JPH10502810A

JPH10502810A - Ｌｅｒｋ−５と命名された新規のサイトカイン

Info

Publication number: JPH10502810A
Application number: JP8504407A
Authority: JP
Inventors: セレッティ，ダグラス・ピー; レディー，プラニーサ
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1994-07-08
Filing date: 1995-07-06
Publication date: 1998-03-17
Also published as: EP0770088A4; AU684988B2; US6303769B1; WO1996001839A1; FI965297L; DE69533923T2; NO965627L; NZ290253A; DK0770088T3; ATE286907T1; US6492140B2; US6596852B2; AU3094095A; ES2236710T3; DE69533923D1; NO965627D0; FI965297A0; PT770088E; US20020103358A1; EP0770088A1

Abstract

(57)【要約】ＬＥＲＫ−５ポリペプチドが開示され、ＬＥＲＫ−５を生成するに有効なＤＮＡ配列、ベクターおよび形質転換された宿主細胞も共に開示されている。ＬＥＲＫ−５ポリペプチドは、チロシンキナーゼレセプターのｅｐｈ／ｅｌｋ族の一員である、ｅｌｋおよびｈｅｋに結合する。

Description

【発明の詳細な説明】ＬＥＲＫ−５と命名された新規のサイトカイン発明の背景チロシンキナーゼレセプターとして知られているタンパク質は、リガンド結合に応じて活性化される固有のキナーゼ活性を持つ。この種のタンパク質は、触媒ドメイン内に保存された構造モチーフを特徴とし（Ｈａｎｋｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２，１９８８）、触媒ドメインまでのＮ末端領域の構造上の特徴を基にして、族（ｆａｍｉｌｙ）に細別することができる。Ｂｏｙｄら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：３２６２，１９９２）は、チロシンキナーゼ活性を示す細胞表面の糖タンパク質を精製した。Ｎ末端アミノ酸配列から、このタンパク質はｅｐｈ／ｅｌｋ族の一員と同定され、それ故、ｈｅｋ（ヒトｅｐｈ／ｅｌｋ様キナーゼ）（ｈｕｍａｎｅｐｈ／ｅｌｋ−ｌｉｋｅｋｉｎａｓｅ）と命名された。ｈｅｋと免疫反応するモノクローナル抗体を用いて、数多くのヒトの細胞の型によるｈｅｋの発現について研究した（Ｂｏｙｄら、同上）。ｈｅｋ抗原は、ヒトの前駆Ｂ細胞白血病細胞系ＬＫ６３（この細胞系は、抗体を上昇させる免疫原として用いられた）およびＴ細胞白血病細胞系ＪＭ上に検出された。ＲａｊｉＢリンパ腫細胞系は弱いｈｅｋ抗原発現を示し、そして試験したその他の細胞系（前駆Ｂ細胞およびＴ細胞系を含む造血細胞系を含む正常な細胞系および腫瘍細胞系の両方）は、一貫して陰性であった。ｈｅｋ抗原発現について試験した正常組織および腫瘍組織の生検試料内では、正常組織で陽性であったものはなく、造血腫瘍のみ非常に低い割合で陽性であった。上記のＬＫ６３細胞系およびＪＭ細胞系、ならびにヒトのＴ細胞白血病細胞系ＨＳＢ−２でのｈｅｋ転写物の発現は、ノーザンブロット分析によって示された（Ｗｉｃｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１６１１，１９９２）。単離されたｈｅｋｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、Ｗｉｃｋｓら、上記に示されている。ｅｌｋと呼ばれる細胞表面タンパク質は、チロシンキナーゼレセプター族タンパク質の他の一員である。ｅｌｋの部分クローンは、最初、ラットの脳のｃＤＮＡ発現ライブラリーを、チロシンキナーゼ活性を示すタンパク質についてスクリーニングした中から発見された（Ｌｅｔｗｉｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ３：６２１，１９８８）。後にｅｌｋコード領域全体に及ぶ複合配列が、前記部分クローンをプローブとして用いて、ラットの脳のｃＤＮＡライブラリーおよびラットの小脳ライブラリーから単離された部分クローンから誘導された（Ｌｈｏｔａｋら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２４９６，１９９１）。ｈｅｋおよびｅｌｋタンパク質は、ｈｅｋ同族体（ｈｏｍｏｌｏｇ）であるｍｅｋ４およびｃｅｋ４（Ｓａｊｊａｄｉら、ＮｅｗＢｉｏｌ．３：７６９，１９９１）；ｅｅｋ（Ｃｈａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ６：１０５７，１９９１）；ｅｒｋ（Ｃｈａｎら、同上）；ｅｃｋ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：６３１６，１９９０）：ｃｅｋ５（Ｐａｓｑｕａｌｅ，Ｅ．Ｂ．ＣｅｌｌＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ２：５２３，１９９１）；およびｅｐｈ（Ｈｉｒａｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：１７１７，１９８７）を含む、数多くのその他のチロシンキナーゼレセプターと密接に関係している。この亜族のタンパク質群は、細胞質ドメインのみならず、細胞外ドメインでも、４１から６８％の同一性で関係している。興味あることに、これら様々なレセプターの組織分布は多様である。例えば、ｅｌｋｍＲＮＡの発現は、精巣および脳に限定されると報告されている（Ｌｈｏｔａｋら、同上）が、ｅｃｋは、これらと同一の２組織内のみならず、肺、腸、腎臓、脾臓、卵巣、および皮膚等にも認められる。チロシンキナーゼレセプターに関して同定されたそれらのリガンドは、レセプターを発現する細胞の成長、分化および生存に影響する多様なタンパク質群である。ｈｅｋおよびｅｌｋのリガンドが単離され、これらは以下にさらに詳細に考察される。さらに、存在するであろうｈｅｋおよびｅｌｋの任意のリガンドの同定は、これらレセプターを通して信号を送ることによって制御される細胞プロセスの性質の研究に有用に提供されるであろう。これらレセプターを通して仲介される特定の生物信号を増強または阻害しようとする場合、そのような信号を導入する役割を果たすであろう個々のタンパク質を同定すると都合がよい。さらに、信号の導入を開始することなしにある種のレセプターと結合するタンパク質が知られており、これらには、インターロイキン−１レセプターアンタゴニストタンパク質が含まれる（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ３４３：３４１，１９９０；Ｈａｎｎｕｍら、Ｎａｔｕｒｅ３４３：３３６，１９９０およびＣａｒｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３４４：６３３，１９９０）。ｈｅｋまたはｅｌｋを結合するさらなるタンパク質の同定は、それらのタンパク質がアンタゴニストとして機能するか否かを決定するために望ましい。発明の概要本発明は、チロシンキナーゼレセプターのｅｐｈ／ｅｌｋ族の一員である、ｅｌｋおよびｈｅｋと結合する、ＬＥＲＫ−５と命名された新規のサイトカインを提供する。また、本発明は、ＬＥＲＫ−５タンパク質をコードするＤＮＡの単離、および単離されたＤＮＡを含む発現ベクターを提供する。ＬＥＲＫ−５を生成する方法は、ＬＥＲＫ−５タンパク質の発現に適当な条件下で発現ベクターを含む宿主細胞を培養し、そしてＬＥＲＫ−５を回収することからなる。ＬＥＲＫ− ５に対する抗体もまた、開示されている。図面の簡単な説明図１は、ヒトのＬＥＲＫ−５およびネズミのＬＥＲＫ−５のアミノ酸配列を並べて比較している。それぞれのタンパク質について、膜貫通領域を箱で囲み、成熟タンパク質の第一アミノ酸を丸で囲んだ。同一アミノ酸を縦線で示す。発明の詳細な説明ｅｌｋおよびｈｅｋとして既知の細胞表面レセプターと結合するＬＥＲＫ−５と命名された新規のタンパク質をコードするｃＤＮＡは、本発明に従って単離された。また、ＬＥＲＫ−５ＤＮＡを含む発現ベクターが提供される。組換えＬＥＲＫ−５ポリペプチドの生成方法は、ＬＥＲＫ−５発現に適当な条件下で発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養し、そして、発現したＬＥＲＫ−５を回収することを含む。細胞外ドメインからなる可溶型タンパク質を含む、精製されたＬＥＲＫ−５タンパク質もまた、本発明の範囲内である。また本発明は、ＬＥＲＫ−５あるいはそれと反応する抗体を生成する免疫原として作用しうるＬＥＲＫ−５フラグメントを提供する。一つの実施態様では、抗体はＬＥＲＫ−５に特異的なモノクローナル抗体である。ヒトＬＥＲＫ−５ｃＤＮＡは、実施例１記載の方法に従って単離に成功した。ヒトＬＥＲＫ−５ｃＤＮＡクローンのコード領域のＤＮＡ配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列を、配列番号１および配列番号２に示す。コードされたタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド（配列番号２のアミノ酸−２５から −１）、細胞外ドメイン（アミノ酸１から１９９）、膜貫通領域（アミノ酸２００から２２５）、および細胞質ドメイン（アミノ酸２２６から３０８）からなる。ｅｌｋおよびｈｅｋとして既知の２つの細胞表面レセプターへのＬＥＲＫ−５の結合は、実施例４に示している。ＬＥＲＫ−５ｃＤＮＡを含む組換えファージλｇｔ１０ベクターを含む細胞溶解液は、１９９４年６月１６日、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託した（寄託番号ＡＴＣＣ７５８１５）。寄託は、ブダペスト条約の条件に基づいて行われた。組換えλｇｔ１０ベクターは、実施例１で単離され、クローンλ６と同定されたベクターである。本明細書中に開示した新規のサイトカインは、チロシンキナーゼレセプターのｅｐｈ／ｅｌｋ族の一員であるラットの細胞表面レセプターｅｌｋのリガンドである。ｅｌｋｍＲＮＡの発現は、ラットの脳および精巣で検出され（Ｌｈｏｔｏｋら、上記）、ｅｌｋがオンコジーンを活性化する能力を持つ可能性が示唆された（Ｌｅｔｗｉｎら、上記）。さらに、サイトカインは、チロシンキナーゼレセプターのｅｐｈ／ｅｌｋ族のその他の一員であるｈｅｋのリガンドである（Ｂｏｙｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：３２６２，１９９２；Ｗｉｃｋｓら、ＰＮＡＳＵＳＡ８９：１６１１，１９９２）。ｈｅｋが発現される細胞型の中に、ヒトのある種の白血病細胞系がある。ここで用いられる”ＬＥＲＫ−５”という言葉は、ｅｌｋおよびｈｅｋを結合する能力を持ち、ここに開示したＬＥＲＫ−５アミノ酸配列と実質上相同性を示すポリペプチド類を指す。ヒトのＬＥＲＫ−５は、これらに限られるわけではないが、マウス、ラット、ウシ、ブタまたは様々な霊長類を含むその他の哺乳動物の種から誘導されたＬＥＲＫ−５タンパク質と同様に、本発明の範囲の内にある。ここに用いられている”ＬＥＲＫ−５”という言葉は、（細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメインからなる）膜結合タンパク質、ならびにｅｌｋ結合性またはｈｅｋ結合性を保持している切除型タンパク質を含む。そのような切除型タンパク質には、例えば、細胞外（レセプター結合）ドメインのみからなる可溶性のＬＥＲＫ−５が含まれる。ｅｌｋおよびｈｅｋに結合するその他のタンパク質も同定されているが、本発明のＬＥＲＫ−５はこれらの他のｅｌｋ結合タンパク質およびｈｅｋ結合タンパク質とは区別される、新規のタンパク質である。一つのｅｌｋリガンドは、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１１３８４に記載されている。このｅｌｋリガンドをコードするクローン化ｃＤＮＡ（クローンｔｅｌｅ７と名付けられた）のヌクレオチド配列、ならびにそれによってコードされるアミノ酸配列は、ＷＯ９４／１１３８４に示されている。タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む、３４６アミノ酸からなる膜貫通タンパク質Ｉ型である。二種類のｈｅｋリガンドタンパク質（Ａ２およびＣ６と名付けられたクローンによってコードされている）は、アミノ酸レベルで３８％同一であり、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／０６０６５に記載されている。２つのｈｅｋリガンドタンパク質をコードするクローン化ｃＤＮＡのＤＮＡ配列およびコードされるアミノ酸配列は、ＷＯ９５／０６０６５出願に示されている。コードされたタンパク質は、それぞれ、Ｎ末端シグナルペプチド、細胞外ドメイン、およびグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定化シグナルを含むＣ末端疎水性領域を含む。転写後プロセシングの後、両タンパク質は、ＧＰＩ結合を通して細胞表面に固定される。ｅｌｋおよびｈｅｋに結合することが見い出されたもう一つのタンパク質は、Ｂ６１と呼ばれている。Ｂ６１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列は、Ｈｏｌｚｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：５８３０，１９９０に示されている。Ｂ６１は、ＷＯ９５／０６０６５に記載された結合アッセイで示したように、後に、ｋｅｌおよびｈｅｋと結合することが見出された。これらの４つのタンパク質（Ｂ６１ならびにクローンｔｅｌｅ７、Ａ２、およびＣ６によってコードされるタンパク質）の内、本発明のＬＥＲＫ−５は、ｔｅｌｅ７によってコードされるｅｌｋリガンド（以下、ｅｌｋ−Ｌｔｅｌｅ７と呼ぶ）と（構造上）最も密接な関係にある。ＬＥＲＫ−５およびｅｌｋ−Ｌｔｅｌｅ７タンパク質の全長のアミノ酸配列は、５８．５％同一であり、ＤＮＡ配列は、６１．４％同一である。ｅｌｋ−ＬおよびＬＥＲＫ−５のシグナルペプチドおよび細胞外ドメインからなる配列は、アミノ酸レベルで５１．６％同一であり、ＤＮＡレベルでは５３．６％同一である。細胞質ドメインは、アミノ酸レベルで７４．７％同一であり、ＤＮＡレベルで７５．５％同一である。ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８：２８５７，１９９３）が上げられる。ＬＥＲＫ−５は、ｈｅｋ２とも結合する。ヒトの染色体１３で発現する配列ｔａｇ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ）（ＥＳＴ）のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）（受託番号Ｌ１３８１９）に見出される。ＥＳＴの源は、月齢３ヶ月のヒト女児の脳のｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡとして同定される。開示されたＥＳＴの３３７ｂｐの配列は、ｅｌｋ−Ｌｔｅｌｅ７ヌクレオチド配列と並べて比較した場合、ｔａｇ配列は、ｅｌｋ−Ｌｔｅｌｅ７ＤＮＡの対応する領域と５９．３％同一である。配列の相同性がこの程度であることから、本発明者らは、配列ｔａｇが生物活性タンパク質、具体的にはｅｌｋまたはｈｅｋと結合するタンパク質、をコードする遺伝子の一部分であるか否かを決定しようとした。ＧｅｎｅＢａｎｋの記録には、ＥＳＴによってコードされるいかなるポリペプチドも開示されておらず（例えば、仮に読み枠があるとしてもそれが何であるか示されておらず）、ましてやそのようなポリペプチドのいずれかがｅｌｋまたはｈｅｋに結合することも示唆していない。仮に、ｔａｇＤＮＡ配列が本明細書中に報告されるＬＥＲＫ−５ＤＮＡのクローニングによって明確になる読み枠の中で発現していたとしても、コードされるアミノ酸配列は、ｅｌｋおよびｈｅｋに結合する上記の４種のタンパク質の細胞外ドメインに保存されている４つのシステイン残基の内の３つが欠落しているであろう。本発明のＬＥＲＫ−５タンパク質中で、これらのシステインは、配列番号２のアミノ酸３７、６４、７６および１２８に認められる。ｔａｇ配列を翻訳したものは、配列番号２のアミノ酸７９から１９０に相当する（実施例１に記載するように、１つのミスマッチを含む）。それ故、３３７ｂｐのｔａｇ配列が、ｅｌｋまたはｈｅｋに結合する能力を持つポリペプチドをコードするとは思えない。以下の実施例１で単離されたヒトＬＥＲＫ−５ＤＮＡは放射能標識されてのよく、種間ハイブリダイゼーションによって他の哺乳動物のＬＥＲＫ−５ｃＤＮＡを単離するためのプローブとして用いることもできる。異なる哺乳動物の種から誘導された様々な細胞系または組織から単離されたＲＮＡは、ＬＥＲＫ−５遺伝子のクローニングに用いるに適当なｍＲＮＡ源を同定するために、ノーザンハイブリダイゼーションによってスクリーニングすることが出来る。ネズミのＬＥＲＫ−５をコードするＤＮＡは、受精後１１．５日の胚から調製されたｃＤＮＡライブラリーより単離された。ネズミＬＥＲＫ−５アミノ酸配列が図１に示され、ヒトＬＥＲＫ−５アミノ酸配列と並べて比較した。ネズミとヒトのＬＥＲＫ−５は、アミノ酸レベルで９７％同一である。配列番号２のＬＥＲＫ−５タンパク質のｅｌｋまたはｈｅｋに結合する能力を有するフラグメントも、本発明の範囲内である。本発明の一つの実施態様では、可溶性ＬＥＲＫ−５ポリペプチドが提供される。可溶性ＬＥＲＫ−５ポリペプチドは、細胞膜上にポリペプチドを保持する膜貫通領域が欠落しているが、天然型のＬＥＲＫ−５細胞外ドメインの全体または部分を含む。可溶性ＬＥＲＫ−５ポリペプチドは分泌を促進するために、最初に合成された時は天然型の（または異種の）シグナルペプチドを含むと好都合であるが、このシグナルペプチドはＬＥＲＫ−５が細胞から分泌される時点で切断される。用いられ得る可溶性ＬＥＲＫ −５ポリペプチドは、ｅｌｋまたはｈｅｋを結合する能力を保持している。また、可溶性ＬＥＲＫ−５は、可溶性ＬＥＲＫ−５タンパク質が分泌され得る限り、膜貫通領域の一部分または細胞質ドメインの一部分あるいはその他の配列を含んでも良い。可溶性ＬＥＲＫ−５は、培養液から所望のタンパク質を発現している完全な細胞を例えば遠心分離によって分離し、所望のタンパク質の存在について培養液（上清）をアッセイすることによって、同定され（また、その非可溶性の膜結合ＬＥＲＫ−５対応物から識別され）る。培養液中にＬＥＲＫ−５が存在することは、タンパク質が細胞から分泌されそれ故所望のタンパク質の可溶型であることを示している。可溶性ＬＥＲＫ−５は、このタンパク質の自然発生型であってもよい。可溶型ＬＥＲＫ−５を用いるとある種の応用に好都合である。可溶性タンパク質は細胞から分泌されるので、組換え宿主細胞からのタンパク質の精製を容易にする。さらに可溶性タンパク質は、一般的に静脈内投与により適当である。可溶性ＬＥＲＫ−５ポリペプチドの例としては、天然型ＬＥＲＫ−５タンパク質の細胞外ドメイン全体からなるそれらが含まれる。そのような可溶性ＬＥＲＫ −５タンパク質の一つは、配列番号２のアミノ酸１から１９９からなる。最初に宿主細胞内で発現した時、可溶性タンパク質はさらに、用いた宿主細胞内で機能する以下に記載する異種のシグナルペプチドの一つを含んでもよい。また、タンパク質は天然型シグナルペプチドを含んでいても良く、そのようなＬＥＲＫ−５は配列番号２のアミノ酸−２５から１９９を含む。可溶性ＬＥＲＫ−５タンパク質をコードするＤＮＡ配列も本発明の範囲内である。可溶性ペプチドを含む切除型ＬＥＲＫ−５は、数多くの従来の技術のいずれかによって調製することができる。所望されるＤＮＡ配列は既知の技術を用いて化学合成することもできる。またＤＮＡフラグメントは、全長のクローン化ＤＮＡ配列を制限エンドヌクレアーゼで消化することによって生成され、アガロースゲル電気泳動によって分離されても良い。所望の位置にＤＮＡフラグメントの５’ 末端または３’末端を再構築するオリゴヌクレオチドが合成されても良い。オリゴヌクレオチドは所望するコード配列の上流に制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含み、そしてコード配列の５’末端に開始コドン（ＡＴＧ）を定めてもよい。制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むリンカーを用いて、所望のＤＮＡフラグメントを発現ベクター中に挿入しても良い。また、熟知されたポリメラーゼ鎖反応法を用いて、所望のタンパク質フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離しても良い。所望されるフラグメントの末端が明確なオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ法でプライマーとして用いられる。さらに代わりの方法として、既知の変異誘発技術を用いて所望する位置、例えば細胞外ドメインの最終アミノ酸のコドンのすぐ下流、に終止コドンを挿入しても良い。ＬＥＲＫ−５タンパク質のシグナルペプチドおよび様々なドメインの前述の考察に関して、タンパク質のそのような領域の上記の境界はおおまかなものであることを熟練者は認識するであろう。例えば、シグナルペプチドの切断部位を予想するコンピュータープログラムを利用できるとしても、切断は予想された部位以外の部位でも起こりうる。さらに、タンパク質調製物は、一つより多くの部位でシグナルペプチドが切断されることによる、異なるＮ末端アミノ酸を持つタンパク質分子の混合物からなりうることが認識されている。さらに、膜貫通領域の正確な境界は、コンピュータープログラムによって予想されたそれらとは異なるかもしれない。翻訳後プロセッシングは、用いられた特定の発現系によって変化し、上記のそれらとは異なるＮ末端またはＣ末端アミノ酸を持つタンパク質が得られるかもしれない。所望の生物活性を保持するそのような変異体も本発明のＬＥＲＫ−５ポリペプチドの内に含まれる。本発明は、組換え体および非組換え体双方の、精製ＬＥＲＫ−５ポリペプチドを提供する。所望の生物活性（例えば、ｅｌｋまたはｈｅｋに結合する能力）を保持する天然型ＬＥＲＫ−５タンパク質の変異体および誘導体もまた、本発明の範囲内にある。ＬＥＲＫ−５変異体は、天然型ＬＥＲＫ−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異誘発によって得ることが出来る。ＬＥＲＫ− ５変異体は、ここで言及されるように、天然型ＬＥＲＫ−５と実質上相同はポリペプチドであるが、一つあるいはそれより多くの欠損、挿入または置換により、天然型ＬＥＲＫ−５のそれとは異なるアミノ酸配列を持つ。望ましくは変異体ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、少なくとも天然型のＬＥＲＫ−５配列と８０％同一であり、望ましくは少なくとも９０％同一である。本発明の一つの実施態様では、ＬＥＲＫ−５タンパク質は細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメインからなり、該ＬＥＲＫ−５タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸１から３０８として示される配列と少なくとも９０％同一である。その他の実施態様では、ｅｌｋおよびｈｅｋと結合する能力を持つ可溶性ＬＥＲＫ−５ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１から１９９として示される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなる。同一性（％）は、例えば、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：３８７，１９８４に記載され、ウイスコンシン大学遺伝子コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）（ｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ）より入手できる、ＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用いて、配列情報を比較することによって決定できる。ＧＡＰプログラムは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０による方法で、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ２：４８２，１９８１によって改訂された、アラインメント法を用いている。ＧＡＰプログラムにとって好ましい欠如（ｄｅｆａｕｌｔ）パラメーターには以下のものが含まれる：（１）ヌクレオチドの一成分からなる比較マトリックス（値１は同一であることを示し、値０は同一でないことを示す）、及び、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ編、ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ、ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ、３５３−３５８頁、１９７９に記載のように、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重比較マトリックス；（２）各ギャップについて３．０のペナルティー、各ギャップの各シンボルについて０．１０のペナルティー、（３）末端のギャップにはペナルティーなし。天然型配列の変更は、数多くの既知技術のうちのいずれによっても行うことができる。天然型配列のフラグメントに連結するのを可能にした制限部位が隣接された、変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の座に突然変異を導入できる。連結反応の後、その結果得られた再構築配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換または欠失を持つ類似体をコードする。あるいは、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発法を用いて、必要とされる置換、欠失または挿入に応じて変化させた特定のコドンを持つ、変化した遺伝子を提供できる。上記の変化を作り出す例示的方法は、Ｗａｌｄｅｒら、Ｇｅｎｅ４２：１３３，１９８６；Ｂａｕｅｒら、Ｇｅｎｅ３７：７３，１９８５；Ｃｒａｉｋ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８５年１月、１２ー１９；Ｓｍｉｔｈら、ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，１９８１；Ｋｕｎｋｅｒｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８，１９８５；Ｋｕｎｋｅｌら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７，１９８７；ならびに米国特許第４，５１８，５８４号および４，７３７，４６２号に開示されており、ここに参照として援用される。変異体は、保存的に置換された配列を含んでもよく、これは所与のアミノ酸残基が類似の物理化学的特徴を持つ残基によって置き換えられることを意味する。保存的置換の例としては、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａを互いに置換するように一つの脂肪族残基を別の脂肪族残基と置換すること、または、ＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；またはＧｌｎとＡｓｎとの間で置換するように一つの極性残基を別のの極性残基と置換すること、が含まれる。その他のそのような保守的置換としては、例えば、同様の疎水性特徴を持つ領域全体を置換することが良く知られている。また、ＬＥＲＫ−５を修飾し、グリコシル基、脂質、リン酸塩、アセチル基およびそれらに類する基のようなその他の化学的部分と共有結合性または凝集性の複合を形成させることによって、ＬＥＲＫ−５誘導体を作り出すこともできる。ＬＥＲＫ−５の共有結合誘導体は、ＬＥＲＫ−５アミノ酸側鎖上の官能基あるいはＬＥＲＫ−５ポリペプチドまたはその細胞外ドメインのＮ末端もしくはＣ末端における官能基に化学的部分を結合することによって調製できる。本発明の範囲内にあるその他のＬＥＲＫ−５誘導体は、組換え培地中でＮ末端またはＣ末端の融合物として合成されるように、ＬＥＲＫ−５またはそのフラグメントと他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合性または凝集性の複合体を含む。例えば、複合体は、ＬＥＲＫ−５ポリペプチドのＮ末端においてシグナルまたはリーダーポリペプチド配列（例えば、サッカロミセス属のα因子リーダー）を含んでもよい。シグナルペプチドまたはリーダーペプチドは、翻訳時または翻訳後に、その合成部位から細胞膜または細胞壁の内側または外側の部位へ複合体を移動させる。ＬＥＲＫ−５ポリペプチド融合体は、ＬＥＲＫ−５の精製および同定を容易にするように加えられたペプチドを含むことが出来る。そのようなペプチドには例えば、米国特許第５,０１１,９１２号（本明細書中に参照として援用される）およびＨｏｐｐら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１２０４、１９８８に記載された、ポリ−Ｈｉｓまたは抗原性を持つ同定用ペプチドが含まれる。そのようなペプチドの一つは、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号３）である。このペプチドは高い抗原性を持ち、特異的モノクローナル抗体によって可逆的に結合されるエピトープを提供して、迅速なアッセイと発現した組換えタンパク質の精製を容易にする。またこの配列は、ウシ粘膜エンテロキナーゼによってＡｓｐ−Ｌｙｓ対合のすぐ後に続く残基で特異的に切断される。さらに本発明は、対応する天然型のグリコシル化パターンを伴うまたは伴わないＬＥＲＫ−５ポリペプチドを含む。酵母または哺乳動物の発現系（例えば、ＣＯＳ−７細胞）内で発現したＬＥＲＫ−５は、選択した発現系によって分子量およびグリコシル化のパターンにおいて、天然型のＬＥＲＫ−５ポリペプチド同様であっても良くまたは有意に異なっていても良い。大腸菌のような細菌発現系内でのＬＥＲＫ−５ポリペプチドの発現では非グリコシル化分子が提供される。ＬＥＲＫ−５細胞外ドメインのＮ−グリコシル化部位を修飾して、グリコシル化を妨げることもできる。真核生物のポリペプチドのそのような部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙ（式中ＸはＰｒｏを除く任意のアミノ酸であり、ＹはＳｅｒまたはＴｈｒである）を特徴とする。ヒトＬＥＲＫ−５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１１−１３および１１４−１１６において、そのようなトリプレットを２つ含む。このトリプレットをコードするヌクレオチド配列の適当な修飾は、結果として、Ａｓｎ側鎖への炭水化物の結合を妨げる、置換、付加または欠失を生ずるであろう。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸によって置換されるように選択して１個のヌクレオチドを変化させると、Ｎ−グリコシル化部位は充分に不活性化される。タンパク質のＮ−グリコシル化部位を不活性化させる既知の方法は、米国特許第５,０７１,９７２号およびＥＰ第２７６,８４６号に記載された方法に含まれており、以後これらは参照として援用される。その他の例としては、生物活性に重要でないＣｙｓ残基をコードする配列を変化させて、Ｃｙｓ残基を欠失または他のアミノ酸で置換させると、復元時の不適当な分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐことが出来る。他の変異体は、隣接する二塩基性のアミノ酸残基を修飾することによって調製され、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性を示す酵母系中での発現を強化する。ＥＰ第２１２，９１４号は、部位特異的突然変異誘発を用いて、タンパク質中のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活性化することについて開示している。ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位は、塩基性残基が隣接することをなくすようにＡｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−ＬｙｓおよびＬｙｓ−Ａｒｇの対を変化させるために、残基を欠失、付加または置換することによって不活性化される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓの対はかなりＫＥＸ２切断を受けにくく、Ａｒｇ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、ＫＥＸ２部位を不活性化するための保存的で好適な方法であることを示している。ヒトＬＥＲＫ−５は、配列番号２のアミノ酸２２８−２２９、２２９−２３０、２３２−２３３および２５１−２５２に、４つのＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を含んでいる。天然に存在するＬＥＲＫ−５変異体もまた本発明の範囲内にある。そのような変異体の例は、選択的なｍＲＮＡスプライシングまたはＬＥＲＫ−５タンパク質のタンパク質分解の結果生じる、ｅｌｋ結合性またはｈｅｋ結合性を保持しているタンパク質である。選択的なｍＲＮＡスプライシングは例えば、自然発生の可溶型タンパク質のような切除されてはいるが生物活性を持つＬＥＲＫ−５タンパク質を生ずるであろう。タンパク質分解に起因する変異は例えば、ＬＥＲＫ−５タンパク質から（一般的には１−５末端アミノ酸から）一つまたはそれより多くの末端アミノ酸がタンパク質分解により除去されることにより、異なる型の宿主細胞で発現させた時、Ｎ端またはＣ末端が異なることを含む。ｅｌｋまたはｈｅｋに結合するための必須の能力を持つ変異体は、任意の適当なアッセイによって同定できる。ＬＥＲＫ−５変異体の生物活性は、例えば、ＬＥＲＫ−５と競合してｅｌｋまたはｈｅｋと結合する変異体の能力を分析すること（即ち、競合結合アッセイ）によって、測定できる。競合結合アッセイは、標準的な技術を用いて行うことが出来る。例えば、放射能標識したＬＥＲＫ−５を用いてＬＥＲＫ−５変異体と競合させて、細胞表面に結合したｅｌｋまたはｈｅｋに対する結合活性についてアッセイすることが出来る。質的評価は競合オートラジオグラフプレート結合アッセイによって得られ、スキャッチャードプロットは量的評価を行うために用いることが出来る。完全な細胞の代わりに、固相に結合させた可溶性ｅｌｋまたはｈｅｋ（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧを含む固相に結合させた可溶性のｅｌｋ／Ｆｃまたはｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質）で代用できる。その他の型の競合結合アッセイでは、放射能標識した可溶性ｅｌｋまたはｈｅｋ、およびＬＥＲＫ−５を発現する完全な細胞が用いられる。また、本発明のＬＥＲＫ−５を結合アッセイに用いて、ｅｌｋまたはｈｅｋを発現している細胞を検出することもできる。例えば、ＬＥＲＫ−５またはその細胞外ドメインを、放射性核種、比色または蛍光測定反応を触媒することのできる酵素、ビオチンまたはアビジンのような検出可能な部分と複合させることができる。ｅｌｋまたはｈｅｋの発現について試験する細胞を、標識したＬＥＲＫ−５と接触させる。インキュベーション後未結合の標識ＬＥＲＫ−５を細胞から分離し、検出可能部分を用いて結合を測定する。本発明の一つの態様は、ｅｌｋまたはｈｅｋタンパク質を結合させるために、ＬＥＲＫ−５を用いることを含む。例えば、ＬＥＲＫ−５はタンパク質精製法の試薬として用いることができる。ＬＥＲＫ−５またはＬＥＲＫ−５／Ｆｃ融合タンパク質は、従来の技術によって固体支持物質に付着させ、アフィニティークロマトグラフィーによってｅｌｋまたはｈｅｋを精製するために用いられる。本明細書中に開示したＬＥＲＫ−５タンパク質はまた、ＬＥＲＫ−５へのそれらの結合親和性によってｅｌｋまたはｈｅｋタンパク質の生物活性を測定するために用いることができる。一つの例としてＬＥＲＫ−５は、ｅｌｋまたはｈｅｋタンパク質を（例えば、化学修飾、切除（truncation）、突然変異等で）修飾した後も生物活性が保持されているか否かを測定するために用いうる。このように、ｅｌｋまたはｈｅｋタンパク質の生物活性を、例えば、それを調査研究に用いる前に確認することができる。ＬＥＲＫ−５タンパク質は、例えば、異なる条件下でのｅｌｋタンパク質の保存寿命および安定性をモニターするために「品質保証」の研究を行う人々により用いられる試薬としての用途が見出されている。実例として、異なる温度で保持されていたまたは異なる細胞型で生産されたｅｌｋタンパク質の生物活性を測定するための結合親和性の研究において、ＬＥＲＫ−５を用いることができる。修飾されたｅｌｋタンパク質のＬＥＲＫ−５への結合親和性を修飾されていないｅｌｋタンパク質のそれと比較すると、修飾によるｅｌｋの生物活性へのあらゆる不利な影響が検出される。同様に、ｈｅｋタンパク質の生物活性をＬＥＲＫ−５を用いて評価することが出来る。またＬＥＲＫ−５ポリペプチドは、それに結合している薬剤をｅｌｋまたはｈｅｋ細胞表面レセプターを発現している細胞へ運ぶためのキャリアーとして用いられることも見出されている。ＪＭと呼ばれるヒトＴ細胞白血病細胞系およびＬＫ６３と呼ばれるヒト前駆Ｂ細胞白血病細胞系を含むある種の白血病細胞系で、ｈｅｋ抗原の発現が報告されている（Ｂｏｙｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：３２６２，１９９２およびＷｉｃｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１６１１，１９９２）。このように、ＬＥＲＫ−５タンパク質はｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏにおける方法で、これらの細胞（または細胞表面にｈｅｋを発現することが見出されたその他の細胞型）に診断用または治療用薬剤を配達するために用いることが出来る。そのような使用例の一つとして、治療剤／ＬＥＲＫ−５複合体にｈｅｋ⁺白血病細胞系をさらし、薬剤が白血病細胞に対して細胞毒性を示すか否かを評価することが上げられる。ＬＥＲＫ−５に結合された数多くの異なる治療剤が、白血病細胞への薬剤の細胞毒性効果を検出し比較するアッセイに含まれることができる。ＬＥＲＫ−５／診断用薬剤複合体は、生体外または生体内でｈｅｋ⁺細胞の存在を検出するために用いることができる。ＬＥＲＫ−５ポリペプチドに結合できる診断用および治療用薬剤は、これに限定されるわけではないが、予定された応用に従って選択される特定の薬剤と共に、薬剤、毒、放射性核種、発色団、比色または蛍光測定反応を触媒する酵素、およびその類似物を含む。薬剤の例としては、様々な形の癌の治療に用いられるそれら、例えば、Ｌ−フェニルアラニンナイトロジェンマスタードまたはシクロホスファミドのようなナイトロジェンマスタード、シス−ジアミノジクロロプラチナのような挿入剤、５−フルオロウラシルのような抗代謝剤、ビンクリスチンのようなビンカアルカロイド、およびブレオマイシン、ドキソルビシンのような抗生物質ならびにそれらの誘導体が含まれる。毒素の中には、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａエキソトキシンＡ、リボゾーム不活性化タンパク質、トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）のようなマイコトキシン、ならびにそれらの誘導体およびフラグメント（例えば、一本鎖）がある。診断用として適当な放射性核種には、これらに限られるわけではないが、¹²³Ｉ、¹³¹Ｉ、^99mＴｃ、¹¹¹Ｉｎおよび⁷⁶Ｂｒが含まれる。治療用として適当な放射性核種には、これらに限られるわけではないが、¹³¹ Ｉ、²¹¹Ａｔ、⁷⁷Ｂｒ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、²¹²Ｐｂ、²¹²Ｂｉ、¹⁰⁹Ｐｄ、⁶⁴Ｃｕ及び⁶⁷Ｃｕが含まれる。そのような薬剤は、任意の適当な従来からの方法によって、ＬＥＲＫ−５に結合させて良い。ＬＥＲＫ−５は、タンパク質であり、例えば、所望される薬剤の官能基と反応して共有結合を形成できるアミノ酸側鎖の官能基を含む。代わりに、タンパク質または薬剤を所望する反応性官能基を生成または付着させるために修飾しても良い。修飾には、タンパク質に様々な分子を付着させることを可能にする二官能性カップリング試薬の一つを付着させることが含まれる（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）。タンパク質を放射能標識する数多くの技術が知られている。放射性核種金属は、例えば、適当な二官能性キレート剤を用いることによってＬＥＲＫ−５に付着させても良い。ＬＥＲＫ−５および適当な診断用または治療用薬剤からなる（望ましくは共有結合した）複合体は、このように調製される。複合体は、特定の適用に適当な量で投与されるかまたは使用される。本発明のＬＥＲＫ−５のもう一つの使用法は、ｅｌｋまたはｈｅｋと複合してｅｌｋまたはｈｅｋレセプターを発現する細胞の増殖または分化に演じるであろう、ＬＥＲＫ−５の役割を研究する研究用の道具として用いられることである。また、本発明のＬＥＲＫ−５ポリペプチドは、ｅｌｋまたはＬＥＲＫ−５またはその相互作用を検出するためのｉｎｖｉｔｒｏでのアッセイに用いられて良い。同様に、ＬＥＲＫ−５は、ｈｅｋまたはｈｅｋとＬＥＲＫ−５の相互作用のアッセイに用いられることが見出されている。上に考察したように、様々なラット組織をｅｌｋ−ｍＲＮＡについて分析したところ、転写物は脳および精巣にのみ検出された（Ｌｈｏｔａｋら、上記）。神経組織上でのＬＥＲＫ−５のｅｌｋへの結合は、神経保護効果または神経栄養効果を及ぼすと信じられている。ＬＥＲＫ−５は、組織培養試薬として用いられることが分かっている。ＬＥＲＫ−５タンパク質は、培養神経の生存度を強化するまたは寿命を延長するためにｉｎｖｉｔｒｏで培養された神経に加えることができ、そうすることによって、神経組織の研究が容易になる。培養液に加えるＬＥＲＫ−５の適当な濃度は、毎日の試験によって決定することができる。本発明の一つの実施態様は、神経組織をＬＥＲＫ−５と接触させることを含む、神経組織の疾病を治療する方法である。そのような疾病には、損傷または慢性急性のいずれかの神経性疾病が含まれる。ＬＥＲＫ−５タンパク質は、そのような損傷または疾病を治療するために哺乳動物に投与することができる。本発明の一つの実施態様では、ＬＥＲＫ−５は、少なくとも部分的には刺激神経毒性として既知の神経死の機構によって特徴づけられる、または仲介される神経変性状態の治療に用いられる。さらにＬＥＲＫ−５は、神経組織に栄養効果を及ぼすために哺乳動物に投与できる。損傷または疾病による神経の損失または損傷に苦しむ患者では、ＬＥＲＫ−５は生き残ったそれら神経の生存能力を強化できる。本発明は、有効量の精製ＬＥＲＫ−５ポリペプチドおよび適当な希釈剤、補助剤、または担体を含む医薬組成物を提供する。そのような担体は、用いられる投与量および濃度では患者に毒性を示さないであろう。通常、そのような組成物の調製は、哺乳動物のＬＥＲＫ−５ポリペプチドまたはその誘導体を、バッファー、アスコルビン酸のような抗酸化剤、低分子量（約１０残基より少ない）ペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（グルコース、スクロース、またはデキストラン）、ＥＤＴＡのようなキレート剤、グルタチオン、またはその他の安定剤および補助剤と組み合わせることを、必然的に伴う。中性に緩衝化した塩類溶液は、適当な希釈剤の一つである。治療に用いるために、組成物は、徴候および患者に適当な様式および服用量で投与される。本発明の分野の当業者には理解されるように、治療に有効な服用量は、治療される状態の性質及び重度、並びに患者の年齢、体格および健康状態等の因子によって変わるであろう。投与は、これらに限られるわけではないが、連続注入、手術中の局部注入、心室内注入（心室内カテーテルの使用を含む）、埋没物（ゲル、膜およびその類似物）からの持続放出または注射（例えば損傷部位への注射もしくは中枢神経系内への注射）を含む、適当な経路で行うことができる。本発明の組成物は、変異体、誘導体、およびその生物活性フラグメントを含む、上記のあらゆる形のＬＥＲＫ−５タンパク質を含んでよい。本発明の一つの実施態様では、組成物は可溶性のヒトＬＥＲＫ−５タンパク質からなる。そのようなタンパク質は、上記のようにＦｃポリペプチドに融合させたヒトＬＥＲＫ−５の細胞外ドメインを含んでも良い。オリゴマー形のＬＥＲＫ−５二量体または三量体のような、オリゴマーの形のＬＥＲＫ−５ポリペプチドは、本発明の内にある。そのようなオリゴマーは、自然発生するか、または組換えＤＮＡ技術によって生成することができる。オリゴマーは、ジスルフィド結合で結合されたか、または、スペーサーペプチドリンカーを伴うもしくは伴わない融合タンパク質として発現された、ＬＥＲＫ−５ポリペプチド（望ましくは細胞外ドメインまたはそのフラグメント）からなって良い。オリゴマーは、例えば、異なるＬＥＲＫ−５ポリペプチド上のシステイン残基の間のジスルフィド結合によって形成することができる。ＬＥＲＫ−５オリゴマーは、免疫グロブリンから誘導されたポリペプチドを用いて調製することもできる。抗体から誘導されたポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の様々な部分と融合させた異種のポリペプチドからなる融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、ＰＮＡＳＵＳＡ８８：１０５３５，１９９１およびＢｙｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ３４４：６７７，１９９０に記載されており、ここに参照として援用される。本発明の一つの実施態様では、ＬＥＲＫ−５二量体は、ＬＥＲＫ−５を抗体（ＩｇＧ１）のＦｃ領域と融合させることによって作り出される。Ｆｃポリペプチドは、可溶性ＬＥＲＫ−５のＣ末端（細胞外ドメインのみからなる）と融合させることが望ましい。ＬＥＲＫ−５／Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合物は、適当な発現ベクターに挿入される。ＬＥＲＫ−５／Ｆｃ融合タンパク質は、組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞で発現し、また、抗体分子と同様に凝集できるので、その結果、鎖間ジスルフィド結合がＦｃポリペプチド間で形成され、二価のＬＥＲＫ−５が得られる。融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖の両者で作られるならば、４つまでのＬＥＲＫ−５細胞外領域を持つＬＥＲＫ−５オリゴマーを形成することが可能である。本明細書中で用いられる”Ｆｃポリペプチド”という言葉は、抗体のＦｃ領域より誘導した天然型および変異型のポリペプチドを含む。また、二量体化を促進するヒンジ領域を含む切除型のそのようなポリペプチドも含まれる。一つの好適なＦｃポリペプチドは、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１に記載されているように、Ｎ末端ヒンジ領域から天然型のＣ末端におよぶ一本鎖ポリペプチドである。このＦｃポリペプチドの変異型は、以下に示す実施例３に記載されている。この変異型はＦｃレセプターの親和性を減少させる。あるいは、ペプチドリンカーを媒介として、ＬＥＲＫ−５ポリペプチド（望ましくは２つの可溶性ＬＥＲＫ−５ポリペプチド）を連結することができる。ポリペプチドの連結に適当なペプチドリンカーは、既知であり、従来の技術によって用いうる。ペプチドリンカーによって連結されたＬＥＲＫ−５ポリペプチドからなる融合タンパク質は、例えば、組み換えＤＮＡ技術によって生成することができる。本発明は、ジスルフィド相互作用によって連結された、またはスペーサーアミノ酸連結基の存在下もしくは非存在下で融合ポリマーとして発現された、ＬＥＲＫ−５細胞外ドメインまたはそのフラグメントのオリゴマーを提供する。例えば、ＬＥＲＫ−５細胞外ドメインの二量体は、ＩｇＧのＦｃ領域の連結基によって連結できる。発現系本発明は、ＬＥＲＫ−５を発現させるための組換え発現ベクター、および発現ベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。任意の適当な発現系を用いることができる。ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子から誘導されたような転写または翻訳を制御する適当なヌクレオチド配列に、機能可能なように連結したＬＥＲＫ−５ＤＮＡ配列を含む。制御配列の例としては、転写プロモーター、オペレータもしくはエンハンサー、ｍＲＮＡリボゾーム結合部位、および転写および翻訳の開始および終結を制御する適当な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は制御配列がＬＥＲＫ−５ＤＮＡ配列と機能的に関係する場合、機能するように連結されている。このように、プロモーターヌクレオチド配列がＬＥＲＫ−５ＤＮＡ配列の転写を制御する場合、プロモーターヌクレオチド配列はＬＥＲＫ−５ＤＮＡ配列と機能できるように連結されるている。さらに、通常は複製開始点によって授与される所期の宿主細胞内での複製能力、および形質転換株を同定するための選択遺伝子を発現ベクター中に更に組み込んでもよい。さらに、ＬＥＲＫ−５遺伝子に本来存在しない適当なシグナルペプチドをコードする配列を、発現ベクター内に組み込んでもよい。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を、ＬＥＲＫ−５配列とフレームが合うように融合させると、その結果、ＬＥＲＫ−５は、最初、シグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳される。予定される宿主細胞中で機能するシグナルペプチドは、ＬＥＲＫ−５ポリペプチドの細胞外への分泌を増強する。シグナルペプチドは、ＬＥＲＫ−５が細胞から分泌される時点で、ＬＥＲＫ−５ポリペプチドから切断される。ＬＥＲＫ−５ポリペプチドを発現する適当な宿主細胞には、原核生物、酵母またはより高等な真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物の細胞宿主で用いられる適当なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、クローニングベクター（ＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒ）：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８５）に記載されている。また、本明細書中に開示したＤＮＡ構築物から誘導したＲＮＡを用いてＬＥＲＫ−５ポリペプチドを生成するために、無細胞翻訳系を用いることもできるだろう。原核生物には、例えば、大腸菌または桿菌等のグラム陰性またはグラム陽性の生物が含まれる。形質転換に適当な原生生物の宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、並びにシュードモナス、ストレプトマイセス、およびスタフィロコッカス属の内の他の様々な種が含まれる。大腸菌のような原核生物宿主細胞内では、ＬＥＲＫ−５ポリペプチドは原核生物宿主細胞内での組換えポリペプチドの発現を容易にするためにＮ末端メチオニン残基を含んでもよい。このＮ末端Ｍｅｔは、発現された組換えＬＥＲＫ−５ポリペプチドから切り離すことができる。原核生物宿主細胞で用いられる発現ベクターは、一般的に一つまたはそれより多くの選択可能な表現型マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を授与するタンパク質または独立栄養要求性を供給するタンパク質をコードする遺伝子である。原核生物宿主細胞に有用な発現ベクターの例としては、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）のような商品として入手可能なプラスミドから誘導したベクターが含まれる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン耐性およびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含み、それ故、形質転換された細胞を同定する簡単な手段が提供される。適当なプロモーターおよびＬＥＲＫ−５ＤＮＡ配列が、ｐＢＲ３２２ベクター内に挿入される。その他の商品として入手可能なベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ．Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐＧＥＭ１（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）が含まれる。組換え原核生物宿主細胞発現ベクターに普通に用いられるプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ２７５：６１５，１９７８；およびＧｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ２８１：５４４，１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．８：４０５７，１９８０およびＥＰ−Ａ−３６７７６）およびｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、４１２，１９８２）が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現系は、ファージλ Ｐ_LプロモーターおよびｃＩ８５７ts非耐熱性リプレッサー配列を用いる。λＰ_L プロモーターの誘導体を取り込んでいるＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２［大腸菌株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ３７０９２）内に存在する］およびｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１（ＡＴＣＣ５３０８２）内に存在する］が含まれる。あるいは、ＬＥＲＫ−５を酵母宿主細胞中で、望ましくはサッカロミセス属（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から、発現させても良い。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）またはクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のような他の属の酵母もまた用いることができる。酵母ベクターは場合により、２μ酵母プラスミドからの複製開始点配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化配列、転写終結配列、および選択可能なマーカー遺伝子を含むであろう。酵母ベクターのプロモーター配列に適するプロモーター配列には、とりわけメタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３，１９８０）、または、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのような、その他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．ＥｎｚｙｍｅＲｅｇ．７：１４９，１９６８；およびＨｏｌｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：４９００，１９７８）のプロモーターが含まれる。酵母中での発現に用いられるその他の適当なベクターおよびプロモーターは、Ｈｉｔｚｅｍａｎ，ＥＰＡ−７３，６５７に記載されている。もう一つの代替物は、Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４，１９８２；およびＢｅｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３００：７２４，１９８２に記載されているグルコース−抑制性ＡＤＨ２プロモーターである。酵母および大腸菌の両方で複製できるシャトルベクターは、大腸菌内での選択および複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐ^r遺伝子および複製開始点）を、上記の酵母ベクターに挿入することによって構築できる。酵母のα因子リーダー配列を用いて、ＬＥＲＫ−５ポリペプチドの分泌を行わせることができる。このα因子リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝子配列との間に挿入されることが多い。Ｋｕｒｊａｎら、Ｃｅｌｌ３０：９３３，１９８２；Ｂｉｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：５３３０，１９８４；米国特許第４，５４６，０８２号およびＥＰ第３２４，２７４号を参照のこと。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適当なその他のリーダー配列は、当業者に既知である。リーダー配列は、一つまたはそれより多くの制限部位を含むようにその３’末端の近くで修飾されていてもよい。このことは、リーダー配列の構造遺伝子への融合を促進するであろう。酵母形質転換のプロトコールは、当業者に既知である。そのようなプロトコールの一つは、Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：１９２９，１９７８に記載されている。Ｈｉｎｎｅｎらのプロトコールは、選択培地（０．６７％酵母窒素原基、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニンおよび２０μｇ／ｍｌウラシルを含む）中でＴｒｐ⁺ 形質転換株を選択する。ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターによって形質転換された酵母宿主細胞は、発現を誘導するように「富栄養」培地中で増殖させても良い。富栄養培地の例としては、８０μｇ／ｍｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウラシルを添加した１％酵母エキス、２％ペプトン、および１％グルコースを含む培地が挙げられる。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、培地からグルコースが使い尽くされた場合に起こる。また、哺乳動物または昆虫の宿主細胞培養系を用いて組換えＬＥＲＫ−５ポリペプチドを発現させることもできるだろう。昆虫細胞中で異種起源タンパク質を生成するバキュロウイルスの系は、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：４７，１９８８に総説されている。また、哺乳動物を起源とする確立された細胞系を用いても良い。適当な哺乳動物宿主細胞系の例としては、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら、Ｃｅｌｌ２３：１７５，１９８１）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＢＨＫ（ＡＴＣＣＣＲＬ１０）細胞系、並びにＭｃＭａｈａｎら、ＥＭＢＯＪ．１０：２８２１，１９９１に記載されているように、アフリカミドリザルの腎臓細胞系ＣＶ１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）より誘導されたＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞系が含まれる。哺乳動物宿主細胞発現ベクターの転写制御および翻訳制御配列は、ウイルスゲノムから切り出すことができる。普通に用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サルウイルス４０（ＳＶ４０）およびヒトのサイトメガロウイルスから誘導される。ＳＶ４０ウイルスゲノムから誘導したＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起点、初期プロモーターおよび後期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位およびポリアデニル化部位は、哺乳動物の宿主細胞内で構造遺伝子配列を発現させるためのその他の遺伝子エレメントを提供するために用いることができる。ウイルスの初期および後期プロモーターはいずれも、ウイルスの複製開始点をも含むであろうフラグメントとして、ウイルスゲノムから簡単に得られるため、特に有用である（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ２７３：１１３，１９７８）。より小さいまたはより大きいＳＶ４０フラグメントが用いることができる。但し、ＳＶ４０ウイルスの複製開始点部位内に位置するＨｉｎｄIII部位からＢｇｌ１部位に及ぶおおよそ２５０ｂｐの配列が含まれることを条件とする。哺乳動物の宿主細胞中で用いられる好例な発現ベクターは、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ、Ｍｏｌ.Ｃｅｌｌ.Ｂｉｏｌ．３：２８０，１９８３に開示された方法に従って構築できる。Ｃ１２７マウス哺乳動物上皮細胞中での哺乳動物のｃＤＮＡの安定な高レベル発現に有用な系は、実質的にＣｏｓｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５，１９８６に記載の方法に従って構築できる。Ｃｏｓｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ３１２：７６８，１９８４に記載されている有用な高発現ベクター、ＰＭＬＳＶＮ１／Ｎ４は、ＡＴＣＣ３９８９０に寄託されている。さらに有用な哺乳動物の発現ベクターはＥＰ−Ａ−０３６７５６６に記載されている。その他の適当なベクターはレトロウイルスから誘導できる。天然型のシグナル配列の代わりに、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されたインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列：Ｃｏｓｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ３１２：７６８，１９８４、に記載のインターロイキン−２レセプターのシグナル配列；ＥＰ第３６７，５６６号に記載のインターロイキン−４シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載のインターロイキン−１レセプターシグナルペプチドＩ型；およびＥＰ第４６０、８４６号に記載のインターロイキン−１レセプターシグナルペプチドII型のような、異種起源のシグナル配列を加えても良い。ＬＥＲＫ−５タンパク質本発明は、上記のような組換え発現系によって産生させることも、あるいは天然に存在する細胞から精製することもできる精製ＬＥＲＫ−５タンパク質を提供する。都合良くはＬＥＲＫ−５は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析において他のタンパク質に相当するタンパク質のバンドがで検出されないように精製される。関連分野の技術者らは、上記のようなグルコシル化の差異、翻訳後プロセシングの差異およびその他の原因によって、ＬＥＲＫ−５タンパク質に相当する複数のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥに見られるであろうことを認識するであろう。ＬＥＲＫ−５タンパク質は、異なる（ＬＥＲＫ−５でない）タンパク質に相当するバンドが見えない限り、精製されていると考えられる。ＬＥＲＫ−５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析でタンパク質のバンドが単一であることによって示されるように、実質上均一になるまで精製されることが最も望ましい。ＬＥＲＫ−５タンパク質を生成させる一つの方法は、ＬＥＲＫ−５をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞をＬＥＲＫ−５が発現するような条件下で培養することを含む。次いで、用いられた発現系に応じてＬＥＲＫ−５タンパク質を培養培地または細胞抽出物から回収する。当業者らは、組換えＬＥＲＫ−５を精製する方法は、用いられた宿主細胞の型およびＬＥＲＫ−５が培養液中に分泌されているかどうかと言ったような因子によって異なることを認識するであろう。例えば、組換えタンパク質を分泌する発現系が用いられる場合、まず最初に、商品として入手できるタンパク質濃縮用フィルター、例えば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）またはミリポアペリコン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｅｌｌｉｃｏｎ）の限外ろ過ユニットを用いて、培養培地を濃縮してもよい。濃縮段階に次いで、濃縮液をゲル濾過培地の如き精製用マトリックスに適用できる。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えば遊離の（ｐｅｎｄａｎｔ）ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を持つマトリックス若しくは支持体を用いることもできる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質の精製に普通に用いられるその他の型である。代わりに、陽イオン交換法を用いることもできる。適当は陽イオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性のマトリックスが含まれる。スルホプロピル基が望ましい。最終的には、疎水性の高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒体（例えば、遊離のメチル基またはその他の脂肪族基を有するシリカゲル）を用いた、一つまたはそれより多い逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ｋ工程を用いて、ＬＥＲＫ−５をさらに精製することが出来る。上述の精製段階のいくつかまたはすべてを様々な組み合わせで用いて、実質上均一な組換えタンパク質を提供することもできる。また、発現したＬＥＲＫ−５ポリペプチドのアフィニティー精製に、ｅｌｋまたはｈｅｋのリガンド結合ドメインを含むアフィニティーカラムを用いることも可能である。ＬＥＲＫ−５ポリペプチドは、高塩の溶離緩衝液でアフィニティーカラムから回収でき、次いで、使用のために低塩緩衝液中で透析される。または、免疫親和性カラムはＬＥＲＫ−５を結合する抗体を含んでもよい。可溶性ＬＥＲＫ−５／Ｆｃ融合タンパク質は、プロテインＡまたはプロテインＧを結合させたクロマトグラフィーマトリックスを用いて精製することもできる。細菌培養で生成された組換えタンパク質は、通常、最初に宿主細胞を粉砕し、遠心分離し、不溶性ポリペプチドであれば細胞ペレットから、または可溶性ポリペプチドであれば上澄み液からの抽出した後、一つまたはそれより多くの方法での濃縮、脱塩、イオン交換、アフィニティー精製、またはサイズ排除クロマトグラフィーの段階によって分離される。最後に、ＲＰ−ＨＰＬＣが、最終精製段階として用いられる。微生物細胞は、凍結融解の繰り返し、音波処理、機械的粉砕、または細胞溶菌剤の使用を含む、任意の慣用された方法によって粉砕できる。形質転換された酵母宿主細胞内では、ＬＥＲＫ−５は精製を簡単にするために分泌ポリペプチドとして発現することが望ましい。分泌された組換えポリペプチドは、Ｕｒｄａｌら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１，１９８４；に開示されている方法に類似した方法で、精製できる。Ｕｒｄａｌらは、組換えヒトＩＬ−２を精製するための分離用ＨＰＬＣカラムでの２連続逆相ＨＰＬＣ工程を含む方法について記載している。核酸さらに、本発明は、ＬＥＲＫ−５のヌレオチド配列を提供する。そのようなヌクレオチド配列には、これらに限定されるわけではないが、ここに開示した一本鎖型および二本鎖型の両方のＬＥＲＫ−５ＤＮＡならびにそのＲＮＡ相補体が含まれる。本発明のＬＥＲＫ−５ＤＮＡは、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、およびそれらを組み合わせを含む。ゲノムＤＮＡは、実施例１で単離したｃＤＮＡまたはその適当なフラグメントをプローブとして用い、慣用的技術に従って単離できる。本発明のＬＥＲＫ−５ＤＮＡの例としては、これらに限定されるわけではないが、配列番号１のヌクレオチド１から１００２（配列番号２の全長のＬＥＲＫ− ５をコードする）；配列番号１のヌクレオチド７６から１００２（全長の成熟ＬＥＲＫ−５をコードする）；配列番号１のヌクレオチド１から６７２（シグナルペプチドおよび細胞外ドメインをコードする）；および配列番号１のヌクレオチド７６から６７２（細胞外ドメインをコードする）からなる群より選択されたヌクレオチド配列からなるＤＮＡを含む。既知の遺伝子コードの縮重により、一つより多いコドンが同じアミノ酸をコードできる。それ故、ＤＮＡ配列を上記のそれらから変化させてもなお、同じアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードできる。そのようなＤＮＡ配列変異体は、例えばＰＣＲ増幅の間に起こるような沈黙突然変異の結果生じ得る。あるいは、そのような沈黙突然変異は、天然型配列の意図的な変異誘発による生成物であろう。本明細書中に開示されたＬＥＲＫ−５をコードするＤＮＡ配列と遺伝暗号の結果縮重するＤＮＡ配列も、本発明の範囲内である。ＬＥＲＫ−５核酸の有用なフラグメントには、標的ＬＥＲＫ−５ｍＲＮＡ（センス）またはＬＥＲＫ−５ＤＮＡ（アンチセンス）配列と結合する能力を持つ一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を有するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明のアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＥＲＫ−５ｃＤＮＡのコード領域のフラグメントからなる。そのようなフラグメントは、一般的に、少なくとも約１４のヌクレオチド、望ましくは約１４から約３０のヌクレオチドからなる。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいて、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４８：２６５９，１９８８ならびにｖａｎｄｅｒＫｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：９５８，１９８８に記載されている。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを標的核酸配列に結合させると二本鎖が形成され、それはそれら二本鎖の分解強化、転写もしくは翻訳の未成熟終了を含むいくつかの手段の一つによって、またはその他の手段によって、標的配列の転写または翻訳をブロックする。それ故、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＥＲＫ−５タンパク質の発現をブロックするために用いることができる。アンチセンスまたはセンスヌクレオチドはさらに、修飾された糖−ホスホジエステル骨格（または、ＷＯ９１／０６６２９に記載されているその他の糖結合）を持つオリゴヌクレオチドを含み、そのような糖結合は内在性ヌクレアーゼに耐性である。耐性の糖結合を持つそのようなオリゴヌクレオチドは、生体内で安定である（即ち、酵素分解を抵抗する能力を持つ）が、標的ヌクレオチド配列を結合する能力を持つ配列特異性を保持している。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのその他の例には、ＷＯ９０／１０４４８に記載されたような有機部分、およびポリ−（Ｌ−リジン）のように標的核酸配列へのオリゴヌクレオチド親和性を増加させるその他の部分、に共有結合しているオリゴヌクレオチドが含まれる。さらになお、エリプチシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）のような挿入剤、アルキル化剤または金属錯体をセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに付着し、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を修飾することもできる。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ₄媒介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子伝達方法によって、またはエプスタイン−バールウイルスのような遺伝子伝達ベクターを用いることによって、標的核酸配列を含む細胞内に導入できる。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくはアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを適当なレトロウイルスベクター内に挿入し、次いで、挿入された配列を含むレトロウイルスベクターと細胞とをｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏのいずれかで接触させることによって、標的核酸配列を含む細胞内に導入する。適当なレトロウイルスベクターには、これらに限定されるわけではないが、ネズミのレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶより誘導されたレトロウイルス）、あるいはＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５ＢおよびＤＣＴ５Ｃと呼ばれる二重コピーベクター（ＰＣＴ出願ＵＳ９０／０２６５６を参照のこと）から誘導されたベクターが含まれる。また、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドをＷＯ９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合性分子との複合体を形成することによって標的ヌクレオチド配列を含む細胞内に導入することもできる。適当なリガンド結合分子は、これらに限定されるわけではないが、細胞表面レセプター、増殖因子、その他のサイトカイン、または細胞表面レセプターと結合するその他のリガンドを含む。リガンド結合性分子の複合化は、リガンド結合性分子がその対応する分子またはレセプターに結合する能力を実質的に妨害しないか、センス若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその複合体の細胞内への導入をブロックしないことが望ましい。また、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドをＷＯ９０／０１４４８に記載されているように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体を形成させることによって、標的核酸配列を含む細胞内に導入することもできる。このセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内在性リパーゼによって細胞内で分離される。以下の実施例は、特定の実施態様を具体的に説明するものであって、本発明の範囲を制限するものではない。実施例１：ヒトＬＥＲＫ−５ｃＤＮＡの単離ヒトＬＥＲＫ−５をコードするｃＤＮＡを、以下の方法に従って単離した。方法は、クローニングに用いるための適当なｃＤＮＡライブラリーの同定、並びにそのようなライブラリーのスクリーニングに用いるプローブの調製から始められた。まず最初に、様々な細胞型から単離されたＲＮＡ上でｃＤＮＡ鎖を合成した。次いで、当該ｃＤＮＡを鋳型として用いて、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）が慣用的技術に従って行われた。ＰＣＲでは、５’および３’プライマーとして、ｃｈ１３ｓｅｑｔａｇ（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｌ１３８１９）と呼ばれる３７７ｂｐのＤＮＡフラグメントからなる末端を定めるオリゴヌクレオチドが用いられた。このＤＮＡフラグメントは、先により詳細に考察したように、ｅｌｋリガンドＤＮＡの一部分との相同性の程度から選ばれた。予想されたサイズ（３３７ｂｐ）のＤＮＡのバンドが、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２（ＡＴＣＣＣＣＬ１２０．１）と名付けられたＴ細胞白血病細胞系から単離されたＲＮＡに由来するｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応によって増幅された。この３３７ｂｐの一本鎖ＤＮＡフラグメントが単離され、プローブとして用いるために標準技術によって³²Ｐで標識された。様々な組織からのｍＲＮＡを含むノーザンブロットは、³²Ｐ標識のＤＮＡフラグメントをプローブとして行った。ハイブリッド形成したｍＲＮＡ（約５ｋｂ）は、ヒト胎児の脳および肺を含む組織で検出された。さらに、予想されるサイズのＤＮＡバンド（３３７ｂｐ）は、鋳型としてヒト成人または胎児のいずれかの肺のｃＤＮＡライブラリーを用いたＰＣＲによって増幅できた。このように、全長のクローンを単離する試みにおいて³²Ｐ標識プローブでスクリーニングするために、ヒト胎児脳からおよびヒト肺繊維芽細胞から誘導したｃＤＮＡライブラリーが選択された。ファージλベクターλｇｔ１０内に挿入されたヒト胎児脳のｃＤＮＡライブラリーは、ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａより購入した。ｃＤＮＡは、ベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入される。第二のｃＤＮＡライブラリーは、ＳＶ４０で形質転換したヒト成人肺繊維芽細胞細胞系ＷＩ−２６ＶＡ４から誘導された。このライブラリーは、米国特許第５，２６４，４１６号の実施例２に記載の方法に従ってファージλベクターλｇｔ１０内に構築された。３３７ｂｐプローブでのスクリーニングは慣用された方法によって行われ、ハイブリダイズしたクローンが両ライブラリーにおいて同定された。ヒト胎児脳のライブラリーから単離された個々のクローンの一つ（クローンλ６と命名）の、ｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列を決定した。クローンλ６ｃＤＮＡのコード領域のＤＮＡ配列、およびそれによってコードされるアミノ酸配列を、配列番号１および配列番号２に示す。ＷＩ２６ＶＡ４ライブラリーから単離したクローンは５’末端が切除されたＤＮＡからなるが、配列番号１の配列の開始コドンより５ｂｐ短いだけである。コードされたタンパク質は、ＬＥＲＫ−５と名付けられ、Ｎ末端シグナルペプチド（配列番号２のアミノ酸−２５から−１）、細胞外ドメイン（アミノ酸１から１９９）、膜貫通領域（アミノ酸２００から２２５）、および細胞質ドメイン（アミノ酸２２６から３０８）からなる。ＬＥＲＫ−５は、実施例４に示すように、ｅｌｋおよびｈｅｋとして既知の二つの細胞表面レセプターと結合する。配列番号１のヌクレオチド３１０から６４６は、上記の３３７ｂｐの配列ｔａｇ（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、受託番号Ｌ１３８１９）と、一つの誤対合を持つのみで、一致する。配列番号１のＬＥＲＫ−５ＤＮＡのヌクレオチド５６８はＡであるが、配列ｔａｇのこの位置はＧである。この差は、対立遺伝子変異またはクローニングの人為結果によるものと解釈できる。配列番号１の位置５６８でＡがＧに変化すると、位置１６５のアミノ酸はＡｓｎではなくＡｓｐとなる。クローンλ６ＤＮＡ（λｇｔ１０内に挿入したＬＥＲＫ−５ｃＤＮＡ）を含む細胞溶菌液は、１９９４年６月１６日、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡに寄託された（寄託番号ＡＴＣＣ７５８１５）。寄託は、ブダペスト条約の条件の下に行われた。実施例２：可溶性ｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質の調製この実施例は、可溶性ｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質をコードする発現ベクターの構築について記載している。この融合タンパク質は、実施例４に記載されたＬＥＲＫ−５がｅｌｋを結合する能力を持つか否かを決定するための結合アッセイに用いられた。ラットのｅｌｋｃＤＮＡのＤＮＡ配列およびコードするアミノ酸配列は、Ｌｈｏｔａｋら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２４９６，１９９１に示されており、ここに参照として援用される。ラットのｅｌｋタンパク質は、５３８アミノ酸からなる細胞外ドメイン、２５アミノ酸からなる膜貫通ドメイン、および４１９アミノ酸からなる細胞質ドメインを持つ。ラットのｅｌｋｃＤＮＡフラグメントを、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分をコードするｃＤＮＡの５’末端に融合させた。ラットのｅｌｋ−ｃＤＮＡは、Ｔ．Ｐａｗｓｏｎ（ＳａｍｕｅｌＬｕｎｅｎｆｅｌｄＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍｔ．ＳｉｎａｉＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｏｒｏｎｔｏ）から得た。Ａｓｐ７１８の制限エンドヌクレアーゼ切断部位は、ｅｌｋコード領域の上流に導入した。ラットのｅｌｋｃＤＮＡのＡｓｐ７１８−ＢｇｌIIフラグメント（全細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞質ドメインの小部分からなる）を単離した。ヒトのＩｇＧ１抗体のＦｃ領域からなる単一のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａより商品として入手できるｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴＳＫ（登録商標）ベクターのＳｐｅＩ部位にクローン化した。このプラスミドベクターは大腸菌内で複製可能であり、２１のユニークな制限部位を含むポリリンカーセグメントを含んでいる。クローン化したＤＮＡのヌクレオチド配列は、それによってコードされるＦｃポリペプチドのアミノ酸配列と共にＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１に記載されており、ここに参照として援用される。ユニークなＢｇｌII部位が導入され、Ｆｃポリペプチドのアミノ酸３および４のコドンの内に取り込まれる。コードされたＦｃポリペプチドは、Ｎ末端ヒンジ領域から天然型Ｃ末端に及ぶ、即ち本質的に全長の抗体Ｆｃ領域である。上記のＡｓｐ７１８−ＢｇｌII ｅｌｋｃＤＮＡフラグメントは、ｅｌｋｃＤＮＡがＦｃｃＤＮＡの上流に位置するように、ＦｃｃＤＮＡを含むｐＢＬＵＥＣＲＩＰＴＳＫ（登録商標）ベクターにクローン化された。遺伝子融合の結果として誘導された一本鎖ＤＮＡは、ｅｌｋの全細胞外ドメインをＦｃ配列に完璧に融合させるために、Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８，１９８５およびＫｕｎｋｅｌら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７，１９８７に記載されている方法に従って変異誘発させた。変異誘発したＤＮＡは、本来のヌクレオチドが排除されていること（即ち、膜貫通領域および細胞質ドメインの一部のＤＮＡが欠失していること）、およびｅｌｋおよびＦｃ配列が同じ読み枠の内にあることを確認するために、配列決定された。ｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＶ１−ＥＢＮＡまたはＣＯＳ−７細胞等の哺乳動物の宿主細胞内で合成されることが望ましい。ｅｌｋ／Ｆｃ遺伝子融合物を摘出し、ＨＡＶ−ＥＯと名付けられた哺乳動物発現ベクター（Ｄｏｗｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：４３１４，１９８９）内に挿入した。哺乳動物の宿主細胞に得られた組換え発現ベクターをトランスフェクトし、培養して融合タンパク質を一時的に発現させた。その融合タンパク質は、ｅｌｋシグナルペプチドを通して培養液中に分泌された。ｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質は、プロテインＡセファロースカラムを用いてアフィニティーカラムクロマトグラフィーで精製した。実施例３：可溶性ｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質の調製この実施例は、可溶性ｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質をコードする発現ベクターの構築について記載している。この融合タンパク質は、実施例４に記載されたＬＥＲＫ−５がｈｅｋを結合する能力を持つか否かを決定するための結合アッセイに用いられた。ヒトｈｅｋｃＤＮＡのＤＮＡ配列およびコードされるアミノ酸配列は、Ｗｉｃｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１６１１，１９９２、に示されており、ここに参照として援用される。このｈｅｋタンパク質は、（Ｎ末端からＣ末端までの）細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインからなる。二つのＤＮＡフラグメント（その内の一方はｈｅｋ細胞外ドメインのＮ末端フラグメントをコードし、他方はｈｅｋ細胞外ドメインのＣ末端フラグメントをコードする）は、Ｗｉｃｋｓら（同上）に公表されたｈｅｋヌクレオチド配列に基づいたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標準的条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって単離された。ＰＣＲの鋳型は、ＣＣＲＦ− ＨＢＳ−２（ＡＴＣＣＣＣＬ−１２０．１）と名付けられたヒトＴ細胞白血病細胞系より単離したｍＲＮＡより調製されたｃＤＮＡである。ｈｅｋＤＮＡの５ ’末端を含むＰＣＲ生成物をＳｐｅＩおよびＨｉｎｄIIIで消化し、成熟型ヒトｈｅｋ配列の５’末端（即ちシグナル配列をコードするＤＮＡを欠く）からｈｅｋ遺伝子に見出されるＨｉｎｄIII部位に及ぶＤＮＡフラグメントを単離した。ｈｅｋ細胞外ドメインＤＮＡの３’末端を含むＰＣＲ生成物は、ＨｉｎｄIIIおよびＣｌａＩで消化し、内部のＨｉｎｄIII部位からｈｅｋ細胞外ドメインをコードする配列の３’末端のすぐ下流のＣｌａＩ部位に及ぶフラグメントを単離した。ＣｌａＩ部位は、細胞外ドメインのすぐ下流に導入されたマルチクローニングサイト（ｍｃｓ）の内部に存在する。ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域変異型をコードするＤＮＡを単離した。このＦｃ変異型ＤＮＡおよびそれをコードするポリペプチドは、米国特許出願第０８／０９７，８２７号（１９９３年７月２３日提出）に「ＯＸ４０のリガンドである新規のサイトカイン」という名称で記載されており、当該出願は本明細書中に参照として援用される。変異型ＤＮＡは、実質的にＤｅｎｇおよびＮｉｃｋｏｌｏｆｆ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００：８１（１９９２）に記載の方法に従って行われる部位特異的突然変異誘発によって、天然型ＦｃポリペプチドをコードするＤＮＡから誘導した。Ｆｃ変異型ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１に記載の天然型Ｆｃポリペプチドのそれと、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、さらにアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化していることを除いては同一である。この変異型Ｆｃは免疫グロブリンレセプターとの親和性が減少している。Ｆｃ変異型ＤＮＡを含む組換えベクターは、ＣｌａＩおよびＮｏｔＩで分解される。これらの制限酵素はそれぞれ、Ｆｃ変異型ＤＮＡ挿入物のすぐ上流およびすぐ下流のポリリンカー領域でベクターを切断する。望ましいＦｃ変異型をコードするフラグメントが単離された。変異型Ｆｃポリペプチドは、Ｎ末端ヒンジ領域から天然型のＣ末端、即ち抗体Ｆｃ領域の実質上の全長、に及ぶ。Ｆｃ領域のフラグメント、例えばＣ末端で切除されたフラグメント、もまた用いられて良い。フラグメントは、二つに分かれたｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質のＦｃポリペプチド部分間に鎖内ジスルフィド結合が形成され二量体を作るために、複数のシステイン残基（少なくともヒンジ内のシステイン残基）を含むことが望ましい。ＳＭＡＧ４と名付けられた哺乳動物発現ベクターを、ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩで切断した。ＳＭＡＧ４ベクターは、哺乳動物の高発現ベクターｐＤＣ２０１（Ｓｉｍｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：５８５，１９８８、およびＰＣＴ出願ＷＯ８９／０３８８４に記載されている）に挿入したネズミのインターロイキン− ７のシグナルペプチドをコードする配列（米国特許第４，９６５，１９５号に記載）を含み、大腸菌内でも複製する能力を持つ。ＳｐｅＩは、ＩＬ−７のシグナルペプチドをコードする配列のすぐ下流でベクターを切断する。ＮｏｔＩは、ベクターのマルチクローニング部位内にあるＳｐｅＩ部位のおおよそ１５５ｂｐ下流を切断する。ベクター配列およびＩＬ−７シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含む大きなＳｐｅＩ／ＮｏｔＩフラグメントが単離された。ＳｐｅＩ／ＮｏｔＩで切断したＳＭＡＧ４発現ベクター内に、上記の２つのｈｅｋをコードするＤＮＡフラグメントおよびＦｃ変異型をコードするＤＮＡフラグメントを挿入するために、４通りの連結反応を行った。大腸菌細胞に連結反応混合物をトランスフェクトし、所望の組み換えベクターをその中から単離した。単離されたベクターは、（Ｎ末端からＣ末端に向かって）ＩＬ−７シグナルペプチド、ｈｅｋの細胞外ドメイン、導入されたｍｃｓによってコードされる４つのアミノ酸、およびＦｃ変異型からなる融合タンパク質をコードする。次に、発現ベクターをプラスミドｐＳＶ３．ＮＥＯと共にＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞内にトランスフェクトした。ＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系（ＡＴＣＣＣＲＬ１０４７８）は、ＭｃＭａｈａｎら、ＥＭＢＯＪ．１０：２８２１，１９９１に記載の方法に従ってサル腎臓細胞系から誘導した。ベクターｐＳＶ３．ＮＥＯは、宿主細胞が生成しないＳＶ４０Ｔ抗原を発現する。ｐＳＶ３．ＮＥＯベクターは、ｐＳＶ３（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：２０７２，１９８１）とよく似ているが、さらにネオマイシン耐性遺伝子を含んでいる。形質転換された細胞を培養し、融合タンパク質を一時的に発現させた。融合タンパク質は、ネズミのＩＬ−７シグナルペプチドによって培養液中に分泌される。融合タンパク質は、プロテインＡセファロースカラムで溶出して精製し、実施例２および３に記載の方法に従って、ｈｅｋ／Ｆｃタンパク質を結合する能力について細胞を選択するために用いられた。実施例４：結合性の研究ｅｌｋおよびｈｅｋとして知られているレセプターへのＬＥＲＫ−５の結合能力は、以下のアッセイにより調査した。方法は、細胞表面上にＬＥＲＫ−５を発現している細胞の調製から始めた。ＬＥＲＫ−５ＤＮＡは、実施例１に記載のクローンλ６ＤＮＡを鋳型として用いて、ＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲに用いたプライマーは、ＬＥＲＫ−５ＤＮＡのコード領域の末端を定め、さらに、増幅されたＤＮＡの５’末端にＸｈｏＩ制限部位を３’末端にＮｏｔＩ部位を加えた。５’プライマーは、さらに、開始コドンの上流にＫｏｚａｋ共通配列を加えた。反応生成物をＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＳａｌＩ（ＸｈｏＩに適合する）およびＮｏｔＩで切断した発現ベクターに挿入した。発現ベクターは、大腸菌内でも複製する哺乳動物の発現ベクター、ｐＤＣ４１０である。ｐＤＣ４１０は、ｐＤＣ４０６とよく似ている（ＭｃＭａｈａｎら、ＥＭＢＯＪ．１０：２８２１，１９９１）。ｐＤＣ４１０のマルチクローニング部位（ｍｃｓ）は、さらなる制限部位と３つの終止コドン（それぞれの読み枠に付一つ）を含む点でｐＤＣ４０６のそれとは異なる。ｍｃｓの下流のＴ７ポリメラーゼプロモーターは、ｍｃｓ内に挿入されたＤＮＡの配列決定を容易にする。さらに、ＥＢＶ複製開始点は、ｐＤＣ４１０内の（ＳＶ４０プロモーターから運転される）ＳＶ４０のラージＴ抗原をコードするＤＮＡによって置き換えられる。１０cm²の皿内のＣＶ１−ＥＢＮＡ−１細胞に、ＬＥＲＫ−５ＤＮＡを含む組換え発現ベクターをトランスフェクトさせた。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞系（ＡＴＣＣＣＲＬ１０４７８）は、ＣＭＶ初期エンハンサー／プロモーターから誘導されたＥＢＶ核抗原−１を構成的に発現する。ＣＶ１−ＥＢＮＡ−１は、ＭｃＭａｈａｎら、ＥＭＢＯＪ．１０：２８２１，１９９１に記載の方法に従って、アフリカミドリザルの腎臓細胞系ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）より誘導した。トランスフェクトした細胞を２４時間培養し、次いで、それぞれの皿の細胞を２４穴のプレートに分配した。さらに４８時間培養の後、結合アッセイを以下の方法によって行った。トランスフェクトされた細胞（約４ｘ１０⁴細胞／穴）を、５０ｍｇ／ｍｌ脱脂粉乳を加えた結合培地（２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２ｍｇ／ｍｌナトリウムアザイド、２０ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７．２を含むＲＰＭＩ１６４０）であるＢＭ−ＮＦＤＭで洗浄した。次いで細胞を、様々な濃度の実施例２で調製したｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質または実施例３で調製したｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質と共に、室温で１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、結合培地中の一定飽和濃度の¹²⁵Ｉ−マウス抗ヒトＩｇＧと共に、室温で１時間緩やかに攪拌しながらインキュベートした。しっかりと洗浄した後、細胞をリプシン処理して遊離させた。上で用いられたマウスの抗ヒトＩｇＧはヒトＩｇＧのＦｃ領域に対するものであり、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ，ＰＡから得られた。抗体は標準的クロラミン−Ｔ方法を用いて¹²⁵Ｉで標識した。抗体は、細胞に結合している任意のｅｌｋ／Ｆｃまたはｈｅｋ／Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分に結合するであろう。すべてのアッセイに於いて、¹²⁵Ｉ−抗体との非特異的な結合はｅｌｋ／Ｆｃ（またはｈｅｋ／Ｆｃ）の非存在下、ならびに、ｅｌｋ／Ｆｃ（またはｈｅｋ／Ｆｃ）および２００倍過剰モルの無標識のネズミ抗ヒトＩｇＧ抗体存在下でアッセイした。細胞に結合した¹²⁵Ｉ−抗体をＰａｃｋａｒｄ自動ガンマカウンターで定量した。親和性の計測（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０，１９４９）をＤｅｌｔａグラフプログラムを用いて行った。ｅｌｋ／Ｆｃ結合アッセイでは組換えＬＥＲＫ−５を発現する細胞は単一の結合親和性クラスを示し、細胞当たりおおよそ１０３．３１７の結合部位を有した。アフィニティー定数（Ｋ_a）は、１．０５ｘ１０⁹Ｍ^-1であった。４つの結合アッセイの結果を平均すると、ｅｌｋ／Ｆｃ結合のＫ_aは、１．２±０．３ｘ１０⁹ Ｍ^-1 であった。組換えＬＥＲＫ−５を発現する細胞はまた、ｈｅｋ／Ｆｃをも結合することが認められた。ｈｅｋ／Ｆｃ結合のＫ_aは、４．３±３．３ｘ１０⁷Ｍ^-1（４つの実験平均値）であった。実施例５：ノーザンブロット分析様々な組織内でのＬＥＲＫ−５発現を調べるために、様々なヒト組織（胎児および成人の両方）からのｍＲＮＡを含むノーザンブロット分析をＬＥＲＫ−５リボプローブをプローブとして行った。プローブは、実施例１で単離された３３７ｂｐＤＮＡフラグメントから以下ように誘導された。３３７ｂｐＤＮＡフラグメントの末端限定オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして用いた。３’プライマーは、さらにＴ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをも含んでいた。ＰＣＲは、３３７ｂｐＤＮＡを鋳型として用いて、慣用的技術によって行われた。それ故、得られた増幅ＤＮＡは、３’末端にＴ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含んでいた。リボプローブは、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼおよび増幅ＤＮＡを鋳型として用いて、標準技術によって調製した。ブロットをリボプローブと６３°Ｃでハイブリダイズさせ、次に、最初に１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、６８°Ｃで１時間、次に０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、６８°Ｃで３０分間洗浄した。ブロットを２枚の補力スクリーンの間にはさんで、−７０°Ｃで１１日間Ｘ線フイルムにさらした。胎児組織から誘導されたＲＮＡを含むブロットでは、主なｍＲＮＡバンド約５．０ｋｂが、心臓、肺および腎臓内で見られるが、肝臓では見られなかった。成人組織からのＲＮＡを含むブロットでは、５ｋｂのバンドは肺および腎臓内に検出されたが、発現レベルは胎児組織内より低かった。ハイブリダイズしたｍＲＮＡバンドは、成人の心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸および抹消血液リンパ球内では検出できなかったか、または非常に微かであった。実施例６：ＬＥＲＫ−５のモノクローナル抗体この実施例は、ＬＥＲＫ−５のモノクローナル抗体の調製について説明している。ＬＥＲＫ−５は、ＣＯＳ−７またはＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞のような哺乳動物の宿主細胞中に発現し、ｅｌｋ／Ｆｃアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製される。精製したＬＥＲＫ−５（または、細胞外ドメインのようなそれのフラグメント）を用いて、慣用された技術、例えば、米国特許第４，４１１，９９３号に記載された技術を用いてＬＥＲＫ−５に対するモノクローナル抗体を生成させることが出来る。簡単に言えば、免疫原としてのＬＥＲＫ−５を完全フロイントアジュバントで乳化したものでマウスを免疫化し、１０−１００μ ｇの範囲の量を皮下または腹腔内に注射する。１０から１２日後、免疫化された動物を、不完全フロイントアジュバントで乳化したさらなるＬＥＲＫ−５で追加免疫した。マウスは、その後も、一週間または二週間の免疫化スケジュールで周期的に追加免疫した。ＬＥＲＫ−５抗体に関してドットブロットアッセイまたはＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）で試験するために、眼窩後方放血または尾の先端切除によって血清サンプル周期的に採取する。適当な抗体力価が検出された後、陽性の動物にもう一度最後の塩水中のＬＥＫＲ−５の静脈注射を行う。３から４日後、動物を屠殺し脾臓細胞を回収する。さらに脾臓細胞をマウスのミエローマ細胞系、例えば、ＮＳ１または望ましくはＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８０）に融合させる。融合物はハイブリドーマ細胞を生成し、それらを複数のミクロタイタープレート中のＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）選択培地中に塗布して、融合していない細胞、ミエローマハイブリッドおよび脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。Ｅｎｇｖａｌｌら、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．８：８７１，１９７１および米国特許第４，７０３，００４号に開示されている技術を適応させて、ハイブリドーマ細胞を精製ＬＥＲＫ−５との反応性について、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。望ましいスクリーニング技術は、Ｂｅｃｋｍａｎｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：４２１２，１９９０、に記載されている抗体捕獲技術である。陽性のハイブリドーマ細胞を有性生殖のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注射し、高濃度の抗ＬＥＲＫ−５モノクローナル抗体を含む腹水を生成させることが出来る。あるいは、ハイブリドーマ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで様々な技術によってフラスコまたは回転瓶中で増殖させることも出来る。マウスの腹水内に生成されたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿、次いで、ゲル限外クロマトグラフィーによって精製することが出来る。または、ＬＥＲＫ−５への結合を基にしたアフィニティークロマトグラフィーと同様に、プロテインＡまたはプロテインＧへの抗体の結合を基にしたアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。実施例７：レセプターのリン酸化以下の実験では、ＬＥＲＫ−５が、ｅｌｋのリン酸化を誘導する能力を証明した。可溶性ＬＥＲＫ−５／Ｆｃタンパク質は、配列番号２のＬＥＲＫ−５のアミノ酸−２５から１９８をコードするＤＮＡを上記のヒトＩｇＧ１ＦｃポリペプチドをコードするＤＮＡと、ベクターｐＤＣ３０３中で融合することによって調製した。哺乳動物の発現ベクターｐＤＣ３０３は、ＳＦＣＡＶとしても既知であり、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１９７７７に記載されている。可溶性ＬＥＲＫ−５／Ｆｃタンパク質は、Ｆａｎｓｌｏｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：６５５，１９９２に記載された方法と類似した方法に従って、発現、精製した。ラットのｅｌｋｃＤＮＡを哺乳動物の発現ベクターｐＤＣ３０３内に挿入し、ＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞内にトランスフェクトした。細胞を２４時間後に１０ｃｍのプレートから６穴のプレートに分けた。さらに２日後、細胞をメチオニンおよびシステインの欠乏状態にし、次いで、［³⁵Ｓ］メチオニンおよび［³⁵Ｓ］システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の１：１混合物、全濃度１００μＣｉ／ｍｌで３時間放射能標識した。１μｇ／ｍｌの可溶性ＬＥＲＫ−５／Ｆｃまたは可溶性ｅｌｋ−Ｌ／Ｆｃ（ＷＯ９４／１１３８４に記載）を３７°Ｃで加え、１０分間刺激した。次いで、細胞を冷ＰＢＳ＋１ｍＭオルトバナジン酸塩で２回迅速に洗浄し、溶解バッファー（２５ｍＭトリス−塩酸，ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭフッ化ナトリウム、１％ＮＰ−４０、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭオルトバナジン酸塩、およびプロテアーゼインヒビター）で溶解した。プロテインＧセファロースを用いて、ウサギの抗ｅｌｋ抗体で細胞溶解液を免疫沈降させた。抗ｅｌｋ抗体は、ヒトｅｌｋ−Ｆｃ融合タンパク質でウサギを免疫化することによって生成させた。ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ８.０、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．５％ｎｏｎｉｄｅｔＰ−４０および０．１％ＳＤＳ）で３回、ＰＢＳで１回洗浄した後、サンプルを還元バッファー中に置き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。次いで、タンパク質をニトロセルロースに移し、［³⁵Ｓ］で標識したタンパク質をＰｈｏｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）で検出した。次いで、メンブレンを抗ホスホチロシン４Ｇ１０（ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ．，ＬａｋｅＰｌａｃｉｄ、ＮＹ）、次にビオチン−ヤギ抗マウス（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄａｎｄＰｅｒｒｙＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ），ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄａｎｄＰｅｒｒｙ）でイムノブロットし、次いで、ＥＣＬ感光試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて感光させた。抗ホスホチロシン抗体とのｅｌｋ免疫沈降物のウエスタン分析は、ＬＥＲＫ−５／Ｆｃが、ｅｌｋ−Ｌ／Ｆｃと同様に，ｅｌｋリン酸化を刺激することを示した。リガンド依存性リン酸化タンパク質は、培地のみで処理したか、あるいはコントロールプラスミドをトランスフェクトしたＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞内には、検出されなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ // Ｃ０７Ｋ 14/715 9356−4ＨＣ０７Ｋ 14/715 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．ｅｌｋおよびｈｅｋを結合する能力を有するＬＥＲＫ−５タンパク質をコードする単離されたＤＮＡであって、前記ＬＥＲＫ−５が、配列番号２のアミノ酸−２５から３０８および配列番号２の１−３０８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するものである、前記ＤＮＡ。２．ＤＮＡが配列番号１のヌクレオチド１から１００２および配列番号１のヌクレオチド７６から１００２からなる群より選択されたヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のＤＮＡ。３．ｅｌｋおよびｈｅｋを結合する能力を有する可溶性ヒトＬＥＲＫ−５タンパク質をコードする単離されたＤＮＡであって、前記ＬＥＲＫ−５が、配列番号２のアミノ酸−２５から１９９および配列番号２の１−１９９からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものである、前記ＤＮＡ。４．ＤＮＡが配列番号１のヌクレオチド１から６７２および配列番号１のヌクレオチド７６から６７２からなる群より選択されたヌクレオチド配列を含む、請求項３記載のＤＮＡ。５．ｅｌｋまたはｈｅｋを結合する能力を有する可溶性ＬＥＲＫ−５ポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡであって、前記可溶性ＬＥＲＫ−５ポリペプチドが、配列番号２の残基１−１９９の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するものである、前記ＤＮＡ。６．ｅｌｋおよびｈｅｋを結合する能力を有するＬＥＲＫ−５ポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡであって、前記ＬＥＲＫ−５ポリペプチドが、細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞質ドメインからなり、かつ、前記ＬＥＲＫ−５ポリペプチドが配列番号２の残基１−３０８の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するものである、前記ＤＮＡ。７．請求項１記載のＤＮＡを含む発現ベクター。８．請求項３記載のＤＮＡを含む発現ベクター。９．請求項５記載のＤＮＡを含む発現ベクター。１０．請求項６記載のＤＮＡを含む発現ベクター。１１．請求項７記載のベクターで形質転換された宿主細胞をＬＥＲＫ−５の発現を促進する条件下で培養し、そして培養液からＬＥＲＫ−５ポリペプチドを回収することからなる、ＬＥＲＫ−５ポリペプチドの調製方法。１２．請求項８記載のベクターで形質転換された宿主細胞をＬＥＲＫ−５の発現を促進する条件下で培養し、そして培養液からＬＥＲＫ−５ポリペプチドを回収することからなる、ＬＥＲＫ−５ポリペプチドの調製方法。１３．請求項９記載のベクターで形質転換された宿主細胞をＬＥＲＫ−５の発現を促進する条件下で培養し、そして培養液からＬＥＲＫ−５ポリペプチドを回収することからなる、ＬＥＲＫ−５ポリペプチドの調製方法。１４．請求項１０記載のベクターで形質転換された宿主細胞をＬＥＲＫ−５の発現を促進する条件下で培養し、そして培養液からＬＥＲＫ−５ポリペプチドを回収することからなる、ＬＥＲＫ−５ポリペプチドの調製方法。１５．ｅｌｋおよびｈｅｋを結合する能力を有する精製されたヒト成熟型ＬＥＲＫ−５タンパク質であって、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−のＮ末端アミノ酸配列を特徴とする、前記ヒトＬＥＲＫ−５タンパク質１６．ＬＥＲＫ−５が配列番号２のアミノ酸１−３０８および配列番号２の１−１９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１５記載の精製されたＬＥＲＫ−５。１７．ポリペプチドが請求項５記載のＤＮＡによってコードされる、精製された可溶性ＬＥＲＫ−５ポリペプチド。１８．ポリペプチドが請求項６記載のＤＮＡによってコードされる、精製されたＬＥＲＫ−５ポリペプチド。１９．請求項１６記載のヒトＬＥＲＫ−５ポリペプチドと免疫反応性の抗体。２０．抗体がモノクローナル抗体である、請求項１９記載の抗体。２１．請求項１７記載の可溶性のヒトＬＥＲＫ−５ポリペプチド、およびＦｃポリペプチドからなる、融合タンパク質。２２．融合タンパク質がジスルフィド結合で連結されている、請求項２１記載の２つの融合タンパク質からなる二量体。