JPH0193537A - アンギオゲニンの抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、アンギオゲニンの抑制剤に関するものである
。

［従来の技術］ アンギオゲニンは血管形成を誘発するヒト蛋白質である
［フェット等、バイオケミストリー、第２４巻、第５４
８０頁（１９８５）　１゜この生物学的活性は３５ｆモ
ル程度の少ない伍で発現される［雛胚芽ＣＡＭ分析法を
用いる、上記］。ヒト腫瘍細胞により状態調節された媒
体から最初に単離されたが、アンギオゲニンは腫瘍特異
性でなく各種の他の細胞及び生物体液に見ることができ
、殆んどの場合正常及び（又は）病理学的な脈管新生の
役割を演する。これは約１４．４００の分子量を有し、
約ＤＨ９，５よりも高い等電点を有する［上記］。スト
リドム等、バイオケミストリー、第２４巻、第５４８６
頁（１９８５）も、アンギオゲニンのアミノ酸配列を開
示している。

アンギオゲニンは酵素活性を有することが知られている
。詳細には、これは２８Ｓ及び１８ＳのｒＲＮＡの限ら
れた開裂を触媒して、長さ１００〜５００ヌクレオヂド
の特定パターンの産生物を生成する［シャピロ等、バイ
オケミストリー、第２５巻、第３７２７頁（１９８６）
　］。しかしながら、これは標準的ＲＮアーゼ分析（上
記）において顕著なりボヌクレアーゼ活性を持たない。

［発明の要点］ 今回、少なくともアンギオゲニンの脈管形成活性を抑制
する物質を腫瘍成長の抑制方法及び組成物に使用しうろ
ことが突き止められた。さらに、上記アンギオゲニンの
１８Ｓ１２８Ｓ　ｒＲＮＡ−分解酵素活性を抑制する物
質は有効な腫瘍抑制剤である。

したがって本発明は、アンギオゲニンの脈管形成活性の
抑制剤を、腫瘍における前記脈管形成活性を抑制するの
に充分な量で投与することをコードする動物における腫
瘍成長の抑制方法に関する。

第二の面において本発明は、次の特異的酵素活性の抑制
剤を動物へ投与することからなり、前記活性は１８Ｓ若
しくは２８Ｓ　　ｒＲＮＡを開裂させて一般に１００〜
５００塩基の断片を生成させることをコードする動物に
おける腫瘍成長の抑制方法を提供する。

次のことが上記方法の好適具体例の特徴である：抑制剤
はＲＮアーゼＡ又はアンギオゲニンに結合することがで
き：抑制剤は上記酵素活性を抑制する能力を持った完全
な天然分子又はそのセグメント若しくは誘導体であり、
特に好ましくはアンギオゲニンの上記酵素活性を抑制す
る能力を持ったヒト胎盤ＲＮアーゼ抑制剤（ＰＲＩ）と
して知られた特異的物質のセグメントからなり：ヒトの
他の組織又は他の哺乳動物から得られるＰＲＩに同族の
他の蛋白質も使用することができ：抑制剤は動物の体重
１ｋＣＩ当り１０〜１０，０００μ９の量で投与され；
かつ動物はヒトである。

第三の面において本発明は、アンギオゲニンの脈管形成
活性を抑制しうる抑制剤を提供し、この抑制剤は薬理学
上適合性である（すなわち、動物に投与するのに適する
）媒体に適当な濃度で分散されかつその鎖は少なくとも
動物の所定領域（たとえば腫瘍を直ぐ取囲む領域）にて
天然産アンギオゲニンの脈管形成活性を抑制するのに充
分な…である。

この面の好適具体例において、抑制剤はアンギオゲニン
の酵素活性を抑制し；待に好ましくは抑制剤は上記１８
Ｓ、２８Ｓ　　ｒＲＮＡ−分解活性を抑制御る能ノ〕を
持ったＰＲＩのセグメント（又は他のヒト組織又は哺乳
動物組織からの同族蛋白質）からなっている。

第四の面にＪ３いて本発明は、脈管新生に伴う障害の抑
制方法を提供する。この方法は、動物に対しアンギオゲ
ニンの脈管形成活性の抑制剤を、前記障害に伴う脈管形
成活性を抑制するのに充分な量で投与することからなっ
ている。

第五の面において本発明は、アミノ酸配列：Ｖａｌ−Ａ
ｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅ
ｕ−（Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ　）　。

Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｉ、ｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｖａｌ−Ｇｌｙ　者１．　（Ｌ！−ｒｒｐからなるポリ
ペプチドを含む治療組成物を提供する。好適具体例にお
いて、ポリペプチドのレグメントはアンギオゲニン抑制
活性を右する。

第六の面において本発明は、上記アミノ酸配列をコード
する処理された核酸を提供刃る。処理された核酸につい
ては下記に定義するか、要するにこれはその天然環境か
ら取り出された任意の核酸を意味する。

第七の面において本発明は、アンギオゲニン抑制活性を
有するポリペプチドのセグメントをコードする処理され
た核酸を提供する。好ましくはこの核酸は、哺乳動物の
遺伝子保存物をアンギオゲニン抑制活性を有するポリペ
プチドのセグメントに対応するプローブでスクリーニン
グすることにより得られ二遺伝子保存物はゲノ云若しく
はｃＤＮＡからなり：このポリペプチドはヒト胎盤リボ
ヌクレアーゼ抑制剤であり；保存物はヒトＤＮＡ若しく
はヒトＣＤＮＡからなり；かっセグＶａ　ｌ　−Ａｓｎ
−Ｐ　ｒｏ−Ａ　１　ａ−Ｌｅｕ−Ａ　ｌ　ａ　−Ｇ　
１　ｕ−Ｌｅｕ−（Ａｓｎ−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ　＞　。

Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓ、ｐ−
Ｖａｌ−Ｇｌｙ、若しくは（Ｔｒｐ若しくはＶａｌ）　
−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−（Ｇｌｎ
若しく　ハＣｙｓ）−Ａｓｐ−（Ｌｙｓ若しくはｖａｌ
）である。

第への面において本発明は、アンギオゲニン抑制活性を
有するポリペプチドの製造方法に関するものである。こ
の方法は、前記ポリペプチドを」−ドする処理された核
酸を宿主細胞で発現させることをコードする。好ましく
は、この前記ポリペプチドはヒト胎盤リボヌクレアーゼ
抑制剤のセグメン１〜である。

本発明は、腫瘍の成長を防止し或いは減少さけ゛る手段
を提供する。好適抑制剤であるＰＲＩは、体液内或いは
たとえば腫瘍を直ぐ取囲む領域のような特定の局部領域
内にアンギオゲニン及びその他のＰＲＩ−結合蛋白質よ
りも僅がモル過剰で存在する場合に活性であり、したが
って極めて低温度で供給することのみを必要とする。

［実施例１ 以下、好適実施例を参照して本発明の他の特徴及び利点
を一層詳細に説明する。

■ アンギオゲニン アンギオゲニンは上記したような活性を有する蛋白質で
あって、フェット等（上記）及びシャピロ等（上記）に
より記載されたように取得しかつ精製することができる
。或いは、アンギオゲニンは組換ＤＮＡ技術を用いて取
得しかつ精製することもできる。クラヂ等、バイオケミ
ストリー、第２４巻、第５４９４頁（１９８５）はアン
ギオゲニンをコードするＣＤＮＡ及び遺伝子を記載して
いる。このＣＤＮＡ若しくは遺伝子は標準的な発現ベク
ターから発現させることができ、かつ得られたアンギオ
ゲニン蛋白は標準的方法によりたとえば哺乳動物、酵母
又は各種の微生物発現系で精製することができる［上記
、第５４９４頁］。

アンギオゲニン抑制剤 アンギオゲニン抑制剤は、アンギオゲニンの脈管形成活
性を抑制しうる任意の化合物である。好ましくは、アン
ギオゲニンの抑制剤は蛋白質であり、特に好ましくはこ
れはアンギオゲニンに結合することができかつ少なくと
もその生物学的脈管形成活性及び好ましくはその酵素２
８Ｓ／１８ＳｒＲＮＡ−分解活性を抑制しうる蛋白質で
ある［酵素活性はシャピロ等（上記）により記載された
ように測定される。要するに、１５〜２５μ９のＲＮＡ
を、全容積１３．５μｊにて３０　ｍ　トｌのＮａ（ｌ
を含有する３０ｍｆ４のＨｅｐｅｓ又は２０ｍＮのトリ
ス（１）８７．５）において３７℃で約１．９μト１の
アンギオゲニンと共に培養する。反応を約９０分間後に
４８μｉのホルムアミド／ホルムアルデヒド試薬を用い
て停止させる（上記）］。好ましくは、抑制剤は哺乳動
物組織、特に好ましくはヒト胎盤組織から分離される。

抑制剤の１例であるＰＲＩはブラックバーンにより記載
されたように単離することができる［ジャーナル・バイ
オロジカル・ケミストリー、第２５４巻、第１２，４８
４頁（１９７９）　］。実質的にＰＲＩに均等である蛋
白質、すなわち同様なアミノ酸配列を有すると共に同様
な生物学的及び酵素学的抑制活性を有するものは、他の
ヒト組織だけでなく他の哺乳動物組織にも見ることがで
きる。

たとえば、バートン等により記載されたＲＮアーゼＡの
各種の抑制剤［インターナショナル・ジャーナル・ペプ
チド・プロティン・リサーチ、第１９巻、第３７２頁（
１９８２）　、これを参考のためここに引用するコが本
発明に適している。これらの蛋白質は、第１表［バート
ン等（上記）から得た表］に示されたように、アミノ酸
組成においてＰＲＩに対し約７０〜８０％の類似性を有
フる。ざらに、この種の蛋白質は本発明の目的に対しア
ンギオゲニン抑制剤となる。これらの蛋白質を分離しか
つ精製する方法については、標準的な親和性クロマトグ
ラフ法又は組換ＤＮＡ技術を用いて下記に示す。

或いは、抑制剤をコードする遺伝子は標準技術によって
クローン化することもできる。この種の技術は抑制剤を
精製し、そのアミノ酸配列の１部を決定し、このアミノ
酸配列をコードしうるＤＮＡプローブを作成しかつこの
プローブを用いてたとえば胎盤細胞から作成されたＣＤ
ＮＡ若しくはゲノム保存物にて組換ベクターを検出する
ことを含む。次いで、クローン化した遺伝子をたとえば
細菌、酵母又は組織培養細胞などの適当な発現宿主細胞
における任意適当な発現ベクターで発現させることがで
きる。次いで、これらの細胞により産生された組換抑制
剤蛋白質を培養上澄液から又は細胞から精製することが
できる。

本発明によるポリペプチドを発現するクローンを検出す
るのに適したオリゴヌクレオチドプローブは、たとえば
長さ少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１６塩
基である第３図の配列（又は対応の反対方向配列）の断
片を用いて第３図に示した核酸配列から生成させること
ができる。第３図の配列における僅かな改変を伴うプロ
ーブ（たとえば１６個の位置のうち３個未満のイ装置で
変化）も許容することかできる。例としてのみド記の断
片を示す。対応の反対方向ストラン１〜ら同作に可能で
ある： ５°−ＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＧＡＣＣＡＧＧ
ＡＧＡＡ−３゜５　’−ＧＴＧＣＴＣＴＧＧＴＴＧＧＣ
ＣＧＡＣＴＧＣＧＡＴ−３“５“−ＧＴＧＭＣＣＣＴＧ
ＣＣＣＴＧＧＣＴＧＡ−３′５°−ＧＴＧＡＡＣＣＣＴ
ＧＧＡＣ’ｒＧＧＣＡＧＡ−３“５°−ＡＡＴＧＡＧＣ
ＴＧＧＧＣＧＡＴＧＴＧＧＧ−３゜５°−ＡＡＣＧＡＧ
ＣＴＧＧＧＣＧＡＴＧＴＣＧＧ−３’より一般化したス
トランド及び対応の反対方向ストランドは次の通りであ
る： ５°−ＴＧＧＢＴＮＴＧＧＢＴＮＧＣＮＧＡＢＣＡＤＧ
ＡＢＡ／１１．−３゜５°−ＴＴＩＴＣＢＴＧＩＴＣＣ
ＧＣＣＡＩＣＣＡＣＴＩＣＣＡ−３゜ＩＩ　　　　　Ｉ ５’−ＡＡＢＧＡＤＢＴＮＧＧＮＧＡＢＧＴＮＧＧ−３
゜５°−ＣＣＣＡＣｒＴＣＣＣＣＣＡＩＢＴＣＩＴＴ−
３゜ｒ　　　　　ＩＩ ■ ［上記配列において、ＢはＣ若しくはＴであり、Ｉはイ
ノシン（これはＡ、Ｔ若しくはＣとの塩基対とすること
かできる）であり、ＮはＡ、Ｔ、Ｃ若しくはＧでありか
つ、ＣはＣ若しくはＩで■ ある］ Ａ、Ｔ及びＣの代りにイノシンをプローブ配列に使用し
て、混合物として合成すべきプローブを天然遺伝子若し
くはｃＤＮＡ配列に対するそのハイブリッド化能力の損
傷なしに最小化させることができる。

ＰＲＩをコードする遺伝子のＣＤＮＡクローンを単離す
る方法の１例は、上記３種の反対方向ストランドのオリ
ゴヌクレオチドプローブを厳格なハイブリッド化条件下
で用いてヒト胎盤ＤＮＡのＣＤＮＡ保存物を試験するこ
とである。

ＰＲＩを発現するＣＤＮＡクローンを分離しかつスクリ
ーニングするための方法の伯の例は次の通りである。上
記のように精製されたＰＲＩに対する抗体をウサギで生
成させる。これらの抗体を親和性クロマトグラフィーに
より精製し、その際たとえばセファ０−ス（たとえばＣ
ＮＢｒにより活性化）のような活性化固体マトリックス
に結合したＰＲＩを使用する。

プローブの１種若しくはそれ以上にハイブリッド化し、
好ましくは３種全てにハイブリッド化する任意のクロー
ン或いは抗−ＰＲＩ抗体に結合する蛋白質を発現するよ
うな任意のクローンが、ＰＲＩコード化遺伝子の有力な
りローンである。

クローンがＰＲＩをコードするかどうかを決定するには
、これらを精製し、次いでプローブに対する再ハイブリ
ッド化又は抗−ＰＲＩ抗体を結合する蛋白質の発現につ
き再検査することができる。

最終的に、これらクローンの配列を決定しかつこれら配
列を比較して、これらがＰＲＩの公知の性質（すなわち
アミノ酸配列、分子量及びアミノ酸組成）と相関するか
どうかを調べることができる。次いで、ＰＲＩの発現は
ＣＤＮＡクローンを発現ベクター及び組換ＰＲＩに挿入
して達成することができ、これを発現させ、分離しかつ
精製する。これら全てのクローンは処理されたＤＮＡ（
すなわちその天然環境から採取されかつベクタ−中へ挿
入された、たとえばプラスミド若しくはファージのよう
なベクター中へ或いは生物ゲノム内にさえ挿入されたＤ
ＮＡ）を含有する。たとえば、処理されたＤＮＡは、も
はや天然配列によりそのいずれの側でも包囲されない。

一般に、この種の処理されたＤＮＡは組換ＤＮＡ技術を
用いて作成され、かつたとえば生体内の染色体ＤＮＡの
移植物がＤＮＡの環境を変化させたような天然ＤＮＡを
含まない。しかしながら、これは何らかの方法でＤＮＡ
が組換ＤＮＡ法によって操作された俊に生ずる天然のも
のを包含する。

今回、ヒＩ□ＰＲＩ　　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を
決定し、かつこのヌクレオチド配列からヒトＰＲＩのア
ミノ酸配列を推定した。さらに、ＰＲＩ　ｌ−リプシン
分解ペプチドのエドマン減成によりアミノ酸配列の１部
を確認した。

第３図は、ＰＲＩ　　ＣＤＮＡ配列及び翻訳アミノ酸配
列を示している。第３図のＣＤＮＡを含有するベクター
ｐＵｃ１８−ＰＲＩ　（Ａ）で形質転換された細菌イー
・コリＤＨ５αについては、１９８８年３月３１日付で
メリーランド州のアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクションに受託番号第６７６６８号として寄託した。

第３図におけるＰＲＩ情報を用いて、たとえば適当な発
現ベクターにＰＲＩ　　ｃＤＮＡを含む細胞を培養しか
つＰＲＩを培養上澄液から精製する標準的技術を用いて
組換ＰＲＩ抑制剤を産生させることにより、アンギオゲ
ニン抑制剤を得ることができる。

第３図の配列を有するＰＲＩの断片及び変種も適してい
る。たとえば、ＰＲＩはトリプシン分解によって断片化
することができ、かつ得られた断片（ＨＰＬＣにより精
製）をアンギオゲニン抑制活性につき本明細書中に記載
したように分析することができる。使用する特定ＰＲＩ
断片は次の通りである： Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｕ−Ｌｅｕ−（Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ　）　；Ｓｅ
ｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ
−Ｇｌｙ；（Ｔｒｐ　、若しくはＶａｌ　）Ｌｌ、ｅｕ
−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−（Ｃｙｓ若しくは
Ｇｉｎ）−Ａｓｐ−（Ｖａｌ若しくはＬｙｓ）たとえば
、第１表に示したような他の吐乳動物からのＰＲＩは、
これらを他の吐乳動物からクローン化ざゼかつ上記した
ようにアンギオゲニン断片を供給することによって取得
しかつ分析することができる。

クローン化させた場合、天然遺伝子を標準的技術により
、たとえば抑制剤がアンギオゲニンの生物学的脈管形成
活性を抑制する能力を有する限りこの抑制剤のアミノ酸
配列を変化させて改変することもできる。この種の改変
は、アンギオゲニンに対する抑制剤の結合能力を増大さ
せるべく設計することができる。ざらに、関連する抑制
剤コード遺伝子は、標準技術により作成された他の動物
ゲノムの保存物に対するプローブとして抑制剤をコード
する上記クローン化遺伝子の１部を用いて単離すること
もできる。

他の抑制剤を分離するには、１つの可能な方法はアンギ
オゲニンを結合しうる蛋白質を検出することであり、た
とえばこれはアンギオゲニンをカラムに結合させかつ有
力な抑制剤蛋白質を含有する試料をこのカラムに通過さ
せて行なわれる［ＲＮアーゼＡをブラッキバーン、ジャ
ーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５４巻、
第１２４８８頁（１９７９）に記載されたようにアンギ
オゲニンの代りに使用することができる］。次いで結合
した蛋白質を、たとえば３Ｍ　　Ｎａ（ｌと１５％グリ
セリンと１ｍ）ｉ　　ＥＤＴＡと５ｍ）ＩＤＤＴとを含
有する０、１Ｍ酢酸す１−リウム（１）Ｈ５，０）を用
いることにより溶出させて、アンギオゲニン／抑制剤複
合体を解離させることができる。次いで下記するように
溶出蛋白質を精製しかつ試験して、放出された蛋白質が
アンギオゲニンの脈管形成活性を抑制するかどうか、或
いはこれらがその酵素活性を抑制するかどうかを調べる
ことができる。

次いで、活性蛋白質を標準法で精製することができる。

ざらに、天然抑制剤の生物学的抑制特性を保持する抑制
剤のセグメント（たとえばＰＲＩのセグメントを）使用
することができ゛る。この種のセグメントは、天然抑制
剤を分解して活性セグメントを生成するプロテアーゼを
用いる標準法により、或いは組ｍＤＮＡ技術を用いて抑
制剤をコードする溝造遺伝子若しくはＧ：ＤＮＡの非必
須部分を除去し、次いでこの処理されたＤＮＡを発現さ
せて改変抑制剤を産生させることにより作成することが
できる。

抑制剤活性 下記は、アンギオゲニンに対するＰＲＩの抑制作用に関
するインごトロ測定の例である。この例は本発明を限定
することを意味せず、当業者はこれらの実施例が他の抑
制剤若しくはそのセグメントをも下記の方法に使用しう
るかどうかを示唆していることを認識するであろう。

アンギオゲニンの酵素活性における抑制の測定アンギオ
ゲニン及びＰＲＩを、一般にフエット等及びシャピロ等
（上記）により記載されたように精製した。アンギオゲ
ニンの酵素活性はシャピロ等（上記）により記載された
ように測定した。

要するに、アンギオゲニンは２８８及び１８８ｒＲＮＡ
の開裂を触媒して、長さ１００〜５００ヌクレオチドの
生成物を形成する。これらの生成物は安定であって、大
きい（約５００塩基）のアカロースグルで見えるセグメ
ントを有する。１つの実験において、１２μ９のＲＮＡ
を３３ｍトＩ　　Ｈｅ　ｐ　ｅ　ｓ及び３３ｍＨＮａＣ
ｌ１　（ｐＨ７，５）中にて３７℃でアンギオゲニン及
び（又は）ＰＲＩと共に又はそれを用いずに培養した。

３０分間後、反応をシャピロ等（上記）により記載され
たように停止させ、試料を１．１％アガロースゲルに流
し、かつ臭化エチジウムで染色した。０．９６μＨのＰ
ＲＩは０．８μＭのアンギオゲニンによりｒＲＮＡの酵
素分解を完全に抑制した。ＰＲＩ単独ではｒＲＮＡに対
し活性を示さなかった。たとえば、ＰＲＩはアンギオゲ
ニンの酵素活性の有力な抑制剤で必り、アンギオゲニン
との１＝１の比より僅か多量にて活性である。

アンギオゲニン／ＰＲＩ複合体の安定性アンギオゲニン
抑制剤の治療用途には、アンギオゲニンに対し強力に結
合しかつその生物学的活性を低下させる抑制剤を使用す
るのが有利である。

ＰＲＩはこの種の抑制剤である。

ＲＮアーゼＡもＰＲＩに結合しかつアンギオゲニンと競
合して溶液中でＰＲＩを結合する。ＲＮアーＬＡの酵素
活性もＰＲＩにより抑制される。

これらの性質を用いて、下記するようにＰＲＩ／アンギ
オゲニン複合体の安定性を決定することができる。

ＵＤＡはＲＮアーＵ△に対し優秀な基質であるが、アン
ギオゲニンについては基質とならない。

１つの実験において、種々異なる量のアンギオゲニンを
０．２７ｎ）ｌのＲＮアーゼＡと０．２０ｒ＋ＨのＰＲ
Ｉとの混合物に添加し、先ず最初にＲＮアーゼＡとアン
ギオゲニンとを混合し、次いでＰＲＩを５分間かけて２
５℃にて添加し、次いでＵｐＡ基貿［１０／１４／ｄの
ヒト血清アルブミン（Ｈ３Ａ＞と０．１Ｍの２−（Ｎ−
モルホリノ）−エタン−スルホン酸と０．１ＭのＮａＣ
（！と１ｍＨのＥＤＴＡとの緩衝液（ｐ）（６，０＞に
おける０、２ｍ）ｆ］を添加した。

混合物に存在するアンギオゲニンが多くなる程、これに
結合するＰＲＩも多くなり、したがってＲＮアーゼＡに
結合しかつその酵素活性を抑制しうるＰＲＩが少なくな
る。さらに、ＲＮアーゼＡに対するよりもアンギオゲニ
ンに対するＰＲＩの結合が強くなる程、ＲＮアーゼＡ活
性の抑制低下も大となる。何故なら、この場合ＰＲｒは
優先的にアンギオゲニンに結合するからである。その結
果を第１図に示す。相対的抑制は（Ｖｏ−Ｖａ）／（Ｖ
ｏ−Ｖｒ）［ここでＶｏはＰＲＩの不存在下におけるＲ
ＮアーゼＡ活性の速度を示し、Ｖｒはアンギオゲニンを
添加しないＰＲＩの存在下での速度を示し、かつＶａは
アンギオゲニンを添加したＰＲＩの存在下での速度を示
す］として計算される。５．．８ｎＭのアンギオゲニン
において、実質的にＲＮアーゼＡ活性の抑制は生じなか
った。したがって、全ＰＲＩをＲＮアーゼＡとの反応か
ら外しかつ抑制するには、大過剰のアンギオゲニンが必
要とされる。

関連した実験において、アンギオゲニン及びＰＲＩに対
するＫｉを上記方法を用いかつこれを改変して推定する
ことができ、その際ＰＲＩとアンギオゲニンとを先ず最
初に１０分間予備培養し、次いでＲＮアーゼＡ及びＵｌ
）Ａを添加する。この゛分析は、ＰＲＩとアンギオゲニ
ンとの培養後に残存する遊離抑制剤の量を決定する。た
とえば、ＰＲＩとアンギオゲニンとの解離が遅ければ、
ＲＮアーゼＡ活性の抑制は小さい。１：　　１．２のア
ンギオゲニン：ＰＲＩの比において、遊離ＰＲＩは検出
されなかった。したがって、ＰＲＩとアンギオゲニンと
は強力に結合し、かつ０．１ｎＨ未満のＫｉを有すると
思われる。

さらに、ＰＲＩとアンギオゲニンとの結合強度をも陽イ
オン交換ＨＰＬＣによって示した。この方法は、遊離ア
ンギオゲニンをアンギオゲニン／ＰＲＩ複合体から区別
することができる。シンクロパックＣＭ　３００カラム
（２５０ｘ　４．１ｍｍニシンクロム・インコーポレー
ション社）とウォータース・アソシエーツ社の液体クロ
マトグラフィー系とヒユーレット・パラカード３３９０
Ａ型積算器とを使用した。その結果を第２図に示す。１
ｍＨのＥＤＴＡと１０島のＨ３Ａとを含有する０、１Ｈ
トリス（ｐＨ７）における１ｄの試料を、２０ｍＨの燐
酸ナトリウム（１）ｌ−１７）における２２０〜６２０
ｍＨＮａＣＩ２の直線濃度勾配により１０分間にわたり
Ｉｄ／ｍｉｎの流速で溶出させ、溶出液を２１４ｎｍに
て監視した。パネルＡにおいて、０．６７！／１１５の
アンギオゲニンの溶出が示され、パネルＢにおいては０
．６４ｇ９のアンギオゲニンと１２ｔＩ９のＰＲＩとの
溶出が示された。パネルＢにおいては、検出し、うる遊
離アンギオゲニンが存在しない。アンギＡゲニンーＰＲ
Ｉ混合物に対するＲＮアーゼＡの３２倍過剰の添加は、
１７時間の培養後でさえ遊離アンギオゲニンを産生しな
かった。かくして、アンギオゲニン／ＰＲＩの解離は、
１日以上の半減期を有すると思われる。

虱宣肛底塁旦μ且星 脈管形成（すなわち脈管形成活性）を、フエット等（上
記）により記載されたナイトン等、ブリティッシュ・ジ
ャーナル・キャンサー、第３５巻、第３４７頁（１９７
７）の雛胚芽コリオアラントイン膜（ＣＡＭ）分析の改
変により測定した。この分析のため、アミコン・セント
リコン−１０型微小濃縮器を用いて脱塩し、緩衝液を少
なくとも５００倍に希釈した。これは、実験に悪影響を
及ぼしたり或いは卵白身を害しうるような阻害成分をＰ
ＲＩ溶液から除去覆る。アンギオゲニンに対しＰＲＩを
添加する結果を下記第２表に示す。

実験Ｎα１及びＮα２のデータは、それぞれ２群及び３
ｕの分析で得られた結果の総合を示している。

１０〜２０個の卵を各組における３実験群のそれぞれに
つき使用した。下記量のアンギオゲニンとＰＲＩとを使
用した：実験Ｎα１、それぞれ７５日ｇ及び２μ９；実
験Ｎ（１２，４６日ｇ及び７００ｎｇ　；及び実験ＮＱ
３．２５日ｇ及びｉａｏｎｇ　。

第２表 アンギオゲニン　　　５８（２４）　　５２（５４）　
　６２（１３）ＰＲＩ　　　　　　　１７（２９）　　
３３（４８）　　１７（１２）アンギオゲニン ＋　Ｐ　ＲＩ　　　　　　１５（２６）　　２５（５２
）　　７（１４）これらの結果から明らかなように、過
剰のＰＲＩはアンギオゲニン活性を緩衝液単独及び抑制
剤単独の比較で観察されるものとは区別しえないレベル
まで低下させる。。

腫瘍成長の抑制 免疫治療研究のため、雄裸（ｎ　ｕ　／　ｎ　ｕ　＞ネ
ズミ（チャールス・リバー・ラボラドリース社）を層流
条件下に維持し、実験にかける前に年齢と檻とを調和さ
せた（檻１個当り５匹の動物）。実験動物（１群当り５
〜１０匹）に５ｘ１０５　ＨＴ−２９ヒト結腸腺癌細胞
［フォー等、「インビトロにおけるヒト腫瘍細胞」、）
Ａ−編、第１１５〜１６０頁、プレナム・プレス社、ニ
ューヨーク（１９７５）　］を００日に皮下注射（Ｓ、
Ｃ，）した。ざらにＯ日日に、動物を緩衝液比較［燐酸
塩緩衝塩水；（０，２ａ　／ｅのＫＣｆｆｉ、０．２ｇ
／でのＫＨ２ＰＯｐ。

８ｇ／２のＮａＣｊ及び２．１ｈ／！のＮａ２８ＰＯ＋
・７）−１２０（３７℃にてＩ）８７．４）に対し透析
したＰＲＩを貯蔵するのに使用する緩衝液、ＰＢＳＡ１
００成］又はＳ、Ｃ，若しくは腹腔的注射（Ｉ。

Ｐ、）による種々な投与量の胎盤抑制剤（１００成）の
いずれかで処理した。処理方式は、実験計画に応じて毎
日の注射（１０〜１１回投与）又は２〜３日間隔での注
射（５〜１０回投与）を含んだ。動物の健康、体重、腫
瘍寸法、並びに写真記録の評価を毎週２〜３回記録した
。実験の終了後、血液及び組織試料を集めて、免疫学的
及び組織学的評価を行なった。

１つの実験において、４０匹の雄ｎ　ｕ／ｎ　ｕネズミ
に５ｘ１０５　ＨＴ−２９細胞をＯ日日に皮下注射した
。ざらに、Ｏ日日にネズミ１〜１０（第１群）には１０
０成の比較緩衝液を摂取させ、ネズミ１１〜２０（第２
群）には１００Ｉｉ１中１０μ９の胎盤抑制剤を摂取さ
せ、ネズミ２１−３０　（第３群）には１００成中１．
０ｉの胎盤抑制剤を摂取させ、かつネズミ３１〜４０に
は１００μｅ中ｏ、　１ｔ１９の胎盤抑制剤を摂取させ
た。

第１群及び第２群には、さらにそれぞれ第１．４．６．
８．１８．２０及び２２日目に緩衝液又は１０縛の胎盤
抑制剤を注射、シた。第１．４．６及び８日日には、第
３群及び第４群にそれぞれ１．０ｔ１９若しくは０、１
．ｑの投与量にて胎盤抑制剤を摂取させた。全処理の注
射は腹腔内で行なった。６０日間後、動物１３．１４．
１７．１８．２０及び２４のみが腫瘍なしに保たれた。

かくして、１０ｉのＰＲＩの接種は、約６０％の動物に
おいて腫瘍形成を防止した。

抑制剤によるアンギオゲニンの生物学的及び酵素学的活
性の両者における抑制は重要な物理的、生理的及び薬理
学的意味を有する。これは、アンギオゲニンのこれら２
種の作用が相関するという仮説と一致し、これはｐｉ−
１５，５におけるブロモアセテートによるカルボキシメ
チル化の際の両活性の同時的損失により従来から示唆さ
れている［シャピロ等、上記］。さらに、これは、この
種の抑制剤がアンギオゲニンのインビボ調整に役割を演
じうるという可能性をもたらす。アンギオゲニン／ＰＲ
Ｉの相互作用は恐らく三次元構造にて大幅に分離された
アンギオゲニンの領域に関与すると思われ、その多くは
活性中心の外側に存在する。

したがって、酵素活性のみに必要な残基の保持は、恐ら
く相互作用の強さを説明しえないと思われる。

このことは、ＰＲＩを結合するアンギオゲニンの能力が
発生の際に独立して維持されたことを意味する。明らか
に、ＰＲＩ及びその他の抑制剤による結合は、薬理学上
及び治療上能力を有する生理学上適切な抑制メカニズム
を反映覆る。たとえば、上記したように、これらの抑制
剤はネズミにおける腫瘍形成の予防に活性である。明ら
かに、これらは腫瘍成長並びに脈管新生に伴うその伯の
病気、たとえば糖尿病網膜症、関節リウマチ症及びコボ
シ氏肉種を予防するためにヒト又はその他の動物に注射
するのに適している。すなわち、これらは脈管形成がた
とえば充実性腫瘍、血管腫症及び乾癖のような病気の病
理学において重要な役割を演じている障害を治療するの
に適している。

好ましくは、これらは血管内、特に好ましくは静脈内注
射され、或いは薬理学上適当な媒体［たとえばＰＢＳＡ
又はクラコツトによりＣａ−Ａキャンサー・ジャーナル
・フォー・クリニシャン、１９８７年３月／り月、第３
７巻、第９３頁に記載されたような緩衝剤及び薬剤］に
て腹腔内注射され、この媒体はたとえば動物内における
アンギオゲニンの天然生物学的活性を抑制するのに充分
な量（たとえば動物体重１ｋｇ当り約１０〜１０．００
０馬）を動物へ投与するのに適している。或いは、これ
らは特定領域に局部塗布したり又は皮下注射することも
できる。

これらの抑制剤は、精製型であれば８μＭ程度の低い濃
度でさえ少なくとも２週間にわたり安定であることが判
明した。投与される貯Ｒ緩衝液又は治療組成物にＤＴＴ
を含ませる必要はないが、生理学上適合性の天然薬剤（
たとえばＮ−アセチルシスティン又はシスティン若しく
はシステアミン）を使用することもできる。投与するに
は、緩衝液が患者に害を与えないことが重要である。こ
れらの抑制剤は低濃度にて予防的に使用することもでき
る。たとえば、癌発生の危険がある患者（たとえば−次
腫瘍が創出されている患者）に対し、体重１　ｋａ当り
１０〜１０，０００ｔ１９のを投与するのが適している
。

【図面の簡単な説明】

第１図はアンギオゲニン抑制剤の例としてのＰＲＩ［ブ
ラックバーン、ジャーナル・バイオロジカル・り°ミス
ドリー、第４２５４巻、第１３４８４頁（１９７９）　
］によるウリジリル（３’　、５’　）アデノシン（Ｕ
ｐＡ）に苅するＲＮアーゼＡ活性の抑制に関するアンギ
オゲニンの作用を示す特性曲線図であり、 第２図はＨＰＬＣカラムからのアンギオゲニン（Ａ＞又
はアンギオゲニンとＰＲＩ（Ｂ）との溶出を示す特性曲
線図であり、 第３図はＰＲＩ　　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び翻
訳アミノ酸配列を示す配列図である。 籾灯箭杉ｐ制御 ＧＣＴＧＣＴＣＴＣＣＣＴＧＧ＾ＣＧＡＣＣＧＧＣＣＴ
ＣＧＡＧＧＣ八八ｃｃｃｙＧｊＧＧＧＴＴＴＧ＾＾ＧＡ
Ｇ＾＾八ＣＧＣＴＣＡＧＡＴＣＣＧＣＴＴ八ＴＴＴＣＴ
ＧＣＣ八６．３−３ 手続補正書（方式） 昭和６３年８月　１２日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 事件の表示　昭和６３年特　願第　９０４５３　　号発
明の名称　アンギオゲニンの抑制剤 補正をする者

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）アンギオゲニンの脈管形成活性の抑制剤を、腫瘍
   における前記脈管形成活性を抑制するのに充分な間で投
   与することを特徴とする動物における腫瘍成長の抑制方
   法。 （２）酵素活性の抑制剤を動物へ投与することからなり
   、前記活性が１８Ｓ若しくは２８ＳのｒＲＮＡを開裂し
   て一般に１００〜５００塩基のセグメントを生成させる
   ことを特徴とする動物における腫瘍成長の抑制方法。 （３）抑制剤がＲＮアーゼＡに結合しうる請求項１又は
   ２記載の方法。 （４）抑制剤がアンギオゲニンに結合しうる請求項１又
   は２記載の方法。 （５）抑制剤がヒト胎盤リボヌクレアーゼ抑制剤のアン
   ギオゲニン抑制性セグメント又はヒト非胎盤組織若しく
   はヒトでない哺乳動物組織からの同族蛋白質を含む請求
   項１又は２記載の方法。 （６）抑制剤がＰＲＩ又はそのアンギオゲニン抑制性セ
   グメントである請求項５記載の方法。 （７）抑制剤を動物の体重１ｋｇ当り１０〜１０，００
   ０μｇの量で投与する請求項１記載の方法。 （８）動物がヒトである請求項１記載の方法。 （９）アンギオゲニンの脈管形成活性を抑制しうる抑制
   剤を、適当な濃度にて動物に対し生理学上適合性であり
   かつ投与するのに適した媒体に分散させて含み、その量
   は前記アンギオゲニンを少なくとも前記動物の所定領域
   内で天然に生成させるアンギオゲニン活性を抑制するの
   に充分な量であることを特徴とする治療組成物。 （１０）抑制剤がアンギオゲニンの酵素活性を抑制する
   請求項９記載の組成物。 （１１）抑制剤がヒト胎盤リボヌクレアーゼ抑制剤のア
   ンギオゲニン抑制性セグメント又はヒ１〜非胎盤組織若
   しくはヒトでない哺乳動物組織からの同族蛋白質を含む
   請求項９記載の組成物。 （１２）抑制剤がＰＲＩ又はそのアンギオゲニン抑制性
   セグメントである請求項１１記載の組成物。 （１３）動物に対しアンギオゲニンの脈管形成活性の抑
   制剤を、脈管新生に伴う障害に関連した脈管形成活性を
   抑制するのに充分な量で投与することを特徴とする脈管
   新生に伴う障害の抑制方法。 （１４）アミノ酸配列： Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇ
   ｌｕ−Ｌｅｕ−（Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ）；Ｓｅｒ−
   Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇ
   ｌｙ；若しくはＴｒｐ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌ
   ａ−Ａｓｐ−（Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）からなるポリ
   ペプチドを含む治療組成物。 （１５）アミノ酸配列： Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇ
   ｌｕ−Ｌｅｕ−（Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ）；Ｓｅｒ−
   Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇ
   ｌｙ；若しくは（Ｔｒｐ若しくはＶａｌ）−Ｌｅｕ−Ｔ
   ｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−（Ｃｙｓ若しくはＧｌ
   ｎ）−Ａｓｐ−（Ｖａｌ若しくはＬｙｓ）からなるポリ
   ペプチドを含む治療組成物。 （１６）ポリペプチドのセグメントがアンギオゲニン抑
   制活性を有する請求項１４記載の治療組成物。 （１７）ポリペプチドを含み、このポリペプチドがＰＲ
   Ｉ配列と同一又はこの配列から構成的に置換された長さ
   少なくとも８個の残基の配列を含む治療組成物。 （１８）請求項１７記載のポリペプチドをコードする処
   理された核酸。 （１９）（ａ）少なくとも２４塩基のＰＲＩｃＤＮＡ配
   列、又は（ｂ）少なくとも２４塩基のＰＲＩｃＤＮＡ配
   列と同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含む請
   求項１８記載の処理された核酸。 （２０）アミノ酸配列： Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇ
   ｌｕ−Ｌｅｕ−（Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ）；Ｓｅｒ−
   Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇ
   ｌｙ；若しくは（Ｔｒｐ若しくはＶａｌ）−Ｌｅｕ−Ｔ
   ｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−（Ｃｙｓ若しくはＧｌ
   ｎ）−Ａｓｐ−（Ｖａｌ若しくはＬｙｓ）をコードする
   処理された核酸。 （２１）哺乳動物の遺伝子保存物を、アンギオゲニン抑
   制活性を有するポリペプチドのセグメントに対応するプ
   ローブでスクリーニングすることにより得られる請求項
   １８記載の核酸。 （２２）遺伝子保存物がゲノム又はｃＤＮＡからなる請
   求項２１記載の核酸。 （２３）ポリペプチドがヒト胎盤リボヌクレアーゼ抑制
   剤である請求項２１記載の核酸。（２４）保存物がヒト
   ＤＮＡ又はヒトｃＤＮＡからなる請求項２１記載の核酸
   。 （２５）プローブが配列： 【遺伝子配列があります。】； 【遺伝子配列があります。】； 【遺伝子配列があります。】； 【遺伝子配列があります。】； 【遺伝子配列があります。】； 及び 【遺伝子配列があります。】 ［配列中、ＢはＣ若しくはＴであり、Ｉはイノシンであ
   り、ＮはＡ、Ｔ、Ｃ若しくはＧでありかつ＾Ｃ＿ＩはＣ
   若しくはＩである］ よりなる群から選択される配列を含む請求項２１記載の
   核酸。 （２６）プローブが配列： ５′−ＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＧＡＣＣＡＧＧ
   ＡＧＡＡ−３′； ５′−ＧＴＧＣＴＣＴＧＧＴＴＧＧＣＣＧＡＣＴＧＣＧ
   ＡＴ−３′； ５′−ＧＴＧＡＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＡ−３
   ′； ５′−ＧＴＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＣＡＧＡ−３
   ′； ５′−ＡＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧＡＴＧＴＧＧＧ−３
   ′； 及び ５′−ＡＡＣＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧＡＴＧＴＣＧＧ−３
   ′ よりなる群から選択される配列を含む請求項１９記載の
   核酸。 （２７）請求項１８記載の処理された核酸を宿主細胞内
   で発現させることを特徴とするアンギオゲニン抑制活性
   を有するポリペプチドの製造方法。 （２８）核酸がヒト胎盤リボヌクレアーゼ抑制剤のセグ
   メントをコードする請求項２７記載の方法。