JPH08502241A

JPH08502241A - 上皮増殖因子受容体およびｅｒｂＢ−２受容体のリガンド増殖因子と相互作用する結合ペプチド

Info

Publication number: JPH08502241A
Application number: JP5519523A
Authority: JP
Inventors: ルプ，ラス; リップマン，マーク
Original assignee: Georgetown University
Current assignee: Georgetown University
Priority date: 1992-04-29
Filing date: 1993-04-29
Publication date: 1996-03-12
Also published as: DE69328091T2; NZ252486A; DE69328091D1; EP0641358A4; ATE190626T1; AU676476B2; EP0641358A1; AU4224493A; CA2134544A1; EP0641358B1; WO1993022339A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ｅｒｂＢ−２受容体または上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対するリガンドに結合できるブロッキングペプチドに関する。本発明のブロッキングペプチドは、そのようなリガンド分子の存在を検出するのに使用できる。ブロッキングペプチドはさらに、ｅｒｂＢ−２受容体またはＥＧＦＲを発現する腺癌細胞の増殖を抑制または抑制するのに使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】上皮増殖因子受容体およびｅｒｂＢ−２受容体のリガンド増殖因子と相互作用する結合ペプチド関連出願本発明は、１９９１年１月１４日に出願された米国特許出願第０７／６４０，４９７号の一部継続出願である米国特許出願第０７／８７５，７８８号（１９９２年４月２９日出願）の一部継続出願であり、現在放棄された１９９０年５月２５日出願の米国特許出願第０７／５２８，４３８号の継続出願である米国特許出願第０７／８７２，１１４号（１９９２年４月２２日出願）の一部継続出願である米国特許出願第０７／９１７，９８８号（１９９２年７月２４日出願）の一部継続出願である。これらの出願の全ては全文のまま引例として含まれている。背景技術技術分野本発明はリガンド増殖因子受容体と相互作用するブロッキングペプチドの分野に関する。特に、本発明のブロッキングペプチドは上皮増殖因子受容体およびｅｒｂＢ−２受容体のリガンドに結合できる。本発明はさらにリガンド増殖因子の存在を検出するためのアッセイにおけるそのようなブロッキングペプチドの使用にも関する。腺癌細胞の増殖を抑制する、および癌を診断するための手段としての本発明のブロッキングペプチドを使用する方法も開示されている。先行文献のレヴュー形質転換増殖因子リガンドは、細胞に形質転換した形態をとらせ、および足場非依存性増殖アッセイで次々に増殖するコロニーを形成させる熱および酸安定性ポリペプチドの一群に属している（DeLarco，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci． USA ，75:4001-4005(1978)；Moses，et al.，Cancer Res.，41:2842-2848(1981) ；Ozanne，et al.，J．Cell．Physiol.，105:163-180(1980)；Roberts,et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，77:3494-3498(1980)）。上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）およびその生理学的リガンド、上皮増殖因子（ＥＧＦ）および形質転換因子アルファ（ＴＧＦα）は多くの正常および悪性腫瘍細胞型の増殖制御に主たる役割を果たしている（Carpenter，G.，Annu．Rev．Biochem.，56:881-914(198 7)）。細胞の癌遺伝子増殖において演ぜられるであろうＥＧＦ受容体系の一つの役割は自己分泌剌激による増殖を通したものである。もし細胞がＥＧＦＲを発現し、ＥＧＦおよび／またはＴＧＦαを分泌するならば、そのような細胞は自身の増殖を剌激することができる。いくつかのヒト乳癌細胞株および腫瘍がＥＧＦＲを発現し（Osborne，et al.，J．Clin．Endo．Metab.，55:86-93(1982)；Frtz patrick，et al.，Cancer Res.，44:3442-3447(1984)；Filmus，et al.，Bioche m．Biophys．Res．Commun. ，128:898-905(1985)；Davidson，et al.，Mol．Endo crinol. ，1:216-223(1987)；Sainsbury，et al.，Lancet，i:1398-1402(1987)； Perez，et al.，Cancer Res.Treat.，4:189-193(1984)）、およびＴＧＦαを分泌するので（Bates，et al.，Cancer Res.，46:1707-1713(1986)；Bates,et al. ，Mol．Endocrinol.，2:543-555(1988)）、乳癌における自己分泌増殖刺激経路が提唱されている（Lippman，et al.，Breast Cancer Res．Treat.，7:59-70(19 86)）。上皮増殖因子受容体およびそのリガンドに対して提案されているものと類似の自己分泌増殖刺激経路が増殖因子受容体の構造記憶を持つ膜貫通タンパク質をコードしている癌遺伝子の増殖表にも用いられるかもしれない。この表には癌原遺伝子ｎｅｕおよびそのヒト等価物ｅｒｂＢ−２またはＨＥＲ２（Bargmann，et a 1.，Nature，319:226-229(1986)；Coussens，et al.，Science，230:1131-1139( 1985)；Yamamoto，et al.，Nature，319:230-234(1986)；ｃ−ｋｉｔ（Yarden， et al.，EMBO J.，6:341-3351(1987)）；ｒｏｓ（Neckameyer，ｅt al.，Mol．C ell．Biol. ，6:1478-1486(1986)）；ｍｅｔ（Park，et al.，Proc.natl.Acad．S ci．USA ，84:6379-6383(1987)）；ｔｒｋ（Martin-Zanca，et al.，Nature，319 :743-748(1986)）およびｒｅｔ（Takahashi，et al.，Mol．Cell．Biol.，7:137 8-1385(1987)）が含まれている。ｅｒｂＢ−２およびｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子はＥＧＦＲと構造相同性を示す因子をコードしている（Yarden，et al.，Annu．Rev ．Biochem. ，57:443-478(1988)）。ｅｒｂＢ−２およびその関連癌遺伝子ｎｅｕはＥＧＦＲと関連しているが、これらのタンパク質は異なっている。例えば、ＥＧＦおよびＴＧＦαのような既知のＥＧＦＲリガンドはｅｒｂＢ−２受容体に結合しない（King，et al.，EMBO J.，7:1647(1988)およびStern，et al.，EMBO J. ，7:995(1988)）。多くのヒト腺腫においてｃ−ｅｒｂＢ−２の増幅または過剰発現またはその両方が記載されている（Semba，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82:6497(1 985)；Van de Vijver，et al.，Mol．Cell．Biol.，7:2019(1987)；Yokota，et al.，Oncogene，2:283(1988)；Slamon，et al.，Science，244:707(1989)；Aasl and，et al.，Br．J．Cancer，57:358(1991)；Cline，et al.，Cancer，60:266 9(1991)）。過剰発現は統計的に乳癌（Slamon，et al.，Science，235:177(1987 )；Walker，et al.，Br．J．Cancer，69:426(1991)；Wright，et al.，Cancer R es. ，49:2087(1991)）、卵巣癌（Berchuck，et al.，Cancer Res.，50:4087(199 0)）および胃癌（Yonomura，et al.，Cancer Res.，51:1034(1991)）の短期の再発と相関している。さらにｐ１８５^erbB-2（ｅｒｂＢ−２癌遺伝子の産物）の過剰発現はＮＩＨ３Ｔ３、乳癌または卵巣癌細胞に対する腫瘍壊死因子の作用（ Hudziak，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85:5102(1988)；Lichtenstein，et al.，Cancer Res.，50:7364(1990)）、およびナチュラルキラー細胞に対するその作用（Wiltshle，et al.，Proc．Am．Assoc．Cancer Res.，32:202(1991)）または乳癌細胞におけるタモキシフェン（Benz，et al.，同文献；211）を含むいくつかの細胞毒性機構に対する腫瘍細胞耐性を伴っている。従って、ｐ１８５^er ^bB-2 腫瘍性蛋白はヒト腫瘍の発生および進行の両方において中心的役割を持っていると考えられ、新生物が過剰発現された場合の好適な治療標的になり、臨床的には思わしくない予後を伴う。ＥＧＦＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）との構造的類似性に基づくと、ｐ１８５^erbB-2 ＥＣＤは増殖因子結合で機能すると考えられた。ｐ１８５^erbB-2に対する二つの候補がこれまで精製されている：（ｉ）３０ｋＤａ糖タンパク質（ｇｐ３０）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞から分泌され、ＥＧＦＲおよびｐ１８５^erbB-2の両方に結合し、リン酸化する（Lupu，et al.，Science，249:1552(19 91)および１９９０年５月２５日に出願された米国特許第０７／５２８，４３８号）、および（ｉｉ）７５ｋＤａタンパク質（ｐ７５）、ＳＫ−Ｂｒ−３ヒト乳癌細胞から分泌され、ｐ１８５^erbB-2と特異的に結合しリン酸化する（Lupu，et al.，Proc.Natl．Acad．Sci．USA，89:2287(1992)および１９９１年１月１４日に出願された米国特許出願第０７／６４０，４９７号）。ｐ１８５^erbB-2を過剰発現しているヒト乳癌細胞の増殖に作用するというこれら二つのタンパク質のさらなる能力は哺乳類新生物において増殖因子としてのｇｐ３０およびｐ７５の役割を指摘している。ＥＧＦおよびＴＦＧαはｐ１８５^erbB-2に結合しないので（ Schecter，et al.，Science，229:976(1985)；King，et al.，EMBO J.，7:164(1 988)；およびStern，et al.，EMBO J.，7:995(1988)）、ｐ１８５^erbB-2およびＥＧＦＲＥＣＤは両方の共通のおよび特異的なリガンドと相互作用するようである。従って、ＥＧＦＲおよびそのリガンドとともに、ｅｒｂＢ−２受容体に対するリガンドが悪性腫瘍細胞の増殖制御に関与している。自己分泌増殖剌激経路によると、悪性腫瘍細胞はインビボで強力な腫瘍増殖因子を分泌することができる。従って、（ヒト絨毛性性腺剌激ホルモンまたはα− フェトプロテインと同じように）増殖因子リガンドが体液中に検出できるであろうし、腫瘍マーカーとしておよび予後徴候変異に使用できるであろう。癌患者の体液中にＴＧＦα活性が検出でき、その存在は患者の腫瘍の生物学に関した重要な情報が提供されることが示唆されている（Stromberg，et al.，J．Cell．Bioc hem. ，32:247-259(1986)；Twardzick，et al.，J．Natl．Cancer Inst.，69:793 -798(1982)；Shewin，et al.，Cancer Res.，43:403-407(1983)）。発明の要約本発明は上皮増殖因子受容体またはｅｒｂＢ−２受容体のリガンドと相互作用するブロッキングペプチドに関する。しかしながら、ｅｒｂＢ−２受容体に対して特異的なブロッキングペプチドはＥＧＦまたはＴＧＦαと有意には相互作用しない。本発明のブロッキングペプチドによるそのような相互作用または結合は受容体分子および対応するリガンド間の相互作用を妨害または抑制する。そのようなリガンドが腺癌細胞の増殖に関与しているため、本発明のブロッキングペプチドは癌の処置に役立つであろう。特に、本発明のブロッキングペプチドは乳房、卵巣、胃、肺、前立腺、唾液腺および甲状腺の癌を含む（しかし、これらに制限されるわけではない）ｅｒｂＢ−２膜貫通タンパク質過剰発現に付随する多くの癌を処置するための方法に使用できる。本発明はさらに、ｐ１８５^erbB-2膜貫通タンパク質またはＥＧＦＲ膜貫通タンパク質を発現している細胞を検出するための本発明のブロッキングペプチドの使用にも関している。本発明はまた、本発明のブロッキングペプチドを産生している細胞から、または、自動化タンパク質合成法による精製されたブロッキングペプチドを得る方法にも関している。図面の簡単な説明アミノ酸配列情報はｅｒｂＢ−２受容体またはＥＧＦＲ内の位置番号により明示されている。ここで使用されたアミノ酸配列の番号付けはBargmann，et al.，Nature ，319:226-230(1986)およびYamamoto，et al.，Nature，319:230-234(198 6)（両方とも全文のまま引例として含まれている）により記載されているものである。図１はヒト乳癌細胞株のバイオアッセイに使用されたｐ１８５^erbB-2ＥＣＤのペプチドを示している。ｐ１８５^erbB-2ＥＣＤのサブドメインはイタリック体で示されており、合成ペプチドＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、ＲＬ１およびＲＬ２が示されている。これらのペプチドのＥＧＦＲの領域に対するパーセント相同性もまた示されている。合成ペプチドＲＬＩおよびＲＬ２はPeptide Synthesis Core F acility，Lombardi Cancer Center，Georgetown University Medical Centerから得られた。図２はｐ１８５^erbB-2相同性ペプチド存在下のＳＫ−Ｂｒ−３細胞におけるｐ１８５^erbB-2競合アッセイを示している。ＳＫ−Ｂｒ−３細胞は４８ウェルプレート（Costar）上、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）ＩＭＥＭ（Biofluids）中におかれた。細胞を洗浄し、結合緩衝液［１mg/mlＢＳＡ、10mM Ｈｅｐｅｓ、20mM グルタミン、ＤＭＥＭ−Ｆ１２ｐＨ７．４］と３７℃にて３０分間インキュベートした。結合試験は４℃で３時間実施された。ＳＫ−Ｂｒ−３細胞については、 1nMのヨード化４Ｄ５が種々の濃度のＰ１（○）、Ｐ２（●）、Ｐ３（△）、Ｐ４（▲）、ＲＬ１（□）およびＲＬ２（■）非標識ペプチド（Ａ）または非標識４Ｄ５（Ｂ）とインキュベートされた。インキュベーション後、細胞を３回結合緩衝液で洗浄し、１％ＳＤＳで可溶化した。ヨード化４Ｄ５の非特異的結合は過剰の（100nM）非標識４Ｄ５で決定した。各々の群は３重にアッセイされた。実験は３回実施され同じ結果であった。図３はｇｐ３０およびＲＬ１またはＲＬ２ペプチドで処理されたＭＤＡ−ＭＢ −４５３およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の自己リン酸化活性の程度を示している。細胞は２４ウェルプレート（Costar）上、５％ＦＣＳＩＭＥＭ中で７０％コンフルエントになるまで増殖され、アッセイの２４時間前に血清を除いた。細胞は３７℃にて２０分間、ｇｐ３０とともに（以下に示した濃度で）またはｇｐ３０なしでＲＬ１またはＲＬ２で処理し（図の欄に示したように）、血清を含まないＩＭＥＭで一度洗浄し、ＳＤＳ（Emprotech）を含む溶解緩衝液で４℃にて１０分間溶解させた。全細胞タンパク質を４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、 Hybond−ＥＣＬ膜（Amersham）上にブロットした。膜をトリス緩衝化塩溶液［５％ＢＳＡ、０．５％トゥイーン２０］でブロックし、トリス緩衝化塩溶液［０．５％ＢＳＡ）０．５％トゥイーン２０］に溶解した１μｇ/mlのホスホチロシンモノクローナル抗体（ＵＢＩ）で調べた。免疫複合体はＥＣＬ−ウエスタンブロッティングキット（Amersham）を用い、使用説明書に従って検出された。デンシトメトリーによる分析はＳＡＭＢＡ４０００システム（Dynatech Laboratorie s）を用いて実施された。値はバックグラウンドに対して補正されており、対照パーセントとして表されている。影響が対照に対して１０％以上の場合相違が有意であると考えられた。上の欄はＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞に対応している。ｐ１８５^erbB-2モノクローナル抗体（Oncogene Science）で同じ膜をさらに調べると、各々のブロットで同一のレベルのｐ１８５^erbB-2発現を示した。下欄はＭＤＡ−ＭＢ−４８６細胞に対応している。ＥＧＦＲモノクローナル抗体（Oncogene Science）で同じ膜をさらに調べると、各々のブロットで同一のレベルのＥＧＦＲ発現を示した。ｇｐ３０は５０pMで使用された。レーン１から４はＲＬ２（左の欄）またはＲＬ１（右の欄）ペプチドの濃度の増加に対応している。１：０．０６μＭ；２：０．６μＭ；３：６μＭ；４：６０μＭ。実験は４回繰り返され同じ結果であった。図４はｇｐ３０およびＲＬ２（ｐ１８５^erbB-2相同体）ペプチドで処理したＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞中の１８５ｋＤａホスホプロテインのホスホアミノ酸分析を示している。ＭＤＡ−ｍｂ−４５３細胞は３５ｍｍ皿（Costar）上、５％ＦＣＳＩＭＥＭ中で７０％コンフルエントになるまで増殖された。細胞はＰＯ₄ を含まないＤＭＥＭ（Gibco）で２回洗浄され、続いて［³²Ｐ］オルトリン酸（A mersham；各々の皿に1.0mCi/ml）と３７℃にて３時間インキュベートした。細胞は次に試料と３７℃にて１０分間処理した、６０μＭＲＬ２、５０ｘ１０^-12 Ｍｇｐ３０、または５０ｘ１０^-12Ｍｇｐ３０＋６０μＭＲＬ２。全ての試料は３７℃で３０分間前もってインキュベートされた。細胞はＰＢＳで２回洗浄され、Frackelton，et al.，J．Biol．Chem.，259:7909(1984)に記載されているごとく１％トリトンＸ−１００およびキナーゼ、プロテアーゼ、およびホスファターゼ抑制剤を含む溶解緩衝液にて４℃で１０分間溶解された。１０，０００ｇで１５分間４℃にて遠心分離した後、以前に報告されているごとく（Frackelton， et al.，J．Biol．Chem.，259:7909(1984)；およびBeitz，et al.，Proc．Natl ． Acad．Sci．USA ，88:2021(1991)）１ｍＭフェニルリン酸を含むＰＢＳｐＨ７．４で溶出するホスホチロシンモノクローナル抗体１Ｇ２（A.R．Frakelton 博士より提供された）上のマイクロバスアフィニティクロマトグラフィーにより、上澄み液よりチロシンリン酸化タンパク質が単離され、プロテインＡーセファロース上に吸着されたｐ１８５^erbB-2モノクローナル抗体Ａｂ−３（Oncogene Science）での免疫沈降によりさらに精製された。チロシンリン酸化ｐ１８５^er ^bB-2 タンパク質は５０μｌ［５０ｍＭトリス−ＨＣ１（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．１％ブロモフェノールブルー、５％βーメルカプトエタノール］の試料付加緩衝液に再懸濁し、９５℃で５分間加熱して７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離した。１８５ｋＤａｅｒｂＢ−２タンパク質に対応するバンドをゲルから切り出し、部分酸分解し、前に記載されているごとく（ Cooper，etal.，Method．Enzymol.，99:387(1983)；Frackelton，et al.，Mol.C ell． Biol .，3:1343(1983)）ＨＴＬＥ−７０００（CBS Scientific Co.）を用いる二次元薄層電気泳動を行った。デンシメトリーによる分析は、前に記載したように実施された。実験は４回繰り返され、同じ結果を与えた。図５はｐ１８５^erbB-2相同性ペプチドで処理したＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞およびＲＬ２，ｇｐ３０およびｐ７５で処理したＳＫ−Ｂｒ−３細胞の軟寒天コロニー形成を示している。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（Ａ）またはＳＫ−Ｂｒ−３細胞（Ｂ）は３５ｍｍ組織培養皿（Costar）におかれた。０．６％バクトーアガー（ Difco）、２ｍＭグルタミン、および１０％ＦＣＳを含む１ｍｌＩＭＥＭの下層が調製された。上層は０．４％バクトーアガー、１０％ＦＣＳＩＭＥＭ中に２ｘ１０⁴の細胞および試料を含んでいる。試料は加える前に０．２２μＭ Mil lex CUミリポアフィルターを用いる濾過により無菌化した。Ａのペプチド記号の説明は図２と同じである。Ｂでは以下の濃度が使用された：５ｘ１０^-12Ｍｇｐ３０、２ｘ１０^-12Ｍｐ７５、６０μＭＲＬ２および陽性対照として１２７ｎＭｐ１８５^erbB-2細胞外ドメイン（ＥＣＤ）。実験は最適のクローニング効率が試験されているＦＣＳ中で実施された。細胞は加湿した５％ＣＯ₂雰囲気中、３７℃にて７−９日間インキュベートした。６０μｍより大きなコロニーを Baush and Lomb Stem Cell Colony Counter（Artex Systems Corp.）を用いて計数した。各々の群は３重にアッセイされた。実験は３回実施された。図６ＡおよびＢ：ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞中のＥＧＦＲを経るＲＬ２−Ｋ媒介によるＥＧＦ信号発生の妨害。図６Ａ：ＥＧＦＲ競合アッセイはＭＤＡ−ＭＢ−４６８で行われた。簡単に記すと、１５０，０００細胞／ウェルを２４ウェルプレートに加えた。結合アッセイはLonardo，et al.，Mol.Cell.Biol.，2:992(1990)に記載されているごとく実施された。簡単に記すと、１ｎＭのヨード化ＥＧＦ（Amersham）を濃度を増加させた（各々０．６、６、６０μＭ）ＲＬ２またはＲＬ２−Ｋとインキュベートした。挿入部分に示したように濃度を増加させた非標識ＥＧＦが対照に用いられた。各々の群は三重にアッセイされた。３回の実験から値を得て、対照に対する平均％として表した。値の標準偏差は１０％を超えなかった。図６Ｂ：ＥＧＦＲチロシンリン酸化アッセイは図３に記したごとくＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を用いて実施された。ＲＬ２−ＫまたはＲＬ２の濃度を増加させ（各々レーン１ー３、０．６、６、６０μＭ）またはさせず、細胞をＥＧＦ（１．６８ｎＭ）で処理した［ＲＬ２−Ｋ（上の欄）およびＲＬ２（下の欄）］。次に、細胞膜にをストライプ状にし、抗−ＥＧＦＲモノクローナル抗体（ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ）で再びプローブした。各ブロットについて比較できるレベルのタンパク質発現が示された。発明を実施するための最良の形態以下の記述中に、リガンドー増殖因子受容体相互作用および組換えＤＮＡ技術の分野で使用される多くの術語が広く利用されている。明細書および請求の範囲の明快で一貫性のある理解を提供するため、そのような術語に与えられた範囲を含む以下の定義が与えられた。ブロッキングペプチド術語”ブロッキングペプチド”とはｅｒｂＢ−２膜貫通タンパク質のリガンドまたは上皮増殖因子受容体のリガンドと何らかの方法で結合または相互作用できるペプチドまたはタンパク質分子を意味している。しかしながら、ｅｒｂＢ−２受容体で観察されたアミノ酸配列のブロッキングペプチドは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）または形質転換増殖因子（ＴＧＦα）とは有意に結合しないであろう。同様に、ＥＧＦＲで観察された配列をもつブロッキングペプチドはｅｒｂＢ−２リガンドとは結合しないであろう。本発明のブロッキングペプチドと対応する増殖因子またはリガンドとの結合または相互作用はリガンドおよびその対応する受容体間の相互作用を妨害または抑制する。ｅｒｂＢー２およびＥＧＦＲ発現腺腫細胞の増殖にはこのリガンドー受容体相互作用が含まれているので、術語”ブロッキングペプチド”には上皮増殖因子受容体またはｅｒｂＢ−２受容体およびそれらの対応するリガンド間の相互作用に不利な影響を及ぼす全てのペプチドが含まれるつもりである。術語”ブロッキングペプチド”は野生型ＥＧＦＲタンパク質またはｐ１８５^er ^bB-2 タンパク質を包含するつもりはない。ブロッキングペプチドの例には、ＥＧＦＲまたはｅｒｂＢ−２受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）または、ＥＣＤのサブドメインIIIのようなそれらの断片が挙げられる。好適には、ブロッキングペプチドはサブドメインIII内のより小さい断片に対応する（下記のＲＬ２ペプチドのように）。もしくは、ブロッキングペプチドは機能的誘導体であろう。好適には、誘導体はペプチドＲＬ２またはＲＬ２−Ｋの配列を含んでいるであろうが、ドメインIIIの完全配列ではない。より好適には誘導体はＲＬ２またはＲＬ２− Ｋに対応する部分のタンパク質分解切断に抵抗するように誘導化されているであろう。本発明のブロッキングペプチドは典型的には、３つのアミノ酸の大きさから１０００のアミノ酸の長さの範囲である。好適であるのは３つのアミノ酸から１００のアミノ酸の大きさの範囲である。より好適には、本発明のブロッキングペプチドは３から５０のアミノ酸の大きさの範囲である。最も好適には、本発明のブロッキングペプチドは少なくとも８つのアミノ酸を持っている。突然変異体ここで使用するかぎり術語”突然変異体”とは、ペプチドのアミノ酸配列が一つまたはそれ以上のアミノ酸の付加、置換、挿入または欠損を生じるような様式で改変されているブロッキングペプチドの誘導体を含むつもりである。ブロッキングペプチドの”生物学的に活性な突然変異体”とは、ブロッキングペプチドにより所有されている全てのまたはいくつかの生物活性（特にリガンド結合活性）を保持しているブロッキングペプチドの誘導体を意味するつもりである。術語”突然変異”はまた、特定の配列内の一つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠損によるＤＮＡまたはＲＮＡの改変を示すような一般的術語として用いられるであろう。機能的誘導体本発明のブロッキングペプチドの”機能的誘導体”とは、その誘導体が誘導されるブロッキングペプチドと実質的に同じ生物活性を持つペプチドを意味するつもりである。”実質的に同じ”とは、本来のブロッキングペプチドが持つ活性と定量的には同じであるが定性的には異なった生物活性を意味している。句”定性的に同じである生物活性”とは、本来のブロッキングペプチドの生物活性がより強くまたはより弱く保持されているペプチドを意味している。例えば、本来のブロッキングペプチドの機能的誘導体はｐ１８５^erbB-2受容体またはＥＧＦＲのリガンドと相互作用または結合する能力を保持している。術語”機能的誘導体”は本発明の本来のブロッキングペプチドの生物学的に活性な”突然変異体”、”断片”、および”変異体”を含むつもりである。本発明により企図される本来のペプチドの機能的誘導体の例として、アミノ酸置換、アミノ酸付着および突然変異および分子の両末端でのＣｙｓ残基の付加によるペプチドの環化などが挙げられるが、これらに制限されるわけではない。断片ブロッキングペプチドの”断片”とはブロッキングペプチドにより活性化が遮断される受容体タンパク質の完全アミノ酸配列の一部を含むペプチド分子を意味している。ブロッキングペプチドの”生物学的に活性な断片”とは、ペプチドの生物学的活性の全てをまたはいくつかを保持しているペプチドの断片を意味している。例えば、もし断片がリガンド結合活性のいくつかまたは全てを保持していれば、そのような断片はブロッキングペプチドの生物学的に活性な断片といえるであろう。変異体本発明のブロッキングペプチドの”変異体”とは、ブロッキングペプチドかまたはその断片と構造および生物学的活性において実質的に同じであるが、そのような分子またはその断片とは同一でないペプチドを意味している。変異体は元々のペプチドから誘導される必要はなく、ＥＧＦＲまたはｅｒｂＢ−２受容体と類似のまたは異なった種々の受容体から得られてもよい。実質的に純粋術語”実質的に純粋”または”実質的に精製された”とは、天然の状態でタンパク質またはペプチドに通常付随するどんな化合物も含んでいないタンパク質またはペプチドを記述するために用いられる（即ち、夾雑タンパク質および炭水化物成分を実質的に含んでいない）。しかしながら、この術語はタンパク質またはペプチドの人工または合成混合物が除外されることは意味していない。この術語はまた、例えば不完全な精製により存在し、ペプチドまたはタンパク質の生物活性を妨害しない少量の不純物の存在が除外されることも意味していない。Ａ．ｅｒｂＢ−２膜貫通タンパク質および／または上皮増殖因子受容体タンパク質のリガンド Lupu，et al.，Science，249:1552-1555(1991)はＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞により分泌される約３０キロダルトン（ｋＤａ）の増殖因子の同定および精製を報告している。この糖タンパク質（ｇｐ３０）は連続的な低アフィニティヘパリン−セファロースクロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーにより明らかに均質にまで精製された。ｇｐ３０リガンドはまた１９９０年５月２５日こ出願された米国特許出願第０７／５２８，４３８号に記載されている。ｇｐ３０糖タンパク質は上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合し、いくつかのＴＧＦα−関連の性質を持っている。さらに精製したｇｐ３０はｐ１８５^erbB-2と相互作用しないＴＧＦαおよびＥＧＦとは対照的にｅｒｂＢ−２を過剰発現している細胞中のｐ１８５^erbB-2のリン酸化を剌激する。驚くことには、ｇｐ３０はｅｒｂＢ−２を過剰発現している全ての細胞に於いて細胞増殖を抑制した（Lupu， et al.，Science，249:1552(1990)）。ｐ１８５^erbB-2の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体（４Ｄ５）（Hudziak，et al.，Mol．Cell．Biol.，9:116 5(1989)）はｐ１８５^erbB-2への結合に対してｇｐ３０と競合でき、ｇｐ３０リガンドは４Ｄ５結合部位を認識し、結合する事を示している。第二のｅｒｂＢ−２リガンド、ｐ７５はｐ１８５^erbB-2に対して高度に相同的な受容体であるＥＧＦＲを認識しないし結合しない。ｐ７５リガンドは１９９１年１月１４日に出願された米国特許出願第０７／６４０，４９７号に開示されている。ｐ７５ｅｒｂＢ−２リガンドは７５キロダルトンタンパク質（ｐ７５）である。実質的に精製されたｐ７５リガンドはｐ１８５^erbB-2結合およびｐ１８５^er ^bB-2 のリン酸化の誘導について４Ｄ５（Hudziak，et al.，Mol．Cell．Biol.，9 :1165(1989)）およびＭＯ１９３抗体と競合する。細胞増殖アッセイにおいては、ｅｒｂＢ−２を過剰発現している細胞株の細胞増殖およびコロニー形成がｐ７５により抑制された。さらに、ｐ７５は可溶性ｅｒｂＢ−２細胞外ドメインの抗増殖効果を逆にできた。ｅｒｂＢ−２細胞外ドメインに結合する他のリガンドは現在知られていないが、本発明のブロッキングペプチドと相互作用する他のリガンドが発見されるであろうことが当業者には明らかになるであろう。従って、本発明のブロッキングペプチドはｇｐ３０およびｐ７５のその受容体との結合の相互作用を予防または抑制するであろうが、本発明のブロッキングペプチドはそれに制限されるわけではなく、ｇｐ３０およびｐ７５以外の上皮増殖因子受容体およびｅｒｂＢ−２受容体とのリガンドの相互作用を防止するであろう。ｅｒｂＢ−２リガンドの同定は１９９１年１月１４日に出願された米国特許出願第０７／６４０，４９７号に従って達成されるであろう。Ｂ．ブロッキングペプチドの製造本発明のブロッキングペプチドは、もしそれらが特異的に反応できるかまたは、ブロッキングペプチドがリガンド分子の生物学的活性をブロックする（抑制または量的に減じる）様式でリガンド分子に結合する（共有結合でまたは非ー共有結合で）ように分子またはリガンドと親和性を持っていれば分子を”結合できる ”。本発明のブロッキングペプチドの例は、ｅｒｂＢ−２膜貫通受容体の細胞外ドメインまたはその断片である。サブドメインIIIおよびこのサブドメインのペプチド断片が特に興味をひいた。本発明に従ったブロッキングペプチドを製造するのにｅｒｂＢ−２膜貫通受容体に関連する受容体の配列もまた使用されるが、好適にはｅｒｂＢ−２リガンドに結合するｐ１８５^erbB-2の細胞外ドメインのペプチド断片が使用されるであろう。そのような関連する受容体には例えば、ｎｅｕ、ｃ−ｋｉｔ、ｍｅｔまたは増殖因子受容体の構造記憶を持つ膜貫通チロシンキナーゼが含まれる。ＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ−２受容体およびｎｅｕの配列比較は Bargmann，et al.，Nature，319:226-230(1986)およびYamamoto，et al.，Natur e ，319:230-234(1986)に記載されている。好適な実施態様に於いて、本発明のブロッキングペプチドはｅｒｂＢ−２受容体のＬｅｕ⁴⁵³からＧｌｕ⁴⁶⁰領域のアミノ酸配列を含んでいる。しかしながら、後に認められるごとく関連受容体からの相同領域も本発明に従ったブロッキングペプチドを含んでいるであろう。例えば、ｅｒｂＢ−２受容体のＬｅｕ⁴⁵³からＧｌｕ⁴⁶⁰に対応するＥＧＦＲのＬｅｕ⁴⁴⁸からＧｌｕ⁴⁵⁵領域は本発明のブロッキングペプチドを含むことができる。ｅｒｂＢ−２受容体のＬｅｕ⁴⁵³からＧｌｕ⁴⁶⁰領域の８つのアミノ酸配列（以後ＲＬ２またはＲＬ２−Ｒと称される）は： Leu-Gly-Leu-Arg-Ser-Leu-Arg-Glu であり、上皮増殖因子受容体のＬｅｕ⁴⁴⁸からＧｌｕ⁴⁵⁵領域の８つのアミノ酸配列（以後ＲＬ２−Ｋと称される）は： Leu-Gly-Leu-Arg-Ser-Leu-Lys-Glu である。ブロッキングペプチドが生物学的活性（例えば、ＥＧＦＲまたはｅｒｂＢ−２受容体へのリガンドに対し特異的に反応するまたは親和性を持つ）を保持する限り本発明のブロッキングペプチド中のアミノ酸を置換できる。上記の配列に対する他の突然変異（置換、欠損および付加）がよく知られた技術により行われ生物学的活性（例えばここに記載したようなリガンドへの結合）が試験された。本発明のブロッキングペプチドは多くの既知の技術により製造されるであろう。合成ペプチドは自動化タンパク質合成機を用いて作製される。もしくは、本発明のブロッキングペプチドは組換えＤＮＡ技術により発生されるであろう。例えば、所望のペプチドの発現が形質転換宿主中で得られるように所望のペプチド配列をコードしているＤＮＡ分子がプロモーターおよびその他の制御配列に機能的に連結される。所望のブロッキングペプチドはまた受容体分子を示す細胞から産生できる。ＳＫ−Ｂｒ−３細胞がｐ１８５^erbB-2の細胞外ドメインの精製に使用されてきた（ Alper，et al.，Cell Growth and Differentiation，1:591-599,1990）。Yamamo to，et al.，Nature，319:230-234(1986)は完全長ｐ１８５^erbB-2遺伝子のクローニングおよび発現について記載している。ｅｒｂＢ−２受容体遺伝子を含むプラスミドはAmerican Type Culture Collection,Rockville,MD（寄託番号ATCC575 84）から得ることができる。上記の８アミノ酸を保持したより短い配列をコードしているプラスミドは常法を用いてこのプラスミドから作製できる。ＥＧＦＲ遺伝子を含む類似のプラスミドも容易に入手可能であり、それらは同様にブロッキングペプチドをコードするプラスミドの作製に使用される。よく知られた組換えまたは自動化技術を用いて、多数の機能的誘導体（生物学的に活性な突然変異体、断片および変異体を含む）が製造された。簡単に記すと、所望のペプチドをコードしているＤＮＡ分子はクローン化ＤＮＡの通常の部位特異的突然変異誘発により突然変異が誘発できる（Maniatis，et al.，Molecula r Cloning，A Laboratory Manual，second edition，Coldspring Harbor,N.Y.(1 989)）。無作為化学的突然変異誘発もまた使用されるであろう。さらに、よく知られた自動化合成機を用いてアミノ酸配列中の無作為なまたは部位特異的な変化（付加、置換、および／または欠損）をペプチドに行うことができる。ブロッキングペプチドの誘導体が産生されたら、ＥＧＦＲまたはｅｒｂＢ−２受容体のような受容体のリガンドに対する誘導体の結合活性を容易に分析できることは明かであろう。実施例により詳細に記載されているごとく、結合競合アッセイ、チロシンリン酸化抑制アッセイ、細胞増殖抑制アッセイ、またはヌードマウスを用いた動物実験が、本発明のブロッキングペプチドの活性または実質的に同じ活性を持つ別のペプチドの分析に使用されうる。本発明のブロッキングペプチドは検出可能な様に標識できまたは本分野でよく知られている標準的な技術により治療薬と複合できることは当業者には理解されるであろう。本発明のブロッキングペプチドの検出可能な標識に利用されるであろう検出可能な標識の例は以下に記載されている。ここで使用される限り術語”治療薬”とは細胞の近傍に導入された場合、殺傷、破壊、増殖または再生の抑制ができ、さもなくば、細胞の生存または再生の助けとならない様式で前記細胞の正常の生理学または代謝を妨害する分子、化学化合物、タンパク質などを意味している。適した治療薬の例には、細胞毒性薬剤、毒素、アイソトープ、内分泌系治療薬などが含まれる。使用される特別の細胞毒性薬剤には、アドリアマイシン、シクロホスファミド、５ーフルオロウラシル、メトトレキセート、シスプラチン、カルボプラチン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ニコチンアミドなどが含まれる。毒素にはリシンＡ、ジフテリアおよびプソイドモナスが含まれるであろう。適したアイソトープが作製できる元素の例にはリン、インジウム、イットリウムおよびヨウ素が挙げられる。適した内分泌系治療薬の例には、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、タモキシフェン、ＬＨＲＨ拮抗薬、プロゲスチン、抗−プロゲスチンなどが含まれる。Ｃ．ｅｒｂＢ−２リガンドを検出するためのアッセイ本発明のブロッキングペプチドはｅｒｂＢ−２リガンドの存在の検出に使用されるであろう。従って、本発明のブロッキングペプチドは乳房、肝臓、卵巣、肺、結腸などの癌腫を持つ患者で発現されるｅｒｂＢ−２リガンドを検出するための組織学および生体組織検査で使用されるであろう。そのような検出は種々のアッセイを使用して達成されるであろう。例えば、ブロッキングペプチドを放射活性になるように標識する事により、結合アッセイを使用してｅｒｂＢ−２リガンドを検出することが可能である。よく知られた免疫アッセイのように多くのアッセイが開発でき、抗体の代わりに本発明のブロッキングペプチドが使用された。そのようなアッセイに蛍光、酵素またはその他の適した標識も使用できる。もししくはｅｒｂＢ−２リガンドの検出はインビボイメージング技術によっても達成でき、そこでは、標識ブロッキングペプチドが患者に投与され、組織試料を前もって除去することなくｅｒｂＢ−２リガンドを発現している乳房、肝臓、卵巣、肺、結腸などの癌腫の存在が検出される。そのようなインビボ検出法は他の検出法よりもより非侵襲的であるという利点をもっており、さらに、患者から容易に除去できない組織中のリガンド発現細胞の存在を検出できる。上に議論したアッセイに従うと、種々の標識および標識法を用いてブロッキングペプチドが標識される。本発明に使用できる標識の型の例には、酵素標識、放射性同位元素標識、非放射性同位元素標識、蛍光標識、毒素標識および化学発光標識が含まれるがこれらに制限されるわけではない。適した酵素標識の例として、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母−アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファーグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼなどが含まれる。適した放射性同位元素標識の例は当業者には容易に明らかになるであろう。本発明に使用するために適した非放射性同位元素標識も当業者には知られているであろう。適した蛍光標識の例としては、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、ｏ−フタルアルデヒド標識、フルオレスカミン標識などが挙げられる。適した毒素標識の例として、ジフテリア毒素、リシン、およびコレラ毒素が含まれる。化学発光標識の例には、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジン塩標識、オキザレートエステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、エクオリン標識などが含まれる。当業者には本発明に従って用いられるであろう他の適した標識が知られるであろう。本発明のブロッキングペプチドへのこれらの標識の結合は当業者には普通に知られている標準的な技術を使用して達成できる。典型的な技術はKennedy，e t al.，（Clin.Chim.Acta，70:1-31(1976)）およびSchurs，et al.，（Clin．Ch im．Acta ，81:1-40(1977)）に記載されている。後者に述べられている結合技術は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドーベンジル−Ｎ−ヒドロキシースクシンイミドエステル法（これらの全ての方法はここに引例として含まれている）である。ブロッキングペプチドの検出は担体の使用のより改善できる。よく知られた担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改良セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトが含まれる。担体の性質は本発明の目的にはある程度可溶性でもまたは不溶性でもよい。支持物質は結合された分子がリガンドに結合できる限りは、事実上任意の可能な構造的コンフィギュレーションを持っていてもよい。従って、支持体コンフィギュレーションはビーズのように球形でも、試験管の内側表面または棒の外側表面のような円筒形でもよい。もしくは、表面は薄板、試験片などのように平たくてもよい。当業者は多くの他のブロッキングペプチド結合のために適した担体に気付くであろうし、日常の実験での使用により同様のことを確かめることができるであろう。本発明の結合分子（ブロッキングペプチド）はまた免疫定量型アッセイ（”二部位”または”サンドイッチ”アッセイとしても知られている）に利用するために適応させてもよい。典型的な免疫定量アッセイに於いては、若干の非標識ブロッキングペプチドが試験されている液体（すなわち、血液、リンパ液、液状化便、大便、組織ホモジネートなど）に不溶性である固形支持体に結合されており、固相ブロッキングペプチド、リガンドおよび標識ブロッキングペプチド間で形成される三成分複合体の検出および／または定量を可能にするように若干の検出できるように標識されたブロッキングペプチドを加える。本発明に従った免疫定量型アッセイにおいて、ブロッキングペプチドの代わりにまたはブロッキングペプチドと組み合わせて抗体が使用できることも当業者には明らかになるであろう。典型的な免疫定量型アッセイには、バイナリー固相ブロッキングペプチドーリガンドの形成により試料から抗原を抽出するため固相へ結合されているブロッキングペプチドを最初に試験される試料と接触させる”前方”アッセイが含まれている。適当なインキュベーション期間後、必要なら液体試料の残留物を除くために（未反応リガンドを含む）固体支持体を洗浄し、次に未知量の標識ブロッキングペプチド（”レポーター分子として機能する）を含む溶液と接触させる。非標識ブロッキングペプチドを通して固体支持体へ結合されたリガンドと標識分子の複合体形成を可能にするための第二のインキュベーション期間後、未反応標識ブロッキングペプチドを除くため固体支持体を洗浄する。この型の前方サンドイッチアッセイは、ｅｒｂＢ−２リガンドが存在するかまたは標識ブロッキングペプチドの測定値を既知の量のリガンドを含む標準試料のものと比較することにより定量的に決定する単純な”イエス／ノー”アッセイであろう。そのような”二部位”または”サンドイッチ”アッセイはWide、Radioimmune Assay Method，頁19 9-206,KirkbamおよびHnter編、E.&S．Livingstone，Edinburgh，1970）により記載されている、ただし、抗体はブロッキングペプチドに置き換えられた。抗体およびブロッキングペプチドの組み合わせもまた使用されるであろう。ｅｒｂＢ−２リガンドの検出に有用であろう別の型の”サンドイッチ”アッセイ、いわゆる”同時”および”逆”アッセイが使用された。同時アッセイは固体支持体に結合されているブロッキングペプチドおよび標識ブロッキングペプチドの両方を同時に試験される試料に加える単一のインキュベーション工程から成っている。インキュベーション完了後、液体試料の残りおよび非複合体化標識ペプチドを除去するために固体支持体を洗浄する。固体支持体と会合した標識ブロッキングペプチドの存在を続いて通常の”前方”サンドイッチアッセイのように決定する。 ”逆”アッセイにおいては、液体試料への標識ブロッキングペプチド溶液の段階的添加に続き適当なインキュベーション期間後、固体支持体に結合された非標識ブロッキングペプチドが添加される。第二のインキュベーション後、試験される試料および未反応ブロッキングペプチドの溶液の残りを除くために通常の様式で固相が洗浄される。固体支持体と会合した標識ブロッキングペプチドの決定は ”同時”または”前方”アッセイのように実施された。上に説明したように、ｅｒｂＢ−２リガンドの免疫定量型アッセイは特定の結合分子が”レポーター分子”で標識される必要がある。これらのレポーター分子または標識は（上で同定したように）通常のものであり、本分野ではよく知られている。一つの酵素では各々の考えられる免疫定量型アッセイで標識として使用するのに理想的ではない。実際、特定のアッセイ系に対してどの酵素が適しているかを決定しなければならない。酵素の選択に際して重要な基準は、純粋な酵素のターンオーバー回数（単位時間当たり、酵素部位当たりに生成物へ変換される基質の数）、酵素試料の純度、その生成物の検出感度、酵素反応の検出の容易さおよび速度、試験液中に妨害因子または酵素様活性が無いこと、酵素およびその複合体の安定性、酵素およびその複合体の手にいれ易さおよび価格などである。本発明の免疫定量型アッセイにおいて好適な標識として使用される酵素に挙げられるものはペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。さらに、本発明のアッセイで使用するための材料はキットの作製に理想的に適している。そのようなキットにはバイアル、試験管などのような一つまたはそれ以上の収納容器に密閉されて受け取れるために区分された運搬容器を含んでいるであろう。前記収納容器は本方法で使用される別々の要素の一つを含んでいる。例えば、収納容器の一つは結合ブロッキングペプチドを含んでいるであろう。そのようなペプチドは別の固相へ、または直接収納容器の内壁へ結合されるであろう。第二の収納容器は検出可能なように標識された抗体またはブロッキングペプチドを凍結乾燥形でまたは溶液で含んでいるであろう。運搬容器はさらにまた各々異なった、前もって決められたおよび既知の量のリガンドを含む多数の収納容器を含んでいるであろう。これらの後者の収納容器は未知の量のリガンドを含む試料から得られた結果を内挿できる標準曲線の作製に使用できる。Ｄ．ブロッキングペプチドの使用本発明のブロッキングペプチドにはたくさんの治療的および診断的使用法がある。例えば、治療的使用には癌またはその他の関連する疾患を持つと疑われる患者における癌治療が含まれるであろう。特に、ＲＬ２の８つのアミノ酸配列を含む本発明のブロッキングペプチドはｅｒｂＢ−２リガンドを産生するおよび／またはｅｒｂＢ−２受容体タンパク質を過剰発現する腺腫細胞を持つ患者の処置に使用されるであろう。同様に、ＲＬ２−Ｋの８つのアミノ酸配列を含むブロッキングペプチドはＥＧＦリガンドを産生するおよび／またはＥＧＦＲを過剰発現する腺腫細胞を持つ患者の処置に使用されるであろう。処置の一つの型は治療薬と一緒にブロッキングペプチドを使用する。治療薬と一緒にＲＬ２−Ｒの８つのアミノ酸配列を持つブロッキングペプチドの有効量を患者に投与することにより、患者のｅｒｂＢ−２リガンドを発現する腺腫細胞の増殖が抑制または殺され、それにより癌に対しての処置が提供される。本発明の癌処置法に従うと、癌腫細胞とｅｒｂＢ−２リガンドとの会合のため複合化ブロッキングペプチドが癌腫細胞を認識および結合できる。癌細胞への結合の機構にはｅｒｂＢ−２（細胞表面に位置しているリガンド、またはリガンドの発現および／または分泌により）の認識が含まれていることは明らかである。リガンドとの相互作用により複合体化ブロッキングペプチドが腺腫細胞に結合または近くに会合したら、治療薬はその細胞の抑制または殺傷が可能である。この様式により、本発明の治療は特定の細胞に（ｅｒｂＢ−２リガンドと会合している癌細胞）対して選択的である。正常細胞およびｅｒｂＢ−２リガンドと会合しない他の細胞（ｅｒｂＢ−２リガンドを発現または結合しない細胞）はほとんどＲＬ２−Ｒの８つのアミノ酸配列を含むブロッキングペプチドによる治療の影響を受けないであろう。さらに、本発明のブロッキングペプチドは腺腫細胞増殖誘導の防止または抑制に使用されるであろう。例えば、ｐ１８５^erbB-2受容体を含む癌細胞は低濃度のｅｒｂＢ−２リガンド存在下増殖が誘導される。ｅｒｂＢ−２リガンド増殖因子とその受容体との相互作用を防ぐことで癌患者の処置法が提供されるであろう。本発明の細胞増殖の抑制または防止法に従うと、ブロッキングペプチドはｅｒｂＢ−２リガンドに結合できる。インビボで放出されたｅｒｂＢ−２との結合によりリガンドーブロッキングペプチド複合体が形成され、それにより立体的またはその他のリガンドー受容体相互作用が防止または抑制されるであろう。従って、本発明は患者に有効量のブロッキングペプチドを投与することによる患者の腺腫細胞増殖を防止または抑制する処置法を提供する。本発明のブロッキングペプチドの多くのその他の治療的使用が工夫されることを理解されたい。そのような治療法には本発明のブロッキングペプチドと組み合わされた他の既知の技術の使用が含まれるであろう。本発明はここに記載された治療的処置に制限されることを意図しているわけではなく、それらは例示のためだけに示されたものである。さらに、腺腫細胞の抑制または殺傷に十分な本発明のブロッキングペプチドの量の投与は、悪性腫瘍細胞の型、患者の体重、使用される治療薬の型などを含む多くの因子に依存して変化するであろう。当業者はインビトロまたはインビボで特定の悪性腫瘍細胞を抑制または殺傷するのに必要な量を最小のルーチンの実験法で容易に決定できることを理解するであろう。そのようなブロッキングペプチドの有効量は非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内または経口で投与されるであろう。さらに、医薬品としての本発明のブロッキングペプチドの加工性または安定性を向上させる適当な添加剤、補助剤または化合物を含む医薬製剤が調製されるであろう。本発明のブロッキングペプチドの診断的使用（リガンドへの結合活性により）には、例えば、患者から得られた試料中のｅｒｂＢ−２リガンドの検出がある。そのような試料は体組織、体液（血液、尿、涙、唾液、血清および脳脊髄液のような）、糞便、細胞抽出液などであろう。ｅｒｂＢ−２リガンド検出法に従うと、ｅｒｂＢ−２リガンドはインビトロで細胞培養培地内へ放出される。別の増殖因子（ＴＧＦα、インビトロで放出される）も癌患者の体液から同定された。必然的に、癌患者からの体液、大便などに増殖因子（ｅｒｂＢ−２リガンド）が検出されるであろうし、本発明のアッセイを用いて検出可能である。患者から得られた試料中のｅｒｂＢ−２のための本発明のアッセイは癌診断のための方法を提供するであろう。すなわち、患者から得られた試料中にｅｒｂＢ −２リガンドが検出されることは患者にｅｒｂＢ−２リガンドを発現している細胞が存在していることを示している。さらに、ブロッキングペプチドはｅｒｂＢ −２リガンドに特異的であるので、このアッセイにより患者の腫瘍の生物学に関する情報が提供されることになる。例えば、ｅｒｂＢ−２受容体を過剰発現する腺腫細胞を持つ癌患者はｅｒｂＢ−２の過剰発現を示さない癌患者よりも疾患を示さない期間がより短く全体の生存率もよくない。ｅｒｂＢ−２リガンド増殖因子の検出は予後の試験としても働き、患者処置のより有効な治療の選択を臨床医に可能にさせている。類似のアッセイがＥＧＦＲブロッキングペプチドの結合に基づいてＥＧＦＲリガンド（ＥＧＦおよびＴＧＦα）の検出に使用されるであろう。本発明をここに十分に説明してきたが、同一のことがある種の特定の実施例を参考にすることによりより明瞭に理解されるであろう、しかしそれらはただ例示の目的でここに含まれているものであり、付随する請求の範囲に特定されない限り本発明の制限を意図しているものではない。実施例実施例１リガンドに結合する小ペプチドの選択 EGFR-ECDを構成する４ドメインモデルが提唱されており、それにおいてサブドメインIIIはリガンド相互作用及びシグナル変換に関与する決定子のほとんどに寄与し、側面に位置するシステインリッチなサブドメインII及びIVは互いに接触して原形質膜に近接している（ウルリッチら（Ullrich，et al.）、セル、61巻、203頁、1990年；ラックスら（Lax，et al.）、EMBO J．、８巻、421頁、1989 年）。ｐ185^erbB-2及びEGFR-ECD配列は多様化していて全体的相同性は44％となっている（ヤマモトら（Yamamoto，et al.）、ネイチャー、319巻、230頁、1986 年）。驚くべきことに、本発明者はｐ185^erbB-2の細胞外サブドメインIIIが、そのEGFR対配列に対して87.5％の相同性を持つ（K459においてアミノ酸１個が異なる）短い親水性ペプチド配列、L453-E460、を示すことを発見している。本発明者は、この高度に保存されているペプチド配列は、gp30蛋白のEGFR或いはｐ185^e ^rbB-2 、又はモノクローナル抗体或いは成長因子のようなEGFR-結合分子のいずれかとの相互作用における主たる決定子を構成するらしいと感じた。L453-E460座（RL2）に対応するペプチドと共に、サブドメインIII中の相同性が減少している領域に対応する２ペプチド及びサブドメインII中の配列に配列に対応する３ペプチドも対照として試験した（図１）。これらのペプチドを、MDA-MB-453又はMDA-MB-468ヒト乳癌細胞においてｐ185^e ^rbB-2 又はEGFRによってそれぞれ誘発される細胞分裂促進性のシグナル変換に対する効果について評価した；或いは、SK-Br-３ヒト乳癌細胞も使用した。SK-Br- 3（ATCC HTB30）、MDA-MB-453（ATCC HTB131）及びMDA-MB-468（ATCC HTB132）細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）ロックビル、MD ）から入手した。先に調べられたように（ループら（Lupu，et al.）、サイエンス、249巻、1552頁、1991年）、SK-Br-3細胞は大量のｐ185^erbB-2を発現し、適度なレベルのEGFRを発現する；MDA-MB-453細胞は大量のｐ185^erbB-2を発現しEGF Rの発現は検出できる程度の量である；逆に、MDA-MB-468細胞は大量のEGFRを発現しｐ185^erbB-2の発現は検出できない量である。 RL2ペプチドがｐ185^erbB-2又はEGFRの細胞外結合部位のいずれかを特異的に表すものであるかどうかを調べるために、本発明者は前記のペプチドをｐ185^erbB- ² 又はＥＧＦＲ結合拮抗アッセイで試験した。ヨウ化gp30が入手できなかったため、ヨウ化モノクローナル抗体4D5及びヨウ化EGFをそれぞれ用いてｐ185^erbB-2 及びEGFR拮抗アッセイを行った。ｐ185^erbB-2モノクローナル抗体4D5及び7C2はジェネンテック社、サウス・サンフランシスコ、CA、から入手した。4D5はSK-Br -3ヒト乳癌細胞におけるｐ185^erbB-2のチロシンリン酸化及びｐ185^erbB-2過剰発現細胞の成長抑制を誘導することが示されているが（フドジァックら（Hudziak ，et al.）、モリキュラー・セル・バイオロジー、９巻、1165頁、1989年；クマーら（Kumar，et al.）、モリキュラー・セル・バイオロジー、11巻、979頁、19 91年）、7C2は（フェンドリーら（Fendly et al.）、キャンサー・リサーチ、50 巻、1550頁、1990年）生物学的反応を何も誘導しない。gp30蛋白はp185^erbB-2への結合については4D5と、又EGFRへの結合についてはEGFと拮抗すること、さらに p185^erbB-2過剰発現細胞における4D5抗体又はEGFR過剰発現細胞におけるEGFのいずれかによって誘導されるものと同様の生物学的反応を誘導することが示されている（ループら（Lupu，et al.）、サイエンス、249巻、1552頁、1991年；ループら（Lupu，et al.）、バイオケミストリー、印刷中；ループら（Lupu，et al. ）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス．USA）89巻、2287-2291頁、1992年）。試験したペプチド類の中でRL2だけが、ヨウ化4D5のSK-Br-３への結合を用量依存的に（B/T 50:8μＭ）置換した（図２）。2-40μMの範囲で試験したペプチド類のうち、１nMの対照ヨウ化7C2抗体の結合又は１nMヨウ化EGFのMDA-MB-468細胞への結合のいずれかに有意な影響を及ぼしたものはなかった（表示なし）。ヨウ化RL2はさらに4D5アフィニティカラムに特異的に結合することが示された。まず、RL2ペプチドをヨウ素を用いてヨウ化し、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で精製した；比活性は26，000 cpm/μgペプチドであった。トリクロロ酢酸（TCA）沈澱により98.8%の収率が得られた。3x10⁶ cpmのヨウ化RL2を4D5をカップリングさせたプロテインA-セファロースカラム（カップリングパーセント：98.5%）に載せた。溶出はMgCl₂の濃度を１から５Mに上昇させて行った（表１参照）。表１において＊の印を付けた特異的溶出は２M MgCl₂に得られた。非結合溶出液にはバックグラウンドレベルの放射能しか含まれなかった。従って、4D5によって認識されるペプチド配列として、L453-E460はgp30の p185^erbB-2への結合における主要な決定子らしい。EGFRへのEGFの結合において有意な抑制がなかったことは、EGFRへのgp30の結合には関係が全くないか又は少ないことを示唆している。実施例２リン酸化におけるブロッキングペプチドの作用 RL2の阻止作用の特徴をさらに調べるために、本発明者はp185^erbB-2或いはEGF Rのいずれか、又はそれらの両方においてgp30によって誘導されるチロシンリン酸化を妨げる能力について相同ペプチド類を分析した。この研究はまず、全ケースについてインビトロのチロシンリン酸化アッセイを用いて行われた。MDA-MB-4 53細胞において、0.06から60μMのRL2はp185^erbB-2チロシンリン酸化のベースライン及びgp30刺激を受けたレベルの両方を、それぞれ70から96%及び80%と強く抑制した。（オートラジオグラムの濃度分析はSAMBA 4000システム（ダイナテク・ラボラトリー製）を用いて行った。得られた値はバックグラウンドについて補正し、対照パーセントで表した。対照に比べて10%より大きい効果が見られた場合に有意差ありと見なした。） MDA-MB-468細胞において、60μM RL2はEGFRチロシンリン酸化のベースラインレベルのみを、程度は低いが（71%）抑制した。しかしながら、gp30剌激を受けたレベルは抑制しなかった。同様に、RL2はMDA-MB-468細胞におけるEGF誘導によるEGFRチロシンリン酸化に効果を示さなかった。L453-E460に近接して、協同作用を持つかもしれないペプチド配列に対応するにもかかわらず、RL1は同様の濃度で試験した場合に有意の抑制を誘導しなかった（図３）。ペプチドP1、P2、P3 及びP4（30μM）は効果を示さなかった（表示なし）。p185^erbB-2チロシンリン酸化におけるRL2の阻止作用の特異性をインビボのリン酸化アッセイ及びそれに次ぐホスホアミノ酸分析により確認した。p185^erbB-2チロシンのリン酸化レベルはgp30剌激の無い場合及び有る場合のいずれも、それぞれ50%及び26%ずつ減少した（図４）。上記のことは、RL2がgp30により開始されるp185^erbB-2の活性化のみを妨げ、g p30により開始されるEGFRの活性化には関与しないことを証明している。さらに、MDA-MB-453及びMDA-MB-468細胞において単独で用いられた際のRL2抑制効果の観察から、分泌されるはずの成長因子の基礎レベル、及びL453-E460決定子との完全な又は部分的な相互作用を通じてのp185^erbB-2又はEGFRリン酸化における作用が示唆される。実施例３増殖におけるブロッキングペプチドの作用 p185^erbB-2活性化レベルにおけるRL2の妨害作用が結果としてp185^erbB-2過剰発現細胞の増殖を抑制できるのかどうかを試験するために、本発明者はMDA-MB-4 53細胞の付着非依存性成長におけるp185^erbB-2相同性ペプチド類の活性を評価した。RL2の作用がMDA-MB-468細胞におけるEGFRチロシンリン酸化の基礎レベルに対して先に観察されているので、この細胞株はEGFR-細胞分裂促進性シグナル変換における別のRL2作用の可能性に関しても試験した。MDA-MB-453細胞の付着非依存性成長は6-60μM RL2ペプチドの存在下で72％抑制されたが、一方P1、P2、P 3、P4及びRL１は同様の濃度で試験した際に有意の作用を表さなかった（図5A）。MDA-MB-468細胞はいずれのペプチドにも反応しなかったが、プラスの対照として用いた10 nM EGFに反応した（表示なし）。EGF結合置換及びgp30刺激を受けたチロシンリン酸化の両方にRL2作用が見られないことと合わせて、このことはEGF R細胞分裂促進性シグナル変換におけるL453のE460決定子への関わりを除外するものである。 p185^erbB-2リガンド介在性作用に対する阻止作用としてのRL2抗増殖作用を説明するために本発明者は、刺激性濃度のgp30又はp75蛋白のいずれかの存在下でのSK-Br-3細胞の付着非依存性成長について、このペプチド及びp185^erbB-2のECD を試験した；p75蛋白はp185^erbB-2とのみ相互作用することが知られている（ループら（Lupu，et al.）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス．USA）89巻、2287-2291頁、1992年）。RL2及びp185^erb ^B-2 ECDの抑制作用はgp30及びp75の両方によって完全に打ち消された。gp30によるRL2効力の打ち消しはL453-E460決定子のgp30増殖力への関与を立証するものであった。p75がSK-Br-３細胞によって分泌されて4D5モノクローナル抗体とp185^er ^bB-2 への結合を競合するとすれば（ループら（Lupu，etal.）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス．USA、89巻、2287-2291頁、1992年）、p75による効力打ち消しはRL2がp185^erbB-2 過剰発現細胞増殖のオートクリン調節における妨害剤であることを示している（図5B）。実施例４ EGFに対するブロッキングペプチド RL2及びRL2-Kはわずか１個のアミノ酸、459-EGFR/454-erbB-2（Lys/Arg）位でのみ異なっている。MDA-MB-468細胞におけるEGFへのEGFRへの結合に対してRL2が作用を持たないことは、p185^erbB-2に由来する8-mer配列がEGFR細胞分裂促進性シグナル化に作用しないことを示していた。以下の実験は、EGFRのL448-E455配列に由来する合成ペプチド（RL2-K）がEGFRシグナル変換を特異的に抑制しうるかどうかを試験したものである。 MDA-MB-468細胞における該ペプチドの作用を、EGF結合、EGFRチロシンリン酸化、及びコロニー形成に際してのその作用について調べた（図６）。RL2とは異なり、RL2-Kはヨウ化EGFのEGFRへの結合を用量依存的に阻止した（図6A）。インビトロのアッセイは6-60μM RL2-KがEGFRチロシンリン酸化に対するEGF剌激を最大85%抑制したがRL2は作用しなかったことを示していた（図6B）。対照的に、RL 2-KはMDA-MB-453細胞のコロニー形成について試験した際に有意の作用は示さなかった（表２）。合わせて考えると、これらの結果はRL2-KがEGFRシグナル変換を特異的に阻止し、p185^erbB-2活性には作用を表さないことを証明している。＊細胞を表示のように処理した。モノクローナル抗体4D5（ジェネンテック社、C A、より寄贈）及びRL2ペプチドをプラスの対照として使用した。軟寒天クローニングアッセイは先に述べられているように行った（ループら（Lupu，et al.）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス． USA、89巻、2287-2291頁、1992年）。60μMよりも大きなコロニーを、バウシュ・アンド・ロムステム・セルコロニーカウンター（アーテックスシステムズ社製）を用いてカウントした。各群は３回ずつアッセイした。実験を３回行い、同様の結果を得た。これらの研究から、p185^erbB-2及びEGFRの細胞外ドメインのサブドメインIII はそれぞれに成長因子結合に関与しており、おのおののレセプターへの成長因子結合における特異性は459/454位のただ１つのアミノ酸の違いに起因することが示唆される。p185^erbB-2中のArg及びEGFR中のLysは両方とも、蛋白−蛋白相互作用に通常関与する＋チャージのアミノ酸である。これらの決定子の二次構造を模倣した種々の化合物は、改善された配座安定性及び、より高い生物学的活性を示すことができる。p185^erbB-2を標的とした治療法、例えばその細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体などが、開発されている。p185^erbB-2及びEGFR中の成長因子結合部位に相当する合成ペプチドの特性決定から、そのような過剰発現されたレセプター及びそのリガンドによって規定されるオートクリン／パラクリンループを中断させるための新分子の設計に基づく、ヒトの悪性腫瘍治療における新たな戦略が提供される。乳癌、卵巣癌又は胃癌の低生存率の一因であるp185^erbB-2過剰発現の生物学的意義は未だによくわからない。NIH 3T3細胞中に過剰発現された際のp185^erbB-2 の構造性キナーゼ及び形質転換活性（ロナルドら（Lonardo，et al.）、モリキュラー・セル・バイオロジー、２巻、992頁、1990年）は、過剰発現の結果としておこるp185^erbB-2の構造的活性化及びそれに次ぐ腫瘍細胞のアンバランスな成長刺激を可能な説明として示唆している。しかしながら、ヒト乳癌細胞株による細胞分裂促進特性を持つp185^erbB-2リガンドの分泌は、p185^erbB-2が乳癌成長のオートクリン調節に完全に関係することを立証している。この点において、ここに開示したデータはL453-E460決定子がgp30及びp75のp185^erbB-2への結合の媒介に関与していることを示している。従って、RL2ペプチドのようなブロッキングペプチドは、erbB-2産物を含むオートクリンループを中断させる新たな候補と思われる。医学、免疫学、ハイブリドーマテクノロジー、薬学、及び／又は関係分野の熟練者に明らかな、本発明を実施するための上記方法の改良は、以下の請求の範囲内に入るものとする。本明細書中に述べた全ての出版物及び特許出願は、本発明が関係する当業者の技術レベルを示すものである。全ての出版物及び特許出願は、個々の出版物及び特許出願がそれぞれ特別且つ別々に参考文献として組み込まれていることが示されている場合と同等の範囲で参考文献としてここに組み込まれている。上述の発明は明瞭に理解されることを目的として説明及び例示するために詳細に述べられているが、一定の変更及び改良は添付の請求項の範囲内で実行できることは明らかである。配列表（２）配列番号：１（ｉ）配列の特性（Ａ）配列の長さ：８アミノ酸残基（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（xi）配列：配列番号：１（２）配列番号：２（ｉ）配列の特性（Ａ）配列の長さ：８アミノ酸残基（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（xi）配列：配列番号：２

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/47 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/574 Ａ 8310−2Ｊ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＮＺ，ＵＳ (72)発明者リップマン，マークアメリカ合衆国メリーランド州20817，ベセスダ，ハーブ・ファーム・ドライブ 8004

Claims

【特許請求の範囲】１．上皮成長因子受容体のリガンドに結合することができ、因って該リガンドと該受容体との結合を抑制できる、実質的に純粋なブロッキングペプチド。２．ｅｒｂＢ−２受容体のリガンドに結合することができ、因って該リガンドと該受容体との結合を抑制できる、実質的に純粋なブロッキングペプチド。３．該リガンドがｇｐ３０である、請求項２に記載のブロッキングペプチド。４．該リガンドがｐ７５である、請求項２に記載のブロッキングペプチド。５．ｅｒｂＢ−２膜受容体の細胞外領域またはその機能的誘導体である、請求項２に記載のブロッキングペプチド。６．ペプチドの長さが約３−１０００アミノ酸残基である、請求項５に記載のブロッキングペプチド。７．ペプチドの長さが約３−１００アミノ酸残基である、請求項６に記載のブロッキングペプチド。８．アミノ酸配列：Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕからなる、請求項２に記載のブロッキングペプチド。９．アミノ酸配列：Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕからなる、請求項１に記載のブロッキングペプチド。１０．腺癌細胞の増殖を抑制するのに十分な量の、上皮成長因子受容体若しくはｅｒｂＢ−２受容体のリガンドに結合できる実質的に純粋なブロッキングペプチドを腺癌の患者に投与することからなる、患者の腺癌細胞の増殖を抑制するための方法。１１．腺癌細胞が、乳房、肺、卵巣、胃、甲状腺、前立腺、または唾液腺の腺癌細胞である、請求項１０の方法。１２．ブロッキングペプチドが、ｅｒｂＢ−２細胞膜受容体またはその機能的誘導体の細胞外領域である、請求項１０に記載の方法。１３．腺癌細胞の増殖を抑制するのに十分な量の、上皮成長因子受容体若しくはｅｒｂＢ−２受容体のリガンドに結合できる実質的に純粋なブロッキングペプチドを該腺癌細胞に接触させることからなる、腺癌細胞の増殖を抑制するための方法。１４．腺癌細胞が、乳房、肺、卵巣、胃、甲状腺、前立腺、または唾液腺の腺癌細胞である、請求項１３に記載の方法。１５．ブロッキングペプチドが、ｅｒｂＢ−２細胞膜受容体またはその機能的誘導体の細胞外領域である、請求項１３に記載の方法。１６．ａ）上皮成長因子受容体若しくはｅｒｂＢ−２受容体のリガンドに結合し、よって該リガンドと該受容体との相互作用を抑制することのできる実質的に純粋なロッキングペプチドを検出可能なように放射ラベルしたものを、患者から得られた試料に接触させ；そしてｂ）該試料中のリガンドの存在を決定する、ことからなる、ｅｒｂＢ−２受容体に対するリガンドを発現する細胞の患者の体内における存在を検出するための方法。１７．該試料が、体内組織、血液、尿、唾液、涙、血清、脳脊髄液および便からなるグループから選択される、請求項１６に記載の方法。１８．該細胞が、乳房、肺、卵巣、胃、甲状腺、前立腺、または唾液腺の腺癌細胞である、請求項１６の方法。１９．ブロッキングペプチドが、ｅｒｂＢ−２細胞膜受容体またはその機能的誘導体の細胞外領域である、請求項１６に記載の方法。２０．ａ）上皮成長因子受容体若しくはｅｒｂＢ−２受容体のリガンドに結合し、よって該リガンドと該受容体との相互作用を抑制することのできる実質的に純粋なロッキングペプチドを検出可能なように放射ラベルしたものを、患者に投与し；そしてｂ）全身ｉｎｖｉｖｏイメージイングにより、リガンドの存在を決定する、ことからなる、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体に対するリガンドを発現する細胞の患者の体内における存在を検出するための方法。２１．該細胞が、乳房、肺、卵巣、胃、甲状腺、前立腺、または唾液腺の腺癌細胞である、請求項２０の方法。２２．ブロッキングペプチドが、ｅｒｂＢ−２細胞膜受容体またはその機能的誘導体の細胞外領域である、請求項２０に記載の方法。