JPH0767654A - ヒトヒスタミンｈ１受容体遺伝子およびその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 配列表１の塩基配列またはアミノ酸配列で示
されるヒスタミンＨ₁ 受容体をコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片、およびそれを利用するヒトヒスタミンＨ₁
受容体遺伝子の多型の検出法。 【効果】 本発明のＤＮＡ断片は、ヒトヒスタミンＨ₁
受容体の構造を初めて明らかにしたものであり、ヒトヒ
スタミンＨ₁ 受容体に関する各種の研究、疾患の治療、
薬物の設計等に貢献すると考えられるものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト染色体に由来する遺
伝子に関し、さらに詳しくはヒトヒスタミンＨ₁ 受容体
をコードする遺伝子ＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒスタミン受容体は、分子構造や臓器分
布および応答機構の差異から、Ｈ₁ 、Ｈ₂ 、Ｈ₃ と３種
類のサブタイプに分類されている。このうちＨ₁ 受容体
については、末梢において血管拡張と透過性の亢進、気
管支収縮など、即時型アレルギー反応の発現に関与する
ことが知られている。ジフェンヒドラミンなどＨ₁ 受容
体に対し選択的に遮断する薬物は、目的臓器の生理機能
を抑制することが可能であり、従来より諸アレルギー疾
患の特効薬として用いられてきた。

【０００３】近年、新薬開発の有効な手段として構造活
性相関の概念が導入され、薬物の分子設計が可能となっ
てきた。薬物受容体の中には、遺伝子の塩基配列やタン
パク質の一次構造が明らかにされたものも多く、このこ
とが選択性の優れた薬物を開発するための有用な情報と
なっている。

【０００４】また中枢性のヒスタミンＨ₁ 受容体は、神
経細胞およびそれを周囲で支持するグリア細胞などにお
いて発現が認められる。さらに、グリア細胞では脳内の
多様な生理機能に積極的に関与することが知られてお
り、これらのことからヒスタミンＨ₁ 受容体と各種神経
疾患との関連性が予想される。

【０００５】例えば、最近以下に示す一連の研究からヒ
スタミンＨ₁ 受容体とてんかん発作との関連性が示唆さ
れている。すなわち、ヒスタミンＨ₁ 受容体刺激薬投
与により発作誘発のいき値が上昇する〔シェルクル(R.
Scherkl)ら、エピレプシーリサーチ(Epilepsy Res.), 1
0(1991) 他〕、ヒスタミンＨ₁ 受容体刺激の反応機構
でもあるＣａ²⁺の細胞内流入が発作現象に関与する〔ジ
ビキ(I. Jibiki) ら、クリニカル・ニューロサイエンス
(Clin. Neurosci.), 5, 380(1987) 他〕、てんかん発
作焦点付近においてヒスタミンＨ₁ 受容体発現量の変化
が認められる〔イイヌマ（K. Iinuma)ら、ランセット
（Lancet), 341, 238(1993) 〕などである。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ヒスタ
ミンＨ₁ 受容体をコードする遺伝子の構造については、
これまでにヤマシタ(M. Yamashita)らによるウシのｃＤ
ＮＡ〔プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス・オブ・ユーエスエー (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA), 88, 11515(1991)〕およびフジ
モト(K. Fujimoto) らによるラットのゲノムＤＮＡ〔バ
イオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・
コミュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Commu
n.), 190, 294(1993)〕についてのみ報告がなされてい
るだけで、ヒトの遺伝子についてはその重要性にもかか
わらず未だ報告がない。本発明の目的であるヒトヒスタ
ミンＨ₁ 受容体遺伝子のクローニングが達成され塩基配
列およびアミノ酸配列が決定されることで、ヒスタミン
Ｈ₁ 受容体を特異的に遮断する理想的な薬物の設計に大
きく貢献するものと考えられる。また、クローニングさ
れた遺伝子を動物培養細胞中で発現させる系が確立され
るならば、ヒスタミンＨ₁ 受容体を介する反応機構の一
端を解明することが可能となり、さらには受容体タンパ
クと薬物との親和力を直接調べることで新たな薬効評価
が可能になると考えられる。

【０００７】また、本遺伝子の変異（多型）とアレルギ
ー疾患やてんかん発作をはじめ予想される各種疾患との
連鎖が証明された場合、これらの疾患の遺伝子診断およ
び遺伝子治療に貢献する可能性が考えられる。さらに、
発現誘導された受容体タンパクに対する抗体を作製すれ
ば、免疫染色法によるヒトヒスタミンＨ₁ 受容体タンパ
クの組織分布や発現量の評価も可能になると考えられ
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、後記配列表の
配列番号１に示されるヒトヒスタミンＨ₁ 受容体をコー
ドする遺伝子ＤＮＡ（以下これを「ヒトヒスタミンＨ₁
受容体遺伝子」と称する）を含むＤＮＡ断片、および該
遺伝子内に存在する変異点の上流部分に対して相補性を
有するオリゴヌクレオチドおよび変異点の下流部分に対
して相補性を有するオリゴヌクレオチドをプライマーと
して用いて該遺伝子内に存在する変異点を含むＤＮＡ領
域を増幅し、該増幅ＤＮＡを解析することを特徴とする
ヒトヒスタミンＨ₁ 受容体遺伝子の多型の検出法に関す
る。

【０００９】本発明のヒトヒスタミンＨ₁ 受容体遺伝子
は、ヒスタミンＨ₁ 受容体をコードするｃＤＮＡおよび
ゲノム遺伝子をクローン化し、塩基配列ならびにアミノ
酸配列を決定することによって得ることができる。

【００１０】本遺伝子は、例えば以下のようにして調製
される。ヤマシタ（M. Yamashita)らが報告した（前
出）ウシヒスタミンＨ₁ 受容体塩基配列をもとに、塩基
番号７５７−７９６、即ちアミノ酸配列２５３番目のグ
リシンから２７８番目のリジンに対応する塩基配列（5'
-GGGAAGGAGTCCCCCTGGGAGGTTCTGAAAAGGAAGCCAA-3'；配列
番号３) に相当するオリゴヌクレオチドを化学合成し、
これをプローブとして、プラークハイブリダイゼーショ
ン法によりヒトグリオーマｃＤＮＡライブラリー（λｇ
ｔｌｌ組換え体ファージ、東洋紡製）などをスクリーニ
ングし、目的ファージクローンを単離する。次に、得ら
れた目的ファージクローンからＤＮＡを抽出し、これを
制限酵素ＥｃｏＲＩなどで消化した後アガロースゲル電
気泳動を行い、サザンブロット後、上記プローブを用い
てサザンハイブリダイゼーションを行って、目的ｃＤＮ
Ａ断片の挿入を確認する。

【００１１】この目的領域を含む組換えファージＤＮＡ
を鋳型として、λｇｔｌｌフォワード(forward) 、リバ
ース(reverse) 両プライマーを用い、ＰＣＲ法によりこ
の領域を増幅させる。増幅産物を、例えば制限酵素Ｓａ
ｃＩで２断片（０．９kbと１．０kb）に消化した後、Ｄ
ＮＡライゲーションキット（宝酒造製）を用いてｐＢＳ
ＳＫ（＋）ベクター（東洋紡製）に結合させ、塩化ルビ
ジウム法によって作製された感受性大腸菌ＨＢ１０１株
（宝酒造製）に導入し形質転換させ、アンピシリン耐性
株を分離する。これらからプラスミドＤＮＡを常法〔マ
ニアティス(T.Maniatis）ら、「モレキュラー・クロー
ニング（Molecular Cloning)」、1.25、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor
Laboratory)、(1989)〕に従って抽出し、得られたプラ
スミドを制限酵素ＳａｃＩ／ＡｐａＩなどで消化し、ア
ガロースゲル電気泳動により目的ＤＮＡ断片の有無を検
出することによって、０．９kbおよび１．０kbの目的ｃ
ＤＮＡ断片がｐＢＳＳＫ（＋）ベクターに挿入されてい
ることを確認することができる。

【００１２】該組換えプラスミド（ｐＢＳＨＲ−１，ｐ
ＢＳＨＲ−２）を、アルカリ法（T.Maniatis ら、前
出、1.38）に従って大量調製し、タック・ダイ・デオキ
シ・ターミネーター・サイクル・シークエンス・キット
（Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequence kit ）
〔アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystem
s）製〕を用いたジデオキシ法〔サンガー (F. Sanger)
ら、Proc. Natl. Acad. Sci.USA., 74, 5463(1977) 〕
によりヌクレオチドの塩基配列を決定し、目的とするヒ
トヒスタミンＨ₁ 受容体をコードするｃＤＮＡを同定す
ることができる。

【００１３】かくして得られる完全長のヒトヒスタミン
Ｈ₁ 受容体ｃＤＮＡの塩基配列およびそれから推定され
るヒトヒスタミンＨ₁ 受容体のアミノ酸配列を、後記配
列表の配列番号１に示す。この遺伝子は、配列番号１に
示される配列から明らかなとおり、４８７個のアミノ酸
をコードする１４６１塩基対より構成される。

【００１４】この遺伝子の特徴は、そのｃＤＮＡにつ
いては、ルヒエリニ（M. Lucherini）らの報告〔ブレイ
ン・リサーチ（Brain Research）, 592, 193(1992)〕な
どからヒスタミンＨ₁ 受容体タンパクの発現が予想され
る組織に由来している点、上記ヒトヒスタミンＨ₁ 受
容体ｃＤＮＡに由来するＤＮＡ断片とハイブリダイズす
るヒトゲノムＤＮＡ断片中には完全なオープンリーディ
ングフレーム（以下これを「ＯＲＦ」ということがあ
る）が存在し（配列番号２参照）、このＯＲＦ中の配列
は配列番号１に示す配列と一致する点、ゲノムＤＮＡ
のヒトヒスタミンＨ₁ 受容体をコードする塩基配列の対
応するアミノ酸配列は、既知のウシおよびラットヒスタ
ミンＨ₁ 受容体と相同性が高い点、既知のラットヒス
タミンＨ₁受容体と同様にゲノムＤＮＡのＯＲＦ中にイ
ントロンが含まれていない点、などである。

【００１５】上記した配列番号１に示される塩基配列を
包含する本発明のヒトヒスタミンＨ₁ 受容体遺伝子を含
むＤＮＡ断片は、ヒトグリオーマｃＤＮＡライブラリー
から分離されたヒトヒスタミンＨ₁ 受容体遺伝子を含む
ＤＮＡ断片のみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装
置、例えばApplied Biosystems社製モデル３９４を用い
て合成されたものであってもよい。

【００１６】また、前記の如くヒトグリオーマｃＤＮＡ
ライブラリーから得られる本発明のＤＮＡ断片は、ヒト
ヒスタミンＨ₁ 受容体をコードする機能を実質的に損な
うことがない限り、配列番号１に示される塩基配列の一
部の塩基が他の塩基で置換されるかまたは削除されてい
てもよく、あるいは新たに塩基が挿入されていてもよ
く、さらに塩基配列の一部が転位されているものであっ
てもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明のヒト
ヒスタミンＨ₁ 受容体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片に包含されるものである。

【００１７】次に、上記ヒトヒスタミンＨ₁ 受容体遺伝
子の多型の検出方法について述べる。先ず、末梢血など
の検体から、それ自体既知の通常用いられる方法によ
り、ヒトゲノムＤＮＡを分離する。次に、これを鋳型Ｄ
ＮＡとして、ヒトヒスタミンＨ₁ 受容体遺伝子内に存在
する変異点の上流部分に対して相補性を有するオリゴヌ
クレオチドおよび変異点の下流部分に対して相補性を有
するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、該遺
伝子内に存在する変異点を含むＤＮＡ領域を増幅する。
該増幅ＤＮＡ断片を適当な方法で解析することによりヒ
トヒスタミンＨ₁受容体遺伝子の多型を検出することが
できる。

【００１８】該増幅ＤＮＡ断片の解析方法には特に制限
はないが、変異点を認識する制限酵素で切断する方法、
ＳＳＣＰ（シングルストランド・コンホメイション・ポ
リモルフィズム）法〔オリタ（M. Orita) ら、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 86, 2766-2770, 1989 〕、ＲＮＡ
アーゼ・プロテクション法〔リボヌクレアーゼ・プロテ
クション・アッセイ・キット(Ribonuclease Protection
Assay Kit) 、アンビオン(Ambion)製〕、ＰＣＲ−ＳＳ
Ｏ（ピーシーアール、シークエンス・スペシフィク・オ
リゴヌクレオチド）法〔サイキ(R. K. Saiki) ら、Pro
c. Natl. Acad.Sci. USA, 86, 6230-6234, 1989 〕およ
び塩基配列の決定等が好適に用いられる。

【００１９】ここでヒトヒスタミンＨ₁ 受容体遺伝子内
に存在する変異点としては、後記配列表の配列番号２で
示される塩基配列中に存在する４８７個のアミノ酸をコ
ードする１４６１塩基対より構成されるＯＲＦ内の塩基
配列であって、該塩基配列に変異を有する塩基であれば
いかなる位置の塩基であってもよいが、好ましくは、後
記配列表の配列番号２に示される塩基配列の２３１５番
目の塩基Ｇを用いるのが適当である。

【００２０】この変異点の上流部分に対して相補性を有
するオリゴヌクレオチドおよび変異点の下流部分に対し
て相補性を有するオリゴヌクレオチドとしては、上記変
異点を挟むように設計された、配列番号１または配列番
号２のＯＲＦ配列の一部と相補性を有するオリゴヌクレ
オチドであれば、いかなるものであってもよい。このオ
リゴヌクレオチドは、配列番号１または２に示される配
列に基づいて容易に設計することができる。プライマー
として用いるオリゴヌクレオチドの具体例としては、例
えば、変異点の上流部分に対して相補性を有するオリゴ
ヌクレオチドとして、下記の配列： GTCTTGAAGT CACCATCCCA （配列番号４） また、変異点の下流部分に対して相補性を有するオリゴ
ヌクレオチドとして、下記の配列： GCGGTTCATG TGCAACCCAG （配列番号５） で示される塩基配列を有するプライマーを挙げることが
できる。

【００２１】上記したオリゴヌクレオチド（プライマ
ー）は、それ自体既知の通常用いられる核酸合成装置、
例えばApplied Biosystems製モデル３９４ＤＮＡ合成機
を用いる固相合成法で容易に行うことができる。

【００２２】前記変異点を含むＤＮＡ領域の増幅は、上
記プライマーを用いて、通常用いられるＰＣＲ法〔サイ
キ(Saiki) ら、サイエンス(Science) 239, 487-491(198
8)〕により容易に行うことができる。

【００２３】

【実施例】次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、下記の実施例は本発明について具体的な認
識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによっ
て本発明の範囲は何ら限定されるものではない。

【００２４】実施例１ ヒトヒスタミンＨ₁ 受容体遺伝
子のクローニング ヒトヒスタミンＨ₁ 受容体ＤＮＡを含むクローンを得る
ために、ヒトグリオーマｃＤＮＡライブラリー（λｇｔ
ｌｌ組換え体ファージ；東洋紡製）を用いた。λｇｔｌ
ｌ組換え体ファージ５×１０⁹ pfu を、大腸菌Ｙ１０９
０株〔ストラタジーン(STRATAGENE)製〕の一晩培養液
〔ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、
０．８％ＮａＣｌ）＋０．２％マルトース、１０mMＭｇ
ＳＯ₄ 〕２００μl に加え、３７℃で１５分間反応させ
た後、７．５mlのＬＢ軟寒天培地（ＬＢ培地＋０．７％
アガロース）とともに直径１５０mmのＬＢプレート（Ｌ
Ｂ培地＋１．５％寒天）３０枚にまいた。これらのプレ
ートを３７℃で５〜６時間培養し、プラークを形成させ
た後、４℃で放置した。組換え体ファージをナイロンメ
ンブレン〔バイオダインＢＮＮＧ１３７、ポール・バイ
オ・サポート・ディビジョン（Pall Bio Support Divis
ion)製〕に移し、アルカリ変性液（０．５N ＮａＯＨ、
１M ＮａＣｌ）を浸した３ＭＭろ紙〔ワットマン（What
man)製〕上に１分間置き、さらに中和液（０．５M Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、pH７．５、１．５M ＮａＣｌ）を浸した
ろ紙上に５分間静置した。２×ＳＳＣ溶液（０．３M Ｎ
ａＣｌ、０．０３M クエン酸三ナトリウム）でメンブレ
ンを洗い、ＵＶ照射することによりファージＤＮＡをメ
ンブレンに固定した。そのメンブレンを、α−³²Ｐ放射
性同位元素で標識した合成オリゴヌクレオチド（比活性
≧１０⁷ cpm/μg ）をプローブに用いてスクリーニング
した〔ベントン（W. Benton)ら、Science, 196, 383(19
77) 〕。

【００２５】プローブとしてはヤマシタらにより報告さ
れた（前出）ウシヒスタミンＨ₁ 受容体ｃＤＮＡのアミ
ノ酸配列の２５３番目のグリシンから２７８番目のリジ
ンに対応するＤＮＡ 5'-GGGAAGGAGTCCCCCTGGGAGGTTCTGA
AAAGGAAGCCAA-3' （配列番号３）を選び、これを自動Ｄ
ＮＡ合成機（モデル３９４、Applied Biosystems製）を
用いて合成し、合成ＤＮＡ鎖（３０pmol）を５０mMＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１０mMＭｇＣｌ₂ 、５mMジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）、１００μCi〔γ−³²Ｐ〕
ＡＴＰ（３０００Ci/mmol 、アマシャム製）および１０
単位のＴ４ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造
製）を含有する溶液５０μl 中で、３７℃で１時間処理
することにより、５´末端をリン酸化した。６×ＳＳ
Ｃ、１×デンハルト溶液（０．０２％ウシ血清アルブミ
ン、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロ
リドン）、０．０５％ＳＤＳ、２００μg/ml酵母ＲＮＡ
および１０⁶ cpm/mlプローブＤＮＡを含む溶液を用い、
４２℃で２０時間メンブレンのハイブリダイゼーション
を行った。そのメンブレンを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓで室温〜４５℃で洗浄し、Ｘ線フィルム〔ＸＡＲ−
５、コダック(Kodak) 製〕に−８０℃で１２時間露光さ
せた。

【００２６】現像後、陽性のシグナルを与えたプラーク
６個をパスツールピペットの先端でかき取り、１mlのＳ
Ｍ液（５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．５、８mMＭｇＳ
Ｏ₄）に懸濁し、４℃で一晩静置した。懸濁液をＳＭ液
で１０⁵ 倍希釈し、そのうち１００μl を前述の方法で
大腸菌Ｙ１０９０株に感染させ、ＬＢプレート上にまき
プラークを形成させた。形成されたプラークで再度上記
のようにプラークハイブリダイゼーションを行い、単一
プラークから成る陽性クローンを得た。

【００２７】陽性クローンをパスツールピペットの先で
かき取り、１mlのＳＭ液に懸濁し、１０⁵ pfu を同様に
して大腸菌Ｙ１０９０株に感染させ、ＬＢプレート４枚
にまき３７℃で７〜８時間培養を行った。プラーク形成
後、各プレートにＳＭ液８mlとクロロホルム１滴を入
れ、４℃で５時間放置した。この間、時々緩やかに振と
うを行った。ファージが溶出されたＳＭ液を回収し、室
温で３０００rpm で２０分間遠心し、上清を得た。この
上清に１μg/μl ＤＮａｓｅＩ〔ベーリンガー・マンハ
イム・バイオケミカ（Boehringer Mannheim Biochemic
a）製〕と１μg/μl ＲＮａｓｅＡ〔シグマ（Sigma)
製〕を各々８μl ずつ加え、３７℃で３０分間反応させ
た。等量の２０％ポリエチレングリコール、２M ＮａＣ
ｌ溶液を加え、よく混ぜてから氷中に１時間放置した。

【００２８】４℃で３０００rpm で２０分間遠心し、上
清を除いた。沈殿物を６００μl のＳＭ液に溶かし、１
０％ＳＤＳ６μl と２５０mMＥＤＴＡ・２Ｎａ（pH８．
０）１２μl を加え、６８℃で１５分間保温した。等量
のフェノールとフェノール／クロロホルム（１：１) で
抽出を行った後、等量のイソプロパノールによりファー
ジＤＮＡの沈殿を得た。これを５０μl ＴＥ緩衝液（１
０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１mMＥＤＴＡ・２Ｎａ、pH８．
０）に溶解させた。

【００２９】得られた溶液５μl に、２μl の１０倍濃
度のＥｃｏＲＩ緩衝液（０．５M ＮａＣｌ、１M Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、 pH ７．５、７０mMＭｇＣｌ₂ ）および１
μl（１０単位）のＥｃｏＲＩ（Boehringer Mannheim B
iochemica製）を加え、全量２０μl の系で３７℃で２
時間反応させた。反応後、０．７％アガロースゲル電気
泳動を行い、サザンブロット法〔サザン（E. Souther
n)、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（J. Mol. Biol. ）, 98, 503(1975) 〕に従ってＤＮＡ
をナイロンメンブレン（バイオダインＢ ＢＮＢＺＦ３
ＲＴ、Pall Bio Support Division 製）にブロッティン
グした。ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチ
ドを用いて、プラークハイブリダイゼーションと同一の
条件で行った。こうして得られたクローンは、約１．７
kbのＥｃｏＲＩ断片を有していた。

【００３０】このファージＤＮＡ１０ngを鋳型として、
１×緩衝液（１０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８．３、１．
５mMＭｇＣｌ₂ 、５０mMＫＣｌ、０．０１％ゼラチン）
中で０．２mMｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ）および２５pmolの各プライマー、０．６
μl （３単位）のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Boehring
er Mannheim Biochemica製）を用いて、挿入ＤＮＡ断片
の増幅を全量１００μl の系で行った。プライマーは、
λｇｔｌｌベクターのＥｃｏＲＩ認識部位外側のアーム
部にアニールするフォワード(forward) およびリバース
(reverse) の両プライマー（ニッポンジーン製）を用い
た。増幅反応は、変性（９４℃、１分間）、アニーリン
グ（５５℃、１分間）、伸長（７２℃、１分間）の順序
で行い、これを３０サイクル繰り返した。

【００３１】増幅産物を、アガロースゲル電気泳動ゲル
から目的のＤＮＡ断片（１．９kb）を切出し、ＤＮＡ回
収フィルター（SUPREC-01 、宝酒造製）を用いることに
より精製した。回収したＤＮＡ断片５００ngを、５mMＡ
ＴＰおよび１×緩衝液〔５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ(pH
７．５) 、１０mMＭｇＣｌ₂ 、５mMＤＴＴ〕中で、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）１０単位によ
り、全量５０μl の系で３７℃で１時間処理し、５´末
端のリン酸化を行った。この反応液を等量のフェノール
／クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈殿し
た後、１×緩衝液〔１０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ(pH ８．
０) 、７mMＭｇＣｌ₂ 、７mMメルカプトエタノール、
０．０１％ＢＳＡ〕中、３単位のＳａｃＩ（Boehringer
Mannheim Biochemica 製）で３７℃で１時間消化し、
２種のＤＮＡ断片（０．９kbおよび１．０kb）を得た。
これを分離回収せずに、ＤＮＡライゲーションキットを
用いて、制限酵素ＳａｃＩとＥｃｏＲＶで二重消化した
ｐＢＳＳＫ（＋）ベクター（１００ng）に各々連結し
た。この反応液４５μl を、感受性大腸菌ＨＢ１０１株
（宝酒造製）を次のとおり形質転換するのに用いた。

【００３２】感受性大腸菌液２０μl と、２×ＴＣＭ液
〔２０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）、２０mMＣａＣ
ｌ₂ 、２０mMＭｇＣｌ₂ 〕で２倍希釈した前記ＤＮＡラ
イゲーション反応液とを混ぜ合せ、氷中に２５分間静置
した。３７℃で３分間保温し氷中に９０秒間放置した
後、１mlのＬＢ培地を加え、３７℃で３０分間保温し
た。これをＬＢプレート（５０μg/mlアンピシリンを含
む）上に塗布し、３７℃で一晩保温した。

【００３３】プレート上に生じたコロニーを５０μg/ml
アンピシリンを含むＬＢ培地１．５mlに植菌し、一晩培
養した。この培養液を遠心して集菌し、プラスミドの少
量調製を常法（T. Maniatis ら、前出、1.25）により行
った。得られたプラスミドＤＮＡ１００ngを、１単位の
制限酵素ＳａｃＩとＡｐａＩ（Boehringer MannheimBio
chemica製）で二重消化し、アガロースゲル電気泳動に
より０．９kbおよび１．０kbのｃＤＮＡ断片が各々ｐＢ
ＳＳＫ（＋）ベクターに挿入されていることを確かめ
た。ｐＢＳＳＫ（＋）ベクターに０．９kbのｃＤＮＡ断
片が挿入されたプラスミドをｐＢＳＨＲ−１、１．０kb
のｃＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドをｐＢＳＨＲ−
２とそれぞれ命名した。これら組換えプラスミドの構築
方法を図１に示す。

【００３４】この組換えプラスミドをアルカリ法（T. M
aniatis ら、前出、1.38）に従って大量調製し、タック
・ダイ・デオキシ・ターミネーター・サイクル・シーク
エンス・キット（Applied Biosystems製）を用いたジデ
オキシ法（F. Sanger ら、前出）によりヌクレオチドの
塩基配列を決定し、目的とするヒトヒスタミンＨ₁ 受容
体をコードするｃＤＮＡを同定した。この遺伝子は、後
記配列表の配列番号１に示されるとおり４８７個のアミ
ノ酸をコードする１４６１塩基対より構成されることが
判明した。

【００３５】実施例２ ヒトヒスタミンＨ₁ 受容体を含
むゲノム遺伝子のクローニング 単離されたヒトヒスタミンＨ₁ 受容体ｃＤＮＡを制限酵
素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで二重消化して得られる１．０
kbのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離回
収し、これをプローブとして用いて、ヒトゲノム遺伝子
ライブラリーよりヒトヒスタミンＨ₁ 受容体遺伝子をク
ローニングした。ヒトゲノム遺伝子ライブラリーは、以
下に示した方法で正常人末梢血より調製した。

【００３６】先ず、採血した血液に対し３倍量のＡ液
（１５５mMＮＨ₄ Ｃｌ、１０mMＫＨＣＯ₃ 、１００mMＥ
ＤＴＡ・２Ｎａ、pH７．４）を混ぜ合わせ、氷中に１５
分間放置した後、４℃で１０００rpm で１０分間遠心し
た。上清を除き、Ｂ液（１００mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１
０mMＥＤＴＡ・２Ｎａ、８mM尿素、１％ＳＤＳ、pH７．
０）を加えて３０分間緩やかに転倒混和した。フェノー
ルとフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出後、ゲ
ノムＤＮＡをエタノール沈殿した。

【００３７】得られたゲノムＤＮＡ１００μg を、緩衝
液〔１００mMＮａＣｌ、１００mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ(pH
７．５) 、７mMＭｇＣｌ₂ 〕中、３７℃で１単位の制限
酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Boehringer Mannheim Biochemica
製）で経時的に部分消化し、常法(T. Maniatisら、前
出、9.24) に従ってショ糖密度勾配超遠心を行い、５０
kb前後のサイズの消化ＤＮＡ断片を分画した。エタノー
ル沈殿により回収したＤＮＡ１μg を、３単位のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（宝酒造製）を用いて、１μg のｐＷＥ１
５コスミドベクター（STRATAGENE製）のＢａｍＨＩ認識
部位に連結した。

【００３８】ギガパックII・パッケージング・エクスト
ラクト（GIGAPACK II PACKAGINGEXTRACT；STRATAGENE
製）を用いて上記組換えＤＮＡのパッケージングを行っ
た後、その一部を、ＴＢ培地（純水１リットル中、バク
トトリプトン１０g 、ＮａＣｌ５g 、１０mMＭｇＳＯ
₄ 、０．２％マルトース）で一晩培養した大腸菌ＮＭ５
５４株(STRATAGENE 製）に感染させ、ＮＺＹ〔ディフコ
（Difco ）製〕寒天培地上にまき、３７℃で一晩培養し
た。タイターの測定を行った後、同様にして５０枚のプ
レート（１５０mm）に３×１０⁵ 個のコロニーをつくら
せ、常法(T. Maniatisら、前出、1.90) に従い、上記ヒ
トヒスタミンＨ₁ 受容体ｃＤＮＡから得た大きさ１．０
kbのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片をプローブとして用い
て、コロニーハイブリダイゼーションによるスクリーニ
ングを行った。

【００３９】得られた陽性クローン１個を分離し、コス
ミドの少量調製を常法(T. Maniatisら、前出、1.25) に
従って実施した。得られたコスミドＤＮＡ（２００ng)
を、緩衝液〔５０mMＮａＣｌ、１００mMＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ(pH ７．５) 、７mMＭｇＣｌ₂ 〕中、１単位の制限酵
素ＥｃｏＲＩで消化し、実施例1 と同様にサザンブロッ
ト法により目的のＤＮＡの挿入を確認した。

【００４０】この挿入ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで消化
し、５kbのＰｓｔＩ断片を分離精製し、その５００ngを
ＤＮＡライゲーションキットを用いて制限酵素ＰｓｔＩ
で消化したｐＢＳＫ（＋）ベクター１００ngに連結し
た。この連結反応物を用いて、実施例１と同様に感受性
大腸菌ＨＢ１０１株（宝酒造製）を形質転換させ、形質
転換体の単離、確認を行った。得られたクローンが保有
する、ｐＢＳＫ（＋）ベクターに５kbのＰｓｔＩ断片が
挿入されたプラスミドを、ｐＨＲＰＰと命名した。この
プラスミドｐＨＲＰＰの構成およびヒトヒスタミンＨ₁
受容体遺伝子を含むヒトゲノムＤＮＡの制限酵素切断点
地図を図２に示す。

【００４１】次に、プラスミドｐＨＲＰＰに挿入された
５kbのＰｓｔＩ断片のうち、ヒトヒスタミンＨ₁ 受容体
遺伝子を含むと考えられる３．３kbの範囲の塩基配列
を、ジデオキシ法により決定した。その配列を、後記配
列表の配列番号２に示す。その配列中には、４８７個の
アミノ酸をコードする１４６１塩基対より成る一個のオ
ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在してお
り、このＯＲＦ中の配列は、実施例１でヒトグリオーマ
ｃＤＮＡライブラリーから得られたヒトヒスタミンＨ₁
受容体遺伝子の配列と同一であった。

【００４２】実施例３ ヒトヒスタミンＨ₁ 受容体遺伝
子中に存在する多型の検出 現在、多型を利用したリスクファクターの評価が種々の
遺伝子について行われている。本発明のヒトヒスタミン
Ｈ₁ 受容体遺伝子においても、配列番号２に示す配列の
２３１５番目の塩基（Ｇ）にアミノ酸置換をもたらす変
異が存在することが、該遺伝子の解析によって明らかと
なった。すなわち、配列番号２の２３１５番目の塩基：
ＧがＣに置換することにより、コードされる３４９番目
のアミノ酸がＡｓｐからＨｉｓに変換され、２３１５〜
２３１８番目の塩基配列（ＧＡＴＣ）を認識する制限酵
素Ｓａｕ３ＡＩ部位が消失する。以下、２３１５番目の
塩基がＧである遺伝子をアリル１、２３１５番目の塩基
がＧからＡに置換し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ部位が消失
した遺伝子をアリル２ということがある。

【００４３】次に、上記ヒトヒスタミンＨ₁ 受容体遺伝
子の多型の検出法を述べる。実施例２と同様の方法でヒ
トゲノムＤＮＡを分離し、これを鋳型ＤＮＡとして、配
列番号２の２３１５〜２３１８番目の塩基配列（ＧＡＴ
Ｃ；Ｓａｕ３ＡＩ部位）を含む４１４bpのＤＮＡをＰＣ
Ｒ法（Saiki ら、前出）で増幅した。

【００４４】ＤＮＡの増幅は、上記Ｓａｕ３ＡＩ部位を
挟むように設計した２種の化学合成したプライマー：プ
ライマー１（配列番号２の２０８４〜２１０３番目の配
列の相補鎖に対して相補性を有する塩基配列）、即ち5'
-GTCTTGAAGTCACCATCCCA-3'（配列番号４）、およびプラ
イマー２（配列番号２の２４７８〜２４９７番目の配列
に対して相補性を有する塩基配列）、即ち5'-GCGGTTCAT
GTGCAACCCAG-3'（配列番号５）を用いて、１×緩衝液
（１０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８．３、１．５mMＭｇＣ
ｌ₂ 、５０mMＫＣｌ、０．０１％ゼラチン）中で０．２
mMｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ）、２５pmolの各プライマー、０．６μl （３単位）
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Boehringer Mannheim Bioch
emica 製）を含む最終液量１００μl の系で、変性（９
４℃、１分間）、アニーリング（５５℃、１分間）、伸
長（７２℃、１分間）を３０サイクル繰り返した。

【００４５】大きさが４１４bpの得られた増幅ＤＮＡ断
片を制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで切断し、３％アガロースゲ
ル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、得られた切断Ｄ
ＮＡ断片の数からヒトヒスタミンＨ₁ 受容体遺伝子の多
型の存在を検出した。その結果を図３に示す。図中、レ
ーン２はアリル１のみを相同染色体にもつ正常人由来の
増幅ＤＮＡについて、レーン３はアリル１およびアリル
２の両方をもつ正常人由来の増幅ＤＮＡについての、そ
れぞれＳａｕ３ＡＩによる切断断片のアガロースゲル電
気泳動パターンである。２３２bpおよび１８２bpのバン
ドはアリル１由来のＳａｕ３ＡＩ切断断片を、４１４bp
のバンドはアリル２由来の未切断断片を示す。レーン１
は分子量マーカーとして用いたΦＸ１７４ＤＮＡの制限
酵素ＨａｅIII による切断断片のアガロースゲル電気泳
動パターンである。

【００４６】上記した方法で血縁関係のない２０人につ
いてヒスタミンＨ₁ 受容体遺伝子の多型を検査した結
果、その検出頻度はアリル１が９２％、アリル２が８％
であった。

【配列表】

【００４７】配列番号： 1 配列の長さ：1462 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト 細胞の種類：グリオーマ 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1461 特徴を決定した方法：E 配列 ATG AGC CTC CCC AAT TCC TCC TGC CTC TTA GAA GAC AAG ATG TGT GAG 48 Met Ser Leu Pro Asn Ser Ser Cys Leu Leu Glu Asp Lys Met Cys Glu 1 5 10 15 GC AAC AAG ACC ACT ATG GCC AGC CCC CAG CTG ATG CCC CTG GTG GTG 96 Gly Asn Lys Thr Thr Met Ala Ser Pro Gln Leu Met Pro Leu Val Val 20 25 30 GTC CTG AGC ACT ATC TGC TTG GTC ACA GTA GGG CTC AAC CTG CTG GTG 144 Val Leu Ser Thr Ile Cys Leu Val Thr Val Gly Leu Asn Leu Leu Val 35 40 45 CTG TAT GCC GTA CGG AGT GAG CGG AAG CTC CAC ACT GTG GGG AAC CTG 192 Leu Tyr Ala Val Arg Ser Glu Arg Lys Leu His Thr Val Gly Asn Leu 50 55 60 TAC ATC GTC AGC CTC TCG GTG GCG GAC TTG ATC GTG GGT GCC GTC GTC 240 Tyr Ile Val Ser Leu Ser Val Ala Asp Leu Ile Val Gly Ala Val Val 65 70 75 80 ATG CCT ATG AAC ATC CTC TAC CTG CTC ATG TCC AAG TGG TCA CTG GGC 288 Met Pro Met Asn Ile Leu Tyr Leu Leu Met Ser Lys Trp Ser Leu Gly 85 90 95 CGT CCT CTC TGC CTC TTT TGG CTT TCC ATG GAC TAT GTG GCC AGC ACA 336 Arg Pro Leu Cys Leu Phe Trp Leu Ser Met Asp Tyr Val Ala Ser Thr 100 105 110 GCG TCC ATT TTC AGT GTC TTC ATC CTG TGC ATT GAT CGC TAC CGC TCT 384 Ala Ser Ile Phe Ser Val Phe Ile Leu Cys Ile Asp Arg Tyr Arg Ser 115 120 125 GTC CAG CAG CCC CTC AGG TAC CTT AAG TAT CGT ACC AAG ACC CGA GCC 432 Val Gln Gln Pro Leu Arg Tyr Leu Lys Tyr Arg Thr Lys Thr Arg Ala 130 135 140 TCG GCC ACC ATT CTG GGG GCC TGG TTT CTC TCT TTT CTG TGG GTT ATT 480 Ser Ala Thr Ile Leu Gly Ala Trp Phe Leu Ser Phe Leu Trp Val Ile 145 150 155 160 CCC ATT CTA GGC TGG AAT CAC TTC ATG CAG CAG ACC TCG GTG CGC CGA 528 Pro Ile Leu Gly Trp Asn His Phe Met Gln Gln Thr Ser Val Arg Arg 165 170 175 GAG GAC AAG TGT GAG ACA GAC TTC TAT GAT GTC ACC TGG TTC AAG GTC 576 Glu Asp Lys Cys Glu Thr Asp Phe Tyr Asp Val Thr Trp Phe Lys Val 180 185 190 ATG ACT GCC ATC ATC AAC TTC TAC CTG CCC ACC TTG CTC ATG CTC TGG 624 Met Thr Ala Ile Ile Asn Phe Tyr Leu Pro Thr Leu Leu Met Leu Trp 195 200 205 TTC TAT GCC AAG ATC TAC AAG GGC GTA CGA CAA CAC TGC CAG CAC CGG 672 Phe Tyr Ala Lys Ile Tyr Lys Gly Val Arg Gln His Cys Gln His Arg 210 215 220 GAG CTC ATC AAT AGG TCC CTC CCT TCC TTC TCA GAA ATT AAG CTG AGG 720 Glu Leu Ile Asn Arg Ser Leu Pro Ser Phe Ser Glu Ile Lys Leu Arg 225 230 235 240 CCA GAG AAC CCC AAG GGG GAT GCC AAG AAA CCA GGG AAG GAG TCT CCC 768 Pro Glu Asn Pro Lys Gly Asp Ala Lys Lys Pro Gly Lys Glu Ser Pro 245 250 255 TGG GAG GTT CTG AAA AGG AAG CCA AAA GAT GCT GGT GGT GGA TCT GTC 816 Trp Glu Val Leu Lys Arg Lys Pro Lys Asp Ala Gly Gly Gly Ser Val 260 265 270 TTG AAG TCA CCA TCC CAA ACC CCC AAG GAG ATG AAA TCC CCA GTT GTC 864 Leu Lys Ser Pro Ser Gln Thr Pro Lys Glu Met Lys Ser Pro Val Val 275 280 285 TTC AGC CAA GAG GAT GAT AGA GAA GTA GAC AAA CTC TAC TGC TTT CCA 912 Phe Ser Gln Glu Asp Asp Arg Glu Val Asp Lys Leu Tyr Cys Phe Pro 290 295 300 CTT GAT ATT GTG CAC ATG CAG GCT GCG GCA GAG GGG AGT AGC AGG GAC 960 Leu Asp Ile Val His Met Gln Ala Ala Ala Glu Gly Ser Ser Arg Asp 305 310 315 320 TAT GTA GCC GTC AAC CGG AGC CAT GGC CAG CTC AAG ACA GAT GAG CAG 1008 Tyr Val Ala Val Asn Arg Ser His Gly Gln Leu Lys Thr Asp Glu Gln 325 330 335 GGC CTG AAC ACA CAT GGG GCC AGC GAG ATA TCA GAG GAT CAG ATG TTA 1056 Gly Leu Asn Thr His Gly Ala Ser Glu Ile Ser Glu Asp Gln Met Leu 340 345 350 GGT GAT AGC CAA TCC TTC TCT CGA ACG GAC TCA GAT ACC ACC ACA GAG 1104 Gly Asp Ser Gln Ser Phe Ser Arg Thr Asp Ser Asp Thr Thr Thr Glu 355 360 365 ACA GCA CCA GGC AAA GGC AAA TTG AGG AGT GGG TCT AAC ACA GGC CTG 1152 Thr Ala Pro Gly Lys Gly Lys Leu Arg Ser Gly Ser Asn Thr Gly Leu 370 375 380 GAT TAC ATC AAG TTT ACT TGG AAG AGG CTC CGC TCG CAT TCA AGA CAG 1200 Asp Tyr Ile Lys Phe Thr Trp Lys Arg Leu Arg Ser His Ser Arg Gln 385 390 395 400 TAT GTA TCT GGG TTG CAC ATG AAC CGC GAA AGG AAG GCC GCC AAA CAG 1248 Tyr Val Ser Gly Leu His Met Asn Arg Glu Arg Lys Ala Ala Lys Gln 405 410 415 TTG GGT TTT ATC ATG GCA GCC TTC ATC CTC TGC TGG ATC CCT TAT TTC 1296 Leu Gly Phe Ile Met Ala Ala Phe Ile Leu Cys Trp Ile Pro Tyr Phe 420 425 430 ATC TTC TTC ATG GTC ATT GCC TTC TGC AAG AAC TGT TGC AAT GAA CAT 1344 Ile Phe Phe Met Val Ile Ala Phe Cys Lys Asn Cys Cys Asn Glu His 435 440 445 TTG CAC ATG TTC ACC ATC TGG CTG GGC TAC ATC AAC TCC ACA CTG AAC 1392 Leu His Met Phe Thr Ile Trp Leu Gly Tyr Ile Asn Ser Thr Leu Asn 450 455 460 CCC CTC ATC TAC CCC TTG TGC AAT GAG AAC TTC AAG AAG ACA TTC AAG 1440 Pro Leu Ile Tyr Pro Leu Cys Asn Glu Asn Phe Lys Lys Thr Phe Lys 465 470 475 480 AGA ATT CTG CAT ATT CGC TCC 1461 Arg Ile Leu His Ile Arg Ser 485

【００４８】配列番号：２ 配列の長さ:3252 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1271..2731 特徴を決定した方法：E 配列 CTGCAGCCTC CTGAGTAGCT AGGACTATAG GTGTATTATA GGACAATTTT TAAAAAATTT 60 CATTGTAAAG ACAGGATTCC ACTGTGTTGC CCAGGCTGCA AGTCTTGGCC TCAAGTGATC 120 ATTCCACCTT TAACTCTTGC CCTCAAGCAG TCCTCCCACC TCAGACTCCC AAAATGCTGG 180 GATTATGGGT GTGAGCCACC ATTTCCAGCC TACTAGCAAG GGTCTTGTTA CATATTACTT 240 GGCATGATTT ATGTAATTTA AAAAAATTGT TTGTTTTTCA AATAGAGAAG TAAAATAACG 300 AATATGCTTT TCCAATAACA TAATCCCCTT CTCACTTGAG AATTTTCCTC TAAAAAGATA 360 TGCTAGATTT ATTTCATGCT TTATGTGCCT CTGGTGTGTC CCCTTATAAC CTCCTCCATA 420 TCATTTAGGG ATGGTCTCAG CTGCAAGTAA GAACTGCCAC AACAGTGATG TAAGCCAAAA 480 AAAAAAAAAA AAAAAAGGCA AGGCCAGGCA AAACAAAGCC CATTTAATTA TTTCCCATAA 540 TAATAAGTCT GGGAGAAGAA GATTCCAGAG TTGGCTCAGC AGCTTAGTGA CAGAAAGGCC 600 CTAGGCTGGC ATTTTCTTGG CCTTCCCGAT GGTCCCAAGA TGACTCCCAT GGCCTCAAAC 660 ATCACTTCCT CACATCCTGT CAGGGAGAAA GAGGCAAGTG AGCAACAACA ATTTTTGTTG 720 TTTTGATCAT TTGTCAGAGA GGAAGAACGT TCCTAAAAAC TCCGCCTCTG CTGTTTGACA 780 TCCTCATCCT ATTCCTTGGC CATGGTGGTA TCTCATGGTC ACTCCTCTAT CTGCCACTGT 840 AAAGAGGAAC TGGATTGCTA TATTCTGCTT AGACACATGA GGATGCAGCC CACCTTCCCA 900 GAACATGTGC GGAATTAGAT TTCTACAAAC ACATTTGTCT TGCTTCTGCC CAACTCTCTC 960 ACTAGAATGC ACATTCCATA GGGGCAAACA TTTTTGTCTA TTTTGTTCAC AGCTATATTC 1020 TCAACACCTA GAAGAGTGAC AGAAATTCAA TAAATAGTTG TTAAGTGAGC AAATGAATGC 1080 ATGAATAAGG AAAAGGGTAC ATGGCTATTG AGTAGGTAAC CAGCAGTGTT GATCACCCCC 1140 AACAGCATAC AACTCCAGTC TGATGAACAT CATGCTACTA AGTGGCCACT CATCACCCAA 1200 GTCTCTGACC TTACTTTTTC TCTCTTTTCT CCCAGGGAGT GAGCCATAAC TGGCGGCTGC 1260 TCTTGCGCCA ATG AGC CTC CCC AAT TCC TCC TGC CTC TTA GAA GAC 1306 Met Ser Leu Pro Asn Ser Ser Cys Leu Leu Glu Asp 1 5 10 AAG ATG TGT GAG GGC AAC AAG ACC ACT ATG GCC AGC CCC CAG CTG ATG 1354 Lys Met Cys Glu Gly Asn Lys Thr Thr Met Ala Ser Pro Gln Leu Met 15 20 25 CCC CTG GTG GTG GTC CTG AGC ACT ATC TGC TTG GTC ACA GTA GGG CTC 1402 Pro Leu Val Val Val Leu Ser Thr Ile Cys Leu Val Thr Val Gly Leu 30 35 40 AAC CTG CTG GTG CTG TAT GCC GTA CGG AGT GAG CGG AAG CTC CAC ACT 1450 Asn Leu Leu Val Leu Tyr Ala Val Arg Ser Glu Arg Lys Leu His Thr 45 50 55 60 GTG GGG AAC CTG TAC ATC GTC AGC CTC TCG GTG GCG GAC TTG ATC GTG 1498 Val Gly Asn Leu Tyr Ile Val Ser Leu Ser Val Ala Asp Leu Ile Val 65 70 75 GGT GCC GTC GTC ATG CCT ATG AAC ATC CTC TAC CTG CTC ATG TCC AAG 1546 Gly Ala Val Val Met Pro Met Asn Ile Leu Tyr Leu Leu Met Ser Lys 80 85 90 TGG TCA CTG GGC CGT CCT CTC TGC CTC TTT TGG CTT TCC ATG GAC TAT 1594 Trp Ser Leu Gly Arg Pro Leu Cys Leu Phe Trp Leu Ser Met Asp Tyr 95 100 105 GTG GCC AGC ACA GCG TCC ATT TTC AGT GTC TTC ATC CTG TGC ATT GAT 1642 Val Ala Ser Thr Ala Ser Ile Phe Ser Val Phe Ile Leu Cys Ile Asp 110 115 120 CGC TAC CGC TCT GTC CAG CAG CCC CTC AGG TAC CTT AAG TAT CGT ACC 1690 Arg Tyr Arg Ser Val Gln Gln Pro Leu Arg Tyr Leu Lys Tyr Arg Thr 125 130 135 140 AAG ACC CGA GCC TCG GCC ACC ATT CTG GGG GCC TGG TTT CTC TCT TTT 1738 Lys Thr Arg Ala Ser Ala Thr Ile Leu Gly Ala Trp Phe Leu Ser Phe 145 150 155 CTG TGG GTT ATT CCC ATT CTA GGC TGG AAT CAC TTC ATG CAG CAG ACC 1786 Leu Trp Val Ile Pro Ile Leu Gly Trp Asn His Phe Met Gln Gln Thr 160 165 170 TCG GTG CGC CGA GAG GAC AAG TGT GAG ACA GAC TTC TAT GAT GTC ACC 1834 Ser Val Arg Arg Glu Asp Lys Cys Glu Thr Asp Phe Tyr Asp Val Thr 175 180 185 TGG TTC AAG GTC ATG ACT GCC ATC ATC AAC TTC TAC CTG CCC ACC TTG 1882 Trp Phe Lys Val Met Thr Ala Ile Ile Asn Phe Tyr Leu Pro Thr Leu 190 195 200 CTC ATG CTC TGG TTC TAT GCC AAG ATC TAC AAG GGC GTA CGA CAA CAC 1930 Leu Met Leu Trp Phe Tyr Ala Lys Ile Tyr Lys Gly Val Arg Gln His 205 210 215 220 TGC CAG CAC CGG GAG CTC ATC AAT AGG TCC CTC CCT TCC TTC TCA GAA 1978 Cys Gln His Arg Glu Leu Ile Asn Arg Ser Leu Pro Ser Phe Ser Glu 225 230 235 ATT AAG CTG AGG CCA GAG AAC CCC AAG GGG GAT GCC AAG AAA CCA GGG 2026 Ile Lys Leu Arg Pro Glu Asn Pro Lys Gly Asp Ala Lys Lys Pro Gly 240 245 250 AAG GAG TCT CCC TGG GAG GTT CTG AAA AGG AAG CCA AAA GAT GCT GGT 2074 Lys Glu Ser Pro Trp Glu Val Leu Lys Arg Lys Pro Lys Asp Ala Gly 255 260 265 GGT GGA TCT GTC TTG AAG TCA CCA TCC CAA ACC CCC AAG GAG ATG AAA 2122 Gly Gly Ser Val Leu Lys Ser Pro Ser Gln Thr Pro Lys Glu Met Lys 270 275 280 TCC CCA GTT GTC TTC AGC CAA GAG GAT GAT AGA GAA GTA GAC AAA CTC 2170 Ser Pro Val Val Phe Ser Gln Glu Asp Asp Arg Glu Val Asp Lys Leu 285 290 295 300 TAC TGC TTT CCA CTT GAT ATT GTG CAC ATG CAG GCT GCG GCA GAG GGG 2218 Tyr Cys Phe Pro Leu Asp Ile Val His Met Gln Ala Ala Ala Glu Gly 305 310 315 AGT AGC AGG GAC TAT GTA GCC GTC AAC CGG AGC CAT GGC CAG CTC AAG 2266 Ser Ser Arg Asp Tyr Val Ala Val Asn Arg Ser His Gly Gln Leu Lys 320 325 330 ACA GAT GAG CAG GGC CTG AAC ACA CAT GGG GCC AGC GAG ATA TCA GAG 2314 Thr Asp Glu Gln Gly Leu Asn Thr His Gly Ala Ser Glu Ile Ser Glu 335 340 345 GAT CAG ATG TTA GGT GAT AGC CAA TCC TTC TCT CGA ACG GAC TCA GAT 2362 Asp Gln Met Leu Gly Asp Ser Gln Ser Phe Ser Arg Thr Asp Ser Asp 350 355 360 ACC ACC ACA GAG ACA GCA CCA GGC AAA GGC AAA TTG AGG AGT GGG TCT 2410 Thr Thr Thr Glu Thr Ala Pro Gly Lys Gly Lys Leu Arg Ser Gly Ser 365 370 375 380 AAC ACA GGC CTG GAT TAC ATC AAG TTT ACT TGG AAG AGG CTC CGC TCG 2458 Asn Thr Gly Leu Asp Tyr Ile Lys Phe Thr Trp Lys Arg Leu Arg Ser 385 390 395 CAT TCA AGA CAG TAT GTA TCT GGG TTG CAC ATG AAC CGC GAA AGG AAG 2506 His Ser Arg Gln Tyr Val Ser Gly Leu His Met Asn Arg Glu Arg Lys 400 405 410 GCC GCC AAA CAG TTG GGT TTT ATC ATG GCA GCC TTC ATC CTC TGC TGG 2554 Ala Ala Lys Gln Leu Gly Phe Ile Met Ala Ala Phe Ile Leu Cys Trp 415 420 425 ATC CCT TAT TTC ATC TTC TTC ATG GTC ATT GCC TTC TGC AAG AAC TGT 2602 Ile Pro Tyr Phe Ile Phe Phe Met Val Ile Ala Phe Cys Lys Asn Cys 430 435 440 TGC AAT GAA CAT TTG CAC ATG TTC ACC ATC TGG CTG GGC TAC ATC AAC 2650 Cys Asn Glu His Leu His Met Phe Thr Ile Trp Leu Gly Tyr Ile Asn 445 450 455 460 TCC ACA CTG AAC CCC CTC ATC TAC CCC TTG TGC AAT GAG AAC TTC AAG 2698 Ser Thr Leu Asn Pro Leu Ile Tyr Pro Leu Cys Asn Glu Asn Phe Lys 465 470 475 AAG ACA TTC AAG AGA ATT CTG CAT ATT CGC TCC TAAGGG AGGCTCTGAG 2747 Lys Thr Phe Lys Arg Ile Leu His Ile Arg Ser *** 480 485 GGGATGCAAC AAAATGATCC TTATGATGTC CAACAAGGAA ATAGAGGACG AAGGCCTGTG 2807 TGTTGCCAGG CAGGCACCTG GGCTTTCTGG AATCCAAACC ACAGTCTTAG GGGCTTGGTA 2867 GTTTGGAAAG TTCTTAGGCA CCATAGAAGA ACAGCAGATG GCGGTGATCA GCAGAGAGAT 2927 TGAACTTTGA GGAGGAAGCA GAATCTTTGC AAGAAAGTCA GACCTGTTTC TTGTAACTGG 2987 GTTCAAAAAG AAAAAAATAA TAAAAATAAA AGAGAGAGAG AATCAGACCT GGGTGGAACT 3047 CTCCTGCTCC TCAGGAACTA TGGGAGCCTC AGACTCATTG TAATTCAAGC TTTCCGAGTC 3107 AAGTGATTGA CAACTGAAGA GACACGTGGC TAGGGTTCCA CTGGAGAATT GAAAAGGACT 3167 CTTGAGCCCT CCTGGAATGG AGCTGTATAA CTGTGCAGAG ACTTTATCCA TGCCAATAGT 3227 TGCTGTCCCC TTCCAGGGGT CACCT 3252

【００４９】配列番号：３ 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGAAGGAGT CCCCCTGGGA GGTTCTGAAA AGGAAGCCAA 40

【００５０】配列番号：４ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTCTTGAAGT CACCATCCCA 20

【００５１】配列番号：５ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類: 他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCGGTTCATG TGCAACCCAG 20

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＢＳＨＲ−１およびｐＢＳＨＲ−
２の構築方法の概略図である。

【図２】プラスミドｐＨＲＰＰの構成図および本発明の
ヒトヒスタミンＨ₁ 受容体遺伝子を含むヒトゲノムＤＮ
Ａの制限酵素切断点地図である。

【図３】ヒトヒスタミンＨ₁ 受容体遺伝子の多型分析結
果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 林 智子 東京都板橋区志村３−30−１ 株式会社三 菱油化ビーシーエル内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１の塩基配列またはア
   ミノ酸配列で示されるヒスタミンＨ₁ 受容体をコードす
   る遺伝子を含むＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 ヒトヒスタミンＨ₁ 受容体遺伝子内に存
   在する変異点の上流部分に対して相補性を有するオリゴ
   ヌクレオチドおよび変異点の下流部分に対して相補性を
   有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、
   該遺伝子内に存在する変異点を含むＤＮＡ領域を増幅
   し、該増幅ＤＮＡを解析することを特徴とするヒトヒス
   タミンＨ₁ 受容体遺伝子の多型の検出法。
3. 【請求項３】 ヒトヒスタミンＨ₁ 受容体遺伝子内の変
   異点の上流部分に対して相補性を有するオリゴヌクレオ
   チドが、次の配列： GTCTTGAAGT CACCATCCCA （配列番号４） で示される塩基配列を有し、該遺伝子の下流部分に対し
   て相補性を有するオリゴヌクレオチドが、次の配列： GCGGTTCATG TGCAACCCAG （配列番号５） で示される塩基配列を有し、かつ増幅ＤＮＡの解析が制
   限酵素Ｓａｕ３ＡＩ切断である請求項２記載の方法。