl 0.5% 停止試薬 0.1% N-ラウリル・サルコシン 0.2% SDS
【００８０】ハイブリダイゼーション混合液： 75mM のクエン酸ナトリウム 750mM の NaCl 0.5% 停止試薬 0.1% N-ラウリル・サルコシン 0.2% SDS 40-50ng ジゴキシジェニン-dUTP 標識プローブ／ml
【００８１】 洗浄液 1：2xSSC + 0.1% (w/v) SDS 洗浄液 2：0.2xSSC + 0.1% (w/v) SDS 洗浄液 3：0.1xSSC + 0.1% (w/v) SDS
【００８２】すすぎ用バッファー １： 100mM の Tris-HCl, pH 7.5 150mM の NaCl すすぎ用バッファー 2： すすぎ用バッファー 1 0.5% 停止試薬(新鮮なものを調製） すすぎ用バッファー 3： すすぎ用バッファー 1 50mM の MgCl2
【００８３】抗ジグ-AP 複合体：ベーリンガー・マンハ
イム社、商品番号 1175041 AMPPD 液：すすぎ用バッファー 3 (0.26μM) 1ml 当た
り 10μl の AMPPD
【００８４】本発明の説明に使用した省略語は、下記の
通りである。 2,4D：2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-dichloropheno
xy acetic acid) AMPPD：ジソジュウム 3-(4-メトキシスピロ｛1,2-ジオ
キソテイン-3,2'-トリシクロ-[3.3.1.13,7 ]デカン}-4-
イル）フェニル・フォスフェート(disodium 3-(4-metho
xyspiro{1,2-dioxetane-3,2'-tricyclo-[3.3.1.13,7]de
can}-4-yl)phyenyl phosphate) AP：アシド・フォスファテース(acid fosfatase) BA：6-ベンジルアミノプリン(6-benzylaminopurine) CMC：細胞原形質雄性不稔性 DIG：ジゴキシジェニン(digoxygenine) dATP：デソキシアデノシン三リン酸(desoxyadenosine t
riphosphate) dCTP：デソキシシトシン三リン酸(desoxycytonsine tri
phosphate) dGTP：デソキシグアニン三リン酸(desoxyguanine triph
osphate) DNTP：デソキシヌクレオチド三リン酸(desoxynucleotid
e triphosphate) dTTP：デソキシチミン三リン酸(desoxythyminetri phos
phate) DUTP：デソキシウラシル三リン酸(desoxyuracyl tripho
sphate) EDTA：エチレンジアミンテトラ酢酸(ethylenediaminete
tra acetic acid) g：重力加速度 (9.8 m.sec-2) IOA：ヨードアセタミド(iodacetamide) kRad：1000 Rad, 電離性放射の単位 μg：マイクログラム μl：マイクロリットル mM：ミリモル μM：マイクロモル M：モル MS：ムラシゲ および スクーグ (Murashige & Skoog) NAA：ナフタレン酢酸 PEG：ポリエチレン・グリコール pH：酸性度の尺度 rpm： 1 分当たりの回転数 SSC：クエン酸ナトリウム生食液(saline sodium citrat
e) SDS：硫酸ドデシルナトリウム(sodiumdodecyl sulphat
e) TC：組織培養 UV：紫外線 v/v:容量／容量 w/v：重量／容量 BB：Bloemkool Beworteling （生成媒体） DAPI：4', 6 diamidino-2-phenylindole BFB： bromophenolblue CTAB:cetyltrimethylammonium bromide(=hexadecyltrim
ethylammonium bromide) RHS:Royal Horticultural Society
【００８５】ほとんどすべての処置について、pH、濃度
などの維持すべき範囲、実行に際して実験をどのレベル
で行なうかを指定できる。溶液／処置に関する三つのレ
ベルを下記に示す。
【００８６】組織培養液: 1/2 MS15, BB に溶解したMS30 蔗糖、たとえばスクローシス、濃度 0.5-600mM, 通常は
200-400mM pH 5-10, 通常は 5.5-6.0
【００８７】培養液温度：22-27℃、通常は 25℃ 放射：0-60 kRad, 通常は 50kRad 融合温度：20-25℃、通常は 22℃ 植物ホルモンの濃度：0-10μM, 通常は 0.3μM
【００８８】
【発明の効果】以上のように本発明によれば、従来技術
の欠点を解消した細胞不捻性雄性ブラシ力を得ることが
できると共に、オグラCMS原形質に代わるものを与える
ことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】B. oleracea由来細胞原形質のプロット図であ
る。
フロントページの続き (71)出願人 597076141 Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ 50 Ｔｒａｍｂａａｎ １ 1749 ＺＨ Ｗａｒｍｅｎｈｕｉｚｅ ｎ Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】プロトプラスト融合により、その細胞原形
    質に、少なくともその一部がB. napus（白菜）由来の D
    NAを含み、かつ、細胞原形質雄性不稔性 (CMS)（すなわ
    ち、B. oleracea の細胞原形質雄性不稔性を誘発する）
    （の性質）と結合したミトコンドリアを供給されたこと
    を特徴とする B. oleracea。
  2. 【請求項２】請求項１による B. oleraceaであって、そ
    の細胞には、この植物にとって正常な種特異的な核ゲノ
    ムが供給されている B. oleracea。
  3. 【請求項３】請求項１または２による B. oleraceaであ
    って、その細胞には、B. napusにとって正常な種特異的
    なミトコンドリアが供給されている B. oleracea。
  4. 【請求項４】請求項３による B. oleraceaであって、そ
    の内部に、前記種特異的ミトコンドリアが細胞体ハイブ
    リダイゼーションによって導入されている B.olerace
    a。
  5. 【請求項５】請求項１−４のいずれか一つによる B. ol
    eraceaであって、B. napus (供与体）が正常な稔性を持
    つものである B. oleracea。
  6. 【請求項６】請求項１−５のいずれか一つによる B. ol
    eraceaであって、下記のものからなるグループから選ば
    れる B. oleracea。 カリフラワー(B. oleracea L. convar. botrytis (L.)
    Alef. var.borytis L.) ブロッコリー(B. oleracea L. convar. botrytis (L.)
    Alef. var.cymosa Duch.) ロマネスコ (B. oleracea L. convar. botrytis (L.) A
    lef. var.botrytis L.) ブラッセル・スプラウト(B. oleracea L. convar. oler
    acea var.gemnifera DC.) ホワイト・キャベツ(B. oleracea L. convar. capitata
    (L.) Alef.var. alba C.) オックスハート(B. oleracea L. convar. capitata
    (L.) Alef. var.alba DC.) 赤キャベツ (B. oleracea L. convar. capitata (L.) A
    lef. var. rubra DC.) ちりめんキャベツ(B. oleracea L. convar. capitata
    (L.) Alef. var.sabauda L.) かぶらキャベツ (B. oleracea L. convar. acephala (D
    C.) Alef. var.gongylo ides) 花キャベツ(B. oleracea L. convar. acephala (DC.) A
    lef. var. sabellica L.)、及び、 ポルトガル・キャベツ (B. oleracea var. tronchuda s
    yn. costata).
  7. 【請求項７】請求項１−６のいずれか一つによる B. ol
    eracea由来の種子または植物部分。
  8. 【請求項８】プロトプラスト融合により、その細胞原形
    質に、少なくともその一部がB. napus由来の DNAを含
    み、かつ、細胞原形質雄性不稔性 (CMS)（すなわち、B.
    oleracea の細胞原形質雄性不稔性を誘発する）（の性
    質）に結合したミトコンドリアを供給されたことを特徴
    とする B. oleraceaの細胞。
  9. 【請求項９】プロトプラスト融合により、その細胞原形
    質に、少なくともその一部がB. napus（白菜）由来の D
    NAを含み、かつ、細胞原形質雄性不稔 (CMS)（すなわ
    ち、B. oleracea の細胞原形質雄性不稔性を誘発する）
    （の性質）に結合したミトコンドリアを供給されたこと
    を特徴とする B. oleraceaの生産法。
JP9142420A 1996-05-31 1997-05-30 細胞原形質雄性不稔性Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ（キャベツ）及びそのような植物の生産法 Pending JPH1052185A (ja)

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ZA (1) ZA974824B (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8058505B2 (en) 2005-10-26 2011-11-15 Sakata Seed Corporation Cybrid plant of the genus Lactuca and method for producing the same
CN104160946A (zh) * 2014-07-30 2014-11-26 镇江瑞繁农艺有限公司 一种松花菜胞质雄性不育系和保持系的育种方法

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1096231C (zh) * 1999-10-19 2002-12-18 武汉大学 水稻无花粉细胞质雄性不育系的选育方法
RU2320166C2 (ru) * 2005-05-11 2008-03-27 Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия (НГСХА) Способ слияния протопластов растительных клеток
EP1763991B1 (en) * 2005-09-20 2025-03-12 Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel B.V. Red lettuce
CN101017152B (zh) * 2007-02-09 2010-07-07 南京农业大学 一种甘蓝种子遗传纯度的快速鉴定方法
WO2008123714A1 (en) * 2007-04-06 2008-10-16 Dongbu Hitek Co., Ltd. A method for producing a hybrid seed using plant of novel cytoplasmic-genic male sterility raphanus sativus line and dna markers for selecting the plant of said raphanus sativus line
EP2060168A1 (en) 2007-11-16 2009-05-20 Syngenta Participations AG Method for the production of pink colored cabbage
CN103734016B (zh) * 2014-01-21 2016-06-08 南京农业大学 一种离体诱导同源四倍体青花菜的育种方法
AU2016336566B2 (en) * 2015-10-06 2020-05-14 Aict Method for producing whole plants from protoplasts
CN106047860B (zh) * 2016-06-03 2019-01-01 中国农业科学院特产研究所 一种植物基因组dna提取方法
CN108719062A (zh) * 2018-05-11 2018-11-02 广州禾立田生物科技有限公司 一种抱子甘蓝的组织培养快速繁殖方法
CN113229148A (zh) * 2021-06-10 2021-08-10 南京新创蔬菜分子育种研究院有限公司 一种培养羽衣甘蓝游离小孢子获得再生植株的方法
CN117363558A (zh) * 2023-12-07 2024-01-09 三亚中国农业科学院国家南繁研究院 一种原生质体的制备方法和原生质体的转化方法及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0255355A3 (en) * 1986-07-30 1988-08-03 Allelix Inc. Haploid protoplast fusion
HU204561B (en) * 1987-12-17 1992-01-28 Zaadunie Bv Process for producing hybrid brassicaceae with citoplasmic male sterility
JP2687396B2 (ja) * 1988-02-26 1997-12-08 三菱化学株式会社 細胞質雑種植物の製造方法
FR2667078B1 (fr) * 1990-09-21 1994-09-16 Agronomique Inst Nat Rech Sequence d'adn conferant une sterilite male cytoplasmique, genome mitochondrial, mitochondrie et plante contenant cette sequence, et procede de preparation d'hybrides.
JPH0731307A (ja) * 1993-07-14 1995-02-03 Sakata No Tane:Kk 雄性不稔植物の育種方法及び増殖方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8058505B2 (en) 2005-10-26 2011-11-15 Sakata Seed Corporation Cybrid plant of the genus Lactuca and method for producing the same
EP2944692A1 (en) 2005-10-26 2015-11-18 Sakata Seed Corporation Cybrid plant of the genus lactuca and method for producing the same
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