JPH0733680A - 免疫抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 下記の (ａ) 、（ｂ）及び (ｃ) の３つのモ
ノクローナル抗体を有効成分として含有する免疫抑制
剤。 (ａ) ヒトＴ細胞表面抗原ＣＤ２に反応性を有するモノ
クローナル抗体 (ｂ) ヒトＴ細胞表面抗原ＣＤ４に反応性を有するモノ
クローナル抗体 (ｃ) ヒトＴ細胞表面抗原ＣＤ８に反応性を有するモノ
クローナル抗体 【効果】 本発明の抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、抗Ｃ
Ｄ８抗体３種類の組み合わせからなる免疫抑制剤は、そ
れが単独或いは２つの組み合わせによる場合に較べ顕著
な免疫抑制効果があり、又特にいずれか１つの抗体が単
独ではＴ細胞増殖活性という好ましくない性質を有する
場合に相乗作用によりそれが抑えられるものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、複数のモノクローナル
抗体を有効成分とする免疫抑制剤に関する。更に詳しく
は、ヒトＴ細胞の表面抗原であるＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ
８に対しそれぞれ特異的に反応する３種のモノクローナ
ル抗体を有効成分として含む免疫抑制剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、臓器移植技術の進歩とともに移植
時に起こる免疫拒絶反応に対する様々な抑制剤が開発さ
れ移植例数の増加にともないその需要を伸ばし、更に異
種動物との移植などその多様性が広がるなかで、完全な
免疫抑制剤が開発されていないのが現状である。具体的
には、臓器移植時の免疫拒絶反応の抑制剤として著名な
サイクロスポリンＡ、ステロイド剤などは液性免疫反応
に関して高い免疫抑制効果を示すことが知られている
が、細胞拒絶反応の一部を抑制することができないとい
う弱点を有している。

【０００３】また、細胞性拒絶反応の抑制能を有する各
種抗体製剤が開発されている。免疫反応担当細胞である
Ｔ細胞の表面抗原であるＣＤ３に対するマウスモノクロ
ーナル抗体 (ＯＫＴ−３) もその一つであるが、Ｔ細胞
を活性化するために極度の発熱悪寒などの副作用を有し
ている^{(1)、(2)、(3)}。また、同様の抗体製剤でＴ細胞の
受容体を認識するマウスモノクローナル抗体ＢＭＡ０３
１^(4)、(5) はＴ細胞の活性化などの副作用はないが、そ
の比活性が低いために大量投与を行わざるをえず、その
結果点滴静注を余儀なくされている。一方ポリクローナ
ル抗体製剤も開発されているが、免疫担当細胞以外の細
胞への反応性があるために赤血球、血小板減少症などの
副作用を有している^(6)、(7)。

【０００４】生体内の防御機構である免疫機構は、主
に、抗原の認識、免疫担当細胞の活性化、細胞傷害の三
段階に分類される。始めのステップで抗原の認識には主
に２種類のリンパ球が担当しており、１つはＢ細胞の担
当する液性免疫で、Ｂ細胞表面上に発現している膜結合
型イムノグロブリンによる抗原のネイティブ形の認識で
ある。もう一方はＴ細胞が主に担当する細胞性免疫機構
で抗原提示細胞にどん食され断片化 (ペプチド化) され
て細胞表面上にあるＭＨＣ分子に提示された抗原に関す
るＴ細胞上のＴ細胞受容体の認識である。この抗原の認
識によって次のステップである免疫担当細胞の活性化が
起こるわけであるが、単に抗原提示細胞とＴ細胞間にお
けるＭＨＣ分子＋抗原の複合体とＴ細胞受容体との結合
のみによるシグナル伝達でＴ細胞の活性化がおこるので
はなくて、その際に、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８のＬＦＡ
−３, ＭＨＣ ClassＩ, ＭＨＣ ClassIIへの結合による
セカンダリーシグナルのＴ細胞への伝達が必須であるこ
とが知られている。更に細胞傷害機構については、ＭＨ
Ｃ ClassＩ上に提示された抗原を、細胞表面上にＣＤ８
を発現しているＭＨＣ ClassＩ拘束性Ｔ細胞 (細胞傷害
性Ｔ細胞) が認識し、パーフォリンを含む顆粒などを分
泌し細胞傷害性を引き起こす。これら免疫反応に深く関
係しているＴ細胞上の表面抗原ＣＤ２, ＣＤ４, ＣＤ８
は、イムノグロブリンスーパーファミリーに属する細胞
接着分子で、いずれもＴ細胞の活性化に関与しているこ
とが知られている。以下にその機能を示す。ＣＤ２は、
Ｔ細胞全般の表面に分布し当初ヒツジ赤血球 (ＳＲＢ
Ｃ) レセプターとしてＥロゼット形成を起こすものとし
同定され、アミノ酸残基３２７個からなる分子量５０Ｋ
の膜結合型糖蛋白質で、そのリガンドとしてＬＦＡ−３
(ＣＤ５８) が知られている⁽⁸⁾。ＣＤ２は、抗原提示
細胞上に発現しているＬＦＡ−３と結合し、抗原を介さ
ずにＴ細胞と抗原提示細胞の結合を強めるとともに、み
ずからもＴ細胞内部へのシグナル伝達を行ってい
る⁽⁹⁾。

【０００５】ＣＤ４は、Ｔ細胞のサブセットと単球及び
一部のＢ細胞株の表面に分布していることが知られてい
る分子量５９Ｋの単一鎖の膜結合型蛋白質である。その
リガンドとして主要組織適合性抗原ＭＨＣ ClassIIの定
常部があり、そのＣＤ４の機能としてＭＨＣ ClassIIと
Ｔ細胞受容体の結合を強化するとともに、ＣＤ４自らも
タイロシンカイネースｐ５６ｌｃｋを介してシグナルト
ランスダクションを行っていることが知られてい
る⁽¹⁰⁾。

【０００６】ＣＤ８は、Ｔ細胞のサブセット及び胸腺細
胞とナチュラルキラー細胞の表面上に分布していて、α
鎖とβ鎖からなるヘテロダイマー⁽¹¹⁾を構成しており、
そのリガンドとしてＭＨＣ ClassＩ⁽¹²⁾が知られてい
る。その機能として、ＭＨＣ ClassＩとＴ細胞受容体の
結合を強化するとともに、ＣＤ８自らも細胞内で接触し
ているタイロシンカイネースｐ５６ｌｃｋを介してシグ
ナルトランスダクションを行っていることが知られてい
る⁽¹⁰⁾。

【０００７】ヒトＴ細胞表面抗原ＣＤ２に反応性を有す
るモノクローナル抗体（以下、抗ＣＤ２抗体という）、
ヒトＴ細胞表面抗原ＣＤ４に反応性を有するモノクロー
ナル抗体（以下、抗ＣＤ４抗体という）並びにヒトＴ細
胞表面抗原ＣＤ８に反応性を有するモノクローナル抗体
（以下、抗ＣＤ８抗体という）についても、その免疫抑
制作用が指摘されている。具体的には、抗ＣＤ２抗体が
異種間臓器移植について免疫抑制効果を示すこと⁽¹³⁾、
抗ＣＤ４抗体が同種間臓器移植について免疫抑制効果を
示すこと、抗ＣＤ８抗体が骨髄移植の際に起きるＧＶＨ
Ｄに対する免疫抑制効果があること⁽¹⁴⁾、が既に知られ
ている。また、組み合わせによるもので免疫抑制効果を
見た例として、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体並びに抗Ｉ
Ｌ２受容体抗体の３種の組み合わせ、抗ＣＤ４抗体と抗
ＣＤ８抗体⁽¹⁶⁾の２種の組み合わせの例が知られてい
る。

【０００８】しかし、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体並び
に抗ＣＤ８抗体の３種類の抗体の組み合わせによる免疫
抑制剤についてはその事例は今だ知られていない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
の抗体を有効成分とする免疫抑制剤に関する前述の欠点
を解消すべく、Ｔ細胞以外の細胞と交差性がなく且つＴ
細胞を活性化しない免疫抑制剤を開発し、提供すること
にある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本願発明者等は、上記課
題を解決すべく、種々のヒトＴ細胞表面抗原に対するモ
ノクローナル抗体について検討を行った結果、抗ＣＤ２
抗体、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体の３種の抗体を混
合して用いた場合に、該混合物が、それら単独或いは２
つの組み合わせ、又は、従来の免疫抑制抗体製剤と較べ
て、驚くべきことに免疫担当細胞特異的でかつＴ細胞活
性化が少なく、しかも著しく免疫抑制作用が高いという
優れた相乗作用を発揮することを見い出し、本発明を完
成させた。

【００１１】本発明は新規な免疫抑制剤の提供に係るも
のである。すなわち、本発明はヒトＴ細胞の表面抗原で
あるＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８に対しそれぞれ特異的に反
応する３種のモノクローナル抗体を有効成分として含む
免疫抑制剤である。本発明で用いることのできるモノク
ローナル抗体については、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８に対
するそれぞれの抗原特異性を保持している或いは損なわ
れない限り、以下の全てのものが使用できる。

【００１２】Ａ：常法により、マウスを含む種々の動物
由来のＢ細胞を用いて作成した抗体産生ハイブリドーマ
により生産されるモノクローナル抗体 Ｂ：Ａの抗体を、以下に例示する様に、遺伝子組換え技
術を用いて、ヒト型化、親和性向上、補体活性除去或い
は強化等を目的として、改変あるいは作製したもの。

【００１３】・Ａの抗体の可変領域或いは超可変領域
を、様々のイムノグロブリンの定常領域あるいは定常領
域部分あるいは定常領域とフレームワークからなる部分
に挿入する。^(19)、(20) ・Ａの抗体の可変領域或いは超可変領域をイムノグロブ
リン以外の分子と結合する。⁽²¹⁾ ・Ａの抗体の可変領域と、該抗体とは異なる抗体の可変
領域を有する２つの特異性を有する (bispecific) な抗
体を造成する。⁽²²⁾ ・ファージ表面上に抗体フラグメントを発現させたもの
より、抗原に親和性の高いものをスクリーニングする。
⁽²³⁾ ・ＰＣＲ法などを用いてＤＮＡ変異を起こし親和性の高
いものに改変したもの。 Ｃ：Ａの抗体に、補体活性除去等の目的で、酵素処理
(例えば、ペプシン処理⁽²⁵⁾やプラスミン処理⁽²⁶⁾によ
りＦｃ部分を除去する) 或いは化学修飾 (例えば、β−
プロピオラクトン処理⁽²⁷⁾やジスルフィド結合の還元ア
ルキル化⁽²⁸⁾によりＦｃ部分を不活化する) を行い改変
したもの。

【００１４】Ｄ：ヒト型イムノグロブリン産生トランジ
ェニック動物⁽²⁴⁾を用いて作製したもの。 Ｅ：免疫不全動物にヒト抗体産生細胞を導入しこれより
作製したもの。 本発明は、抗原提示反応のみを抑えるのでなく細胞障害
反応も抑制するので、同種間及び異種間における臓器移
植時あるいは骨髄細胞などの細胞移植時におこる拒絶反
応抑制剤としてだけでなく、自己抗原を認識しそれに対
して細胞傷害性を起こす自己免疫疾患一般の治療薬とし
ても利用できる。尚その際はヒト以外の抗体では、長期
投与によって該抗体に対する抗体ができると思われるの
で、ヒト型化するのが望ましい。

【００１５】本発明の免疫抑制剤における３種のモノク
ローナル抗体のそれぞれの配合比率は、各々が10〜60％
の範囲でかつ全体として100％になるような比率であ
る。本発明は注射剤、好ましくは静脈投与の態様で使用
することができ、投与量、投与回数は対象の疾患患者の
病状を配慮して決めることができるが成人一人当たり10
μｇ〜100mg/日まで投与することができる。

【００１６】本発明は、溶液製剤或いは凍結乾燥製剤と
して調剤することができ、必要に応じて薬剤的に許容さ
れる賦形剤、希釈体、安定化剤、等張化剤、緩衝剤を添
加物として含むことができる。好ましい添加物として
は、マルトース等の糖類、ポリソルベート等の界面活性
剤、グリシン等のアミノ酸、ヒト血清アルブミン等の蛋
白質、塩化ナトリウム等の塩類を挙げることができる。

【００１７】

【発明の効果】本発明の抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、
抗ＣＤ８抗体３種類の組み合わせからなる免疫抑制剤
は、それが単独或いは２つの組み合わせによる場合に較
べ顕著な免疫抑制効果があり、又特にいずれか１つの抗
体が単独ではＴ細胞増殖活性という好ましくない性質を
有する場合に相乗作用によりそれが抑えられるものであ
る。したがって、この免疫抑制剤は従来の免疫抑制剤に
較べて優れた免疫抑制効果を奏するばかりでなく、使用
する抗体にＴ細胞増殖活性があったとしても混合により
それを抑制し該活性に基づく副作用を押さえるという異
質の効果を奏するものであり、また、ポリクロナール抗
体製剤にあるような免疫担当細胞以外の細胞への反応性
による副作用の恐れもないので産業上きわめて有用であ
る。 （調製例） 抗体の調製 （１）抗体のスクリーニングとクローニング 雌のBalb/cマウス８週令にＢ細胞株 (CCRF-SB ATCC No.
CCL-120)で活性化したＴ細胞２×10⁷ を尾静注にて免疫
した。この免疫されたマウスのヒ臓を摘出しこのヒ臓に
より調製したリンパ球とマウスミエローマp3X63 6.5.3
(ATCC No.CRL-1580) をポリエチレングリコール1500
(ベリンガー社) を用いて細胞融合を行った。この融合
細胞を限界希釈法を用いて抗体分泌陽性株のクローニン
グを行った。尚、陽性株の判定は ELISA法を用いた。具
体的にはヒト末梢血をPBSにて洗浄し血球画分を0.１％F
CS/PBSに懸濁してフィコールに重層した。1500rpm で30
分間遠心後buffy coatを単核細胞画分として回収した。
この単核細胞画分をIgGカラムに通してＢ細胞を取り除
いた。このようにして得られたＴ細胞とCCRF-SBを混合
し37℃にて６日間培養してＴ細胞を活性化した。この細
胞をFicolに重層して1500rpm で遠心後buffy coatをと
りPBSで３回洗浄し免疫抗原の調製を行った。この免疫
原をBalb/cマウスの尾静脈に注入した。このマウスのヒ
臓を摘出しこのヒ臓より調製したリンパ球とp3X63 6.5.
3をポリエチレングリコール1500にて細胞融合した。こ
の融合細胞を96穴プレートにまきこみ37℃、５％CO₂ HA
T(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン、シグマ
社) ＋10％FCS RPMI培地にて10日間〜20日間培養した。
この培養上清にかんしてＴ細胞に対する酵素免疫抗体法
を用いてアッセイを行い得られた陽性株について限界希
釈を行い１個／ウエルで96穴プレートにまきこんだ。こ
の限界希釈操作を繰り返すことによってヒトＴ細胞認識
抗体分泌ハイブリドーマのクローニングを行った。 （２）自動蛍光解析装置による抗体の解析 常法に従い末梢血よりＴ細胞を調製した。このＴ細胞を
上記抗体および市販のＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８抗体を用
いて蛍光二次染色を行った。この蛍光染色されたＴ細胞
をフローサイトメトリーFACSCAN(ベクトン デッキンソ
ン社) を使って解析し抗体の同定を行った。このように
して得られた抗ヒトＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８抗体を下記
のin vitroの評価系サンプルに供した。具体的には末梢
血からFicol(ファルマシア社) を用いた密度勾配遠心法
によりリンパ球の分離を行うことにより単核細胞画分を
調製した。このＴ細胞を0.１％ NaN₃ ２％ FCS/PBSに懸
濁しヒトイムノグロブリンを加え氷中30分放置しこれを
0.１％ NaN₃ 2％FCS/PBSで３回洗浄後、FITCで標識され
た抗マウスIgG抗体を添加しこれを0.１％ NaN₃２％ FCS
/PBSで３回洗浄後、各市販のピコエリスリンで標識され
た抗ヒトＣＤ２抗体 (anti-Leu5b ベクトン デッキンソ
ン社) 抗ヒトＣＤ４抗体 (anti-Leu3aベクトン デッキ
ンソン社) 抗ヒトＣＤ８抗体 (anti-Leu2a ベクトン デ
ッキンソン社) をそれぞれ加えて30分室温にて放置し
た。これを0.１％ NaN₃ ２％ FCS/PBSで３回洗浄した。
このようにして得られた蛍光標識されたＴ細胞をFACSca
n を用いたドットブロット解析することにより、各市販
のＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８抗体と上記モノクローナル抗
体とのＴ細胞認識群の差を検定した。各Ｔ細胞抗体と市
販のＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８抗体を用いた二重染色によ
るドットプロットのパターンを図１に示す。図１より取
得された抗体は各市販のＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８抗体と
競合するかあるいは同じＴ細胞群を認識する抗体である
ことが判明した。 （３）抗体の精製 各抗ヒトリンパ球抗体分泌ハイブリドーマを無血清培養
した。この培養上清をプロテインＡディスクカラムに通
し、吸着したIgG画分を緩衝液にて溶出した。具体的に
はハイブリドーマをERDF培地 ( (極東製薬工業) ＋イン
シュリン＋トランスフェリン等) にて37℃６日間培養し
た。この培養液を遠心し培養上清を回収した。この培養
上清をプロテインＡカラム (富士フィルター工業) に通
してイムノグロブリン画分を吸着させた。このカラムを
1.５M Glycine ３M NaCl pH8.9にて洗浄し、0.１M Glyc
ine pH2.5にてイムノグロブリン画分を溶出した。 （試験例） 免疫抑制試験 （１）リンパ球混合培養試験 前述した免疫反応において抗原提示細胞により抗原刺激
を受けたリンパ球は活性化を受け増殖が促進される。こ
れをin vitroの系でみたのがリンパ球混合培養試験であ
り、種々の免疫抑制物質の効果の判定に使用することが
できる⁽¹⁷⁾。具体的にはハプロタイプの異なるヒト同士
(以下、便宜上ヒトＡ、ヒトＢという)のリンパ球を混
合し、リンパ球増殖を促し、これを上記抗体によって抑
制する。あらかじめヒトＡの末梢血より調製したリンパ
球をマイトマイシンＣを用いて非増殖化しておく。この
非増殖化されたリンパ球 (Stimulator) と抗体の添加さ
れたヒトＢの末梢血より調製したリンパ球 (Responder)
を混合し４日後トリチウムラベルされたサイミジンを添
加しヒトＢのリンパ球の増殖を測定する。以下にその方
法を示す。 １) リンパ球の調製 ハプロタイプの異なるヒトＡ、ヒトＢの末梢血からFico
lを用いた密度勾配遠心法によりリンパ球の分離を行な
った。 ２) Stimulatorの調製 ヒトＡのリンパ球１×10⁷個を、10％のヒトＢより調製
した血清を含むRPMI培地 (ギブコ社) ５mlに浮遊した。
このリンパ球浮遊液にマイトマイシンＣ250μｇを加え
て37℃ 30分 ５％CO₂存在下インキュベートした。1500r
pm ５分で遠心後、沈澱物を１％FCS PBSに懸濁し、更に
遠心しこの洗浄操作を４回繰り返した後、10％Ｂ氏血清
RPMIに懸濁した。 ３) Responderの調製 ヒトＢのリンパ球５×10⁵/ml に10％Ｂ氏血清RPMIに懸
濁 ４) リンパ球の混合 StimulatorとResponder 各々100μｌずつＵ底96穴プレ
ート上で混合した。この時あらかじめ混合する１時間前
に抗体をResponder側に入れておく。この混合リンパ球
を37℃ ４日間 ５％CO₂存在下培養した。 ５) サイミジンの取り込み このプレートに ³Ｈサイミジンを0.25μCi/well添加
し、37℃ 16〜24時間 ５％CO₂ 存在下放置した。 ６) ラベルの取り込み量の測定 セルハーベスター (ワッラック社) で ³Ｈサイミジンを
取り込んだＤＮＡを回収した。この ³Ｈサイミジンのβ
線量を液体シンチレーションカウンター (ワッラック
社) で測定した。

【００１８】結果 我々が取得したマウス抗ヒトＣＤ２モノクローナル抗体
(62D4) 、マウス抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体 (a2
0-4)、マウス抗ヒトＣＤ８モノクローナル抗体(h32-1)
それぞれ単独及び１：１：１に混合したサンプルのリン
パ球混合培養試験におけるサイミジンの取り込みを (抑
制効果) を図２に示す。それぞれサンプルの抗体総和の
終濃度は700ng/mlになるように調製した。マウス抗ヒト
ＣＤ３モノクローナル抗体 (OKT-3)がコントロールより
も高いＴ細胞増殖活性 (サイミジンの取り込み14000cp
m) をしめすのに対して、それぞれの抗ＣＤ２抗体、抗
ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体は高い免疫抑制能を示した
(サイミジンの取り込み1000〜1200cpm)。更に抗ＣＤ２
抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体を１：１：１に混合
したものは単独の抗体と混合総和の終濃度が同じにもか
かわらずより、高い免疫抑制活性 (260cpm) を示した。
このことより抗ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８抗体のコンビネ
ーションによる相乗効果を示していると思われる。

【００１９】次に、我々が取得した、上記と別のマウス
抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体 (k35-37) 、マウス抗
ヒトＣＤ８モノクローナル抗体 (a86-2)と先程の抗ヒト
ＣＤ２モノクローナル抗体 (62D4) を用いてそれぞれの
抗体単独及び組み合わせにおける免疫抑制効果を図３に
示す。単独で各抗体を用いた場合、抗ＣＤ２抗体、抗Ｃ
Ｄ４抗体に関しては前述同様免疫抑制効果を示し、抗Ｃ
Ｄ８抗体単独についてはＴ細胞増殖活性をしめす組み合
わせであるが、このような組み合わせでも抗ＣＤ２抗
体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体の３種類の混合にする
と高い免疫抑制効果を示した。そしてこの効果は各抗Ｃ
Ｄ２、ＣＤ４、ＣＤ８抗体２種類の組み合わせのいずれ
よりも高かった。

【００２０】更に我々が取得したマウス抗ヒトＣＤ２モ
ノクローナル抗体 (h82-35、62D 4)、マウス抗ヒトＣＤ
４モノクローナル抗体 (k35-37、N93-18) 、マウス抗ヒ
トＣＤ８モノクローナル抗体 (h32-1、N49-4)を用いて
それぞれ単独及び抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ
８抗体の３種類の混合 (抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、
抗ＣＤ８抗体＝１：１：１) における免疫抑制効果を図
４に示す。この抗体間の組み合わせにおいても、いずれ
の場合にも抗ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８抗体３種類混合に
よる相乗効果を示した。

【００２１】また、市販のマウス抗ヒトＣＤ２モノクロ
ーナル抗体 (IOT-11:IMMUNOTECH社)、マウス抗ヒトＣＤ
４モノクローナル抗体 (A40:PHARMINGEN社) 、マウス抗
ヒトＣＤ８モノクローナル抗体 (G-42-8:PHARMINGEN社)
の単独及び３種類の混合による免疫抑制効果を図５に
示す。この場合にも３種類混合による相乗効果が確認さ
れた。

【００２２】抗ＣＤ２抗体 (62D4) 、ＣＤ４ (k35-37)
、ＣＤ８抗体 (h32-1)の免疫抑制活性の濃度依存性の
検討を図６に示す。終濃度2.8ng/ml〜350ng/mlの間での
各抗ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８抗体単独および３種類混合
(抗ＣＤ２：ＣＤ４：ＣＤ８抗体＝１：１：１) による
免疫抑制効果を検討した結果、いずれの抗体濃度におい
ても各抗ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８抗体３種類混合による
相乗効果が見られた。

【００２３】これらのことよりリンパ球混合培養試験に
おいて抗ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８抗体単独で十分に免疫
抑制活性を有しているものだけでなく、抗ＣＤ２、ＣＤ
４、ＣＤ８抗体単独のさいには免疫抑制活性が低いある
いはＴ細胞増殖活性を有しているものでも３種類混合す
ることによって相乗効果がでることが確認できた。な
お、これらの検定における Responderリンパ球と Stmul
aterリンパ球は、それぞれの検定ごとに異なったヒトの
ものを使用しているが( 例えば、図２のデーターがヒト
ＡとヒトＢのものとすると、図３ではヒトＣとヒトＤの
ものという様に）、何れでも相乗効果が出ることから、
この効果はヒトの固体差にかかわらず認められるものと
言える。 （２）標的細胞障害性試験 前述の一連の免疫反応の最終段階において起きるリンパ
球による細胞障害性は移植の際におきる免疫反応、ウイ
ルス感染細胞に対する免疫反応、自己免疫疾患等に深く
関連している。この細胞性障害作用をin vivoでヒトに
おいて測定することはできないのでin vitroでの測定法
であるこの細胞障害性試験などが広く用いられている
⁽¹⁸⁾。具体的にはターゲットとなるマイトマイシンＣに
よって非増殖化したヒトのＢ細胞株とヒト末梢血より調
製した単核細胞を共培養し、細胞障害性Ｔ細胞を調製し
た。⁵¹Ｃｒを取り込ませた新鮮なヒトＢ細胞株 (標的細
胞)と上記の細胞障害性Ｔ細胞を共培養し障害を受けた
Ｂ細胞株より放出された培養上清中のクロム量を測定す
る。その方法を以下に示す。 １) ヒト末梢血より単核細胞の調製 ヒト末梢血を1500rpm 10分遠心し、血球画分をPBSに懸
濁しフィコールに重層した。これを1500rpm 30分間遠心
し、Buffy coatをリンパ球画分として集めて、２％FCS/
PBSで２回洗浄後10％RPMIに懸濁。 ２) アロ刺激細胞 (標的細胞) の調製 標的細胞となるＢ細胞株SKW.6.4 を10％FCSで懸濁し、
マイトマイシンＣを終濃度50μg/mlになるように加え、
37℃で30分間放置後PBSで４回洗浄する。 ３) 単核細胞へのアロ刺激 (細胞障害性Ｔ細胞の調製) 上記１) で調製した単核細胞に上記２) の細胞を混合
し、37℃ 5％CO₂ ６日間インキュベートした。この細胞
を上記１) と同様の操作で調製し10％ヒト血清RPMIに懸
濁した。尚、コントロールとして上記２) の細胞を混合
していないものを用いた。 ４) 標的細胞への⁵¹Ｃｒの取り込み Ｂ細胞株SKW.6.4 を10％FCS RPMIに懸濁しこれに⁵¹Ｃｒ
(ＮＥＮ社) を添加し37℃ 5％CO₂ １時間インキュベー
ト後１％FCS/PBSで５回洗浄した。 ５) アッセイ 上記３) の細胞と上記４) の細胞を混合し10％ヒト血清
RPMIにて37℃ 5％CO₂４時間インキュベートした。この
培養上清を上清採取システム (大日本製薬（株）) にて
回収した。この回収された標識体をガンマーカウンター
(AUTO-GAMMA5650パッカード社) にて測定した。尚、抗
体の添加は、標的細胞 (上記４))と細胞障害性細胞 (上
記３))を混合する１時間前に細胞障害性細胞に行なっ
た。

【００２４】結果 抗ＣＤ２抗体 (h82-35、62D4) 、抗ＣＤ４抗体 (k35-3
7、N93-18) 、ＣＤ８抗体 (h32-1)のそれぞれ単独及び
各抗ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８抗体３種類混合 (抗ＣＤ
２：ＣＤ４：ＣＤ８抗体＝１：１：１) を終濃度200ng/
mlになるように添加したときの免疫抑制効果を図７に示
す。それぞれ、抗ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８抗体単独で用
いたときより３種類混合したときのほうが高い免疫抑制
効果を示し、混合による相乗効果が認められた。次に同
抗体を用いてそれぞれ単独、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８抗
体の内２種類混合 (１：１) と３種類混合 (１：１：
１) の際の免疫抑制効果を図８、図９に示す。抗体総和
の終濃度が図８では350ng/ml、図９では200ng/mlになる
ように添加した。その結果２種類ではむしろ免疫抑制効
果の低下が見られるものもあったが、３種類混合におい
てはいずれも相乗的免疫抑制効果を示した。同様に抗Ｃ
Ｄ２抗体 (62D4) 、ＣＤ４ (k35-37、N93-18) 、ＣＤ８
抗体 (N49-4、h32-1)のそれぞれ単独及び各抗ＣＤ２、
ＣＤ４、ＣＤ８抗体３種類混合 (抗ＣＤ２：ＣＤ４：Ｃ
Ｄ８抗体＝１：１：１) を終濃度200ng/mlになるように
添加したとき免疫抑制効果を図10に示す。

【００２５】これらの検定ではいずれも異なるヒトから
細胞障害性Ｔ細胞の調製を行なったが、いずれも各抗Ｃ
Ｄ２、ＣＤ４、ＣＤ８抗体３種類混合 (抗ＣＤ２：ＣＤ
４：ＣＤ８抗体＝１：１：１) の組み合わせによる相乗
効果が確認された。また、市販のマウス抗ヒトＣＤ２モ
ノクローナル抗体 (IOT-11：IMMUNOTECH社) 、マウス抗
ヒトＣＤ４モノクローナル抗体 (A40:PHARMINGEN社) 、
マウス抗ヒトＣＤ８モノクローナル抗体 (G-42-8:PHARM
INGEN 社) の単独及び３種類の混合による免疫抑制効果
を図１１に示す。この場合にも３種類混合による相乗効
果が確認された。 抗ＣＤ２抗体 (62D4) 、抗ＣＤ４抗
体 (k35-37) 、抗ＣＤ８抗体 (h32-1)、OKT-3 (マウス
抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体 オルソ ファーマシ
ューテイカル社) それぞれ単独及び抗ＣＤ２、ＣＤ４、
ＣＤ８抗体３種類混合物 (１：１：１) に関して各々終
濃度３ng/ml〜700ng/mlになるように添加したときの細
胞障害活性抑制効果の濃度依存性を図１２に示す。抗Ｃ
Ｄ２、ＣＤ４、ＣＤ８抗体３種類混合は終濃度10ng/ml
以上でそれぞれ単独の抗体よりも高い抑制効果を示し
た。さらに OKT-3が700ng/mlで約36％の％ of lysisを
しめすのに対して、３種類混合の場合350ng/mlで約33％
の％ of lysisを示した。

【００２６】抗ＣＤ２抗体 (62D4) 、抗ＣＤ４抗体 (k3
5-37) 、抗ＣＤ８抗体 (h32-1)を抗ＣＤ２、ＣＤ４、Ｃ
Ｄ８抗体混合比を１：０：０、０：１：０、０：０：
１、７：５：３、２：１：１、１：２：１。１：１：
２、１：１：１の割合でかつ総抗体濃度が700ng/mlで添
加したとき、およびOKT-3 (抗ヒトＣＤ３モノクローナ
ル抗体 オルソ ファーマシューテイカル社) 700ng/ml
添加したときの、各抗体による細胞障害活性抑制効果を
図１３に示す。

【００２７】抗ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８抗体３種類混合
物はいずれの抗体単独よりも高い免疫抑制効果を示し、
またその混合比が抗ＣＤ２：ＣＤ４：ＣＤ８抗体＝１：
１：２の時にこの検定においてはもっとも高い免疫抑制
相乗効果がみられた。これは細胞障害性Ｔ細胞の多くに
ＣＤ８陽性細胞が存在することに起因するのかもしれな
い。

【００２８】

【実施例】

実施例１ 液剤−１ 抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体をそれぞれ
２mg、ポリソルベート１mg、塩化ナトリウム16mg、２ml
PBSからなる溶液を無菌的に調製、アンプル充填し、注
射液とした。

【００２９】実施例２ 液剤−２ 抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体をそれぞれ
1.５mg、1.５mg、３mg、ポリソルベート１mg、塩化ナト
リウム16mg、２ml PBSからなる溶液を無菌的に調製、ア
ルプル充填し、注射液とした。 実施例３ 液剤−３ 抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体をそれぞれ
1.５mg、３mg、1.５mg、ポリソルベート１mg、塩化ナト
リウム16mg、２ml PBSからなる溶液を無菌的に調製、ア
ルプル充填し、注射液とした。

【００３０】実施例４ 液剤−４ 抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体をそれぞれ
３mg、1.５mg、1.５mg、ポリソルベート１mg、塩化ナト
リウム16mg、２ml PBSからなる溶液を無菌的に調製、ア
ンプル充填し、注射液とした。 実施例５ 液剤−５ 抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体をそれぞれ
２mg、１mg、３mg、ポリソルベート１mg、塩化ナトリウ
ム16mg、２ml PBSからなる溶液を無菌的に調製、アンプ
ル充填し、注射液とした。

【００３１】実施例６ 液剤−６ 抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体をそれぞれ
３mg、１mg、２mg、ポリソルベート１mg、塩化ナトリウ
ム16mg、２ml PBSからなる溶液を無菌的に調製、アルプ
ル充填し、注射液とした。 実施例７ 凍結乾燥剤−１ １バイヤル中に抗ヒトＴリンパ球 (ＣＤ２、ＣＤ４、Ｃ
Ｄ８) モノクローナル抗体６mg (抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ
４抗体、抗ＣＤ８抗体をそれぞれ２mg) および添加剤と
してポリソルベート１mg、塩化ナトリウム16mg、２ml P
BSからなる溶液を無菌的に調製した凍結乾燥剤、注射用
蒸留水にて溶解後、注射液として使用する。

【００３２】実施例８ 凍結乾燥剤−２ １バイヤル中に抗ヒトＴリンパ球 (ＣＤ２、ＣＤ４、Ｃ
Ｄ８) モノクローナル抗体６mg (抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ
４抗体、抗ＣＤ８抗体をそれぞれ1.５mg、1.５mg、３m
g) および添加剤としてポリソルベート１mg、塩化ナト
リウム16mg、２mlPBSからなる溶液を無菌的に調製した
凍結乾燥剤、注射用蒸留水にて溶解後、注射液とし使用
する。

【００３３】実施例９ 凍結乾燥剤−３ １バイヤル中に抗ヒトＴリンパ球 (ＣＤ２、ＣＤ４、Ｃ
Ｄ８) モノクローナル抗体６mg (抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ
４抗体、抗ＣＤ８抗体をそれぞれ1.５mg、３mg、1.５m
g) および添加剤としてポリソルベート１mg、塩化ナト
リウム16mg、２mlPBSからなる溶液を無菌的に調製した
凍結乾燥剤、注射用蒸留水にて溶解後、注射液とし使用
する。

【００３４】実施例10 凍結乾燥剤−４ １バイヤル中に抗ヒトＴリンパ球 (ＣＤ２、ＣＤ４、Ｃ
Ｄ８) モノクローナル抗体６mg (抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ
４抗体、抗ＣＤ８抗体をそれぞれ３mg、1.５mg、1.５m
g) および添加剤としてポリソルベート１mg、塩化ナト
リウム16mg、２mlPBSからなる溶液を無菌的に調製した
凍結乾燥剤、注射用蒸留水にて溶解後、注射液とし使用
する。

【００３５】実施例11 凍結乾燥剤−５ １バイヤル中に抗ヒトＴリンパ球 (ＣＤ２、ＣＤ４、Ｃ
Ｄ８) モノクローナル抗体６mg (抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ
４抗体、抗ＣＤ８抗体をそれぞれ３mg、1.５mg、1.５m
g) および添加剤としてポリソルベート１mg、塩化ナト
リウム16mg、２mlPBSからなる溶液を無菌的に調製した
凍結乾燥剤、注射用蒸留水にて溶解後、注射液とし使用
する。

【００３６】実施例12 凍結乾燥剤−６ １バイヤル中に抗ヒトＴリンパ球 (ＣＤ２、ＣＤ４、Ｃ
Ｄ８) モノクローナル抗体６mg (抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ
４抗体、抗ＣＤ８抗体をそれぞれ３mg、１mg、２mg) お
よび添加剤としてポリソルベート１mg、塩化ナトリウム
16mg、２ml PBSからなる溶液を無菌的に調製した凍結乾
燥剤、注射用蒸留水にて溶解後、注射液とし使用する。 〔引用文献〕 (１) Von Wauwe J.P., Demey J.R., Goosens J.G. J Immunol, 124, 2708(1980) (２) Ellenhorn J.D.I., Woodle E.S., Ghobrial I, Th
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【図面の簡単な説明】

【図１】各種抗体と市販の抗ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８抗
体での蛍光自動解析装置によるリンパ球の染色パターン

【図２】混合リンパ球培養試験の結果を示す図。 Cont : 10 ％ＦＣＳ培地（コントロール） Ａ：62D4 (抗ＣＤ２抗体) Ｂ：k35-37 (抗ＣＤ４
抗体) Ｃ：h32-1 (抗ＣＤ８抗体) OKT-3 : 抗ＣＤ３抗体 Ａ＋Ｂ＋Ｃ：Ａ、Ｂ、Ｃの混合 Ａ：Ｂ：Ｃ＝１：
１：１ それぞれの抗体単独あるいは混和終濃度は700ng/ml

【図３】混合リンパ球培養試験の結果を示す図。 Ｔ(R) : レスポンダーＴ細胞 ｍＴ(S) : マイトマイシンＣにより非増殖処理したステ
ィミュレーターＴ細胞 Ａ：62D4 (抗ＣＤ２抗体) Ｂ：k35-37 (抗ＣＤ４
抗体) Ｃ：a86-2 (抗ＣＤ８抗体) Ａ＋Ｂ：Ａ、Ｂの混合 Ａ：Ｂ＝１：１ Ａ＋Ｃ：Ａ、Ｃの混合 Ａ：Ｃ＝１：１ Ｂ＋Ｃ：Ｂ、Ｃの混合 Ｂ：Ｃ＝１：１ Ａ＋Ｂ＋Ｃ：Ａ、Ｂ、Ｃの混合 Ａ：Ｂ：Ｃ＝１：１：
１ それぞれの抗体単独あるいは混和終濃度は700ng/ml

【図４】混合リンパ球培養試験の結果を示す図。 Ａ：h82-35 (抗ＣＤ２抗体) Ｂ：62D4 (抗ＣＤ２抗
体) Ｃ：k35-37 (抗ＣＤ４抗体) Ｄ：N93-18 (抗ＣＤ４
抗体) Ｅ：h32-1 (抗ＣＤ８抗体) Ｆ：N49-4 (抗ＣＤ８
抗体) OKT-3 ：抗ＣＤ３抗体 (ortho) 尚、各抗ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８抗体の混合比は１：
１：１ それぞれの抗体単独あるいは混和終濃度は200ng/ml

【図５】混合リンパ球培養試験の結果を示す図。 Anti-CD2：抗ＣＤ２抗体 (IOT-11：IMMUNOTECH) Anti-CD4：抗ＣＤ４抗体 (A-40：PHARMINGEN) Anti-CD8：抗ＣＤ８抗体 (C-42-8：PHARMINGEN) Mix：抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体の混
合 Anti-CD2：Anti-CD4：Anti-CD8＝１：１：１ それぞれの抗体単独あるいは混和終濃度は350ng/ml

【図６】混合リンパ球培養試験の結果を示す図。 anti-CD2：62D4 anti-CD4：k35-37 anti-CD8：h32-1, Mix：anti-CD2＋anti-CD4、anti-CD8の混合抗ＣＤ２抗
体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体の混合比はAnti-CD2：
Anti-CD4：Anti-CD8＝１：１：１

【図７】細胞障害性試験の結果を示す図。 Ａ：h82-35 (抗ＣＤ２抗体) Ｂ：62D4 (抗ＣＤ２抗
体) Ｃ：k35-37 (抗ＣＤ４抗体) Ｄ：N93-18 (抗ＣＤ４
抗体) Ｅ：h32-1 (抗ＣＤ８抗体) それぞれの抗体単独あるいは混和終濃度は200ng/ml 抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体混合比は
１：１：１

【図８】細胞障害性試験の結果を示す図。 Ａ：62D4( 抗ＣＤ２抗体) Ｂ：k35-37( 抗ＣＤ４抗
体) Ｃ：h32-1(抗ＣＤ８抗体) それぞれの抗体単独あるいは混和濃度は350ng/ml 抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体混合比は、
２種混合の場合は１：１、３種混合の場合は１：１：１

【図９】細胞障害性試験の結果を示す図。 Ａ：h82-35 (抗ＣＤ２抗体) Ｂ：62D4 (抗ＣＤ２抗
体) Ｃ：k35-37 (抗ＣＤ４抗体) Ｄ：N93-18 (抗ＣＤ４
抗体) Ｅ：h32-1 (抗ＣＤ８抗体) それぞれの抗体単独あるいは混和終濃度は200ng/ml 抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体混合比は、
２種混合の場合は１：１、３種混合の場合は１：１：１

【図10】細胞障害性試験の結果を示す図。 Ａ：62D4( 抗ＣＤ２抗体) Ｂ：k35-37 (抗ＣＤ４
抗体) Ｃ：N93-18 (抗ＣＤ４抗体) Ｄ：N49-4 (抗ＣＤ８
抗体) Ｅ：h32-1 (抗ＣＤ８抗体) それぞれの抗体単独あるいは混和終濃度は200ng/ml 抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体混合比は
１：１：１

【図11】細胞障害性試験の結果を示す図。 Anti-CD2：抗ＣＤ２抗体 (IOT-11：IMMUNOTECH) Anti-CD4：抗ＣＤ４抗体 (A-40：PHARMINGEN) Anti-CD8：抗ＣＤ８抗体 (C-42-8：PHARMINGEN) Mix：抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体の混
合 Anti-CD2：Anti-CD4：Anti-CD8＝１：１：１ それぞれの抗体単独あるいは混和終濃度は350ng/ml

【図12】細胞障害性試験の結果を示す図。 anti-CD2：62D4 anti-CD4：k35-37 anti-CD8：h32-1,
OKT-3: (抗ＣＤ３抗体：ORTHO) Mix：抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体の混
合比はAnti-CD2：Anti -CD4：Anti-CD8＝１：１：１

【図13】細胞障害性試験の結果を示す図。 anti-CD2：62D4 anti-CD4：k35-37 anti-CD8：h32-1,
OKT-3: (抗ＣＤ３抗体：ORTHO) 抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体の混合比は
それぞれ １．7:5:3 ２．2:1:1 ３．1:2:1 ４．1:1:2
５．1:1:1 それぞれの抗体単独あるいは混和終濃度は700ng/ml

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の (ａ) 、（ｂ）及び (ｃ) の３つ
   のモノクローナル抗体を有効成分として含有する免疫抑
   制剤。 (ａ) ヒトＴ細胞表面抗原ＣＤ２に反応性を有するモノ
   クローナル抗体 (ｂ) ヒトＴ細胞表面抗原ＣＤ４に反応性を有するモノ
   クローナル抗体 (ｃ) ヒトＴ細胞表面抗原ＣＤ８に反応性を有するモノ
   クローナル抗体
2. 【請求項２】 モノクローナル抗体がマウス由来である
   ことを特徴とする請求項１記載の免疫抑制剤。