JPH02203795A

JPH02203795A - 抗ヒト組織因子モノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH02203795A
Application number: JP1022634A
Authority: JP
Inventors: Yukiya Koike; 小池　行也; Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1989-02-02
Filing date: 1989-02-02
Publication date: 1990-08-13
Anticipated expiration: 2013-07-23
Also published as: JP2779193B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（ａ）産業上の利用分野本発明はヒト組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒ）
に対するモノクローナル抗体、特にヒト胎盤由来の組織
因子アポ蛋白を特異的に認識し、結合するモノクローナ
ル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイプリドー
マ細胞および該モノクローナル抗体の製造方法に関する
ものである。

（ｂ）従来の技術組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒ）は組織トロン
ボプラスチンとも呼ばれ、外因系凝固の開始物質として
重要な働きを示すことが知られている。すなわち、第Ｖ
Ｉ因子と複合体を形成し、第Ｘ因子や第１Ｘ因子を活性
化する物質である。組織因子は脂質部分と蛋白部分（ア
ポ蛋白）よりなる糖脂質蛋白（ｌｙｃｏｌ　１ｐｏｐｒ
ｏｔｅｉｎ）で、その活性発現には双方の存在が必要で
ある。アポ蛋白は分子量５万前後の糖蛋白で一種の膜蛋
白と考えられている。１ｎｔａＣｔな細胞では組織因子
は細胞膜中に表面を覆われた状態で存在すると考えられ
、特にガンなどにおける組織・血管の損傷によって、細
胞表面に組織因子が露呈し、曲管内凝固が起こり易くな
る。またＴＮ　Ｆ　（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　
Ｆａｃｔｏｒ）やＩ　Ｌ　（ＩｎｔｅｒＬｅｕｋｉｎ）
　、サイト力イン類が、ある種の細胞を刺激して細胞表
面に組織因子活性が発現すると報告されている［Ｐ、Ｒ
，Ｃｏｎｋｌｉｎｇ、　Ｃ，Ｓ、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ　
　ａｎｄＪ、Ｂ、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ；　Ｂｌｏｏｄ、　
ｖｏｌ　７２．　Ｎｏ、１．１２８−１３３（１９８８
）参照］。

最近、ヒト組織因子アポ蛋白をコードするＣ［）ＮＡク
ローンが単離され、蛋白の１次構造が明らかになった［
Ｅ、に、５ｐｉｃｅｒ、　ｅｔ　ａｌ；　Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ｔｌｓＡ、　　ｖｏ！、
８４．　５１４８−５１５２　　（１９Ｂ？）参照］　
。

またヒト組織因子アポ蛋白は不溶制であるがトリプシン
等の酵素によって消化を受けると可溶化することも明ら
かにされている。

ヒト組織因子は全身諸臓器に存在するが、特に肺、脳、
胎盤に多く、血管内皮細胞も組織因子を産生ずることが
知られている［Ｃｏ１ｕｃｃｉ　Ｍ、　ｅｔａｌ；　Ｊ
、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７１．１８９３−１
８９６　（１９８３）参照］。

既にヒト脳由来の組織因子アポ蛋白は精製され、その分
子量が４４．０００であることが明らかにされている［
Ｇ、Ｊ、Ｂｒｏｚｅ、　Ｊｒ、　ｅｔ　ａｔ、　Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

ｖｏｌ、２６０．　Ｎｏ、２０．１０９１７−１０９２
０　（１９８５）］　、またヒト脳由来の組織因子アポ
蛋白に対するモノクローナル抗体も報告されている［Ｓ
、Ｄ、Ｃａｒｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ。

Ｂｌｏｏｄ、　ｖｏｌ　７０．　Ｎｏ、２．　ｐ４９０
−４９３　（１９８７）］。このモノクローナル抗体は
ヒト脳由来の組織因子アポ蛋白に結合し、凝固を起こす
活性を抑制する抗体である。

これはヒト脳由来の組織因子アポ蛋白に結合する該モノ
クローナル抗体が、ヒト組織因子の第Ｖ］［因子との結
合部位を認識するものであり、第■因子と該抗体との間
で競争阻害がおこり、該抗体が結合したヒト組織因子は
第Ｖ「因子と複合体を形成することができず、第■因子
の血液凝固能を活性化させることができないために血液
凝固を抑制するものと考えられる。

従って、このモノクローナル抗体を用いて、ヒト組織因
子と第ＶＩＩ因子との複合体を検出することはできない
。

他方、ヒト胎盤由来の組織因子アポ蛋白も精製され、そ
の分子量が４８．０００〜５８．０００であると報告さ
れている［Ｇｏｎｍｏｒｉ　Ｈｅｔ　ａｍ　Ｔｈｒｏｍ
ｂ。

Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　３６．９０−１０３．１９７６
　］　。ヒト脳由来の組織因子アポ蛋白とヒト胎盤由来
の組織因子アポ蛋白は分子量が異なり、物質として違う
ものであると考えられる。また、ヒト胎盤由来の組織因
子アポ蛋白に対するモノクローナル抗体については未だ
報告されていない。

（Ｃ）発明の目的そこで、本発明者らは、ヒト組織因子の血液凝固活性を
阻害せず、かつヒト組織因子アポ蛋白の異なる２つの部
位に結合する抗ヒト組織因子モノクローナル抗体を提供
することができれば、これらを使用することによってヒ
ト組織因子、ヒト組織因子と第Ｖｌ因子との複合体およ
びヒト組織因子の分解物に対して、それぞれの検出、精
製および定量等が可能となると考え、鋭意研究した結果
、本発明に到達したものである。

（ｄ）発明の構成すなわち、本発明は、ヒト組織因子に特異的に結合し、
該ヒト組織因子の血液凝固活性を阻害しない抗ヒト組織
因子モノクローナル抗体であり、ヒト胎盤由来の組織因
子に特異的に結合し、該ヒト組織因子の血液凝固活性を
阻害しない抗ヒト組織因子モノクローナル抗体であり、
ヒト胎盤由来の組織因子アポ蛋白に特異的に結合し、該
ヒト組織因子の血液凝固活性を阻害しない抗ヒト組織因
子モノクローナル抗体であり、ヒト胎盤由来の組織因子
アポ蛋白をＣＮ　Ｂｒで分解して得られた、ヒト胎盤由
来の組織因子アポ蛋白のリン脂質を結合するドメインを
含むカルボキシル基末端側の断片に結合せず、ヒト胎盤
由来の組織因子アポ蛋白のリン脂質を結合するドメイン
を含まないアミノ基末端側の断片に結合し、該ヒト組織
因子の血液凝固活性を阻害しない抗ヒト組織因子モノク
ローナル抗体であり、下記一般式（Ｉ）Ｈ２Ｎ　−ＧＱＥＫＧＥＦＲＥＩＦＹＩＩＧＡＶＶＦＶ
ＶＩＩＬＶＩＩＬＡＩＳＬＨＫＣＲＫＡＧＶＧＱＳＷＫ
ＥＮＳＰＬＮＶＳ−ＣＯＯＮ　　　　　−（Ｉ　）で表
わされるヒト組織因子アポ蛋白の断片に結合せず、下記
一般式（Ｉ）で表わされるヒト組織因子アポ蛋白の断片に結合し、該
ヒト組織因子の血液凝固活性を阻害しない抗ヒト組織因
子モノクローナル抗体である。

以下、本発明について詳細に説明する。

ヒト組織因子は前記した通り、脂質部分と蛋白部分（ア
ポ蛋白）よりなる糖脂質蛋白であり、第ｖ■因子と複合
体を形成し、第Ｘ因子や第１Ｘ因子を活性化する外因系
血液凝固の開始物質である。ヒト組織因子は１ｎｔａＣ
ｔの細胞では細胞膜中に表面を覆われた状態で存在する
。近年、ヒト組織因子アポ蛋白、更にヒト組織因子アポ
蛋白をトリプシン等の酵素によって消化あるいはＣＮ８
ｒ等によって分解されたヒト組織因子アポ蛋白の断片等
も得られているが、血液凝固活性の発現には脂質部分と
蛋白部分（アポ蛋白）との双方の存在が必要である。

また、本発明に用いられるヒト組織因子の由来は特に限
定はないが、好ましくは胎盤、尿、脳であり、特に好ま
しくは胎盤、尿であり、更に好ましくは胎盤である。

本発明で用いられる抗ヒト組織因子モノクローナル抗体
はヒト組織因子に特異的に結合し、かつ該ヒト組織因子
の血液凝固活性を阻害しないモノクローナル抗体である
。具体的には、微工研奇託番号ＦＥＲＮ　Ｐ−１０５０
５（Ｇ　Ｘ　３を産生ずる。）、ＦＥＲＮＰ−１０５０
６（ＧＸ４を産生する。）　、　ＦＥＲＮ　Ｐ−１０５
０７（ＥＸ６を産生する。）のハイブリドーマ細胞が産
生ずる抗体およびそれと同等の結合特性を有する抗ヒト
組織因子モノクローナル抗体である。

これらの抗体のなかで好ましいものとしては、ヒト組織
因子アポ蛋白を特異的に結合するものであり、特に好ま
しいものとしてはヒト組織因子アポ蛋白をＣＮＢｒで処
理した断片に特異的に結合するものであり、更に好まし
いものとしてはヒト組織因子アポ蛋白をＣＮＢｒを処理
した断片のうち、ヒト組織因子アポ蛋白のリン脂質を結
合するドメインを含むカルボキシル基末端側の断片に結
合せず、ヒト胎盤由来の組織因子アポ蛋白のリン脂質を
結合するドメインを含まないアミノ基末端側の断片に結
合するもの、および式（Ｉ＞で表わされるヒト組織因子
アポ蛋白の断片に結合せず、式（ｎ）に表わされるヒト
組織因子アポ蛋白の断片に結合するものである。

これらの抗体は完全な形の抗体のままで用いうろことは
もちろんのこと、その本質的結合能が維持される抗体断
片、例えばユニバレントの抗体。

Ｆａｂ　、　Ｆａｂ’、　（Ｆａｂ’）２等として用い
ることもできる。

本発明に関して微工研に寄託したハイブリドーマ細胞が
産生するＧＸ３．ＧＸ４およびＥＸ６の抗ヒト組織因子
モノクローナル抗体の特徴を述べる。

これらはともにヒト組織因子に特異的に結合し、該ヒト
組織因子の血液凝固活性を阻害しないものであり、更に
ＧＸ３は式（ＩＩ＞を認識し、ＧＸ４は式（ＩＩ）を認
識し、かつ式（ＩＩ）の高次構造をも認識するものであ
り、ＥＸ６は式（Ｉ）を認識するものである。

本発明で用いられる抗ヒト組織因子モノクローナル抗体
はそれ自体、上記の特徴を有するものであればその製造
方法は特に限定されない。具体的な方法としては、ヒト
組織因子等を抗原として免疫したマウスの肺臓細胞をマ
ウスのミエローマ細胞と融合させた後、得られたハイブ
リドーマ細胞［Ｋ６ｈｌｅｒ　＆　Ｈｉｌｓｔｅｉｎ；
　Ｎａｔｕｒｅ：　２５６．４９５−４９７（１９７５
）　］によって産生される。

Ａ、抗原本発明において用いられる抗原としてはヒト胎盤由来の
組織因子、ヒト胎盤由来の組織因子アポ蛋白、ヒト胎盤
由来の組織因子アポ蛋白をＣＮ　Ｂｒで分解することに
よって得られた、リン脂質を結合するドメインを含まな
いアミノ基末端側の断片および、式（ＩＩ＞で表わされ
るヒト組織因子アポ蛋白の断片等が上げられ、ヒト胎盤
由来の組織因子アポ蛋白、ヒト胎盤由来の組織因子アポ
蛋白をＣＮ　Ｂｒで分解することによって得られたリン
脂質を結合するドメインを含まないアミノ基末端側の断
片、および式（ＩＦ＞で表わされるヒト組織因子アポ蛋
白の断片であることが好ましく、ヒト胎盤由来の組織因
子アポ蛋白をＣＮＢｒで分解することによって得られた
リン脂質を結合するドメインを含まないアミノ基末端側
の断片および式（ＩＩ＞で表わされるヒト組織因子アポ
蛋白の断片であることが特に好ましい。

抗原に用いるヒト胎盤由来の組織因子アポ蛋白は、Ｇｏ
ｎｍｏｒｉらの方法［ＧＯｒｌｌｌｌＯｒｉ　）ｌ、　
ｅｔ　ａｔ丁ｈｒｏｍｂ、　ｕａｅｍｏｓｔａｓ、　３
６．９０−１０３　（１９７６）］によりヒト胎盤から
単離、精製され、そのアミノ酸配列は下記式（ＩＩＩ）で表わされる。

Ｂ、上記抗原によるマウスの免疫１Ｂａｌｂ／Ｃマウスを用いることができるが他の系（
ｔｒａｉｎ）のマウスを使用してもよい。その際、免疫
計画、および抗原の濃度は十分な量の抗原刺激を受けた
、リンパ球が形成されるように選ばれるべきである。例
えばマウスに５０μＱの抗原を２週間間隔で腹腔に３回
免疫の後、ざらに３０μ９を静脈に投与する。最終免疫
の数日後に融合の為に肺臓細胞をとり出す。

Ｃ０細胞融合上記の如く免疫したマウスの肺臓を無菌的に取り出し、
そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの肺臓細胞を
適当なラインからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により、細胞融合させる。牌臓細胞対、骨髄腫
細胞の好ましい比率は約２０：１〜約２：１の範囲であ
る。約１０８個の肺臓細胞について０．５〜１．５−の
融合媒体の使用が適当である。

細胞融合に用いるマウス骨髄腫細胞は、良く知られてい
るが、本発明では、Ｐ　３−　Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１細
胞（Ｐ３−Ｕ　１　）　　［Ｙｅｌｔｏｎ、　Ｄ、Ｆ　
ｅｔ　ａｔＣｕｒｒｅｎｔ、　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｈ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
、　８１．１　（１９７８）参照］が好ましい。

好ましい融合促進剤としては、例えば、平均分子量１０
００〜４０００ポリエチレングリコールを有利に使用で
きるが、この分野で知られている他の融合促進剤を使用
することもできる。

Ｄ、融合した細胞の選択別の容器内（例えばマイクロタイタープレート）で未融
合の牌繊細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞および融合し
たハイブリドーマ細胞の混合物を未融合のマウス骨髄腫
細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死
滅させるのに十分な時間（約１週間）培養する。培地は
、薬物抵抗性（例えば８−アザグアニン抵抗性）で未融
合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの、（例えばＨＡ
Ｔ培地）が使用される。この選択培地中では、未融合の
骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の肺臓細胞は非腫瘍
性細胞なので、ある一定期間後（１週間後）死滅する。

これらに対して融合した細胞は、骨髄腫の親細胞の腫瘍
性と、親牌細胞の性質を合せ持つため、選択培地中で生
存できる。

Ｅ、各容器中のヒト組織因子抗体の確認かくして、ハイ
ブリドーマ細胞が検出された後、その培養上清を採取し
、ヒト組織因子に対する抗体について酵素免疫定量法（
Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ−３ｏｒｂ
ｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ）によりスクリーニングする。

Ｆ、目的の抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞のクロー
ン化目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限界希釈法）でクローン化すると、抗体は２つ
の異なった方法で産生される。その第１の方法によれば
、ハイブリドーマ細胞を一定時叩、適当な培地で培養す
ることにより、その培養上清からそのハイブリドーマ細
胞の産生ずるモノクローナル抗体を得ることができる。

第２の方法によれば、ハイブリドーマ細胞は同質遺伝子
、または半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射するこ
とができる。一定時間後の宿主動物の血液中および腹水
中より、そのハイブリドーマ細胞の産生ずるモノクロー
ナル抗体を得ることができる。

（ｅ）発明の効果本発明において得られる抗ヒト組織因子モノクローナル
抗体はヒト胎盤由来の組織因子を抗原とした新規なモノ
クローナル抗体であり、更にヒト組織因子の血液凝固活
性を阻害しないものである。

また、本発明のモノクローナル抗体を用いることによっ
てヒト組織因子、ヒト組織因子と第Ｖ］［因子との複合
体およびヒト組織因子の分解物の成体組織からの抽出、
精製および定量等が可能となり、更に溶液状態（例えば
ヒト血漿、ヒト尿）にあるヒト組織因子アポ蛋白、更に
、それらの分解物の免疫学的測定（ＥＩＡ、Ｒ’ｌＡ＞
が可能となる。

さらには該モノクローナル抗体の特異性・結合の強さか
ら各種ガンにおける組織染色１診断、イメージングに用
いることができる。

（ｆ）実施例以、下、本発明について実施例を挙げて説明する。

実施例１ヒト組織因子　ＴＦ）に結合するモノクローナル抗体を
産生ずるバイプリドーマ　　合　胞）の取ｑヒト胎盤抽出物から精製したヒト組織因子アポ蛋白（以
下、抗原１と略称する）、およびヒト胎盤由来組織因子
アポ蛋白をＣＮ　Ｂｒで分解することによってリン脂質
を結合するドメインを含まないアミノ基末端側の断片（
以下、抗原２と略称する）をそれぞれ雌のＢａ　Ｉ　ｂ
／　ｃマウス（４週令）合計３匹に対して１４日間隔で
４回免疫した。初回の免疫は生理食塩水に溶解した５０
μＱの抗原を等量のフロイントの完全アジュバントと混
合し、そのエマルジョンを腹腔内に投与した。２回目、
３回目の免疫は、同じり５０μＱの抗原をフロイントの
不完全アジュバントと混合し、同じく腹腔内に投与した
。最終免疫（４回目）は、３０μｇの抗原をマウスを静
脈から追加投与した。最終免疫の３日後に免疫したマウ
スの肺臓細胞を細胞融合に用いた。

抽出したマウスの肺臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
（Ｐ３ｔＪ１）とを約５：１の割合で混合し、５０％ポ
リエチレングリコール１５４０を融合促進剤として、ケ
ーラーとミルシュタインの方法に従い細胞融合を行なっ
た。

融合後の細胞は１　ｘ１０６　ｃｅｌｌｓ　／ｒａｉｌ
の細胞濃度となるように１０％の牛血清を含むＲＰＭｌ
　１６４０培地に懸濁し、９６ウエルマイクロプレート
に１ウェル当り１００μｌずつ分注した。

ハイブリドーマ（融合細胞）はＣＯ２インキユベータ−
（５％ＣＯ２，３７℃）中で培養し、ヒポキサンチン、
アミノプテリン、チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）で
培地交換を行ない、ＨＡＴ培地中で増殖させて、肺臓細
胞と骨髄腫細胞からなるバイプリドーマのスクリーニン
グを行なった。

ハイブリドーマの培養上清中の抗体は、ヒト胎盤より精
製したヒト組織因子アポ蛋白を吸着させたマイクロタイ
タープレートを用い、ＥＬＩＳＡ法により検出した。バ
イプリドーマをまいた合計１０２２ウエルのうち６６９
ウエルにコロニーの形成が認められ、このうちヒト胎盤
由来の組織因子アポ蛋白に結合性を示す抗体産生陽性ウ
ェルは３５６ウエルであった。（表１）表　１　細胞融合これらの抗体酸性陽性ウェルのうち４つのウェルについ
て限界希釈法によるクローニングを２回繰り返して行な
い、３個のモノクローンを得た。

得られたクローンは１０％ＤＭＳＯを含む９０％牛血清
溶液中に懸濁させ、液体窒素中に保存した。各クローン
の産生するモノクローナル抗体は、クローンをＢａ　Ｉ
　ｂ／　ｃマウス腹腔内で増殖させ、その腹水からプロ
ティンＡ−セファロース４Ｂカラムを用いて精製した。

実施例２精製モノクローナル抗体のクラスマウス腹水から精製した各クローンのＩＱＧについてク
ラスをオフタロニー法により決定した。

表　２　モノクローナル抗体のクラス実施例３ヒト胎盤由来組織因子アポ蛋白に対する結合性ヒト胎盤
より抽出、精製したヒト組織因子アポ蛋白を５μＯ／ｄ
の濃度でマイクロタイタープレートに吸着させ、１％Ｂ
ＳＡでＢｌｏｃｋｉｎｇ後、適当な濃度になるように希
釈したモノクローナル抗体溶液（０，１６〜５．０μｇ
／ｄ）とを反応させた。次に、アルカリ性フォスファタ
ーゼ標識化した抗マウス抗体を加え、３種類のモノクロ
ーナル抗体のヒト組織因子アポ蛋白に対する結合性を検
出し、調べた。

得られた３種類のモノクローナル抗体は、ヒト組織因子
アポ蛋白に対して強い結合性を示した（図１）実施例４モノクローナル抗体の抗原認識部位の相異性ヒト胎盤由
来組織因子アポ蛋白を５μ（］　／ｄの濃度でマイクロ
タイタープレートに吸着させ、１％ＢＳＡでＢｌｏｃｋ
ｉｎｇ後、適当な濃度になるように希釈した各種モノク
ローナル抗体溶液（０，１６〜５．０μ（１／ｍＡ＞と
、パーオキシダーゼ酵素標識化したＥＸ６抗体とを同時
に抗原に対して反応させた。

その結果、ＥＸ６とＧＸ４はヒト組織因子アポ缶内に同
時に結合でき、抗原標識部位が異なることが示唆された
。ＥＸ６とＧＸ３はじト組織因子アポ蛋白への結合に際
し、競争阻害がかかるが、ＥＸ６とパーオキシダーゼ標
識化ＥＸ６の同じ抗体の阻害に比しおよそ５０％程度の
阻害であることから、ＥＸ６とＧＸ３の抗原認識部位は
異なり、立体的に近接した部位であることが示唆された
（図２）。

実施例５ヒト組織因子アポ蛋白（４０Ｈｇ）溶液にＨＣＯＯＨを
加えて、７０％のＨＣＯＯＨ溶液とした。この溶液にＣ
ＮＢｒ粉末を加えて、溶解させ室温で１８時間反応させ
た後、ＨＣＯＯＨをｄｒｙ　ｕｐさせた。

４０μｌのＨｚＯを加えて蛋白を溶解後、２μｇ相当を
２−メルカプトエタノール存在下で還元し、４〜２０％
濃度のｇｒａｄｉｅｎｔゲルを用いて５ＤＳ−ポリアク
リルアミド電気泳動を行なった（　Ｈ，Ｗ、　３１　、
０００および２７，０００の断片）。比較の為にＣＮ　
Ｂｒ処理していない組織因子アポ蛋白（Ｈ，Ｗ、　５８
，０００）を同様に還元し、電気泳動を行なった。

電気泳動後、ゲル中の蛋白はプロッティング装置（マリ
ツル味製）を用いて、ニトロセルロース膜に電気的に転
写した。

３％ゼラチンを含むＴＢＳ　（２０ｍＨトリス溶液０．
１５ＨＮａＣ２ｐＨ７，４）でニトロセルロース膜をブ
ロッキング後、各種モノクローナル抗体（ＧＸ３゜ＧＸ
４およびＥＸ６）を２μｇ／−濃度で含む１％ゼラチン
−ＴＢＳ溶液と室温で一晩反応させた。

０、０５％Ｔｗｅｅｎ　２０−　Ｔ　Ｂ　Ｓで３回、ニ
トロセルロース膜を洗浄し、パーオキシダーゼ標識化抗
マウスＩ（］抗体の１％ゼラチン−ＴＢＳ溶液と室温で
４時間反応させた。洗浄後、４−クロロ−１−ナフター
ル基質溶液を加えて、ニトロセルロース膜上に結合した
酵素標識化抗体を発色させた。モノクローナル抗体が結
合した蛋白は濃青色のバンドとして検出できた。

得られた３種のモノクローナル抗体結合特性は表３のと
ありである。

表Ｏ：強く結合する △：弱く結合する ×：結合しない実施例６モノクローナル抗体の組織因子活性に及ぼす影響得られ
たモノクローナル抗体者々（ＧＸ３．ＧＸ４．ＥＸ６＞
５０μ９とヒト胎盤由来組織因子１００μｑを混合して
１ｒ１１ｔｌの溶液とし、３７°Ｃで１時間反応後、４
°Ｃで１＠放置した。そのうち２００μｌをヒト血漿１
００μｌに加え反応させ凝固時間（Ｐ　’Ｔ−）を測定
した。コントロールとしてモノクローナル抗体の換わり
に組織因子アポ蛋白に対するウサギ抗血清を用いた。測
定はＳｙｓｍｅｘ社製のＢｌｏｏｄ　Ｃｏａｇｕｌａｔ
ｉｏｎ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　ＣＡ−１００を用いて行な
った。図３に各試料の凝固時間をグラフにしてボした。

本発明のモノクローナル抗体３種類（ＧＸ３゜ＧＸ４．
ＥＸ６）はいずれもヒｉ〜胎盤由来組織因子の凝固を起
こす活性には影響を与えなかった。

実施例７被検液のヒト組織因子アポ蛋白の検出モノクローナル抗体ＧＸ３を２０μ（］／ｄの濃度にな
るようにＰＢＳ（１０ｍＭリン酸緩衝液−〇、　１５８
ＮａαＩ）Ｈ７，４）で希釈し、マイクロタイタープレ
ートのウェルに１００μｌ加えて、−晩装置し、抗体を
同相に吸着させた。１％ＢＳＡ　（牛血清アルブミン）
を含むＰＢＳを１５（）μｉ／ウェル加えて室温で２時
間放置した。続いて０．０５％丁ｗｅｅｎ　２０と０．
１％ＢＳＡを含むＰＢＳ　（洗浄用バッファー）で洗浄
した。次にヒト胎盤由来組織因子アポ蛋白を洗浄用バッ
ファーで２５ｎ！ＩＩ／ｄ、　５０ｒｉ（］／ｄ、　１
００ｎ（］／ｄの濃度になるように希釈し、またヒト尿
を８０倍および４０倍希釈して各々１００μｉ／ウエル
加え、３７°Ｃで１時間反応させた。３回洗浄用バッフ
ァーで洗浄した後、パーオキシダーピ標識化モノクロー
ナル抗体ＧＸ４を洗浄用バッファーで３００ｎ（］／ｍ
ｉの濃度になるように希釈し、１００μ、＋２／ウェル
加え、３７℃で１時間反応させた。３回洗浄用バッファ
ーで洗浄した後、基質溶液（ＡＢＴＳ＞を１００μｍ／
ウェル加えて波長４１５ｎｍにおける吸光度を測定した
。測定結果を表４に示す。

本発明のモノクローナル抗体はヒト尿に含まれる組織因
子アポ蛋白に結合し、検出する手段として有用であるこ
とを認めた。

表　　　４

【図面の簡単な説明】

添付図１は、本発明のモノクローナル抗体のヒト組織因
子アポ蛋白に対する結合性の強さを示したものであり、
図２は本発明のモノクローナル抗体３種類の抗原認識部
位（エピトープ）の相異性を示したものである。図３は
、本発明のモノクローナル抗体の組織因子活性に及ぼす
影響を示したものである。図１゜モノクロ−１７１才に体のａＪ屓刃子アポ長白へ一７爺
か合・匿ｆｉｔ＆ｔｅ？　七ノクローナル才九体；７１
＆（メ６り手続補上書平成元年特詐庁長官殿１、事件の表示特願平　　１、発明の名称抗ヒト組織因子モノクローナル抗体３月ンｑ日（１）明細書第６頁下から第６行に「不溶制」とあるの
を「不溶性」に訂正する。（２）明細書第１０頁下から第５行に「トリプロファン
」とあるを「トリプトファン」に訂正する。（３）明細書第１７頁下から第１行にｒｔｒａｉｎ　Ｊ
とあるのをｒｓｔｒａｉｎＪに訂正する。（４）明細書第２１頁第６行〜第７行にｒ成体組織」と
あるのを「生体組織」に訂正する。（５）明細書第２４頁下から第７行に「抗体酸性陽性ウ
ェル」とあるのを［抗体産生陽性ウェル」に訂正する。帝人株式会社以上

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒト組織因子に特異的に結合し、該ヒト組織因子
の血液凝固活性を阻害しない抗ヒト組織因子モノクロー
ナル抗体。
（２）ヒト胎盤由来の組織因子に特異的に結合し、該ヒ
ト組織因子の血液凝固活性を阻害しない請求項１記載の
抗ヒト組織因子モノクローナル抗体。
（３）ヒト胎盤由来の組織因子アポ蛋白に特異的に結合
し、該ヒト組織因子の血液凝固活性を阻害しない請求項
２記載の抗ヒト組織因子モノクローナル抗体。
（４）ヒト胎盤由来の組織因子アポ蛋白をＣＮＢｒで処
理して得られた、ヒト胎盤由来の組織因子アポ蛋白のリ
ン脂質を結合するドメインを含むカルボキシル基末端側
の断片に結合せず、ヒト胎盤由来の組織因子アポ蛋白の
リン脂質を結合するドメインを含まないアミノ基末端側
の断片に結合し、該ヒト組織因子の血液凝固活性を阻害
しない請求項３記載の抗ヒト組織因子モノクローナル抗
体。
（５）下記一般式（ I ）【遺伝子配列があります。】・・・（ I ）ここで、アミノ酸の略号は下記の通りであるＮ：アスパ
ラギンＤ：アスパラギン酸Ａ：アラニンＲ：アルギニンＩ：イソロイシンＧ：グリシンＱ：グルタミンＥ：グルタミン酸Ｃ：システインＳ：セリンＹ：チロシンＷ：トリプトファンＴ：トレオニンＶ：バリンＨ：ヒスチジンＦ：フェニルアラニンＰ：プロリンＭ：メチオニンＫ：リシンＬ：ロイシンで表わされるヒト組織因子アポ蛋白の断片に結合せず、
下記一般式（II）【遺伝子配列があります。】・・・〔II〕〔ここでアミノ酸の略号は式（ I ）に同じである。〕で表わされるヒト組織因子アポ蛋白の断片に結合し、該
ヒト組織因子の血液凝固活性を阻害しない請求項３記載
の抗ヒト組織因子モノクローナル抗体。
（６）請求項１記載の抗ヒト組織因子モノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ細胞。
（７）請求項１記載の抗ヒト組織因子モノクローナル抗
体の製造方法。