JPH09201199A

JPH09201199A - Ｄｎａ変異の検出法

Info

Publication number: JPH09201199A
Application number: JP8268687A
Authority: JP
Inventors: Kokichi Sugano; 康吉菅野
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-11-24
Filing date: 1996-10-09
Publication date: 1997-08-05
Anticipated expiration: 2016-10-09
Also published as: JP4042826B2

Abstract

(57)【要約】【課題】遺伝子多型を利用する遺伝子欠失の検出法を
簡便かつ高感度化し、診断に応用できる方法を提供する
こと。【解決手段】蛍光ラベル化したオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いてＰＣＲを行った後、ＰＣＲ産物の３’
末端側を平滑末端化処理し、ＳＳＣＰ法でＬＯＨを検出
することにより、遺伝子の欠失を簡便かつ高感度に検出
する。ｐ５３癌抑制遺伝子等の癌抑制遺伝子の欠失は、
細胞の癌化と深く関連しているので、癌の診断に用いる
ことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、例えば遺伝子多型
を用いるヘテロ接合性の消失（ロスオブヘテロツァ
イゴシティ：ＬＯＨ）の検出を、定量的で簡便かつ高感
度に実施し、癌などの疾病の診断に応用することができ
る検出法に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子操作法の進歩はめざましく、遺伝
子を利用した疾病の診断法へも広がりつつある。例え
ば、機能蛋白（酵素や構造蛋白）の遺伝的な欠損や機能
異常が原因とされる遺伝病の診断、癌化に伴う正常細胞
から癌細胞への遺伝子変異を検出する癌の診断、感染菌
やウイルスなどの遺伝子の検出や同定を利用する感染症
の診断、組織の細胞中ｍＲＮＡの検出から遺伝子の転写
レベルの定量（蛋白発現レベルの予測）など広範にわた
り、一部は、既に臨床に供されているものもある。

【０００３】癌の遺伝子診断とは、狭義には、癌遺伝子
あるいは癌抑制遺伝子の発現や変異などの異常を遺伝子
（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）から特定するものであるが、
広義には、ある種の癌に特異的に発現する蛋白を同定し
たり発現量を検索することも含んでいる。この癌化にか
かわる遺伝子として多くの癌遺伝子や癌抑制遺伝子が報
告されており、これらの遺伝子に欠失や突然変異などの
何らかの変異が認められることも多い。しかし、これら
の遺伝子のうち、診断的価値のある遺伝子、即ち、比較
的多くの症例で共通の変異が認められている遺伝子の報
告は少ないが、このような遺伝子として、癌遺伝子では
ｒａｓ遺伝子など、癌抑制遺伝子ではｐ５３遺伝子など
が知られている。

【０００４】ポリメラーゼチェーンリアクション法（Ｐ
ＣＲ）は、点突然変異、遺伝子増幅、染色体欠失などの
色々な遺伝子変異の分析に利用されてきた。染色体欠失
は、悪性新生物の一般的な特徴であり、polymorphic ba
se substitutions、variablenumber of tandem repeats
（ＶＮＴＲ）、マイクロサテライト型多型などの種々
の遺伝子多型マーカーを用いることにより、ヘテロ接合
性の消失（ＬＯＨ）として検出される。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】マイクロサテライト型
多型を指標とするヘテロ接合体の検出には、ＰＣＲが利
用され、広く遺伝子の連鎖分析に用いられてきた。しか
し、固形癌を対象とする場合、この方法を用いるＬＯＨ
の検出には、幾つかの問題点があった。(1) 一般に、癌
組織中に含まれる癌細胞数は少なく、また、癌細胞によ
って引き起こされる間質系細胞の増殖や白血球の浸潤に
よって、欠失の判定が困難になる場合があった。(2) 常
に、正常細胞との比較が必要であった。(3) フォルマリ
ン固定パラフィン包埋切片のような保存材料では、ＤＮ
Ａが断片化してＰＣＲが難しく、ＬＯＨの検出は困難で
あった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記した
ような問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、末端
平滑化したＤＮＡ断片を例えば一本鎖ＤＮＡ高次構造多
型解析法（ＳＳＣＰ法）で分析すると、ＬＯＨが簡便か
つ定量的に検出できることを見出し、本発明に至ったも
のである。即ち本発明は、癌の診断などに有用なＬＯＨ
の簡便で高感度な検出法を提供するものである。

【０００７】本発明の第１の要旨は、試料中のＤＮＡ断
片を検出する際に、あらかじめ該ＤＮＡ断片の末端平滑
化処理を行うことを特徴とするＤＮＡ断片中の変異の検
出法である。

【０００８】本発明の第２の要旨は、試料中のＤＮＡ断
片が、ポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ）
の産物である第１の要旨のＤＮＡ断片中の変異の検出法
である。

【０００９】本発明の第３の要旨は、変異の検出法が一
本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法（ＳＳＣＰ法）である第
１又は２の要旨のＤＮＡ断片中の変異の検出法である。

【００１０】本発明の第４の要旨は、遺伝子から遺伝子
多型の存在する遺伝子領域のＤＮＡを複製し、複製した
ＤＮＡ断片の３’末端側に平滑化処理を行い、得られた
ＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法（ＳＳＣ
Ｐ法）で分析することを特徴とするヘテロ接合性の消失
（ＬＯＨ）を検出する方法である。

【００１１】本発明の第５の要旨は、ＤＮＡ断片として
複製しようとする１遺伝子領域中における遺伝子多型は
１箇所の塩基置換による多型である第４の要旨のＬＯＨ
の検出方法である。

【００１２】本発明の第６の要旨は、遺伝子多型が、ｐ
５３癌抑制遺伝子のイントロン１領域における制限酵素
ＨａｅIII 感受性の有無である第４又は５の要旨のＬＯ
Ｈの検出方法である。

【００１３】本発明の第７の要旨は、複製するＤＮＡ断
片が、オリゴヌクレオチドプライマー、５’ＴＣＴＴＡ
ＧＣＴＣＧＣＧＧＴＴＧＴＴＴＣ３’（前向き）と５’
ＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＴＧＴＡＡＡＴＧ３’（逆向
き）を用いるＰＣＲで増幅される領域である第４又は５
の要旨のＬＯＨの検出方法である。

【００１４】本発明の第８の要旨は、遺伝子多型が、ｐ
５３癌抑制遺伝子のエクソン４領域における制限酵素Ｂ
ｓｔＵＩ感受性の有無である第４又は５の要旨のＬＯＨ
の検出方法である。

【００１５】本発明の第９の要旨は、複製するＤＮＡ断
片が、オリゴヌクレオチドプライマー、５’ＡＧＣＴＣ
ＣＣＡＧＡＡＴＧＣＣＡＧＡＧ３’（前向き）と５’Ｃ
ＴＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧ３’（逆向
き）を用いるＰＣＲで増幅される領域である第４又は５
の要旨のＬＯＨの検出方法である。

【００１６】本発明の第１０の要旨は、遺伝子多型が、
ｐ５３癌抑制遺伝子のイントロン７領域における制限酵
素ＡｐａＩ感受性の有無である第４又は５の要旨のＬＯ
Ｈの検出方法である。

【００１７】本発明の第１１の要旨は、複製するＤＮＡ
断片が、オリゴヌクレオチドプライマー、５’ＡＧＧＴ
ＣＡＧＧＡＧＣＣＡＣＴＴＧＣＣ３’（前向き）と５’
ＧＴＧＡＴＧＡＧＡＧＧＴＧＧＡＴＧＧＧＴ３’（逆向
き）を用いるＰＣＲで増幅される領域である第４又は５
の要旨のＬＯＨの検出方法である。

【００１８】本発明の第１２の要旨は、ｐ５３癌抑制遺
伝子内の複数個の遺伝子多型のそれぞれを、第４又は５
の要旨のＬＯＨの検出法で検出し、その結果を組み合わ
せることによる癌の検査方法である。

【００１９】本発明の第１３の要旨は、第７，９，１１
の要旨のＬＯＨの検出方法により得られる検出結果を２
以上組み合わせることによる第１２の要旨の癌の検査方
法である。

【００２０】本発明の第１４の要旨は、２組以上のプラ
イマーを同時に用いる第４又は５の要旨のＬＯＨの検出
方法である。

【００２１】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
先ず、本発明における試料中のＤＮＡ断片とは、組織、
血液、細胞、体液、精子、感染菌、ウイルスなどから抽
出したＤＮＡを制限酵素などで適当なサイズに切断した
ＤＮＡ断片、または、組織、血液、細胞、体液などから
抽出したＤＮＡを鋳型として適当なＤＮＡ領域のみをＰ
ＣＲなどで増幅したＤＮＡ断片を意味する。

【００２２】本発明の末端平滑化処理とは、２本鎖ＤＮ
Ａ断片の末端１本鎖部分を平滑にすることであり、Klen
owフラグメントやＴ4 ＤＮＡポリメラーゼのような３’
→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、１本鎖部分を修
復する酵素で処理するか、平滑に切断する制限酵素で処
理して１本鎖部分を含む末端部を取り除けばよい。３′
→５′エクソヌクレアーゼ活性有する耐熱性ポリメラー
ゼを用いてＰＣＲ法を施行する等の方法を用いることが
可能である。分析しようとする２本鎖ＤＮＡ断片のセン
ス鎖とアンチセンス鎖の長さが異なったり不揃いの場
合、熱変成して１本鎖にして分析すると、ＤＮＡ断片に
由来するピークは分裂し、多重となる。これに対し、２
本鎖ＤＮＡ断片を平滑化して分析すると単一ピークに収
束し、遺伝子変異を起こしたＤＮＡ断片との識別が、極
めて容易となる。

【００２３】本発明のＤＮＡ断片中の変異とは、点突然
変異あるいは遺伝子多型等の塩基の置換、塩基の欠損や
挿入とそれに伴うフレームシフト、数塩基の欠損や挿
入、遺伝子全体の脱落などが含まれる。

【００２４】本発明のＤＮＡ断片中の変異の検出法とし
ては、ＳＳＣＰ(single-stranded conformation polymo
rphism) 法、ＨＥＴ(hetero duplex analysis)法、ＤＧ
ＧＥ(denaturing gradient gel electrophoresis)法、
ＤＳ(direct sequence) 法、ＣＣＭ(chemical cleavage
mismatch)法、ＣＤＩ(carbodiimide modification)法
などがあげられる（バイオマニュアルシリーズ１，遺伝
子工学の基礎技術，山本雅編，羊土社(1993)）。

【００２５】本発明における遺伝子とは、被験者の組
織、血液、細胞、体液、感染菌、ウイルスなどから抽出
したＤＮＡである。特に、癌患者の診断の場合は、癌組
織、癌細胞あるいは尿、膵液、十二指腸液等の体液から
抽出したゲノムＤＮＡが対象になる。

【００２６】本発明の遺伝子多型とは、ヒト染色体の遺
伝的多型であり、遺伝子上の塩基配列の個体差に由来す
る。平均して数百塩基に１箇所程度そのような遺伝子多
型が存在すると言われており、遺伝子多型を解析するこ
とにより、父方由来の染色体（アレル）と母方由来の染
色体（アレル）を区別することができる。従って、遺伝
子多型を利用し、ヘテロ接合体における一方のアレルの
消失（ＬＯＨ）を測定すれば、遺伝子の欠失を検出する
ことができる。しかし、一塩基の置換による遺伝子多型
は、ヘテロ接合体である頻度が最大でも50％であり、１
つの遺伝子の欠失を調べるためには、ヘテロ接合体の出
現頻度の高い、複数の遺伝子多型を組み合わせるのが望
ましい。また、遺伝子多型には民族間差が存在するの
で、欠失を診断したい遺伝子のなかから、その民族で出
現頻度の高い遺伝子多型を選択する必要がある。

【００２７】本発明の複製すべき遺伝子の領域とは、１
つの遺伝子多型を含む範囲であれば特に制限はないが、
ＰＣＲで増幅し易くＳＳＣＰに適した長さと範囲を選ぶ
必要がある。長さは通常 100〜200bp で、範囲はＰＣＲ
に適したオリゴヌクレオチドプライマーの設計から決め
ればよい。

【００２８】ＤＮＡ断片の検出のために、ＤＮＡ断片の
ラベル化をすることもできる。ＤＮＡ断片のラベル化と
しては、プライマーとして予めラベル化したプライマー
を使用する方法、又は、ＰＣＲを実施する際にラベル化
した塩基成分（例えば燐の放射性ラベル）を用いる方
法、又は、ＰＣＲを実施した後にラベル化する方法があ
る。

【００２９】ラベル化処理方法としては、ＳＳＣＰ後に
検出し易いものであれば特に制限はなく、放射性物質、
蛍光物質、化学発光物質、ビオチン（酵素標識アビジン
で検出）などで例えば、ＤＮＡの５’末端側を標識化す
ればよい。特に好ましくは、ＰＣＲ用のオリゴヌクレオ
チドプライマーの５’末端をあらかじめＡ．Ｌ．Ｆ．ｒ
ｅｄ（Ｃｙ５^TM）ａｍｉｄｉｔｅ試薬（ファルマシア
社）で蛍光ラベル化したものを用いればよい。これをＳ
ＳＣＰ法に応用したのが蛍光ＳＳＣＰ法である。

【００３０】本発明によれば、ＬＯＨの判定を簡便かつ
高感度で行なうことができ、例えば大腸癌、膵癌、膀胱
癌などの各種癌等の診断に利用することができる。又、
同一遺伝子座位に存在する２個以上の好ましくはお互い
に重複しない複数個の遺伝子多型についてそれぞれＬＯ
Ｈを検出し、その検出結果を組み合わせることにより、
即ち、それら検出結果のいずれかひとつがヘテロ接合で
ありかつＬＯＨ陽性であれば仮に他がホモ接合であって
も「陽性」と判定することにより、遺伝子欠失の判定可
能な症例をより増加させることができ、癌等の疾病の診
断効率の向上に一層寄与することができる。

【００３１】

【実施例】実施例によって本発明を具体的に説明する
が、本発明がこれらの実施例のみによって限定されるも
のではない。

【００３２】実験例ｐ５３癌抑制遺伝子のイントロン１における制限酵素Ｈ
ａｅIII 遺伝子多型の検出（オリゴヌクレオチドプライ
マー、５’ＴＣＴＴＡＧＣＴＣＧＣＧＧＴＴＧＴＴＴＣ
３’（前向き）と５’ＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＴＧＴ
ＡＡＡＴＧ３’（逆向き）を用いるＰＣＲで増幅される
１２４ｂｐのＤＮＡ断片のＳＳＣＰ）１．オリゴヌクレオチドプライマーの調製ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマー、５’ＴＣＴ
ＴＡＧＣＴＣＧＣＧＧＴＴＧＴＴＴＣ３’（前向き）
と、５’末端をＡ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄ^TM（Ｃｙ５^TM）ａｍ
ｉｄｉｔｅ試薬（ファルマシア社）で蛍光ラベルした
５’ＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＴＧＴＡＡＡＴＧ３’
（逆向き）は、Ｏｌｉｇｏ１０００ＤＮＡｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｚｅｒ^TM（ベックマン社）を用いて合成した。

【００３３】２．ゲノムＤＮＡの抽出手術で入手した新鮮な大腸癌および膵癌患者検体から癌
組織と正常組織を入手した。また、正常者の組織として
末梢血の白血球を用いた。これらの組織からのＤＮＡの
抽出は、プロテナーゼＫで消化後、フェノール・クロロ
フォルムで抽出するデイビスら（Basic Method in Mole
ular Biology， Elsevir Science Publishing 社出版）
や菅野ら（Lab. Invest. 68 361 (1993) ）の方法で行
った。

【００３４】３．ＰＣＲ組織より抽出したゲノムＤＮＡ（鋳型） 0.5μg 、各オ
リゴヌクレオチドプライマーを12.5ｐmoleずつ、各ヌク
レオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）を10ｎmoleずつ、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡（株））1.25units を、Ｋ
Ｃｌ50ｍＭ、ＭｇＣｌ₂1.0 ｍＭ、トリトンＸ−１００
0.1％を含む10ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ 9.0）50μ
l に加え、その上にミネラルオイル（シグマ社）50μl
を重層した。この溶液について、次の条件下でＰＣＲを
行った。最初の変成条件のみは94℃で５分間、その後の
反応は、94℃で１分間、50℃で１分間、72℃で１分間の
サイクルを40回繰り返し、最後は72℃で７分間の反応を
行った。

【００３５】また、ＤＮＡポリメラーゼの違いによるＰ
ＣＲ産物の３’末端側の状態（ゲノムＤＮＡ非依存性の
伸長部分）を比較するため、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（東洋紡（株））をＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキ
ンエルマー・シータス社）又はＰｆｕＤＮＡポリメラー
ゼ（ストラタジン社）に変え、同様に反応させた。反応
の緩衝液は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエル
マー・シータス社）についてはＫＣｌ50ｍＭ、ＭｇＣｌ
₂ 1.5ｍＭ、ゼラチン 0.001％を含む10ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ 8.3）を、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ス
トラタジン社）についてはＫＣｌ10ｍＭ、（ＮＨ₄）₂
ＳＯ₄６ｍＭ、ＭｇＣｌ₂２ｍＭ、トリトンＸ−１００
0.1％、ヌクレアーゼの混入がないＢＳＡ10μg/mlを含
む20ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ 8.2）を用いた。

【００３６】ＰＣＲ産物の収率は、８％アクリルアミド
ゲルで電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色して求
めた。

【００３７】４．ＰＣＲ産物の３’末端の平滑化 0.5 units の Klenow fragment（宝酒造（株））を、Ｔ
ａｑＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡（株）又はパーキンエ
ルマー・シータス社）で調製したＰＣＲ反応液５μl に
添加し、37℃で30分間反応した。

【００３８】５．蛍光ＳＳＣＰ分析分析は、Ａ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄ^TMＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃ
ｅｒ（ファルマシア社）を用い、トリス・グリシン緩衝
液（トリス25ｍＭ、グリシン 192ｍＭ）を含む15％アク
リルアミド（ビスアクリルアミド／アクリルアミド＝１
／30）ゲル（高さ 200mm×幅 345mm×厚さ 0.5mm）を用
いた。ＰＣＲ反応液、もしくは、３’平滑化処理したＰ
ＣＲ反応液の１μl を、ＳＳＣＰ用のローディング液10
μl に加えて80℃で５分間加熱変成後、このうちの１μ
l をゲルにチャージし泳動した。ローディング液の組成
は、ＥＤＴＡ20ｍＭ、ブロムフェノールブルー0.05％を
含む脱イオン処理した90％ホルムアミド溶液である。電
気泳動の緩衝液は、トリス25ｍＭ、グリシン 192ｍＭを
含む溶液である。電気泳動は、24℃で20Ｗ×10時間行っ
た。測定データの解析は、解析用のソフトＦｒａｇｍｅ
ｎｔＭａｎａｇｅｒ^TM（ファルマシア社）を用いた。

【００３９】下記の比較例は、実験例の各操作に従って
行った。

【００４０】比較例１大腸癌患者検体と正常者白血球から抽出したゲノムＤＮ
Ａを、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー・
シータス社）を用いてＰＣＲで増幅後、蛍光ＳＳＣＰ分
析を行った結果を図１Ａに示した。図中のラインは、そ
れぞれ、１：ＨａｅIII 感受性ホモ接合体の健常者、
２：ＨａｅIII 耐性ホモ接合体の健常者、３：ヘテロ接
合体の大腸癌患者の正常組織部、４：同一大腸癌患者の
癌組織部（ＬＯＨ＋）を示した。

【００４１】比較例２ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（東洋紡（株））を用い、比較例１と同様にして行っ
た。結果を図１Ｂに示した。

【００４２】比較例３ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ
（ストラタジン社）を用い、比較例１と同様にして行っ
た。結果を図１Ｄに示した。

【００４３】図１Ａ，Ｂ，Ｄのいずれにおいても、ピー
クが２つに分裂したり、多数のピークが出現し、遺伝子
欠損の判定が煩雑であった。

【００４４】実施例１（ＰＣＲ産物の３’末端平滑化の
効果）実験例の操作法に従い、比較例２のＰＣＲ反応物に Kle
now fragment（宝酒造（株））を加えて３’末端を平滑
化後、蛍光ＳＳＣＰ分析を行った。その結果を図１Ｃに
示した。ＰＣＲ産物の３’末端を平滑化処理することに
より、図１Ａ，Ｂの様なピークの分裂が収束しＬＯＨの
判定が、極めて容易になった。概念図で示すと図１５の
様になる。即ち、末端平滑化処理により、ピークの分裂
が収束する。また、ＤＮＡポリメラーゼを変えた比較例
１のＰＣＲ反応物についても Klenow fragment（宝酒造
（株））を加えて３’末端を平滑化後、蛍光ＳＳＣＰ分
析を行い、図１Ｃと同様な結果を得た。

【００４５】実施例２（ＬＯＨの検出感度）ＬＯＨ＋の癌細胞の検出感度を調べるため、ヘテロ接合
体の健常者の白血球ゲノムＤＮＡ（ＬＯＨ−の正常細胞
に相当）に、ＬＯＨ＋のＤＮＡモデルとして、ＨａｅII
I 感受性ホモ接合体の健常者の白血球ゲノムＤＮＡ（モ
デルとしてホモ接合体のＬＯＨ−細胞を用いているの
で、片方のアレルが欠損した癌細胞としては１／２量の
ＤＮＡでよい）を20：０（癌細胞の含量は０％に相
当）、18：１（10％）、16：２（20％）、14：３（30
％）、12：４（40％）、10：５（50％）、８：６（60
％）、６：７（70％）、４：８（80％）、２：９（90
％）、０：10（100 ％）の比率で混合し、実験例に従っ
てＰＣＲ反応、ＰＣＲ産物の３’末端の平滑化、蛍光Ｓ
ＳＣＰ分析を行った。測定データは、解析用のソフトＦ
ｒａｇｍｅｎｔＭａｎａｇｅｒ^TM（ファルマシア社）
を用いて解析し、その結果を図２に示した。図２では、
ＨａｅIII 耐性アレル（Ａ１）とＨａｅIII 感受性アレ
ル（Ａ２）をそれぞれ 100bpと 200bpに設定し、Ａ２の
高さを合わせて重ね書きした。また、癌細胞の割合とＡ
１／Ａ２の比をプロットしたところプロットは、良好な
直線に乗った（図３）。このことから、ＰＣＲ産物の
３’末端側を平滑化処理してＡ１／Ａ２比を求めること
により、アレル欠損の量、即ち、正常細胞の中に含まれ
る癌細胞数を正確に測定できることが分かる。

【００４６】実施例３（膵癌組織におけるｐ５３遺伝子
のＬＯＨ検出例）１４名の癌患者正常組織のｐ５３遺伝子ＨａｅIII 耐性
アレル（Ａ１）とＨａｅIII 感受性アレル（Ａ２）を分
析したところ、７名（50％）がヘテロ接合体で、ＬＯＨ
を測定する対象として適していた。そこで、これら７名
の癌患者の正常組織と癌組織のゲノムＤＮＡを、実施例
１の蛍光ＳＳＣＰ法で分析した（表１）。対象者７名の
正常組織のＡ１／Ａ２比は、0.96±0.01（平均±ＳＤ）
であった。平均±２ＳＤの範囲0.94〜0.98を正常値（Ｌ
ＯＨ−）とすれば、それを越える５／７（71.4％）が陽
性（ＬＯＨ＋）であった。また、ＬＯＨ＋とＫ-ras遺伝
子の突然変異との一致は、５／６（83.3％）であった。
ＬＯＨ＋症例のＡ１／Ａ２比の範囲は0.52〜1.48で、
｛A1/A2(正常組織) −A1/A2(癌組織) ｝／｛A1／A2（正
常組織）｝の計算式から推定した癌組織中に含まれる癌
細胞の割合は19〜37％であった。このように、本発明の
方法を用いるＬＯＨの検出法は、癌の診断に有用である
ことが分かる。ここで、Ａ１は欠失する方のアレルを示
し、Ａ２は保存される方のアレルを示す。

【００４７】

【表１】

【００４８】実施例４（膀胱癌患者のｐ５３遺伝子のＬ
ＯＨの検出例）１．ゲノムＤＮＡの抽出膀胱癌患者尿２８例及び健常者尿１２例を入手した。

【００４９】５０ｍＬ用量のディスポの遠心管に集めた
尿サンプルを、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上
清を捨てて尿沈渣を集めた。この沈渣を４０ｍＬの生理
食塩水に再分散し、再度１０００ｒｐｍで５分間遠心分
離して洗浄した。ＤＮＡを抽出するまでは、この沈渣の
状態で、−８０℃に凍結して保存した。実験例と同様
に、洗浄沈渣をプロテナーゼＫで酵素消化後、フェノー
ル・クロロフォルム法でＤＮＡを抽出した。

【００５０】膀胱癌患者１９名の正常及び癌組織のＤＮ
Ａは、外科手術時に得られた対応組織のフォルマリン固
定パラフィン包埋サンプルから、Ｌｅviらの方法（Canc
er Res.,68，361(1993))に従って抽出した。

【００５１】２．プライマーの合成オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｏｌｉｇｏ１００
０ＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ^TM（ベックマン
社）を用いて合成した。ｐ５３遺伝子のイントロン１、
エクソン４、イントロン７部位の遺伝子多型を解析する
ためにデザインしたそれぞれのプライマーの組み合わせ
を、表２に示した。

【００５２】

【表２】

【００５３】前向き、または、後ろ向きプライマーのい
ずれか一方の５’末端は、Ａ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄ（Ｃｙ５
^TM）ａｍｉｄｉｔｅ試薬（ファルマシア社）を用いて、
ヨウ化ジカルボシアニンで蛍光ラベル化した。

【００５４】３．ＰＣＲｐ５３遺伝子のイントロン１とエクソン４部位のＰＣＲ
の条件は、次の通りであった。抽出したゲノムＤＮＡ
（鋳型）を 0.1〜0.5 μg 、各オリゴヌクレオチドプラ
イマーを12.5ｐmoleずつ、各ヌクレオチド３リン酸（ｄ
ＮＴＰ）を10ｎmoleずつ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（東洋紡（株））1.25units を、ＫＣｌ50ｍＭ、ＭｇＣ
ｌ₂ 1.0ｍＭ、トライトンＸ−１００ 0.1％を含む10ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ 9.0）50μl に加え、その上
にミネラルオイル（シグマ社）50μlを重層した。一
方、イントロン７部位については、抽出したゲノムＤＮ
Ａ（鋳型）を 0.1〜0.5 μg 、各オリゴヌクレオチドプ
ライマーを12.5ｐmoleずつ、ｄＮＴＰを10ｎmoleずつ、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー・シータ
ス社）1.25units を、ＫＣｌ50ｍＭ、ＭｇＣｌ₂ 1.5ｍ
Ｍ、ゼラチン 0.001％(W/V) を含む10ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ 8.3）50μl に加え、その上にミネラルオイ
ル50μl を重層した。これらの溶液について、次の条件
下でＰＣＲを行った。イントロン１については、最初の
変成条件のみは94℃で５分間、その後の反応は、変成条
件94℃で１分間、アニーリング50℃で１分間、伸長反応
72℃で１分間のサイクルを40回繰り返し、最後は72℃で
７分間の伸長反応を行った。イントロン７については、
最初の変成条件のみは94℃で５分間、その後の反応は、
94℃で１分間、60℃で30秒間、72℃で１分間のサイクル
を40回繰り返し、最後は72℃で７分間反応を行った。エ
クソン４については、最初の変成条件のみは94℃で５分
間、その後の反応は、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72
℃で１分間のサイクルを40回繰り返し、最後は72℃で７
分間反応を行った。

【００５５】ＰＣＲ産物の収率は、８％ポリアクリルア
ミドゲルで電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し
て求めた。

【００５６】４．ＰＣＲ産物の３’末端の平滑化 0.5units／μl のKlenow fragment （宝酒造（株））
を、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡（株）又はパー
キンエルマー・シータス社）で調製したＰＣＲ反応液５
μl に添加し、37℃で30分間反応した。

【００５７】５．蛍光ＳＳＣＰ分析分析は、Ａ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄ^TMＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃ
ｅｒ（ファルマシア社）に、トリス・グリシン緩衝液
（トリス25ｍＭ、グリシン 192ｍＭ）を含む15％ポリア
クリルアミド（ビスアクリルアミド／アクリルアミド＝
１／30）ゲル（高さ 200mm×幅 345mm×厚さ 0.5mm）を
セットして行った。３’末端平滑化処理したＰＣＲ反応
液の１μl を、ＳＳＣＰ用のローディング液10μl に加
えて80℃で５分間加熱変成後、このうちの１μl をゲル
にチャージし泳動した。ローディング液の組成は、ＥＤ
ＴＡ20ｍＭ、ブロムフェノールブルー0.05％を含む脱イ
オン化した90％ホルムアミド溶液である。電気泳動の緩
衝液は、トリス25ｍＭ、グリシン 192ｍＭを含む溶液で
ある。電気泳動は、イントロン１とイントロン７につい
ては24℃、エクソン４では20℃のそれぞれの温度で、20
Ｗ×10時間行った。測定データの解析は、解析用のソフ
トＦｒａｇｍｅｎｔＭａｎａｇｅｒ^TM（ファルマシア
社）を用いた。

【００５８】ヘテロ接合体である患者の正常組織及び癌
組織のアレルのシグナル比から、癌組織中に含まれる癌
細胞の割合を推定する計算は、実施例３と同様にして行
った。また、癌細胞の割合が１０％を越えた場合、ＬＯ
Ｈ＋とした。

【００５９】６．分析例ｐ５３遺伝子のイントロン１、エクソン４、イントロン
７の３つともヘテロ接合体であった典型的な尿サンプル
での分析例を、図４〜７に示した。図４，５，６はそれ
ぞれＬＯＨ＋患者Ａ２５，Ａ６，Ａ１の例、図７は健常
者Ｂ１の例である。矢印は、欠失の有るアレルのシグナ
ルを示す。

【００６０】また、同一患者Ａ６の尿と組織を分析し、
その結果を比較した例を、図８〜１０に示した。図８は
尿、図９は癌組織、図１０は対応組織の正常部位の分析
結果を、それぞれ示している。図８のかっこ内は、アレ
ルのシグナルの高さから計算した癌組織中に含まれてい
る癌細胞の予想割合を示している。図８〜９のように、
癌患者の尿の分析パターンと癌組織のパターンは、良く
一致していた。

【００６１】７．分析結果のまとめ４０尿検体を分析して、ｐ５３遺伝子のイントロン１、
エクソン４、イントロン７に存在する３つの遺伝子多型
のうち、１つ以上がヘテロ接合体であった２３尿検体
（５８％）が分析対象として有効であった。このうち、
膀胱癌患者は１６検体、健常者は７検体であった。健常
者７検体の各遺伝子多型内のアレルのシグナルの比バラ
ツキは、±２ＳＤで５％未満と、極めて安定していた。
癌患者１６検体の測定結果を表３にまとめた。いずれか
の遺伝子多型のＬＯＨが陽性であるものは８検体（５０
％）であった。ｐ５３遺伝子の３ヶ所の遺伝子多型の中
から選んだ、単一の遺伝子多型だけで判断した場合、Ｌ
ＯＨ＋は６〜７検体と、いずれの場合も、３つの組み合
わせより劣っていた。従って、できるだけ重複の少ない
遺伝子多型を選択し、それらを組み合わせることによ
り、ＬＯＨの検出効率を、さらに向上できることが示さ
れた。

【００６２】一方、癌組織レベルでは、測定できた９検
体のうち、８検体（８９％）がＬＯＨ＋であった。ま
た、尿検体とＬＯＨの一致率は、６検体／８検体（７５
％）と高率であった。このことから、膀胱癌において
は、尿検体を用いても、十分にＬＯＨの検出が可能であ
ることが分かった。

【００６３】

【表３】

【００６４】表３の結果を、さらに、ステージ、グレー
ド別に分類し、表４にまとめた。Ｔis、Ｔa の初期ステ
ージにおいては、ＬＯＨの陽性例はなく、ステージの進
行とともに陽性化していくことが分かる。ｐ５３以外の
遺伝子マーカーや細胞診の結果と組み合わせることによ
り、より詳細な癌の把握が可能になる。

【００６５】

【表４】

【００６６】実施例５（複数個のＰＣＲ反応を同時に行
って複数個の遺伝子多型を同時に分析する方法）大腸癌患者の検体を用い、実施例４のゲノムＤＮＡの抽
出とＰＣＲを次のように変更してｐ５３遺伝子のＬＯＨ
を検出した。

【００６７】１．ゲノムＤＮＡの抽出大腸癌患者検体から癌組織と正常組織を入手し、実験例
と同様にしてゲノムＤＮＡを抽出した。

【００６８】２．ＰＣＲ抽出したゲノムＤＮＡ（鋳型）を 0.1〜0.5 μg ／ 2.5
μｌ、表２のイントロン１の各オリゴヌクレオチドプラ
イマー 5ｐmoleずつを含む溶液1.25μｌ、表２のエクソ
ン４の各オリゴヌクレオチドプライマー 5ｐmoleずつを
含む溶液1.25μｌ、表２のイントロン７の各オリゴヌク
レオチドプライマー1.25ｐmoleずつを含む溶液0.3125μ
ｌ、各ヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ） 5ｎmoleずつ
を含む溶液４μｌ、ＫＣｌ 500ｍＭ、ＭｇＣｌ₂10ｍ
Ｍ、トライトンＸ−１００ 1％を含む 100ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ 9.0） 2.5μl 、ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼ（東洋紡（株）） O.625units ／0.125 μｌ、蒸留
水 13.0625μｌを混合した。この反応液25μｌ上にミネ
ラルオイル（シグマ社）50μl を重層し、ＰＣＲ反応を
行った。最初の変成条件のみは94℃で５分間、その後の
反応は、変成条件94℃で１分間、アニーリング55℃で１
分間、伸長反応72℃で１分間のサイクルを40回繰り返
し、最後は72℃で７分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ産
物の収率は、８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動
後、エチジウムブロマイドで染色して求めた。

【００６９】図１１に分析結果を示した。図から明らか
なように、一回のＰＣＲだけで、大腸癌患者のエクソン
４、イントロン７、イントロン１の各部位における３つ
の遺伝子多型が同時に分析でき（図１１Ａ）、大腸癌患
者癌組織のＬＯＨ（図１１Ｂ）が検出できることが分か
る。

【００７０】図１２から１４は、図１１のエクソン４、
イントロン７、イントロン１部位の遺伝子多型をそれぞ
れ拡大したものである。それぞれの部位におけるアレル
のピーク高さから計算した癌組織中に含まれる癌細胞の
推定割合は、それぞれエクソン４が６１．２％、イント
ロン７が５２．３％、イントロン１が５８．４％と、ほ
ぼ同様の結果が得られた。このことから、ＰＣＲの条件
を工夫することにより、複数個のＰＣＲ反応を同時に行
って複数個の遺伝子多型を同時に分析できることが分か
る。

【００７１】

【発明の効果】本発明により、ＬＯＨの判定が簡便かつ
高感度（高い検出率）に行えるようになり、癌の診断に
有用であった。

【図面の簡単な説明】

【図１】蛍光ＳＳＣＰ分析法におけるＰＣＲ産物の３’
末端平滑化の効果を示す。

【図２】本発明によるＬＯＨの検出感度を示す。

【図３】癌細胞含量の検量線を示す。

【図４】末端平滑化ＳＳＣＰ法による癌患者Ａ２５の尿
サンプルの分析結果を示す。

【図５】末端平滑化ＳＳＣＰ法による癌患者Ａ６の尿サ
ンプルの分析結果を示す。

【図６】末端平滑化ＳＳＣＰ法による癌患者Ａ１の尿サ
ンプルの分析結果を示す。

【図７】末端平滑化ＳＳＣＰ法による健常者Ｂ１の尿サ
ンプルの分析結果を示す。

【図８】末端平滑化ＳＳＣＰ法による癌患者Ａ６の尿サ
ンプルの分析結果を示す。

【図９】末端平滑化ＳＳＣＰ法による癌患者Ａ６の癌組
織（Ｔｕｍｏｒ）サンプルの分析結果を示す。

【図１０】末端平滑化ＳＳＣＰ法による癌患者Ａ６の対
応正常部位組織（Ｎｏｒｍａｌ）サンプルの分析結果を
示す。

【図１１】大腸癌患者組織から抽出したゲノムＤＮＡを
用いて、複数個のＰＣＲ反応を同時に行って複数個の遺
伝子多型を同時に分析し、ＬＯＨを解析した結果を示
す。

【図１２】図１１のエクソン４部位の遺伝子多型の拡大
図である。

【図１３】図１１のレントロン７部位の遺伝子多型の拡
大図である。

【図１４】図１１のイントロン１部位の遺伝子多型の拡
大図である。

【図１５】末端平滑化ＳＳＣＰ法による遺伝子欠失の高
感度検出の概念図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中のＤＮＡ断片を検出する際に、あ
らかじめ該ＤＮＡ断片の末端平滑化処理を行うことを特
徴とするＤＮＡ断片中の変異の検出法。
【請求項２】試料中のＤＮＡ断片が、ポリメラーゼチ
ェーンリアクション法（ＰＣＲ）の産物である請求項１
記載のＤＮＡ断片中の変異の検出法。
【請求項３】変異の検出法が一本鎖ＤＮＡ高次構造多
型解析法（ＳＳＣＰ法）である請求項１又は２記載のＤ
ＮＡ断片中の変異の検出法。
【請求項４】遺伝子から遺伝子多型の存在する遺伝子
領域のＤＮＡを複製し、複製したＤＮＡ断片の３’末端
側に平滑化処理を行い、得られたＤＮＡ断片を一本鎖Ｄ
ＮＡ高次構造多型解析法（ＳＳＣＰ法）で分析すること
を特徴とするヘテロ接合性の消失（ロスオブヘテロ
ツァイゴシティ：ＬＯＨ）を検出する方法。
【請求項５】ＤＮＡ断片として複製しようとする１遺
伝子領域中における遺伝子多型は１箇所の塩基置換によ
る多型である請求項４記載のＬＯＨの検出方法。
【請求項６】遺伝子多型が、ｐ５３癌抑制遺伝子のイ
ントロン１領域における制限酵素ＨａｅIII 感受性の有
無である請求項４又は５記載のＬＯＨの検出方法。
【請求項７】複製するＤＮＡ断片が、オリゴヌクレオ
チドプライマー、５’ＴＣＴＴＡＧＣＴＣＧＣＧＧＴＴ
ＧＴＴＴＣ３’（前向き）と５’ＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧ
ＴＧＴＧＴＡＡＡＴＧ３’（逆向き）を用いるＰＣＲで
増幅される領域である請求項４又は５記載のＬＯＨの検
出方法。
【請求項８】遺伝子多型が、ｐ５３癌抑制遺伝子のエ
クソン４領域における制限酵素ＢｓｔＵＩ感受性の有無
である請求項４又は５記載のＬＯＨの検出方法。
【請求項９】複製するＤＮＡ断片が、オリゴヌクレオ
チドプライマー、５’ＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＡＴＧＣＣ
ＡＧＡＧ３’（前向き）と５’ＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＡ
ＣＡＧＡＡＧＡＴＧ３’（逆向き）を用いるＰＣＲで増
幅される領域である請求項４又は５記載のＬＯＨの検出
方法。
【請求項１０】遺伝子多型が、ｐ５３癌抑制遺伝子の
イントロン７領域における制限酵素ＡｐａＩ感受性の有
無である請求項４又は５記載のＬＯＨの検出方法。
【請求項１１】複製するＤＮＡ断片が、オリゴヌクレ
オチドプライマー、５’ＡＧＧＴＣＡＧＧＡＧＣＣＡＣ
ＴＴＧＣＣ３’（前向き）と５’ＧＴＧＡＴＧＡＧＡＧ
ＧＴＧＧＡＴＧＧＧＴ３’（逆向き）を用いるＰＣＲで
増幅される領域である請求項４又は５記載のＬＯＨの検
出方法。
【請求項１２】ｐ５３癌抑制遺伝子内の複数個の遺伝
子多型のそれぞれを、請求項４又は５記載のＬＯＨの検
出法で検出し、その結果を組み合わせることによる癌の
検査方法。
【請求項１３】請求項７，９，１１記載のＬＯＨの検
出方法により得られる検出結果を２以上組み合わせるこ
とによる請求項１２記載の癌の検査方法。
【請求項１４】２組以上のプライマーを同時に用いる
請求項４又は５記載のＬＯＨの検出方法。